CN105039374B - 一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用 - Google Patents
一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用。该淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌含有重组载体，重组载体为在PHT43质粒的BamHI酶切位点前通过连续三次重叠PCR方式将Pgrac启动子替换成α‑淀粉酶启动子PamyQ，然后在BamHI酶切位点后插入麦芽寡糖基海藻糖合成酶‑麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因。本发明所用的α‑淀粉酶启动子和淀粉酶信号肽与表达基因麦芽寡糖基海藻糖合成酶‑麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因结合时，淀粉诱导其表达效果优于其它诱导型表达效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用，特别涉及一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶及制造海藻糖的方法，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
海藻糖是一种普遍存在的非还原性双糖，由葡萄糖通过α-1,1糖苷键连接，其中α,α-1,1-海藻糖目前已被分离，并被发现广泛存在于植物、动物及微生物中。天然的海藻糖对生物体或生物大分子具有较好的且非特异性的保护作用，可以使得具备海藻糖的生物体能够度过饥饿、干燥、低温、高温、辐射等恶劣环境。随着对海藻糖认知程度的增加，海藻糖在各方面的应用不断得到拓展，在医药、食品、农业等领域得到广泛推广。
目前海藻糖的生产工艺主要有三种：
(1)提取法
提取法主要通过培养海藻糖含量较高天然生物来获取，目前主要的提取对象为酵母(海藻糖含量约占酵母干重的15％)，但由于海藻糖属于酵母内容物，提取时需要进行复制的破壁及分离提取工艺，因此目前逐渐被酶法制备海藻糖法取代。
(2)单酶法
单酶法在1995年由日本Nishimoto等人首次提出，即采用海藻糖合酶转化麦芽糖生产海藻糖的工艺。海藻糖合酶能够将α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，该转化反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质，但该方法所采用的酶热稳定性一般较低，且转化率多为60％左右，另外由于该酶同时具有轻微的水解活性，因此单酶法转化过程中还会产生少量副产物的葡萄糖。
(3)双酶法
双酶法在1991年由Lama等人首次报道，即采用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)两种酶利用淀粉为底物生产海藻糖的方法。该方法中第一种酶用来催化聚合度(DP)大于3的麦芽糊精，转化其还原端的α-1,4连接键生成α-1,1连接键。第二种酶专一性催化水解α-1,4键生成的α-1,1键海藻糖和低分子量的麦芽低聚糖。目前双酶法多数以还原性淀粉为原料，转化率多为70-80％左右，因此较单酶法相比更为经济，除能够生产海藻糖之外，还可以同时产生具有较高附加值的麦芽三糖，因此该工艺路线已被用于工业化生产。
虽然双酶法具有以上诸多优点，但依然存在不足之处：双酶法转化所用两种酶需要分别进行发酵及纯化才能获取，因此酶的生产成本明显高于单酶法。
枯草芽孢杆菌启动子是实现基因高效表达的关键元件之一。近年来，在启动子的研究方面开展了大量的工作并取得了长足的进展，克隆获得了一批可以应用于枯草芽孢杆菌的启动子。但是，枯草芽孢杆菌的现有启动子在数量、表达量和调控方式等方面存在着诸多问题。需要进一步研究和完善，获得更多表达强度高，诱导调控方便的启动子元件。
对于来自于解淀粉芽孢杆菌的PamyQ启动子来说，用淀粉诱导目的蛋白产生，该淀粉诱导物即能够诱导目的蛋白产生，反过来得到的目的蛋白酶以淀粉为底物直接转化为海藻糖，增加了海藻糖合成的转化率，对于制造海藻糖来说具有重要意义。同时PamyQ系统的诱导物淀粉相对于IPTG和木糖来说，价格便宜，成本低，且对细菌本身无毒性，因此在工业上很有实用价值。
发明内容
本发明主要针对现有技术的不足，提供一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种重组载体，其特征在于，在PHT43质粒的BamHI酶切位点前通过连续三次重叠PCR方式将Pgrac启动子替换成α-淀粉酶启动子PamyQ，然后在BamHI酶切位点后插入麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；
所述的α-淀粉酶启动子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述重组质粒载体的制备方法，步骤如下：
(i)以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段；
所述的PCR引物序列如下：
PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
PHT-down:5’-CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，引物PHT-up(10μmol/L)2.5μl，引物PHT-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(ii)提取B.amyloliquefaciens菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到PamyQ片段；
所述的PCR引物序列如下:
PamyQ-up:5’-TTTTATCTTATCACGCCCCGCACATACGAA-3’
PamyQ-down:5’-TTCCTCCTTTAATTGGGAAGCACAAGTCTGAACGAAA-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，引物PamyQ-up(10μmol/L)2.5μl，引物PamyQ-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(iii)以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到SamyQ片段；
所述的PCR引物序列如下:
SamyQ-up:5’-GTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGG-3’
SamyQ-down:5’-GGATCCTACGGCTGATGTTTTTGT-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，引物SamyQ-up(10μmol/L)2.5μl，引物SamyQ-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(iv)将步骤(i)制得的PHT片段与步骤(ii)制得的PamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT片段4μl；PamyQ片段4μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-up 2μl；下游引物PamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(v)将步骤(ii)制得的PamyQ片段与步骤(iii)制得的SamyQ片段进行重叠PCR，制得PamyQ-SamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PamyQ片段4μl；SamyQ片段4μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PamyQ-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(vi)将步骤(iv)制得的PHT-PamyQ片段与步骤(v)制得的PamyQ-SamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ-SamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT-PamyQ片段4μl；PamyQ-SamyQ片段4μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(vii)将步骤(vi)制得的PHT-PamyQ-SamyQ片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ；然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ和PHT43进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43；
(viii)以Arthrobacter sp.L77基因组DNA为模板，分别设计引物F1和R1(扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶TreY)、F2和R2(扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶TreZ)；
F1:5’-GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3’
R1 5’-CCTCGGGGGTGAACGTGC-3’
F2:5’-ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3’
R2:5’-GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3’
以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR过程获得产物TreY；
所述PCR体系为50μl：
2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板2.5μl；ddH2O17.5μl；
所述PCR程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(ix)以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR过程获得产物TreZ；
所述PCR体系为50μl：
2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板2.5μl；ddH2O17.5μl；
所述PCR程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(x)将获得的产物1和产物2通过重叠PCR方法实现两基因间的拼接,得到产物TreY-TreZ；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物F1 2μl；下游引物R2 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(xi)将TreY-TreZ基因片段连接至pZERO-Blunt载体上，制得重组质粒pZERO-TreY-TreZ；用限制性内切酶BamHI和AatII对重组质粒pZERO-TreY-TreZ和步骤(vii)制得的重组质粒PamyQ-PHT43进行双酶切，用T4连接酶进行连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ。
一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将上述重组质粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ转化枯草芽孢杆菌获得。
根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB800n。枯草芽孢杆菌WB800n来源于杭州宝赛生物有限公司；
上述淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌的制备方法，步骤如下：
将感受态细胞在2500V、25uF的条件下电击转化(电击结果：时间常数＝4.5～5.0ms,如果时间常数<4.2，则需要增加电转培养基的漂洗次数或者提高感受态的稀释倍数来获得更高的转化效率)，氯霉素筛选，即得。
根据本发明优选的，所述氯霉素筛选步骤如下：
在含有氯霉素抗生素的平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有氯霉素的液体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有氯霉素抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证，将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，含有目的条带的，即得；
含有氯霉素的液体LB培养基，每升组分如下：
10g蛋白胨、10g NaCl、5g酵母浸粉、5mg氯霉素。
淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。
原理说明
本发明通过用淀粉作为诱导剂诱导α-淀粉酶启动子的启动，促使表达基因麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因的翻译表达，所表达的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶达到了食品安全级别，同时麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶可以直接将价格便宜的诱导剂淀粉作为底物，逐步转化为海藻糖。
本发明通过将来源于解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)基因组中的α-淀粉酶启动子替换穿梭质粒PHT43上的Pgrac启动子，然后将来源于噬尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合，然后构建到穿梭质粒PHT43的淀粉酶信号肽SamyQ的后面，最后通过淀粉的诱导表达将麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶分泌到胞外。在胞外可以通过浓缩发酵液，将其制取的酶液用于转化淀粉底物为海藻糖，同时在发酵液中直接分离已经以诱导物淀粉为底物转化完的海藻糖。
本发明的优点：
1、本发明所用的α-淀粉酶启动子和淀粉酶信号肽与表达基因麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因结合时，淀粉诱导其表达效果优于其它诱导型表达效果。
2、该发明在制备海藻糖方法中，首次采用淀粉作为诱导剂，较其它诱导剂来说，价格便宜，制取成本低，应用广泛，没有毒性，是发酵产品最佳的诱导剂。
3、该发明通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合表达，海藻糖制备单酶法转化率为60％左右，而双酶法多数以还原性淀粉为原料，转化率多为70-80％左右，因此较单酶法相比更为经济。
4、麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶可以直接以诱导物淀粉作为底物，在发酵液中直接转化为海藻糖以及麦芽三糖等产品，同时减少了下游技术以及成本。
5、该发明所表达的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶可以作为食品安全级的酶制剂。在食品和医疗等行业能够广泛的应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
穿梭质粒PHT43购自杭州宝赛生物有限公司；
枯草芽孢杆菌WB800n购自杭州宝赛生物有限公司；
噬尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；
解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)购自湖北启明生物工程有限公司；
实施例1
将来源于解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)的α-淀粉酶启动子PamyQ构建到穿梭质粒PHT43，替换原来的Pgrac启动子；
步骤如下：
(i)以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段；
所述的PCR引物序列如下：
PHT-up:5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
PHT-down:5’-CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，引物PHT-up(10μmol/L)2.5μl，引物PHT-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(ii)提取B.amyloliquefaciens菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到PamyQ片段；
所述的PCR引物序列如下:
PamyQ-up:5’-TTTTATCTTATCACGCCCCGCACATACGAA-3’
PamyQ-down:5’-TTCCTCCTTTAATTGGGAAGCACAAGTCTGAACGAAA-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，引物PamyQ-up(10μmol/L)2.5μl，引物PamyQ-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(iii)以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到SamyQ片段；
所述的PCR引物序列如下:
SamyQ-up:5’-GTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGG-3’
SamyQ-down:5’-GGATCCTACGGCTGATGTTTTTGT-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，引物SamyQ-up(10μmol/L)2.5μl，引物SamyQ-down(10μmol/L)2.5μl，模板2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(iv)将步骤(i)制得的PHT片段与步骤(ii)制得的PamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT片段4μl；PamyQ片段4μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-up 2μl；下游引物PamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(v)将步骤(ii)制得的PamyQ片段与步骤(iii)制得的SamyQ片段进行重叠PCR，制得PamyQ-SamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PamyQ片段4μl；SamyQ片段4μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PamyQ-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(vi)将步骤(iv)制得的PHT-PamyQ片段与步骤(v)制得的PamyQ-SamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ-SamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT-PamyQ片段4μl；PamyQ-SamyQ片段4μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(vii)将步骤(vi)制得的PHT-PamyQ-SamyQ片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ；然后用限制性内切酶Kpn1和BamH1对pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ和PHT43进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43；
实施例2
将来源于噬尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因融合，将融合表达基因构建到穿梭质粒PHT43。
(viii)以Arthrobacter sp.L77基因组DNA为模板，分别设计引物F1和R1(扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶TreY)、F2和R2(扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶TreZ)；
F1:5’-GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3’
R1 5’-CCTCGGGGGTGAACGTGC-3’
F2:5’-ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3’
R2:5’-GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3’
以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR过程获得产物TreY；
所述PCR体系为50μl：
2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板2.5μl；ddH2O17.5μl；
所述PCR程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(ix)以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR过程获得产物TreZ；
所述PCR体系为50μl：
2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板2.5μl；ddH2O17.5μl；
所述PCR程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(x)将获得的产物1和产物2通过重叠PCR方法实现两基因间的拼接,得到产物TreY-TreZ；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物F1 2μl；下游引物R2 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
(xi)将TreY-TreZ基因片段连接至pZERO-Blunt载体上，制得重组质粒pZERO-TreY-TreZ；用限制性内切酶BamHI和AatII对重组质粒pZERO-TreY-TreZ和步骤(vii)制得的重组质粒PamyQ-PHT43进行双酶切，用T4连接酶进行连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ。
制得的重组质粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ，在PHT43质粒的BamHI酶切位点前将Pgrac启动子替换为α-淀粉酶启动子PamyQ，在BamHI酶切位点后插入麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；
所述的α-淀粉酶启动子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例3
将重组的穿梭质粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ在枯草芽孢杆菌WB800n中的转化；
挑取枯草芽孢杆菌WB800n单菌落接种于TBY培养基(胰蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％)，37℃培养箱培养过夜。
用100mL LBSP培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 1g/L、葡萄糖250mmol/L、K2HPO4/KH2PO4 50mmol/L，PH7.2)稀释2mL的过夜培养物，37℃、220rpm培养至OD值为1.0；置菌液于冰上冰浴10min；在4℃条件下用遇冷的离心管10000rpm离心5min以富集细胞；
用100mL冰浴的SHMG(蔗糖250mmol、Hepes 1mmol、MgCl2 0.5mmol、甘油10％)洗富集的细胞三次，最后溶于3mL冰浴过的SHMG；按每份100μl分装感受态细胞，贮存于-80℃。
取一管感受态细胞迅速置于37℃水中至溶化；取1～10μL溶有0.01～1μl DNA的SHMG加入感受态细胞中，充分混匀；将混合物加入预冷的2mm电转化杯中，放在冰上冰浴30min；在2500V、25μF条件下转化；电击一次完毕后迅速用10倍的LBSPG(LBSP+10％甘油)稀释，置于摇床中37℃、220prm培养1h；取150μL涂到TBY琼脂板上(含有氯霉素抗性)过夜培养，筛选出氯霉素抗性的转化子即枯草芽孢杆菌基因工程菌株WB800n(PamyQ-PHT43-TreY-TreZ)，即淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌。
实施例4
重组融合酶的表达、纯化及性质测定：
取实施例3制得的淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌，用2％淀粉诱导培养基培养24h后，离心收集发酵上清液，分别采用盐析、透析、离子交换和凝胶过滤进行纯化，对重组融合酶的酶学性质进行测定。
所述2％淀粉诱导培养基，每升组分如下：
10g蛋白胨、10gNaCl、5g酵母浸粉、20g淀粉浆；
结果表明所获融合酶能够同时展示出麦芽寡糖基海藻糖合成酶(比酶活：174.8U/mg)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(比酶活：183.3U/mg)两种酶的活性，且融合酶的酶学性质与融合之前的两种酶相似(最适pH值均在5.5左右，最适温度均为50℃)，以500U/L的添加量在50℃下转化20％的淀粉乳液20小时所得的海藻糖转化率可达86％，到达相同转化率时间较双酶法相比节约了近4.3小时。测定原发酵液中诱导出的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶对诱导剂淀粉乳液酶解之后的存在于发酵液中的海藻糖生成含量为2.4mg/mL。
Claims (7)
1.一种重组载体，其特征在于，在PHT43质粒的BamHI酶切位点前通过连续三次重叠PCR方式将Pgrac启动子替换成α-淀粉酶启动子PamyQ，然后在BamHI酶切位点后插入麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶基因；
所述的α-淀粉酶启动子PamyQ核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述重组质粒载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（i）以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到PHT片段；
所述的PCR引物序列如下：
PHT-up: 5’-ACTCAAACATCAAATCTTACAAA-3’
PHT-down:5’-CTTTTCGTATGTGCGGGGCGTGATAAGATAAAAAATTTTTCACGCTTACATCAT-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物PHT-up 2.5μl，10μmol/L引物PHT-down2.5μl，模板 2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（ii）提取 B. amyloliquefaciens菌体的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到PamyQ片段；
所述的PCR引物序列如下:
PamyQ-up: 5’-TTTTATCTTATCACGCCCCGCACATACGAA-3’
PamyQ-down:5’-TTCCTCCTTTAATTGGGAAGCACAAGTCTGAACGAAA-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物PamyQ-up 2.5μl，10μmol/L引物PamyQ-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（iii）以穿梭质粒PHT43为模板，进行PCR扩增，得到SamyQ片段；
所述的PCR引物序列如下:
SamyQ-up:5’-GTGAGCGGATAACAATTCCCAATTAAAGGAGGAAGG-3’
SamyQ-down:5’-GGATCCTACGGCTGATGTTTTTGT-3’
所述的PCR扩增体系为50μl：
2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L引物SamyQ-up 2.5μl，10μmol/L引物SamyQ-down 2.5μl，模板 2.5μl，用ddH2O补足50μl；
所述的PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（iv）将步骤（i）制得的PHT片段与步骤（ii）制得的PamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT片段4μl； PamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-up 2μl；下游引物PamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（v）将步骤（ii）制得的PamyQ片段与步骤（iii）制得的SamyQ片段进行重叠PCR，制得PamyQ-SamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PamyQ片段4μl；SamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH2O 4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PamyQ-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸40sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（vi）将步骤（iv）制得的PHT-PamyQ片段与步骤（v）制得的PamyQ-SamyQ片段进行重叠PCR，制得PHT-PamyQ-SamyQ片段；
所述的重叠PCR的初次扩增体系为25μl：
PHT-PamyQ片段4μl；PamyQ-SamyQ片段4μl； 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl； ddH2O4.5μl；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸30sec，5个循环；72℃延伸2min；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物PHT-up 2μl；下游引物SamyQ-down 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（vii）将步骤（vi）制得的PHT-PamyQ-SamyQ片段连接到pTOPO-T vector上，制得pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ；然后用限制性内切酶KpnI和BamHI对pTOPO-T-PHT-PamyQ-SamyQ和PHT43进行双酶切，然后采用T4连接酶连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43；
（viii）以Arthrobacter sp.L77基因组DNA为模板，分别设计扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶TreY的引物F1和R1、扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶TreZ 的引物F2和R2；
F1: 5’-GGATCCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC-3’
R1 5’-CCTCGGGGGTGAACGTGC-3’
F2: 5’-ATGAGTTCGCCATTCGAGGT-3’
R2: 5’-GACGTCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG-3’
以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F1和R1为引物，通过PCR过程获得产物TreY；
所述PCR体系为50μl：
2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板 2.5μl；ddH2O17.5μl；
所述PCR程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（ix）以Arthrobacter sp.L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR过程获得产物TreZ;
所述PCR体系为50μl：
2×HiFi-PCR master 25μl；上游引物F1 2.5μl；下游引物R1 2.5μl；模板 2.5μl；ddH2O17.5μl；
所述PCR程序如下：
95℃变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（x）将获得的产物1和产物2通过重叠PCR方法实现两基因间的拼接，得到产物TreY-TreZ；
所述的重叠PCR的初次扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸2.5min，5个循环；
所述的重叠PCR的补充扩增体系为25μl：
上游引物F1 2μl；下游引物R2 2μl；2×Taq PCR MasterMix 12.5μl；ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；
（xi）将TreY-TreZ基因片段连接至pZERO-Blunt载体上，制得重组质粒pZERO-TreY-TreZ；用限制性内切酶BamHI和AatII对重组质粒pZERO-TreY-TreZ和步骤（vii）制得的重组质粒PamyQ-PHT43进行双酶切，用T4连接酶进行连接，制得重组质粒PamyQ-PHT43-TreY-TreZ。
3.一种淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将权利要求1所述重组载体转化枯草芽孢杆菌获得。
4.如权利要求3所述的淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，将权利要求1所述重组载体转化枯草芽孢杆菌WB800n。
5.权利要求3所述淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将权利要求1所述的重组载体在2500V、25uF的条件下电击转化枯草芽孢杆菌WB800n的感受态细胞，氯霉素筛选，即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氯霉素筛选步骤如下：
在含有氯霉素抗生素的平板上进行白斑筛选，挑取白色单一斑点，接种到含有氯霉素的液体LB培养基，培养至对数末期，对能在含有氯霉素抗生素的LB培养基上生长的菌液进行PCR验证，将能够扩增出目的条带的转化子进行提取质粒，对提取的质粒进行酶切验证，含有目的条带的，即得；
含有氯霉素的液体LB培养基，每升组分如下：
10g 蛋白胨、10g NaCl、5g酵母浸粉、5mg氯霉素。
7.权利要求3所述的淀粉诱导型重组枯草芽孢杆菌在制备海藻糖合成酶中的应用。
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