CN109679887A - 一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法 - Google Patents

一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法，本发明首次通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC后，构建获得重组工程菌pHT01‑P43‑PhoD‑MTSase‑MTHase(LM1234)，并采用了特殊序列的刚性连接，从而实现了目标酶的功能表达；通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。

Description

一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的 方法
技术领域
本发明涉及一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose)是由两个吡喃环葡萄糖以1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性二糖。
海藻糖广泛存在于自然界中，具有保湿性，抗冻抗干燥性，热酸稳定性等特殊的生物学功能，对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。
酶转化法生产海藻糖是上世纪90年代逐渐兴起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。当前以麦芽糊精为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因工程菌、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。以该方法生产海藻糖的转化率高达80％以上，在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推动了海藻糖的工业化生产进程。
中国专利文献CN103215300A(申请号201310174692.7)公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并将此酶用于生产海藻糖的方法。具体是将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产海藻糖合成酶。经过简单分离，发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造。虽然该技术中的海藻糖合酶可以分泌到胞外，但仍然无法实现耦合发酵生产海藻糖。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法。
本发明技术方案如下：
一种高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：
(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC分别转化B.subtilisWB800n感受态细胞，制得重组菌B.subtilis(LM1234)；
(2)分别PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，然后通过重叠PCR连接启动子P43、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase之间通过特殊序列的刚性连接肽连接，构建重组质粒pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase；然后转化步骤(1)制得的重组菌B.subtilis(LM1234)，即得；
所述特殊序列的刚性连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，敲除载体为载体pMAD；进一步优选的，所述的连接为将基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC与敲除载体pMAD分别用限制性内切酶BamHI/EcoRI酶切后，酶切产物经T4连接酶连接，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，转化条件为：电压2000V的条件下转化5ms。
转化后，采用常规筛选步骤：涂布于含40μg/mL X-gal和30μg/mL红霉素抗性的LB平板，35～38℃过夜培养，筛选蓝色转化子，液体LB培养基中35～38℃过夜培养，按体积百分比5％接种量转接至含浓度30μg/mL的红霉素抗性LB培养基中，28～32℃孵育2h，升温至40～43℃继续孵育5.5～6.5h，稀释至10-2～10-5，涂布含有浓度40μg/mL X-gal和浓度30μg/mL红霉素抗性的LB平板，40～43℃过夜培养，挑取阳性单菌落于28～32℃在无抗性LB培养基中孵育5.5～6.5h，升温至40～43℃继续孵育2.5～3.5h，稀释至10-2～10-5，涂布含有40μg/mL X-gal的LB平板，40～43℃过夜培养，挑取白斑的单菌落，验证后，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，启动子P43的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-F：CGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为SacI酶切位点
P43-R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，分泌信号肽PhoD的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
PhoD-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG；
PhoD-R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
MTSase-F：GGGGCCTTTGAAGTAATGCGTACACCGGTTTCA
MTSase-R：CGCGGATCCTTAGCTTTCGCCTCCTGT下划线为BamHI酶切位点
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
MTHase-F：GGGGCCTTTGAAGTAATGACGCATACATACCCGA
MTHase-R：CGCGGATCCTTAATCGCTCACAACTGCCG下划线为BamHI酶切位点
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，重叠PCR连接启动子P43、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的步骤如下：
(i)启动子P43片段与分泌信号肽PhoD片段重叠得到P43-PhoD基因片段，重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：
初次扩增体系为25μl：
启动子P43片段4μl，PhoD片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 4.5μl；
初次扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环；72℃延伸2min；
补充扩增体系为25μl：
上游引物P43-F 2μl，下游引物PhoD-R 2μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
(ii)基因片段MTSase与MTHase重叠得到MTSase-MTHase基因片段，两个基因片段通过特殊序列的连接肽连接，重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：
初次扩增体系为25μl：
MTSase片段4μl，MTHase片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 4.5μl，初次扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环；72℃延伸2min；
补充扩增体系为25μl：
上游引物MTSase-F 2μl，下游引物MTHase-R 2μl，2×Phanta Max Master Mix12.5μl，ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
(iii)基因片段P43-PhoD与MTSase-MTHase重叠得到P43-PhoD-MTSase-MTHase基因片段重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：
初次扩增体系为25μl：
P43-PhoD片段4μl，MTSase-MTHase片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O4.5μl；
初次扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环；72℃延伸2min；
补充扩增体系为25μl：
上游引物P43-F 2μl，下游引物MTHase-R 2μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、分泌信号肽PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，启动子P43的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.10所示，分泌信号肽PhoD的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ IDNO.11所示，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQID NO.12所示，麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.13所示。
利用上述构建的工程菌耦合发酵生产海藻糖的方法，步骤如下：
a、将上述构建的工程菌接种于含氯霉素的LB液体培养基中，35～38℃、150～250r/min恒温摇床培养10～14h，制得初始种子液；
b、将步骤a制得的种子液按体积百分比1～5％的比例转接到含氯霉素的LB液体培养基中，35～38℃、150～250r/min恒温摇床培养8～10h，制得接种种子液；
c、将步骤b制得的接种种子液按体积百分比1～5％的比例转接到发酵培养基中，在转速450～550rpm，温度35～38℃，发酵32～40h，当发酵至12h时，开始流加淀粉液化液，流速1mL/min，转速降低为200～280rpm，升温至42～48℃，即得。
根据本发明优选的，所述步骤a和b中，含氯霉素的LB液体培养基组份如下：
蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，含氯霉素30mg/L；
根据本发明优选的，所述步骤c中，发酵培养基组份如下：
胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，蔗糖12g/L，KH2PO4 8.34g/L，K2HPO4 0.87g/L；
根据本发明优选的，所述步骤c中，淀粉液化液是淀粉液化后生成的DE值在20％以下的溶液。
有益效果
本发明首次通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC后，构建获得重组工程菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase(LM1234)，并采用了特殊序列的刚性连接，从而实现了目标酶的功能表达；通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。
附图说明
图1为实施例17的海藻糖浓度-转化率-时间曲线图；
具体实施方法
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中涉及的菌株和质粒均为普通市售产品。
培养基
LB固体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，琼脂粉2g/L；
LB液体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，pH 7.0；
TB发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，甘油4ml/L，KH2PO4 8.34g/L，K2HPO4 0.87g/L；
发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，蔗糖12g/L，KH2PO4 3.13g/L，K2HPO40.33g/L；
实施例1：敲除裂解基因重组菌的构建
1.1引物设计
引物名称 引物序列 酶切位点
Xpf-1 CGC<u>GGATCC</u>AGATGTGCAGTGACTATT BamHI
Xpf-2 ACGTATGACAAGCTTCAAATAAAAAACGGACAC
Xpf-3 TCCGTTTTTTATTTGAAGCTTGTCATACGTTTG
Xpf-4 CCG<u>GAATTC</u>CCGTAGCCGCCGACAAGA EcoRI
SkfA-1 CGC<u>GGATCC</u>GTTGGTGCGTTAGGGGTT BamHI
SkfA-2 CCCTATTCTCAAATGAAGTAAACCTCCTCTCAA
SkfA-3 AGAGGAGGTTTACTTCATTTGAGAATAGGGAGT
SkfA-4 CCG<u>GAATTC</u>ATTTATGACGTGCTTCCC EcoRI
LytC-1 CGC<u>GGATCC</u>ACAGAATTAGTCTTGATG BamHI
LytC-2 TAGATTTGTCTCTTTCGATAAAATAATCAATAACTT
LytC-3 AAGTTATTGATTATTTTATCGAAAGAGACAAATCTA
LytC-4 CCG<u>GAATTC</u>GTTGAAATACTTGTCCAC EcoRI
SdpC-1 CGC<u>GGATCC</u>TAGTTTAGAAGGTTATAT BamHI
SdpC-2 AAGACACTCAATTATAATATTATTATACCTCCATTA
SdpC-3 TAATGGAGGTATAATAATATTATAATTGAGTGTCTT
SdpC-4 CCG<u>GAATTC</u>AATATCTAAATGTCTAAA EcoRI
1.2基因片断的扩增
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别使用引物Xpf-1/Xpf-2和Xpf-3/Xpf-4PCR扩增得到Xpf基因的上下游同源臂Xpf-up和Xpf-down，然后通过重叠PCR将Xpf-up和Xpf-down重叠得到△Xpf基因片段。使用同样的方法得到△SkfA、△LytC和△SdpC基因片段。
PCR扩增体系如下，总体系50μl：
上游引物2μl，下游引物2μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 8.5μl；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：
初次扩增体系为25μl：
Xpf-up片段4μl，Xpf-down片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O4.5μl；
初次扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环；72℃延伸2min；
补充扩增体系为25μl：
上游引物Xpf-1 2μl，下游引物Xpf-2 2μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
1.1重组质粒的构建
分别将重叠得到△Xpf、△SkfA、△LytC和△SdpC基因片段，通过酶切位点BamHI和EcoRI连接到敲除载体pMAD，得到四个敲除质粒pMAD-Xpf、pMAD-SkfA、pMAD-LytC和pMAD-SdpC。
1.2重组菌的构建
依次将敲除质粒pMAD-Xpf、pMAD-SkfA、pMAD-LytC和pMAD-SdpC通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis WB800n，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌B.subtilis LM1234(△Xpf、△SkfA、△LytC和△SdpC)，将此重组菌命名为LM1234。
实施例2：pHT01-P43-MTSase/B.subtilis(LM1234)的构建
1、PCR扩增组成型启动子P43和麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase，将所得到的P43和MTSase基因片段通过重叠PCR的方法连接得到P43-MTSase基因片段，将P43-MTSase与经SacI和BamHI双酶切纯化的载体pHT01，用T4DNA ligase 16℃连接12h。连接产物转化克隆至E.coli(DH5α)涂布LB固体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养12h后，经PCR验证，选取验证正确的菌培养抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到重组质粒pHT01-P43-MTSase。
2、将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis(LM1234)，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。
3、摇瓶发酵产酶
将构建的重组菌pHT01-P43-MTSase，接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。
将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心去上清，收集菌体，用10mL 20mMpH6.5PBS缓冲液重悬，经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清夜，得到粗酶液。
实施例3：pHT01-P43-MTHase/B.subtilis(LM1234)的构建
1、PCR扩增组成型启动子P43和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，将所得到的P43和MTHase基因片段通过重叠PCR的方法连接得到P43-MTHase基因片段，将P43-MTHase与经SacI和BamHI双酶切纯化的载体pHT01，用T4DNA ligase 16℃连接12h。连接产物转化克隆至E.coli(DH5α)涂布LB固体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养12h后，经PCR验证，选取验证正确的菌培养抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到重组质粒pHT01-P43-MTHase。
2、将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis(LM1234)，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。
3、摇瓶发酵产酶
将构建的重组菌pHT01-P43-MTHase，接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。
将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心去上清，收集菌体，用10mL 20mMpH6.5PBS缓冲液重悬，经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清夜，得到粗酶液。
实施例4：酶活定义
(1)麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)酶活力测定和定义
将麦芽五糖溶于100mM pH 5.5的柠檬酸缓冲液中，配成20％的溶液。取100mL该溶液，加入1mL MTSase酶液，60℃反应10min，100℃沸水中煮10min终止反应。将转化液冷却后，调节pH到4.2，加入0.1mL葡萄糖酶化液，60℃糖化24h，常规液相色谱测定糖化液中海藻糖的含量。MTSase催化麦芽五糖生成麦芽糖五糖基海藻糖，糖化酶可以水解α-1,4-糖苷键，而不能水解α-1,1-糖苷键，故而糖化后的溶液中中只含有海藻糖和葡萄糖。因此，最终海藻糖的摩尔生成量即等于MTSase催化产生的麦芽五羰基海藻糖摩尔的量。MTSase的酶活单位(U)定义为每1min转化麦芽五糖生成1mM麦芽五羰基海藻糖所需的酶量。
(2)麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)酶活测定和定义
将麦芽五糖溶于100mM pH 5.5的柠檬酸缓冲液中，配成20％的溶液。取100mL该溶液，加入200U MTSase酶液，60℃反应5h，100℃沸水中煮10min终止反应。待溶液冷却后，调节pH 5.3，加入1mL MTHase酶液，60℃反应10min，100℃沸水中煮10min终止反应。HPLC测定转化液中海藻糖的含量。MTHase的酶活单位(U)定义为每1min水解麦芽五羰基海藻糖生成1mM海藻糖所需的酶量。
实施例5：摇瓶培养检测双酶的转化率
将液化后的淀粉液化液pH调至5.0，加入普鲁兰酶，在60℃条件下处理24h，使淀粉液化液完全转化为麦芽糊精。反应结束后，将pH调节到6.5，按照1:1的比例加入破碎得到的粗酶液MTSase和MTHase，在45℃条件下处理12h，反应结束后，100℃处理10min，使酶失活。通过高效液相色谱检测反应液中的海藻糖浓度，计算海藻糖转化率为59％。
实施例6：分泌型pHT01-P43-PhoD-MTSase/B.subtilis(LM1234)的构建
1、PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD和麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase，将所得到的P43、PhoD和MTSase基因片段通过重叠PCR的方法连接得到P43-PhoD-MTSase基因片段，将P43-PhoD-MTSase与经SacI和BamHI双酶切纯化的载体pHT01，用T4DNA ligase 16℃连接12h。连接产物转化克隆至E.coli(DH5α)涂布LB固体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养12h后，经PCR验证，选取验证正确的菌培养抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到重组质粒pHT01-P43-PhoD-MTSase。
2、将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis(LM1234)，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。
3、摇瓶发酵产酶
将构建的重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase，接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。
将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心，收集发酵液。
实施例7：分泌型pHT01-P43-PhoD-MTHase/B.subtilis(LM1234)的构建
1、PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，将所得到的P43、PhoD和MTHase基因片段通过重叠PCR的方法连接得到P43-PhoD-MTHase基因片段，将P43-PhoD-MTHase与经SacI和BamHI双酶切纯化的载体pHT01，用T4DNA ligase 16℃连接12h。连接产物转化克隆至E.coli(DH5α)涂布LB固体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养12h后，经PCR验证，选取验证正确的菌培养抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到重组质粒pHT01-P43-PhoD-MTHase。
2、将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis(LM1234)，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。
3、摇瓶发酵产酶
将构建的重组菌pHT01-P43-PhoD-MTHase，接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。
将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心，收集发酵液。
实施例8：摇瓶培养检测上清液中双酶的转化率
将液化后的淀粉液化液pH调至5.0，加入普鲁兰酶，在60℃条件下处理24h，使淀粉液化液完全转化为麦芽糊精。反应结束后，将pH调节到6.5，按照1:1的比例加入发酵液中的粗酶液MTSase和MTHase，在45℃条件下处理12h，反应结束后，100℃处理10min，使酶失活。通过高效液相色谱检测反应液中的海藻糖浓度，计算双酶转化率大约为61％。
实施例9：融合酶pHT01-P43-MTSase-MTHase/B.subtilis(LM1234)的构建
1、PCR扩增组成型启动子P43、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，将所得到的P43、MTSase和MTHase基因片段通过重叠PCR的方法连接得到P43-MTSase-MTHase基因片段，两个酶之间通过特殊序列的刚性连接肽EAAAKEAAAK(SEQ IDNO.1)连接，将P43-MTSase-MTHase与经SacI和BamHI双酶切纯化的载体pHT01，用T4DNAligase 16℃连接12h。连接产物转化克隆至E.coli(DH5α)涂布LB固体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养12h后，经PCR验证，选取验证正确的菌培养抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到重组质粒pHT01-P43-MTSase-MTHase。
2、将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis(LM1234)，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。
3、摇瓶发酵产酶
将构建的重组菌pHT01-P43-MTSase-MTHase，接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心去上清，收集菌体，菌体用10mL 20mM pH 6.5PBS缓冲液重悬，经超声波细胞粉碎机破碎细胞，离心取上清夜，得到粗酶液。
实施例10：融合酶酶活定义
取10mL酶液，加10mL质量分数为2％的淀粉液化液(淀粉液化度值为10％；淀粉液化度是淀粉中还原糖与总糖含量的比值)，45℃酶解20min用HPLC法检测海藻糖。酶活单位定义如下：在上述反应条件下每分钟释放1μmol的海藻糖所需的酶量为一个酶活单位。
实施例11：摇瓶培养检测融合酶的酶活
将液化后的淀粉液化液pH调至5.0，加入普鲁兰酶，在60℃条件下处理24h，使淀粉液化液完全转化为麦芽糊精。反应结束后，将pH调节到6.5，按照1:1的比例加入破碎得到的融合酶，在45℃条件下处理12h，反应结束后，100℃处理10min，使酶失活。通过高效液相色谱检测反应液中的海藻糖浓度，计算融合酶的酶活为15874U/g。
实施例12：双酶的酶学性质研究
A MTSase-MTHase转化的最适温度
将液化后的淀粉液化液pH调至5.0，加入普鲁兰酶，在60℃条件下处理24h，使淀粉液化液完全转化为麦芽糊精。反应结束后，将pH调节到6.5，按照1:1的比例加入发酵液中的融合酶，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下处理12h，反应结束后，100℃处理10min，使酶失活。通过高效液相色谱检测反应液中的海藻糖浓度，计算融合酶的酶活，验证最适转化温度。
B MTSase-MTHase转化的最适pH
将液化后的淀粉液化液pH调至5.0，加入普鲁兰酶，在60℃条件下处理24h，使淀粉液化液完全转化为麦芽糊精。反应结束后，将pH调节到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按照1:1的比例加入发酵液中的融合酶，在45℃条件下处理12h，反应结束后，100℃处理10min，使酶失活。通过高效液相色谱检测反应液中的海藻糖浓度，计算融合酶的酶活，验证最适转化pH。
实施例13：分泌型融合酶pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase/B.subtilis(LM1234)的构建
1、PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，将所得到的P43、PhoD、MTSase和MTHase基因片段通过重叠PCR的方法连接得到P43-PhoD-MTSase-MTHase基因片段，两个酶之间通过特殊序列的刚性连接肽EAAAKEAAAK连接，将P43-MTSase-MTHase与经SacI和BamHI双酶切纯化的载体pHT01，用T4DNA ligase 16℃连接12h。连接产物转化克隆至E.coli(DH5α)涂布LB固体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养12h后，经PCR验证，选取验证正确的菌培养抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到重组质粒pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase。
2、将重组质粒通过电转的方法转入表达宿主B.subtilis(LM1234)，涂布LB固体培养基(含30μg/mL氯霉素)，37℃培养箱培养12h，将固体培养基上的单菌落进行PCR验证，挑取验证正确的单菌落，经LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)37℃培养12h得到重组菌。
3、摇瓶发酵产酶
将构建的重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase，接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL TB培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，发酵液离心，收集上清液。
实施例14：摇瓶培养检测发酵液中融合酶的酶活
将液化后的淀粉液化液pH调至5.0，加入普鲁兰酶，在60℃条件下处理24h，使淀粉液化液完全转化为麦芽糊精。反应结束后，将pH调节到6.5，按照1:1的比例加入发酵液中的融合酶，在45℃条件下处理12h，反应结束后，100℃处理10min，使酶失活。通过高效液相色谱检测反应液中的海藻糖浓度，计算发酵液中融合酶的酶活为28457U/L。
实施例15：发酵罐培养检测融合酶的酶活
分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase B.subtilis(LM1234)在5L发酵罐中培养，取样检测酶活，测定转化率。
1、初始种子培养：将分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase B.subtilis(LM1234)接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液。
2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液。
3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵36h，每隔2-3h取样测菌体和发酵上清液中融合酶的酶活。
实施例16：发酵条件的优化
A不同pH对产酶的影响
1、种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase B.subtilis(LM1234)接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为种子液。
2、发酵产酶：使用TB培养基作为原始培养基，使用磷酸盐缓冲液将发酵培养基的pH分别调节到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，将培养好的种子液以3％的接种量接于100mL发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养24h，测定重组菌的菌体和发酵上清液中的酶活。
表1
pH 胞内酶活U/g 上清酶活U/L
5.5 11924 18368
6.0 17354 27168
6.5 20357 31792
7.0 16927 26423
7.5 10752 17638
B不同温度对融合酶转化的影响
将液化后的淀粉液化液pH调至5.0，加入普鲁兰酶，在60℃条件下处理24h，使淀粉液化液完全转化为麦芽糊精。反应结束后，将pH调节到6.5，按照1:1的比例加入融合酶，将转化温度分别调节为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，转化12h，反应结束后，100℃处理10min，使酶失活。通过高效液相色谱检测反应液中的海藻糖浓度，计算融合酶的酶活。
表2
温度℃ 胞内酶活U/g 上清酶活U/L
35 10932 18357
40 18628 28476
45 22762 32168
50 17322 26841
55 9756 15756
实施例17：耦合发酵生产海藻糖
发酵罐中流加淀粉液化液耦合发酵
采取流加淀粉液化液的方式实现边发酵边转化，流加500mL淀粉液化液。
1、初始种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHaseB.subtilis(LM1234)接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液。
2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液。
3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵36h，12h时开始流加淀粉液化液，流速1mL/min，转速降低为250rpm，温度升高到45℃，每隔2-3h取样测菌体和发酵上清液中双酶转化率。
对比例
采用上述构建自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase的方法，不同之处在于，两个酶的连接使用刚性连接肽EAAAK(SEQ ID NO.14)，构建得到pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase B.subtilis(LM1234，EAAAK)。
采用实施例17的方法在5L发酵罐中进行耦合发酵生产海藻糖。
发酵罐中流加淀粉液化液耦合发酵
采取流加淀粉液化液的方式实现边发酵边转化，流加500mL淀粉液化液。
1、初始种子培养：将自诱导分泌型重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHaseB.subtilis(LM1234，EAAAK)接种于50mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养12h，作为初始种子液。
2、接种种子培养：将培养的初始种子液按1％的比例接种到三瓶100mL LB液体培养基(含30μg/mL氯霉素)中，置于37℃恒温摇床，200r/min，培养8h，作为接种种子液。
3、发酵罐发酵：将接种种子液按3％的比例接种到5L发酵罐发酵培养，培养基使用优化后的发酵培养基(含30μg/mL氯霉素)，转速500rpm，温度37℃，发酵36h，12h时开始流加淀粉液化液，流速1mL/min，转速降低为250rpm，温度升高到45℃，每隔2-3h取样测菌体和发酵上清液中双酶转化率。
结果显示，重组菌pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase B.subtilis(LM1234，EAAAK)发酵罐中培养，通过液相检测未检测到海藻糖，说明融合酶未表达，表明刚性连接肽EAAAK对融合酶的空间结构造成影响，使融合酶不能翻译表达。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种利用高效分泌表达的双酶融合酶耦合发酵生产海藻糖的方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 458
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 2
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacacatgaa cagacaag 458
<210> 3
<211> 162
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 3
atggcatacg acagtcgttt tgatgaatgg gtacagaaac tgaaagagga aagctttcaa 60
aacaatacgt ttgaccgccg caaatttatt caaggagcgg ggaagattgc aggactttct 120
cttggattaa cgattgccca gtcggttggg gcctttgaag ta 162
<210> 4
<211> 2328
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 4
atgcgtaccc cggtttctac ctaccgtctg cagatccgta aaggtttcac cctgttcgac 60
gctgctaaaa ccgttccgta cctgcactct ctgggtgttg actgggttta cctgtctccg 120
gttctgaccg ctgaacaggg ttctgaccac ggttacgacg ttaccgaccc gtctgctgtt 180
gacccggaac gtggtggtcc ggaaggtctg gctgctgttt ctaaagctgc tcgtgctgct 240
ggtatgggtg ttctgatcga catcgttccg aaccacgttg gtgttgctac cccggctcag 300
aacccgtggt ggtggtctct gctgaaagaa ggtcggcagt ctcgttacgc tgaagctttc 360
gacgttgact gggacctggc tggtggtcgt atccgtctgc cggttctggg ttctgacgac 420
gacctggacc agctggaaat ccgtgacggt gaactgcgtt actacgacca ccgtttcccg 480
ctggctgaag gtacctacgc tgaaggtgac gctccgcgtg acgttcacgc tcgtcagcac 540
tacgaactga tcggttggcg tcgtgctgac aacgaactga actaccgtcg tttcttcgct 600
gttaacaccc tggctggtgt tcgtgttgaa atcccggctg ttttcgacga agctcaccag 660
gaagttgttc gttggttccg tgaagacctg gctgacggtc tgcgtatcga ccacccggac 720
ggtctggctg acccggaagg ttacctgaaa cgtctgcgtg aagttaccgg tggtgcttac 780
ctgctgatcg aaaaaatcct ggaaccgggt gaacagctgc cggcttcttt cgaatgcgaa 840
ggtaccaccg gttacgacgc tctggctgac gttgaccgtg ttctggttga cccgcgtggt 900
caggaaccgc tggaccgtct ggacgcttct ctgcgtggtg gtgaaccggc tgactaccag 960
gacatgatcc gtggtaccaa acgtcgtatc accgacggta tcctgcactc tgaaatcctg 1020
cgtctggctc gtctggttcc gggtgacgct aacgtttcta tcgacgctgg tgctgacgct 1080
ctggctgaaa tcatcgctgc tttcccggtt taccgtacct acctgccgga aggtgctgaa 1140
gttctgaaag aagcttgcga actggctgct cgtcgtcgtc cggaactgga ccaggctatc 1200
caggctctgc agccgctgct gctggacacc gacctggaac tggctcgtcg tttccagcag 1260
acctctggta tggttatggc taaaggtgtt gaagacaccg ctttcttccg ttacaaccgt 1320
ctgggtaccc tgaccgaagt tggtgctgac ccgaccgaat tcgctgttga accggacgaa 1380
ttccacgctc gtctggctcg tcgtcaggct gaactgccgc tgtctatgac caccctgtct 1440
acccacgaca ccaaacgtag cgaagacacc cgtgctcgta tctctgttat ctctgaagtt 1500
gctggtgact gggaaaaagc tctgaaccgt ctgcgtgacc tggctccgct gccggacggt 1560
ccgctgtctg ctctgctgtg gcaggctatc gctggtgctt ggccggcttc tcgtgaacgt 1620
ctgcagtact acgctctgaa agctgctcgt gaagctggta actctaccaa ctggaccgac 1680
ccggctccgg ctttcgaaga aaaactgaaa gctgctgttg acgctgtttt cgacaacccg 1740
gctgttcagg ctgaagttga agctctggtt gaactgctgg aaccgtacgg tgcttctaac 1800
tctctggctg ctaaactggt tcagctgacc atgccgggtg ttccggacgt ttaccagggt 1860
accgaattct gggaccgttc tctgaccgac ccggacaacc gtcgtccgtt ctctttcgac 1920
gaccgtcgtg ctgctctgga acagctggac gctggtgacc tgccggcttc tttcaccgac 1980
gaacgtacca aactgctggt tacctctcgt gctctgcgtc tgcgtcgtga ccgtccggaa 2040
ctgttcaccg gttaccgtcc ggttctggct tctggtccgg ctgctggtca cctgctggct 2100
ttcgaccgtg gtaccgctgc tgctccgggt gctctgaccc tggctacccg tctgccgtac 2160
ggtctggaac agtctggtgg ttggcgtgac accgctgttg aactgaacac cgctatgaaa 2220
gacgaactga ccggtgctgg tttcggtccg ggtgctgtta aaatcgctga catcttccgt 2280
tctttcccgg ttgctctgct ggttccgcag accggtggtg aatcttaa 2328
<210> 5
<211> 1797
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 5
atgacccaca cctacccgcg tgaagctgct aaaccggttc tgggtccggc tcgttacgac 60
gtttgggctc cgaacgctga atctgttacc ctgctggctg gtggtgaacg ttacgctatg 120
cagcgtcgtg ctgaaaccgg tccggaagac gctggttggt ggaccgctgc tggtgctccg 180
accgacggta acgttgacta cggttacctg ctggacggtg acgaaacccc gctgccggac 240
ccgcgtaccc gtcgtcagcc ggacggtgtt cacgctctgt ctcgtacctt cgacccgtct 300
gcttactctt ggcaggacga cgcttggcag ggtcgtgaac tgcagggtgc tgttatctac 360
gaactgcacc tgggtacctt caccccggaa ggtaccctgg aagctgctgc tggtaaactg 420
gactacctgg ctggtctggg tgttgacttc atcgaactgc tgccggttaa cgctttcaac 480
ggtacccaca actggggtta cgacggtgtt cagtggttcg ctgttcacga agcttacggt 540
ggtccggaag cttaccagcg tttcgttgac gctgctcacg ctgctggtct gggtgttatc 600
caggacgttg tttacaacca cctgggtccg tctggtaact acctgccgcg tttcggtccg 660
tacctgaaac agggtgaagg taacacctgg ggtgactctg ttaacctgga cggtccgggt 720
tctgaccacg ttcgtcgtta catcctggac aacctggcta tgtggctgcg tgactaccgt 780
gttgacggtc tgcgtctgga cgctgttcac gctctgaaag acgaacgtgc tgttcacatc 840
ctggaagact tcggtgctct ggctgaccag atctctgctg aagttggtcg tccgctgacc 900
ctgatcgctg aatctgacct gaacaacccg cgtctgctgt acccgcgtga cgttaacggt 960
tacggtctgg aaggtcagtg gtctgacgac ttccaccacg ctgttcacgt taacgttacc 1020
ggtgaaacca ccggttacta ctctgacttc gactctctgg ctgctctggc taaagttctg 1080
cgtgacggtt tcttccacga cggttcttac tcttctttcc gtgaacgtca ccacggtcgt 1140
ccgatcaact tctctgctgt tcacccggct gctctggttg tttgctctca gaaccacgac 1200
cagatcggta accgtgctac cggtgaccgt ctgtctcaga ccctgccgta cggttctctg 1260
gcgctggctg ctgttctgac cctgaccggt ccgttcaccc cgatgctgct gatgggtgaa 1320
gaatacggtg cttctacccc gtggcagttc ttcacctctc acccggaacc ggaactgggt 1380
aaagctaccg ctgaaggtcg tatcaaagaa ttcgaacgta tgggttggga cccggctgtt 1440
gttccggacc cgcaggaccc ggaaaccttc cgtcgttcta aactggactg ggctgaagct 1500
gctgaaggtg accacgctcg tctgctggaa ctgtaccgtt ctctgaccgc tctgcgtcgt 1560
tctaccccgg acctgaccaa actgggtttc gaagacaccc aggttgcttt cgacgaagac 1620
gctcgttggc tgcgtttccg tcgtggtggt gttcaggttc tgctgaactt ctctgaacag 1680
ccggtttctc tggacggtgc tggtaccgct ctgctgctgg ctaccgacga cgctgttcgt 1740
ctggaaggtg aacgtgctga actgggtccg ctgtctgctg ctgttgtttc tgactga 1797
<210> 6
<211> 510
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 6
atgcaagact tactatttga atataaacgc acgctcaaac aaacaagaat acaatataaa 60
ccgctcgctg aggcagatga atccgtgctc tcagctgaag agctgaagga taaaaaaatc 120
atcagaaata tgattactga tcttgaatat gtaacagaat ggcttgaaaa aggaaggcag 180
cccggcatca gacgggcgat tgaccggcgt gatgtttacc agcggctgat gatcaaggac 240
ccgagaatca tcgaatcatt ttccagcgct atgatgtttg agccggacgg acaggtatca 300
gaagaagaca gagatagaat tcgagaagca ttagccctgt taacggacag agaaaaggaa 360
atgtttttgc tgcataaggt agaatgtttt tcttatgaac ggatcgccga tcttctcggc 420
gtaaaaaaat cgacagtgca aacgacgatt aaacgggcga gtttaaagat gcaaagacag 480
caggaagaaa tgaatcgatc acttgcctga 510
<210> 7
<211> 168
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 7
atgaaaagaa accaaaaaga atgggaatct gtgagtaaaa aaggacttat gaagccggga 60
ggtacttcga ttgtgaaagc tgctggctgc atgggctgtt gggcctcgaa gagtattgct 120
atgacacgtg tttgtgcact tccgcatcct gctatgagag ctatttaa 168
<210> 8
<211> 510
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 8
atgcaagact tactatttga atataaacgc acgctcaaac aaacaagaat acaatataaa 60
ccgctcgctg aggcagatga atccgtgctc tcagctgaag agctgaagga taaaaaaatc 120
atcagaaata tgattactga tcttgaatat gtaacagaat ggcttgaaaa aggaaggcag 180
cccggcatca gacgggcgat tgaccggcgt gatgtttacc agcggctgat gatcaaggac 240
ccgagaatca tcgaatcatt ttccagcgct atgatgtttg agccggacgg acaggtatca 300
gaagaagaca gagatagaat tcgagaagca ttagccctgt taacggacag agaaaaggaa 360
atgtttttgc tgcataaggt agaatgtttt tcttatgaac ggatcgccga tcttctcggc 420
gtaaaaaaat cgacagtgca aacgacgatt aaacgggcga gtttaaagat gcaaagacag 480
caggaagaaa tgaatcgatc acttgcctga 510
<210> 9
<211> 612
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)
<400> 9
ttgaaaagta aattacttag gctattgatt gtttccatgg taacgatatt ggttttttca 60
ttagtaggac tctctaagga gtcaagtaca tctgctaaag aaaaccatac attttctgga 120
gaagattact ttagaggact tttatttgga caaggggaag ttggtaaatt aatttcaaac 180
gatttggacc ctaaactcgt aaaagaggca aatagtacag aaggtaaaaa gttagtaaat 240
gatgtagtca aatttataaa aaaagatcaa ccacaatata tggatgaatt gaaacaatcg 300
attgacagca aagaccctaa aaaactcatt gaaaatatga ccaaagcaga ccaacttatc 360
caaaaatatg ctaagaaaaa tgaaaacgta aaatactctt ctaataaagt tactccatct 420
tgtgggcttt atgccgtctg tgtagcagct ggatatttat atgttgtggg cgttaacgca 480
gttgcattac aaacggctgc cgcagtaaca actgcagtgt ggaaatacgt tgccaaatat 540
tcctcttcag cttctaataa ttctgattta gaagcggctg ctgcaaaaac cctaaaattg 600
attcatcaat aa 612
<210> 10
<211> 445
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacac 445
<210> 11
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
atggcttacg attctcgttt cgatgaatgg gttcaaaaac ttaaagaaga atctttccaa 60
aacaacacat tcgatcgtcg taaattcatc caaggcgctg gcaaaatcgc tggcctttct 120
cttggcctta caatcgctca atctgttggc gcttcgaagt t 161
<210> 12
<211> 2328
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
atgcgtacac cggtttcaac atatagactg caaatcagaa agggcttcac actttttgac 60
gcggcaaaaa cagttccgta tctgcatagc ctgggcgtgg attgggtgta tcttagcccg 120
gtgctgacag cggaacaagg atctgatcat ggatatgatg tcacagatcc gtcagcagtt 180
gatccggaaa gaggcggacc ggaaggatta gcagcagtta gcaaagcagc gagagcagcg 240
ggaatgggag ttttaattga tattgtcccg aaccacgtcg gcgttgcgac acctgcacaa 300
aatccgtggt ggtggtcact gcttaaagaa ggaagacaaa gcagatacgc ggaagcattt 360
gatgttgatt gggatctggc gggaggcaga attagactgc cggttcttgg cagcgatgat 420
gatcttgatc aacttgaaat ccgcgatgga gaactgagat attatgatca tcgcttcccg 480
cttgcagaag gaacatatgc agaaggcgat gcaccgagag atgttcatgc gagacagcat 540
tatgaactta tcggctggag aagagcggat aatgaactta attaccgcag attcttcgcg 600
gttaatacac ttgcgggcgt tagagttgaa attccggcgg tttttgatga agcacatcag 660
gaagtggtta gatggtttag agaagatctg gcggatggcc tgagaattga tcatccggat 720
ggactggcag atccggaagg atatcttaaa agactgagag aagtgacggg cggcgcatat 780
cttctgattg aaaaaattct ggagcctggc gaacaacttc cggcatcatt tgaatgtgaa 840
ggaacaacag gctacgatgc actggcagat gtggatagag ttctggttga tccgagagga 900
caggaaccgc ttgatagact tgatgcatca ctgagaggag gagaaccggc ggattatcaa 960
gatatgatta gaggaacgaa gcgcagaatt acagatggaa ttctgcatag cgagatcctt 1020
agactggcga gactggtgcc gggagatgca aatgtttcaa ttgatgcggg cgcggatgca 1080
ctggctgaaa ttattgcggc atttccggtg tatagaacat atcttccgga aggcgcagaa 1140
gttcttaaag aagcatgcga acttgcggcg agaagaagac cggaactgga tcaggcgatt 1200
caggcgttac aaccgctgct tctggataca gatcttgaac ttgcaagaag attccagcaa 1260
acatcaggaa tggttatggc aaaaggcgtg gaagatacag catttttcag atataaccgt 1320
ctgggcacac ttacagaagt tggagcagat ccgacagaat ttgcggttga accggatgaa 1380
tttcatgcaa gactggcaag aagacaagcg gaactgccgc tgagcatgac aacactgtca 1440
acacatgata caaagcgcag cgaagataca agagcaagaa ttagcgtgat ctcagaagtg 1500
gcgggagatt gggaaaaagc gcttaataga cttcgcgatc ttgcgccgct tccggatgga 1560
cctctttcag cacttctgtg gcaagcaatt gcgggagcat ggcctgcaag cagagaaaga 1620
cttcagtatt atgcactgaa ggcggcgaga gaagcgggaa attcaacaaa ttggacagat 1680
ccggcaccgg catttgaaga aaaacttaaa gcagcagtgg acgcggtttt tgacaatccg 1740
gcggtgcagg ctgaagttga agcgttagtt gaactgctgg aaccgtatgg cgcgagcaat 1800
agcctggctg caaaacttgt gcaacttaca atgccgggag tgccggatgt ttatcaagga 1860
acagaatttt gggaccgctc actgacagat ccggataata gaagaccgtt ttcattcgat 1920
gaccgcagag cggcgcttga acagttagat gcaggcgatc ttccggcgag ctttacagat 1980
gaaagaacaa aactgctggt gacaagcaga gcgcttagac tgagaagaga tagaccggaa 2040
ttattcacag gatacagacc ggttcttgca agcggaccgg ctgcaggaca tcttttagca 2100
tttgatagag gcacagcggc ggcgcctgga gcactgacgc tggcaacgcg tttaccttat 2160
ggacttgaac aaagcggagg atggagagat acagcggtgg aacttaatac agcgatgaaa 2220
gatgagctga caggcgcggg atttggccct ggagcagtga agattgcgga tatttttaga 2280
agcttcccgg ttgcgcttct ggttccgcaa acaggaggcg aaagctaa 2328
<210> 13
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
atgacgcata catacccgag agaagcagcg aaaccggtgc ttggcccggc gagatatgat 60
gtgtgggcgc cgaatgcgga atcagttaca cttctggcgg gaggcgaaag atatgcaatg 120
cagagaagag cagaaacagg cccggaagat gcaggctggt ggacagcggc aggcgcacct 180
acagatggca atgttgatta tggatacctg ctggatggcg atgaaacacc gctgccggac 240
cctagaacaa gaagacagcc ggatggcgtt catgcactga gcagaacatt tgatccgagc 300
gcatattcat ggcaggatga tgcatggcag ggaagagaac ttcaaggcgc agtgatctat 360
gaactgcatc tgggaacatt cactccggaa ggcacacttg aagcagcagc aggaaaactg 420
gattatctgg cgggcctggg cgtggatttt attgaactgc ttccggttaa cgcattcaat 480
ggcacacata attggggata tgacggcgtg cagtggtttg cagttcatga agcatatgga 540
ggaccggaag cgtatcaaag atttgttgat gcggcgcatg cggcaggcct gggagtgatt 600
caagatgtgg tttataacca cctgggacct agcggcaatt atctgccgag atttggcccg 660
tatctgaaac agggcgaagg caatacatgg ggcgatagcg tgaatctgga tggccctggt 720
tcagatcatg tgagaagata tatcctggac aacctggcaa tgtggcttag agattataga 780
gtggatggcc tgagactgga tgcagttcat gcactgaaag atgaaagagc ggtgcatatt 840
ctggaagatt ttggagcact tgcagatcaa atctcagcgg aagtgggcag accgcttaca 900
ctgattgcag aatcagatct gaacaacccg agacttcttt atccgagaga tgttaatggc 960
tacggacttg aaggacaatg gtcagatgat tttcaccatg cggttcatgt taacgttaca 1020
ggcgaaacaa caggctatta ttcagatttc gacagcctgg cagcacttgc gaaagttctt 1080
agagatggct ttttccatga cggctcatat agcagcttta gagaaagaca tcacggcaga 1140
ccgattaatt tttcagcagt gcatccggca gcactggttg tgtgctcaca aaatcatgat 1200
cagatcggca atcgcgcgac aggcgataga cttagccaaa cacttccgta tggcagcctg 1260
gcgcttgcgg cagttcttac actgacaggc ccgtttacac cgatgcttct tatgggcgaa 1320
gaatatggag cgtcaacacc gtggcagttt ttcacaagcc atccggaacc ggaactggga 1380
aaagcaacag cggaaggcag aattaaggaa tttgaaagaa tgggctggga cccggcggtt 1440
gtgccggacc ctcaagatcc ggaaacattt cgcagatcaa aacttgattg ggcggaagcg 1500
gcagaaggag atcatgcgag actgcttgaa ctttatagat cactgacggc gcttagaaga 1560
agcacaccgg atctgacaaa actgggcttt gaagatacac aagtggcatt tgatgaggat 1620
gcaagatggc tgagatttcg cagaggcggc gttcaggtgc ttcttaattt ttcagaacag 1680
ccggttagcc ttgatggcgc aggcacagca cttcttcttg caacagatga tgcagttaga 1740
ctggaaggcg aaagagcaga acttggcccg cttagcgcgg cagttgtgag cgattaa 1797
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5

Claims (10)

1.一种高产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的构建方法，步骤如下：
(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC分别转化B.subtilisWB800n感受态细胞，经筛选，制得重组菌B.subtilis(LM1234)；
(2)分别PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，然后通过重叠PCR连接启动子P43、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase之间通过特殊序列的刚性连接肽连接，构建重组质粒pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase；然后转化步骤(1)制得的重组菌B.subtilis(LM1234)，即得；
所述特殊序列的刚性连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，敲除载体为载体pMAD；进一步优选的，所述的连接为将基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC与敲除载体pMAD分别用限制性内切酶BamHI/EcoRI酶切后，酶切产物经T4连接酶连接，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，转化条件为：电压2000V的条件下转化5ms。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，启动子P43的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-F：CGAGCTCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为SacI酶切位点
P43-R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA；
优选的，所述步骤(2)中，分泌信号肽PhoD的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
PhoD-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG，
PhoD-R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG；
优选的，所述步骤(2)中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
MTSase-F：GGGGCCTTTGAAGTAATGCGTACACCGGTTTCA，
MTSase-R：CGCGGATCCTTAGCTTTCGCCTCCTGT下划线为BamHI酶切位点
优选的，所述步骤(2)中，麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
MTHase-F：GGGGCCTTTGAAGTAATGACGCATACATACCCGA
MTHase-R：CGCGGATCCTTAATCGCTCACAACTGCCG下划线为BamHI酶切位点。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，重叠PCR连接启动子P43、分泌信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的步骤如下：
(i)启动子P43片段与分泌信号肽PhoD片段重叠得到P43-PhoD基因片段，重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：
初次扩增体系为25μl：
启动子P43片段4μl，PhoD片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 4.5μl；
初次扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环；72℃延伸2min；
补充扩增体系为25μl：
上游引物P43-F 2μl，下游引物PhoD-R 2μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
(ii)基因片段MTSase与MTHase重叠得到MTSase-MTHase基因片段，重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：
初次扩增体系为25μl：
MTSase片段4μl，MTHase片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 4.5μl，初次扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环；72℃延伸2min；
补充扩增体系为25μl：
上游引物MTSase-F 2μl，下游引物MTHase-R 2μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存；
(iii)基因片段P43-PhoD与MTSase-MTHase重叠得到P43-PhoD-MTSase-MTHase基因片段重叠PCR扩增体系如下，总体系50μl：
初次扩增体系为25μl：
P43-PhoD片段4μl，MTSase-MTHase片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O4.5μl；
初次扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸15sec，5个循环；72℃延伸2min；
补充扩增体系为25μl：
上游引物P43-F 2μl，下游引物MTHase-R 2μl，2×Phanta Max Master Mix 12.5μl，ddH2O 8.5μl；
所述的重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸5min，-20℃保存。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，启动子P43的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、分泌信号肽PhoD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，启动子P43的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.10所示，分泌信号肽PhoD的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.11所示，麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.12所示，麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的核苷酸序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.13所示。
8.利用上述构建的工程菌耦合发酵生产海藻糖的方法，其特征在于，步骤如下：
a、将上述构建的工程菌接种于含氯霉素的LB液体培养基中，35～38℃、150～250r/min恒温摇床培养10～14h，制得初始种子液；
b、将步骤a制得的种子液按体积百分比1～5％的比例转接到含氯霉素的LB液体培养基中，35～38℃、150～250r/min恒温摇床培养8～10h，制得接种种子液；
c、将步骤b制得的接种种子液按体积百分比1～5％的比例转接到发酵培养基中，在转速450～550rpm，温度35～38℃，发酵32～40h，当发酵至12h时，开始流加淀粉液化液，流速1mL/min，转速降低为200～280rpm，升温至42～48℃，即得。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤a和b中，含氯霉素的LB液体培养基组份如下：
蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，含氯霉素30mg/L。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤c中，发酵培养基组份如下：
胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，蔗糖12g/L，KH2PO4 8.34g/L，K2HPO4 0.87g/L；
优选的，所述步骤c中，淀粉液化液是淀粉液化后生成的DE值在20％以下的溶液。
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