CN105039381B - 一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用 - Google Patents
一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用。一种重组质粒载体，在PHT01质粒的BamHI酶切位点前插入麦芽糖诱导启动子替换PHT01质粒上的Pgrac启动子，在BamHI酶切位点前插入Tat型信号肽的表达基因，在BamHI酶切位点后插入海藻糖合成酶的表达基因，本发明还涉及麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法。本发明采用麦芽糖启动子和海藻糖合成酶融合后进行表达的效果显著优于其它诱导型表达的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用，特别涉及一种麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C12H22O11·2H2O，广泛分布于自然界中许多生物细胞中。海藻糖自身性质非常稳定，通常在环境胁迫条件下大量生产，并对多种生物活性物质起到保护剂的作用。随着社会的进步和人们生活水平的提高，海藻糖逐渐的被广泛应用于食品和医疗行业，加大了人们对海藻糖的要求。因此，大规模的高效、安全、廉价生产海藻糖具有极大的经济价值，同时也将更能推广和普及海藻糖在食品领域的使用。
枯草芽孢杆菌启动子是实现基因高效表达的关键元件之一。近年来，在启动子的研究方面开展了大量的工作并取得了长足的进展，克隆获得了一批可以应用于枯草芽孢杆菌的启动子。但是，枯草芽孢杆菌的现有启动子在数量、表达量和调控方式等方面存在着诸多问题。需要进一步研究和完善，获得更多表达强度高，诱导调控方便的启动子元件。
在枯草芽孢杆菌中常用的启动子系统有Pspac、Pxyl和PsacB系统，这三个启动子系统在枯草杆菌研究工作中应用很广，但它们也有自己的缺点：Pspac启动子的诱导物IPTG不仅成本高，而且有毒性；Pxyl启动子的诱导物木糖价格高，易增加生产成本；sacB启动子的表达量相对较低。这些缺陷使得它们在工业生产中有一定的局限性。
为了使海藻糖合成酶酶制剂应用到食品医疗行业，我们应用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖启动子，也具有很好的应用潜力。整个麦芽糖操纵子的转录过程是由结构基因上游的Pglv启动子控制，该操纵子包括三个结构基因glvA、glvR、glvC，这三个基因在调控上起到重要作用。glvA基因是编码水解通过磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统(PTS)转运到细胞内的磷酸化的麦芽糖的6-磷酸-α葡萄糖苷酶。glvR基因则是整个操纵子的关键基因，该基因编码的调控蛋白可通过结合磷酸化的麦芽糖而被激活，激活的调控蛋白的N末端与麦芽糖启动子glv序列结合，促进了该启动子的转录表达，起到了正向调控的作用。glvC编码的渗透蛋白是组成磷酸烯醇式丙酮酸系统组件，在转运麦芽糖过程中起到渗透作用。
Pglv系统的诱导物麦芽糖相对于IPTG和木糖来说，价格便宜，成本低，且对细菌本身无毒性，因此在工业上很有实用价值。此外，研究启动子对于枯草芽孢杆菌的基因组以及分子遗传的研究工作也有着十分重要的意义。但其同时也存在着不足，葡萄糖对表达系统枯草 芽孢杆菌B.subtilis有强烈的抑制作用，这与Pglv启动子的性质相符。Pglv启动子碳水化合物异化代谢的调控元件受葡萄糖的负反馈抑制，通过启动子的优化，解除葡萄糖对Pglv启动子的抑制应该是进一步提高Pglv启动子的表达强度，拓展其应用价值的有效策略。
对于用Pglv启动子诱导海藻糖合成酶产生来说，该麦芽糖诱导物即能够诱导海藻糖合成酶产生，反过来得到的海藻糖合成酶以麦芽糖为底物直接转化为海藻糖，增加了海藻糖合成酶的转化率，对于制造海藻糖来说具有重要意义。
Bacillus subtilis是很有潜力的分泌型基因工程菌，Bacillus subtilis分泌表达蛋白质主要有两种途径，一种是Sec(Sec-dependent translocation)途径，一种是Tat(twin-arginine translocation)途径。Sec途径主要有两个瓶颈：一是不能转移在细胞质中已经折叠好的蛋白质，另一个是外源蛋白转移到胞外后折叠缓慢且来不及折叠就会被蛋白酶分解掉。而Tat途径的功能是转运那些折叠迅速或紧密的蛋白质甚至是多亚基酶复合物，这些蛋白无法通过Sec途径分泌，同时依赖于Tat途径分泌到胞外，减少了胞外蛋白酶对它的降解。而YwbN信号肽和PhoD信号肽是枯草芽孢杆菌中最具有代表性的Tat信号肽，对于麦芽糖诱导海藻糖合成酶合成、分泌来说具有重要的作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种重组质粒载体，其特征在于，在PHT01质粒的BamHI酶切位点前插入麦芽糖诱导启动子替换PHT01质粒上的的Pgrac启动子，在BamHI酶切位点前插入Tat型信号肽的表达基因，在BamHI酶切位点后插入海藻糖合成酶的表达基因；
所述的麦芽糖诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Tat型信号肽的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示、海藻糖合成酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述重组质粒载体的制备方法，步骤如下：
(i)以穿梭质粒PHT01为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段；
所述的PCR引物序列如下：
PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
PHT-down:5’-AGCTCGTCCCGTAACACGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGC-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物(10μmol/L)2.5μl，下游引物(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(ii)提取枯草芽孢杆菌subtilis168菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Pglv片段；
所述的PCR引物序列如下：
Pglv-up:5’-CACGTGTTACGGGACGAGCTATC-3’
Pglv-down:5’-GGATCCATGACGACCTCCTTGATAATTTACAATTCCATT-3’
其中单下划线为酶切位点，双下划线为通过设计引物对启动子Pglv做了定点突变，由原来的CG变为AT，这样可以缓解葡糖糖代谢物的抑制，有利于麦芽糖启动子的表达。
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物(10μmol/L)2.5μl，下游引物(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(iii)将步骤(i)制得的PHT片段与步骤(ii)制得的Pglv片段进行重叠PCR，制得PHT-Pglv片段；
所述的重叠PCR引物序列如下：
PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
Pglv-down:5’-GGATCCATGACGACCTCCTTGATAATTTACAATTCCATT-3’
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT片段4μl；Pglv片段4μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-up 2μl；下游引物Pglv-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(iv)将步骤(iii)制得的PHT-glv片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-PHT-glv；然后用限制性内切酶Kpn1和BamH1对pTOPO-T-PHT-glv和PHT01进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒Pglv-PHT01；
(v)以恶臭假单胞杆菌基因组为模板，经PCR扩增，制得海藻糖合成酶TreS的核苷酸序列，然后连接至pZERO-Blunt载体上，制得重组质粒pZERO-Blunt-TreS；用限制性内切酶BamHI和AatII对重组质粒pZERO-Blunt-TreS和步骤(iv)制得的重组质粒Pglv-PHT01进行双酶切，用T4连接酶进行连接，制得重组质粒Pglv-PHT01-TreS；
所述PCR引物序列如下：
上游引物TreS-up:5’-CGCGGATCCATGACCCAGCCCGACC-3’
下游引物TreS-down:5’-CCCAAAGACGTCTCAAACATGCCCGCTGC-3’
所述PCR体系为50μl：
2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物TreS-up 2.5μl；下游引物TreS-down 2.5μl；模板2.5μl；ddH2O 17.5μl；
所述PCR程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(vi)以质粒Pglv-PHT01-TreS为模板，分别用上游引物PHT-Pglv-1-up和下游引物PHT-Pglv-1-down、上游引物PHT-Pglv-1-up和下游引物PHT-Pglv-2-down进行PCR扩增，得到片段PHT-Pglv-1片段和PHT-Pglv-2片段；
所述的PCR引物序列如下：
PHT-Pglv-1-up：5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
PHT-Pglv-1-down：5’-CTGTTCATCGCTCATATGACGACCTCCTTGAT-3’
PHT-Pglv-2-down：5’-GTATGCCATATGACGACCTCCTTGAT-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物(10μmol/L)2.5μl，下游引物(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(vii)提取枯草芽孢杆菌subtilis168菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到YwbN片段或PhoD片段；
所述的PCR引物序列如下：
YwbN-up：5’-CAAGGAGGTCGTCATATGAGCGATGAACAGAAAAAGCC-3’
YwbN-down：5’-CGCGGATCCTGGCTTAGCCGCAGTCTGA-3’
或
PhoD-up：5’-TTATCAAGGAGGTCGTCATATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGGG-3’
PhoD-down：5’-CGCGGATCCTACTTCAAAGGCCCCAACCGA-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物(10μmol/L)2.5μl，下游引物(10μmol/L)2.5μl， 模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(viii)将步骤(vi)制得的PHT-Pglv-1片段与步骤(vii)制得的YwbN片段或步骤(vi)制得的PHT-Pglv-2片段与步骤(vii)制得的PhoD片段进行重叠PCR，制得PHT-Pglv-YwbN片段或PHT-Pglv-PhoD片段；
所述的重叠PCR引物序列如下：
PHT-Pglv-1-up：5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
YwbN-down：5’-CGCGGATCCTGGCTTAGCCGCAGTCTGA-3’
或
PHT-Pglv-1-up：5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
PhoD-down：5’-CGCGGATCCTACTTCAAAGGCCCCAACCGA-3’
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT-Pglv-1或PHT-Pglv-2片段4μl；YwbN片段或PhoD片段4μl；2×Taq PCRMasterMix12.5μl；ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-Pglv-1-up 2μl；下游引物YwbN-down或PhoD-down 2μl；2×Taq PCRMasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(ix)将步骤(viii)制得的PHT-Pglv-YwbN片段或PHT-Pglv-PhoD片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-PHT-Pglv-YwbN或pTOPO-T-PHT-Pglv-PhoD；然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对pTOPO-T-PHT-Pglv-YwbN或pTOPO-T-PHT-Pglv-PhoD和Pglv-PHT01-TreS质粒进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒Pglv-PHT01-YwbN-TreS或Pglv-PHT01-PhoD-TreS；
所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的Tat型信号肽片段来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的血红素DyP型的过氧化物酶基因信号肽DNA片段或是磷酸二酯酶基因信号肽DNA片段。
根据本发明优选的，所述步骤(v)中的恶臭假单胞杆菌为恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida KT2440)。
一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法，包括如下步骤：
(1)将上述重组质粒载体转化枯草芽孢杆菌，制得重组枯草芽孢杆菌；
(2)在载体pGJ244的ApaI和EcoRI两个酶切位点之间插入启动子P43片段，在EcoRI和SacI两个酶切位点之间插入GAb片段，制得表达载体pCYL17；
(3)在整合载体pE3的KpnI和ApaI两个酶切位点之间插入GAf片段，在SalI和BamHI两个酶切位点之间插入spec片段，制得整合载体PYG43；
(4)在整合载体PYG43的BamHI和SacI两个酶切位点插入步骤(2)制得的P43-GAb片段，制得整合载体pCYL25；
所述的启动子P43片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，GAf片段核苷酸序列如SEQID NO.6所示，GAb片段核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，spec片段核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；
(5)将步骤(4)制得的整合载体pCYL25转化步骤(1)制得的重组枯草芽孢杆菌，筛选有壮观霉素抗性的克隆，制得麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌。
根据本发明优选的，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168衍生菌株WB800n。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，转化的步骤如下：
将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，氯霉素筛选，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，在载体pGJ244的ApaI和EcoRI两个酶切位点之间插入启动子P43片段的步骤如下：
以枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA为模板，用引物P43-1-up和P43-down PCR扩增P43启动子，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-P43。用ApaI和EcoRI消化pGEMT-P43，回收启动子P43片段，克隆到枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pGJ244中，得到表达载体pGJ288R。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，在EcoRI和SacI两个酶切位点之间插入Gab片段的步骤如下：
提取枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA，以其为模板，用一对引物GlvA-bac-up和GlvA-bac-down，扩增枯草芽孢杆菌基因组中麦芽糖启动子下游500bp的GAb片段，回收GAb片段，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-GAb，用EcoRI和SacI消化pGEMT-GAb，回收GAb片段，克隆到表达载体pGJ288R，得到pCYL17。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，在SalI和BamHI两个酶切位点之间插入spec片段的步骤如下：
以pDG1728为模板，用引物Spec-1-up和Spec-1-down PCR扩增1.1kb的壮观霉素抗性基因spec，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-spec。用BamH1和Sal1消化pGEMT-spec，回收spec基因，克隆到pE3的相应位点，得到pGJ265。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，在KpnI和ApaI两个酶切位点之间插入GAf片段的步骤如下：
提取枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA，以其为模板，用一对引物GlvA-fro-up和GlvA-fro-down，扩增枯草芽孢杆菌基因组中麦芽糖启动子上游500bp的GAf片段，回收GAf片段，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-GAf，用KpnI和ApaI消化pGEMT-GAf，回收GAf片段，克隆到整合载体pGJ265，得到PYG34。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，BamHI和SacI两个酶切位点插入步骤(2)制得的P43-GAb片段的步骤如下：
用BamHI和SacI消化pCYL17，回收P43-GAb片段，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pCYL19，用BamHI和SacI消化pCYL19，回收P43-GAb，将其克隆到pYG34中，构建整合载体pCYL25。
整合载体pCYL25转化重组枯草芽孢杆菌的步骤如下：
将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，壮观霉素筛选，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(5)中，筛选有壮观霉素抗性的克隆的步骤如下：
在含有抗生素平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有壮观霉素的液体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证，将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，得到目的条带。
利用上述制备方法制得的麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌。
麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。
原理说明
本发明为了达到生产出食品安全级的海藻糖合成酶酶制剂，最安全有效便宜的诱导剂是使用麦芽糖诱导剂，将麦芽糖诱导型启动子替换在枯草芽孢杆菌稳定表达的穿梭质粒载体PHT01的启动子，然后将信号肽DNA片段和海藻糖合成酶基因片段克隆到穿梭质粒载体上，这样在宿主细胞中可通过麦芽糖诱导海藻糖合成酶的分泌表达。另外将组成型启动子P43通过双交叉整合的方式替换上述的枯草芽孢杆菌基因组的麦芽糖操纵元的启动子，增强glvA、glvR、glvC基因的表达，这样进一步提高麦芽糖启动子的诱导表达系统。
本发明用到的穿梭质粒载体PHT01购自Mo Bi Tec公司，质粒分别含有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制子，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都能够复制，同时含有次要复制单元，可以在枯草芽孢杆菌中稳定遗传，减少了质粒丢失率。重新构建的整合质粒转化到枯草芽孢杆菌时，通过壮观霉素抗性选择，只有整合到枯草芽孢杆菌染色体的重组菌才能生长，这样就筛选出重组子。壮观霉素抗性基因(spec)来源于美国俄亥俄州立大学杆菌保藏中心(BGSC)提供的pDG1782质粒。
所涉及的引物如下表所示：
本发明的优点是：
1、本发明采用麦芽糖启动子和海藻糖合成酶融合后进行表达的效果显著优于其它诱导型表达的效果；
2、本发明采用的麦芽糖诱导剂与IPTG诱导剂相比，具有无毒的特性，此特点产出的海藻糖合成酶可适用于食品安全级的酶制剂，而与乳糖和木糖诱导剂相比，麦芽糖作价格较便宜，较少了生产成本；
3、麦芽糖作为诱导剂诱导海藻糖合成酶表达，同时又可作为海藻糖合成酶的底物，直接转化为海藻糖，减少了分离纯化的步骤，提高海藻糖合成酶的转化效率；
4、本发明所用的表达载体为PHT01穿梭质粒，含有主要复制功能和次要复制功能，与整合型表达载体来说具有拷贝数高的优点，同时该质粒能够稳定遗传，提高了麦芽糖诱导海藻糖合成酶诱导表达效果；
5、本发明使用Tat型转运信号肽，相对于Sec信号肽来说，该信号肽具有促进海藻糖 合成酶折叠完全功能，并将其转运到胞外，减少了胞外蛋白酶对其产生降解的作用。
附图说明
图1是Pglv-PHT01-YwbN-TreS构建示意图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis)购自杭州宝赛生物有限公司；
穿梭质粒PHT01购自杭州宝赛生物有限公司；
恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida KT2440)来源于美国标准生物品收藏中心(ATCC)，编号ATCC47054；
枯草芽孢杆菌WB800n购自杭州宝赛生物有限公司；
质粒pDG1728来源于美国俄亥俄州立大学杆菌保藏中心。
实施例1
将包含来源于枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)基因组中的麦芽糖操纵元的麦芽糖启动子，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的血红素DyP型的过氧化物酶基因信号肽DNA片段或磷酸二酯酶基因信号肽DNA片段和来源于恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida KT2440)的海藻糖合成酶基因表达元件克隆到穿梭质粒PHT01。
1.构建重组质粒Pglv-PHT01
根据Genbank中注释的麦芽糖启动子Pglv序列，分别针对PHT01质粒和Pglv设计两对引物为：
PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
PHT-down:5’-AGCTCGTCCCGTAACACGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGC-3’
Pglv-up:5’-CACGTGTTACGGGACGAGCTATC-3’
Pglv-down:5’-GGATCCATGACGACCTCCTTGATAATTTACAATTCCATT-3’(其中单下划线为酶切位点，双下划线为通过设计引物对启动子Pglv做了定点突变，由原来的CG变为AT，这样可以缓解葡糖糖代谢物的抑制，有利于麦芽糖启动子的表达。)分别用以上两对引物，分别以PHT01质粒和枯草芽孢杆菌subtilis168菌体为模板进行质粒PCR和菌落PCR扩增。PCR反应体系50μl：2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物(10umol/L)2.5μl，下游引物(10umol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl。PCR反应程序：(1)95℃5min；(2)95℃30sec；(3)51℃30sec；(4)72℃40sec；(5)72℃10min；其中(2)、(3)、(4)共30个循环，-20℃保存。
将两个片段PHT和Pglv连接，通过利用PHT-up和Pglv-down两个引物对PHT片段与Pglv片段进行重叠PCR，PCR连接体系：PHT片段4μl；Pglv片段4μl；2×Taq PCRMasterMix12.5μl；ddH2O 4.5μl。PCR反应程序：(1)95℃5min；(2)94℃30sec；(3)51℃30sec；(4)72℃30sec；(5)72℃2min；(2)、(3)、(4)循环5次，然后在(5)步骤下的72℃下，2min过程中再加入25μl补充体系，上游引物PHT-up 2μl；下游引物Pglv-down 2μl；2×TaqPCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl。PCR反应程序：(1)95℃5min；(2)94℃30sec；(3)51℃30sec；(4)72℃30sec；(5)72℃10min；其中(2)、(3)、(4)为30个循环，-20℃保存。
将PHT-Pglv片段连接到pTOPO-T vector上，通过KpnI和BamHI限制酶同时对pTOPO-T-PHT-glv和PHT01进行双酶切，双酶切后用T4连接酶连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经筛选鉴定重组质粒Pglv-PHT01。
2.构建重组质粒Pglv-PHT01-TreS
通过Genbank中注释的海藻糖合成酶TreS的序列，通过设计一对引物：
上游引物TreS-up:5’-CGCGGATCCATGACCCAGCCCGACC-3’
下游引物TreS-down:5’-CCCAAAGACGTCTCAAACATGCCCGCTGC-3’
将PCR出来的克隆片段连接到pZERO-Blunt载体上，测序后经BLAST比对后完全正确，用BamHI和AatII两个限制酶对pZERO-Blunt-TreS和Pglv-PHT01质粒进行双酶切后，用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒Pglv-PHT01-TreS。
3.构建重组质粒Pglv-PHT01-YwbN-TreS或Pglv-PHT01-PhoD-TreS
将来源于枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis]的血红素DyP型的过氧化物酶基因信号肽DNA片段YwbN构建到重组质粒Pglv-PHT01-TreS，通过重叠PCR的方式将YwbN或PhoD信号肽DNA片段与质粒部分片段连接，然后连接到pTOPO-T vector，通过限制酶将酶切后的产物用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态中，经筛选鉴定获得重组质粒Pglv-PHT01-YwbN-TreS或Pglv-PHT01-PhoD-TreS。
4.将重组的穿梭质粒Pglv-PHT01-YwbN-TreS在枯草芽孢杆菌WB800n中的转化
挑取枯草芽孢杆菌WB800n单菌落接种于TBY培养基(胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％)，37℃培养箱培养过夜。用100mL LBSP培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 1g/L、葡萄糖250mmol/L、K2HPO4/KH2PO4 50mmol/L，PH7.2)稀释2mL的过夜培养物，37℃、220rpm培养至OD值为1.0；置菌液于冰上冰浴10min；在4℃条件下用遇冷的离心管10000rpm离心5min以富集细胞；用100mL冰浴的SHMG(蔗糖250mmol、Hepes 1mmol、MgCl20.5mmol、甘油10％)洗富集的细胞三次，最后溶于3mL冰浴过的SHMG；按每份100μl分装感受态细胞，贮存于-80℃。取一管感受态细胞迅速置于37℃水 中至溶化；取1～10uL溶有0.01～1μl DNA的SHMG加入感受态细胞中，充分混匀；将混合物加入预冷的2mm电转化杯中，放在冰上冰浴30min；在2500V、25uF条件下转化；电击完毕后迅速用10倍的LBSPG(LBSP+10％甘油)稀释，置于摇床中37℃、220prm培养1h；取150uL涂到TBY琼脂板上(含有氯霉素抗性)过夜培养，筛选出氯霉素抗性的转化子即枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB800n(Pglv-PHT01-YwbN-TreS或Pglv-PHT01-PhoD-TreS)。
实施例2
来源于来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43启动子，来源于质粒pDG1728的壮观霉素抗性基因以及麦芽糖启动子两端的同源臂整合到pE3相应位点得到整合质粒pCYL25。
1.构建整合质粒pCYL25
提取枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA，以其为模板，用2组引物[GlvA-fro-up和GlvA-fro-down及GlvA-bac-up和GlvA-bac-down]，分别扩增枯草芽孢杆菌基因组中麦芽糖启动子上游500bp的GAf片段和下游500bp的GAb片段。回收GAf和GAb片段，将其分别克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-GAf和pGEMT-GAb。
以枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA为模板，用引物P43-1-up和P43-down PCR扩增P43启动子，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-P43。用ApaI和EcoRI消化pGEMT-P43，回收启动子P43片段，克隆到枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pGJ244中，得到表达载体pGJ288R。用EcoRI和SacI消化pGEMT-GAb，回收GAb，克隆到pGJ288R中，构建GAb的表达载体pCYL17。
以枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA为模板，用引物P43-2-up和GlvA-bac-downPCR扩增800bp的P43-GAb表达盒，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到PCYL19。
以pDG1728为模板，用引物Spec-1-up和Spec-1-down PCR扩增1.1kb的壮观霉素抗性基因spec，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-spec。用BamHI和SalI消化pGEMT-spec，回收spec基因，克隆到pE3的相应位点，得到pGJ265。用KpnI和ApaI消化pGEMT-GAf，回收GAf，将其克隆到pGJ265的相应位点，得到pYG34。用BamHI和SacI消化pCYL19，回收P43-GAb表达盒，将其克隆到pYG34中，构建整合载体pCYL25。
2.优化表达宿主B.subtilis WB800n含有[Pglv-PHT01-YwbN-TreS或Pglv-PHT01-PhoD-TreS质粒]的构建利用SacI线性化整合载体pCYL25，电转化枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800n[含有Pglv-PHT01-YwbN-TreS质粒]，挑选有壮观霉素抗性的克隆，得到重组子B.subtilis WB800n[含有Pglv-PHT01-YwbN-TreS或Pglv-PHT01-PhoD-TreS质粒及基因组麦芽糖操纵元启动子为P43]。
实施例3
海藻糖合成酶的生产，操作步骤如下：
1)一级种的制备：从含新氯霉素20ug/mL的LB平板上接上述枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在3mL LB液体培养基37℃、200rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；
2)二级种的制备：一级种接种于含新氯霉素20ug/mL的800mL LB液体培养基，于37℃、200rpm培养至OD600为0.8-1.0之间(约4-5小时)；
3)三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控制pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20-30％,培养至OD600为0.8-1.0之间(约4-5小时)；
4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36-37℃，通风搅拌，溶氧控制在20-30％，以柠檬酸、NaOH控PH6-8，当培24-26小时，10000g离心除菌，用截留分子量5000-10000超滤膜浓缩上清液后，即得海藻糖合成酶浓缩原液。
5)主要通过以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，通过常规酶法转化生产海藻糖的方法利用上述重组海藻糖合成酶的浓缩溶液制造海藻糖，其次可以将浓缩出来的滤液中已经转化出来的海藻糖分离纯化回收。
海藻糖合成酶酶活的测定按如下方法进行。取1mL适当稀释的酶液+1mL 60％麦芽糖底物(用50mM pH6.5磷酸缓冲液配制)，混匀后在37℃反应30min，反应液10000rpm离心3min取上清，用按还原糖测定方法(3,5-二硝基水杨酸比色法)测定还原糖含量。对照则取1ml 60％+1ml 50mM pH6.5磷酸缓冲液，37℃反应30min，10000rpm离心3min取上清，同上方法测定还原糖含量。
活力单位(U)定义为1ml酶液在pH6.5,37℃条件下，每分钟转化1ug麦芽糖为非还原糖为一个海藻糖合成酶活力单位。计算方法如下：U(μg/ml.min)＝(V1×M×(OD1-OD2)/OD1)/(T×V2)＝(1ml×100mg/ml×(OD1-OD2)/OD1×1000)/(30min×1ml)
(V1：底物体积(ml)，V2：参加反应的酶液体积(ml)，M：底物溶度(mg/ml)，OD1：对照样测还原糖时的吸光值，OD2：样品测还原糖的吸光值，1000：mg转化成μg的系数，T：酶反应时间(min))。
经测定，发酵原液离心后，各枯草芽孢杆菌基因工程菌株发酵表达的最高酶活(包括发酵液中已经转化完的海藻糖部分)见表1：
表1
实施例4
海藻糖的制备
1、麦芽糖浆转化为海藻糖
取100L含30mg/ml麦芽糖的溶液，用磷酸缓冲液调节pH为6.9(缓冲液的终溶度为5mM)。加入10L 1000U的WB800[P43+Pglv-PHT01-YwbN-TreS]菌株表达的酶液，在50℃条件下反应32小时。用高效液相色谱仪测定可知反应32小时后反应液的海藻糖的含量为20.4mg/ml，麦芽糖为6.6mg/ml，葡糖糖为2.8mg/ml。总的麦芽糖转化为海藻糖的转化率为：20.4×1.1/30＝74.8％(不包含发酵液中麦芽糖转化为海藻糖的量)。
2、木薯淀粉转化为海藻糖
首先将木薯淀粉经α-淀粉酶液化再由β-淀粉酶处理后生成麦芽糖，然后将获得的麦芽糖用如上所述的方法转化为海藻糖。实验证明100公斤淀粉可以得到约55公斤海藻糖。
3、分离纯化浓缩出来的滤液得海藻糖
将发酵液进行浓缩后，其滤液还有已经转化得到的海藻糖，通过分离转化将其直接纯化得海藻糖。实验证明发酵液中的海藻糖含量为1.5mg/mL。
对比例1
在申请本技术方案之前，本发明人将海藻糖合成酶通过被构建到穿梭质粒pHT43，该质粒含有AmyQ信号肽(一种胞外α淀粉酶的信号肽序列，典型的Sec型信号肽)，通过用IPTG作为诱导剂诱导其表达，成功实现了其在枯草芽孢杆菌中的胞内表达，单位菌体胞内酶活达到了1400±48U/g，同时使用带有AmyQ信号肽的质粒时，海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌不能实现分泌表达，但在胞内可以进行较好表达，其表达效果远弱于在大肠杆菌中的表达。
然而本申请的技术方案可以解决上述问题，通过采用带有Tat型信号肽(YwbN信号肽或PhoD信号肽)能够将完全折叠的海藻糖合成酶引导分泌到胞外，解决了Sec型信号肽引导的未完全折叠的海藻糖合成酶在胞外容易被胞外其它蛋白酶降解的问题，有利于减缓胞外其它蛋白酶对成熟的海藻糖合成酶的分解，从而促使海藻糖合成酶在胞外的表达量大大提升，其转化率达74.8％。IPTG具有毒性，其作为诱导剂，诱导产生的海藻糖合成酶达不到食品与医疗等行业安全级别的酶制剂。然而本技术方案所采用的诱导剂是没有毒性、价格较便宜的麦芽糖，其作为诱导剂，不仅可以解决酶制剂在食品与医疗行业的安全问题，而且诱导剂也可以作为海藻糖合成酶的底物，直接将其转化为海藻糖，提高了海藻糖转化效率，发酵液中的胞外海藻糖含量达到1.5mg/mL，减少了下游技术以及成本问题。
对比例2
在2013年黄日波的发明专利《以整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法》中，该发明人通过将组成型启动子P43基因、β-淀粉酶信号肽基因和海藻糖合 成酶基因构建到整合质粒上，最后转化整合到枯草芽孢杆菌WB600或WB800基因组中。伴随着基因组的转录翻译，P43强启动子持续的启动表达，使β-淀粉酶信号肽基因和海藻糖合成酶基因海分泌到胞外，结果显示，总的麦芽糖转化为海藻糖的转化率达63.1％。
然而Yang(Ming-Ming,Y,2006)等研究证明，诱导型的Pglv启动子的强度大于组成型的启动子P43。Pglv启动子在某些物理和化学的信号的刺激下，可以大幅度提高这类启动子所驱动的目的基因的转录水平，而组成型启动子启动则以恒定的水平驱动目的基因的转录。本申请的技术方案所用的启动子正是采用麦芽糖启动子，将其构建到穿梭质粒PHT01上，转化到枯草芽孢杆菌WB800n，该质粒不仅在枯草芽孢杆菌中能够稳定的遗传，而且与基因组拷贝比较来说，其具有拷贝数高的特点。因此麦芽糖启动子在麦芽糖诱导下能够大幅度的驱动目的基因的转录，使产生的海藻糖合成酶分泌到胞外，其麦芽糖转化为海藻糖的转化率高达74.8％，另外产生的海藻糖合成酶可以直接将诱导物麦芽糖作为底物转化为海藻糖(发酵液中的胞外海藻糖含量达到1.5mg/mL)。因此，相比较整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶来说，采用麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌产海藻糖合酶显得更加有优势。参考文献：Ming-Ming,Y,Wei-Wei,Z,Xi-Feng,Z,and Pei-Lin,C.(2006).Constructionand characterization of a novel maltose inducible expression vector inBacillus subtilis。
Claims (9)
1.一种重组质粒载体，其特征在于，在PHT01质粒的BamHI酶切位点前插入麦芽糖诱导启动子替换PHT01质粒上的Pgrac启动子，在BamHI酶切位点前插入Tat型信号肽的表达基因，在BamHI酶切位点后插入海藻糖合成酶的表达基因；
所述的麦芽糖诱导启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Tat型信号肽的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示、海藻糖合成酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种麦芽糖诱导型海藻糖合酶合成工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求1所述重组质粒载体转化枯草芽孢杆菌，制得重组枯草芽孢杆菌；
（2）在载体pGJ244的ApaI和EcoRI两个酶切位点之间插入启动子P43片段，在EcoRI和SacI两个酶切位点之间插入GAb片段，制得表达载体pCYL17；
所述在载体pGJ244的ApaI和EcoRI两个酶切位点之间插入启动子P43片段的步骤如下：
以枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA为模板，用引物P43-1-up和P43-down PCR扩增P43启动子，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-P43；
P43-1-up：TTGGGCCCTCAGCATTATTGAGTG
P43-down：GCGGAATTCATTCCTCTCTTACCTATAATG；
用ApaI和EcoRI消化pGEMT-P43，回收启动子P43片段，克隆到枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pGJ244中，得到表达载体pGJ288R；
所述在EcoRI和SacI两个酶切位点之间插入Gab片段的步骤如下：
提取枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA，以其为模板，用一对引物GlvA-bac-up和GlvA-bac-down，扩增枯草芽孢杆菌基因组中麦芽糖启动子下游500bp的GAb片段，回收GAb片段，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-GAb，用EcoRI和SacI消化pGEMT-GAb，回收GAb片段，克隆到表达载体pGJ288R，得到pCYL17；
GlvA-bac-up：GCGGAATTCATGAAGAAAAAATCATTCTC
GlvA-bac-down：TTGAGCTCGGAATAATTGAGCATCC；
（3）在整合载体pE3的KpnI和ApaI两个酶切位点之间插入GAf片段，在SalI和BamHI两个酶切位点之间插入spec片段，制得整合载体PYG43；
所述在SalI和BamHI两个酶切位点之间插入spec片段的步骤如下：
以pDG1728为模板，用引物Spec-1-up和Spec-1-down PCR扩增1.1kb的壮观霉素抗性基因spec，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-spec；用BamH1和Sal1消化pGEMT-spec，回收spec基因，克隆到pE3的相应位点，得到pGJ265；
Spec-1-up：TTGGATCCGAATGGCGATTTTC
Spec-1-down：GGCGTCGACTTGAAAAAAGTGTTTC；
（4）在整合载体PYG43的BamHI和SacI两个酶切位点插入步骤（2）制得的P43-GAb片段，制得整合载体pCYL25；
所述的启动子P43片段核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，GAf片段核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，GAb片段核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，spec片段核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
（5）将步骤（4）制得的整合载体pCYL25转化步骤（1）制得的重组枯草芽孢杆菌，筛选有壮观霉素抗性的克隆，制得麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168衍生菌株WB800n。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，转化的步骤如下：
将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，氯霉素筛选，即得。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，在KpnI和ApaI两个酶切位点之间插入GAf片段的步骤如下：
提取枯草芽孢杆菌WB800n的基因组DNA，以其为模板，用一对引物GlvA-fro-up和GlvA-fro-down，扩增枯草芽孢杆菌基因组中麦芽糖启动子上游500bp的GAf片段，回收GAf片段，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pGEMT-GAf，用KpnI和ApaI消化pGEMT-GAf，回收GAf片段，克隆到整合载体pGJ265，得到PYG43；
GlvA-fro-up：TTGGTACCGTTTCCTGACACACCGTTC
GlvA-fro-down：TTGGGCCCTGAATTTTAAGTGAATATACGC。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，BamHI和SacI两个酶切位点插入步骤（2）制得的P43-GAb片段的步骤如下：
用BamHI和SacI消化pCYL17，回收P43-GAb片段，将其克隆到pGEMT-Vector中，得到pCYL19，用BamHI和SacI消化pCYL19，回收P43-GAb，将其克隆到PYG43中，构建整合载体pCYL25。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，整合载体pCYL25转化重组枯草芽孢杆菌的步骤如下：
将感受态细胞在2500V、25uF的电击条件下转化，壮观霉素筛选，即得。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，筛选有壮观霉素抗性的克隆的步骤如下：
在含有抗生素平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有壮观霉素的液体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证，将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，得到目的条带。
9.权利要求2制备的麦芽糖诱导型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。
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Effective date of registration: 20220718 Address after: 265300 Suzhou Road West, Taocun Town Industrial Park, Qixia City, Yantai City, Shandong Province Patentee after: Shandong KaiDun Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 250353 University Road, Changqing District, Ji'nan, Shandong Province, No. 3501 Patentee before: Qilu University of Technology |
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