CN112011495B - 一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用，本发明使用大肠杆菌表达含嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)来源的嗜热菌蛋白酶Npr的突变体，突变体Npr‑115M2的全细胞催化体系酶活为17U/mL，较突变前提高了55％。后续利用大肠杆菌BL21表达Npr‑115M2，并进行全细胞转化合成阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜的温度优化，底物苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯在反应温度为34℃时的转化率为70％，最终得到的阿斯巴甜产率在95％以上。

Description

一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
阿斯巴甜的化学名称为L-天冬酰胺-L-苯丙氨酸甲脂，简称为APM，是一种新型高效的甜味剂。阿斯巴甜的甜味大约是蔗糖200倍，热量仅为蔗糖的1/200，具有清凉感，和其他的甜味剂比较而言具有味质佳、稳定性好等优点。阿斯巴甜不仅在甜味方面具有优势，也适合添加到特殊人群食品当中。由于阿斯巴甜是由天冬氨酸和苯丙氨酸组成的二肽化合物，进入人体后可以分解为两种氨基酸，可以供人体合成蛋白质使用。同时，因为阿斯巴甜的甜度高，用量小，所以提供的热量很低，可以用于减肥健身等健康食品的研发。此外，阿斯巴甜在人体内的代谢过程不涉及胰岛素，不影响血糖水平，可供糖尿病人食用。另一方面，阿斯巴甜在口腔内不会被链球菌利用产生酸，故不会产生龋齿，所以可应用于儿童安全食品。实现阿斯巴甜的高效生产，对降低食品生产成本，提高食品品质和安全，满足特殊人群的甜味需求有着重要的作用。
阿斯巴甜由天冬氨酸和苯丙氨酸形成二肽后甲酯化形成，如果反应过程中两种氨基酸不带保护基，则会发生自身酰化或互相酰化形成六种二肽，副产物多。目前报道的阿斯巴甜主要通过化学法、酶法两种方法来合成。化学合成法主要分为酸酐法和内酯法，酸酐法合成阿斯巴甜反应中会产生β-异构体，回收难度大收率低，内酯法合成过程需要剧毒原料，因此限制了其工业化应用。
酶合成法是使用蛋白酶将两种氨基酸进行缩合，目前的研究一般采用嗜热蛋白酶或者嗜热蛋白酶与化学法结合的方法生产阿斯巴甜，日本专利JP60118190在使用嗜热蛋白酶合成阿斯巴甜的过程中，反应体系采用双相法高效的合成阿斯巴甜前体，可以将生成的中间体直接萃取到有机相中，因此酶促反应不受到抑制，过剩原料存在溶液中可循环使用，产率达到95％以上。然而这些研究仍然处于实验室阶段，产物在两相中的分配比例难以控制，底物浓度低，高浓度底物和有机相对酶抑制程度强，难以大规模应用。
目前我国最有实力的阿斯巴甜生产厂家武进牛塘化学厂和浙江亚美生化股份有限公司均通过化学法合成。化学合成法合成过程中需要将氨基酸加上保护碱基，再将保护碱基去除，合成路线普遍较长，专一性较差，收率偏低，该过程污染严重、反应副产物多、分离纯化价格高。酶法合成过程需要对酶进行纯化，而利用全细胞转化法合成阿斯巴甜可以避免酶的纯化过程，改变目前已有的阿斯巴甜的生产现状，对低生产成本、控制环境污染，促进阿斯巴甜价格竞争力，有着重要的作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过对嗜热菌蛋白酶的关键位点进行定点饱和突变，进一步提高了全细胞催化体系的酶活。随后对反应温度进行了优化，进一步提高了阿斯巴甜的转化效率，可以降低生产成本、控制环境污染，促进阿斯巴甜价格竞争力。
本发明的第一个目的是提供一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌异源表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嗜热菌蛋白酶Npr突变体。
进一步地，所述的嗜热菌蛋白酶Npr突变体的氨基酸序列是将SEQ ID NO.1所示的亲本序列中，成熟序列的第115位色氨酸突变为甘氨酸。
进一步地，所述的重组大肠杆菌是以pET系列载体表达嗜热菌蛋白酶Npr。
进一步地，所述的重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109或大肠杆菌W3110。
本发明的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将嗜热菌蛋白酶编码基因序列与载体连接，构建表达载体；
(2)将步骤(1)构建得到的表达载体转入大肠杆菌宿主中，得到表达嗜热菌蛋白酶的重组大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌在全细胞转化合成阿斯巴甜中的应用。
进一步地，所述的应用具体是以重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，催化苯丙氨酸甲酯和苄氧羰基天冬氨酸反应生成苄氧羰基阿斯巴甜。
进一步地，所述的全细胞催化剂是将重组大肠杆菌在发酵培养基中培养收集得到的菌体，采用缓冲液配制成的细胞悬液；其中，所述的培养是在400～600rpm，25～30℃，通气量为0.8～1.2vvm条件下，培养至菌体OD600为0.5～0.7时，添加0.3～0.5mM的IPTG诱导目的基因表达。
进一步地，所述的催化的体系为300～350mM苯丙氨酸甲酯，70～90mM苄氧羰基天冬氨酸和20～30g·L-1全细胞催化剂，催化的条件为31～37℃，200～250rpm，反应时间为20～30h。
进一步地，所述的发酵培养基为酵母粉20～25g·L-1，胰蛋白胨10～15g·L-1，甘油3～7mL，15～20mM磷酸氢二钾和70～75mM磷酸二氢钾混合溶液80～120mL。
本发明的有益效果：
本发明使用大肠杆菌表达含嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusthermoproteolyticus)来源的嗜热菌蛋白酶Npr的突变体，突变体Npr-115M2的全细胞催化体系酶活为17U/mL，较突变前提高了55％。后续利用大肠杆菌BL21表达Npr-115M2，并进行全细胞转化合成阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜的温度优化，底物苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯在反应温度为34℃时的转化率为70％，最终得到的阿斯巴甜产率在95％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
培养基：
反应底物：含2％酪蛋白的Tris-HCl缓冲液(pH为8)。
10％三氯乙酸溶液(TCA)：称取10gTCA，溶解于100mL水中。
大肠杆菌种子培养基：酵母粉0.5g·L-1，胰蛋白胨1g·L-1，氯化钠1g·L-1。
大肠杆菌发酵培养基：酵母粉24g·L-1，胰蛋白胨12g·L-1，甘油5mL，17mM磷酸氢二钾和72mM磷酸二氢钾混合溶液100mL。
涉及的检测方法：
嗜热菌蛋白酶酶活检测方法：以含2％酪蛋白的Tris-HCl缓冲液作为反应底物，每300μL底物加入500μL大肠杆菌细胞悬浮液，40℃反应10min。随后用500μLTCA缓冲液终止反应，将反应体系在4℃条件下静置20min，8000×g离心10min，吸取上清液在280nm波长下测定吸光值。
表1引物序列
引物名称 DNA序列(SEQ ID NO.5～11)
npF CTCGAGATGAAAATGAAAATGAAATTAGCATCGTTTGGT
npR TCCGAATTCTTATTTCACCCCTACCGCATCAAAGG
npr-1F ATAACAGGAACATCAACTGTCGGAGT
npr-1R TTGCGAACCGTTNNNAAATGCGTTATTATA
npr-2F GCATTTNNNAACGGTTCGCAAATG
npr-2R TTATTTCACCCCTACCGCATCAAAGG
npr-3R GACAGTTGATGTTCCTGTTATCGACTTCAC
实施例1：嗜热菌蛋白酶编码基因npr序列PCR扩增
以嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)基因组为模板，利用引物对npF/npR和高保真DNA聚合酶Primerstar Max扩增npr基因序列，将PCR体系纯化后得到npr DNA片段。
实施例2：利用简并引物对嗜热菌蛋白酶进行定点饱和突变
以实施例1中DNA片段为模板，利用引物对npr-1F/npr-1R和npr-2F/npr-2R扩增npr基因的成熟序列(嗜热菌蛋白酶Npr的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，成熟序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，氨基酸序列如SEQ ID NO.3)，纯化后将两个片段利用重叠PCR方法融合，所用引物为npr-1F和npr-2R。利用引物对npF/npr-3R扩增npr基因的前序列，纯化后将该片段与上述片段利用重叠PCR方法融合，验证后纯化，并用EcoRI、XhoI双酶切片段。将片段与载体pET28a连接后转化转化大肠杆菌JM109，挑取含氨苄卡那霉素的LB固体平板上长出的转化子进行单菌落PCR验证。
实施例3：嗜热菌蛋白酶突变体的筛选
将含重组质粒的菌株接种于LB液态培养基中37℃振荡培养过夜作为种子液接种于TB培养基中，利用IPTG诱导培养10h。按酶活检测方法检测嗜热菌蛋白酶酶活，选取酶活最高的重组菌株接种于LB液态培养基中过夜37℃振荡培养后，提取质粒并测序。共计得到3株具有正向效果的突变株，突变株的成熟序列第115位的氨基酸残基被替换，如Npr-115M1(W115S)，Npr-115M2(W115G)，Npr-115M3(W115N)(酶活数据见表2)。
表2突变株酶活数据
嗜热菌蛋白酶 全细胞催化剂酶活(U/mL)
Npr 11
Npr-115M1 13
Npr-115M2 17
Npr-115M3 14
实施例4：嗜热菌蛋白酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
将实施案例3中得到的嗜热菌蛋白酶酶活最高的重组质粒(含Npr-M2编码序列)转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取含氨苄卡那霉素的LB固体平板上长出的转化子进行单菌落PCR验证，测序后将菌株接种于LB液态培养基中37℃振荡培养过夜。重组大肠杆菌的发酵培养选用迪必尔公司3-L生物反应器，接种量1％，发酵培养基装液量2.1L，发酵过程搅拌转速500rpm，通气量1vvm，发酵温度28℃。当罐内菌体OD600为0.6时，添加0.4mM的IPTG诱导目的基因表达。IPTG诱导后6h回收发酵液，8000×g转速下离心10min，收集菌体，用20mM的Tris-HCl缓冲液冲洗菌体两次。用2％的Tris-HCl缓冲液配制OD600为0.8的细胞悬浮液，作为全细胞催化剂。
实施例5：全细胞催化合成阿斯巴甜温度的优化
全细胞催化反应在500mL三角摇瓶中进行，催化体系为：320mM苯丙氨酸甲酯，80mM苄氧羰基天冬氨酸，25g·L-1全细胞催化剂，反应条件为220rpm，反应时间为24h，设置三组不同温度下催化的实验(见表3)。
表3全细胞催化温度优化
反应温度(℃) 24h阿斯巴甜转化率(％)
28 52
31 58
34 70
37 66
实施例6：阿斯巴甜的纯化
随后将催化体系抽滤，可以得到阿斯巴甜的合成前体苄氧羰基阿斯巴甜(Cbz-APM)，用pH＝10的缓冲液溶解Cbz-APM后用稀盐酸调节pH＜5，再次抽滤后弃液体并将固体干燥，此时可获得高纯度的苄氧羰基阿斯巴甜。将阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜加入到含有钯碳的甲醇和叔丁醇体积比为1:1的溶液中，并在反应体系中通入氢气。在常温下搅拌6h，最后真空抽滤得到白色纯净的固体阿斯巴甜。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学，江苏汉光生物工程有限公司
<120> 一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 548
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Lys Met Lys Met Lys Leu Ala Ser Phe Gly Leu Ala Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Ala Gln Val Phe Leu Pro Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Thr Glu His
20 25 30
Val Thr Trp Asn Gln Gln Phe Gln Thr Pro Gln Phe Ile Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Leu Lys Val Asn Gly Thr Ser Pro Glu Glu Leu Val Tyr Gln Tyr
50 55 60
Val Glu Lys Asn Glu Asn Lys Phe Lys Phe His Glu Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys Asn Asp Asn Leu Gly Phe Thr Phe
85 90 95
Met Arg Phe Gln Gln Thr Tyr Lys Gly Ile Pro Val Phe Gly Ala Val
100 105 110
Val Thr Ser His Val Lys Asp Gly Thr Leu Thr Ala Leu Ser Gly Thr
115 120 125
Leu Ile Pro Asn Leu Asp Thr Lys Gly Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys
130 135 140
Leu Ser Glu Lys Gln Ala Arg Asp Ile Ala Glu Lys Asp Leu Val Ala
145 150 155 160
Asn Val Thr Lys Glu Val Pro Glu Tyr Glu Gln Gly Lys Asp Thr Glu
165 170 175
Phe Val Val Tyr Val Asn Gly Asp Glu Ala Ser Leu Ala Tyr Val Val
180 185 190
Asn Leu Asn Phe Leu Thr Pro Glu Pro Gly Asn Trp Leu Tyr Ile Ile
195 200 205
Asp Ala Val Asp Gly Lys Ile Leu Asn Lys Phe Asn Gln Leu Asp Ala
210 215 220
Ala Lys Pro Gly Asp Val Lys Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly
225 230 235 240
Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr
245 250 255
Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe
260 265 270
Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala
275 280 285
Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp
290 295 300
Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His
305 310 315 320
Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val
325 330 335
His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met
340 345 350
Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly
355 360 365
Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr
370 375 380
Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Met
385 390 395 400
Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro
405 410 415
Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp
420 425 430
Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His
435 440 445
Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile
450 455 460
Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly
465 470 475 480
Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly
485 490 495
Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn
500 505 510
Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr
515 520 525
Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala
530 535 540
Val Gly Val Lys
545
<210> 2
<211> 951
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ataacaggaa catcaactgt cggagtggga agaggagtac ttggtgatca aaaaaatatt 60
aatacaacct actctacgta ctactattta caagataata cgcgtggaaa tgggattttc 120
acgtatgatg cgaaataccg tacgacattg ccgggaagct tatgggcaga tgcagataac 180
caattttttg cgagctatga tgctccagcg gttgatgctc attattacgc tggtgtgaca 240
tatgactact ataaaaatgt tcataaccgt ctcagttacg acggaaataa tgcagctatt 300
agatcatccg ttcattatag ccaaggctat aataacgcat tttggaacgg ttcgcaaatg 360
gtgtatggcg atggtgatgg tcaaacattt attccacttt ctggtggtat tgatgtggtc 420
gcacatgagt taacgcatgc ggtaaccgat tatacagccg gactcattta tcaaaacgaa 480
tctggtgcaa ttaatgaggc aatgtctgat atttttggaa cgttagtcaa attttacgct 540
aacaaaaatc cagattggga aattggagag gatgtgtata cacctggtat ttcaggggat 600
tcgctccgtt cgatgtccga tccggcaaag tatggtgatc cagatcacta ttcaaagcgc 660
tatacaggca cgcaagataa tggcggggtt catatcaata gcggaattat caacaaagcc 720
gcttatttga ttagccaagg cggtacgcat tacggtgtga gtgttgtcgg aatcggacgc 780
gataaattgg ggaaaatttt ctatcgtgca ttaacgcaat atttaacacc aacgtccaac 840
tttagccaac ttcgtgctgc cgctgttcaa tcagccactg acttgtacgg ttcgacaagc 900
caggaagtcg cttctgtgaa gcaggccttt gatgcggtag gggtgaaata a 951
<210> 3
<211> 316
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 3
Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp
1 5 10 15
Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp
20 25 30
Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr
35 40 45
Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala
50 55 60
Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr
65 70 75 80
Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn
85 90 95
Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn
100 105 110
Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln
115 120 125
Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu
130 135 140
Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu
145 150 155 160
Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Met Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val
165 170 175
Lys Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val
180 185 190
Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro
195 200 205
Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr
210 215 220
Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala
225 230 235 240
Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val
245 250 255
Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr
260 265 270
Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala
275 280 285
Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala
290 295 300
Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys
305 310 315
<210> 4
<211> 548
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
Met Lys Met Lys Met Lys Leu Ala Ser Phe Gly Leu Ala Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Ala Gln Val Phe Leu Pro Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Thr Glu His
20 25 30
Val Thr Trp Asn Gln Gln Phe Gln Thr Pro Gln Phe Ile Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Leu Lys Val Asn Gly Thr Ser Pro Glu Glu Leu Val Tyr Gln Tyr
50 55 60
Val Glu Lys Asn Glu Asn Lys Phe Lys Phe His Glu Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys Asn Asp Asn Leu Gly Phe Thr Phe
85 90 95
Met Arg Phe Gln Gln Thr Tyr Lys Gly Ile Pro Val Phe Gly Ala Val
100 105 110
Val Thr Ser His Val Lys Asp Gly Thr Leu Thr Ala Leu Ser Gly Thr
115 120 125
Leu Ile Pro Asn Leu Asp Thr Lys Gly Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys
130 135 140
Leu Ser Glu Lys Gln Ala Arg Asp Ile Ala Glu Lys Asp Leu Val Ala
145 150 155 160
Asn Val Thr Lys Glu Val Pro Glu Tyr Glu Gln Gly Lys Asp Thr Glu
165 170 175
Phe Val Val Tyr Val Asn Gly Asp Glu Ala Ser Leu Ala Tyr Val Val
180 185 190
Asn Leu Asn Phe Leu Thr Pro Glu Pro Gly Asn Trp Leu Tyr Ile Ile
195 200 205
Asp Ala Val Asp Gly Lys Ile Leu Asn Lys Phe Asn Gln Leu Asp Ala
210 215 220
Ala Lys Pro Gly Asp Val Lys Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly
225 230 235 240
Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr
245 250 255
Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe
260 265 270
Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala
275 280 285
Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp
290 295 300
Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His
305 310 315 320
Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val
325 330 335
His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Gly Asn Gly Ser Gln Met
340 345 350
Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly
355 360 365
Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr
370 375 380
Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Met
385 390 395 400
Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Lys Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro
405 410 415
Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp
420 425 430
Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His
435 440 445
Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile
450 455 460
Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly
465 470 475 480
Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly
485 490 495
Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn
500 505 510
Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr
515 520 525
Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala
530 535 540
Val Gly Val Lys
545
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ctcgagatga aaatgaaaat gaaattagca tcgtttggt 39
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
tccgaattct tatttcaccc ctaccgcatc aaagg 35
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
ataacaggaa catcaactgt cggagt 26
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 8
ttgcgaaccg ttnnnaaatg cgttattata 30
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 9
gcatttnnna acggttcgca aatg 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ttatttcacc cctaccgcat caaagg 26
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
gacagttgat gttcctgtta tcgacttcac 30

Claims (10)

1.一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌异源表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嗜热菌蛋白酶Npr突变体。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的嗜热菌蛋白酶Npr突变体的氨基酸序列是将SEQ ID NO.1所示的亲本序列中，成熟序列的第115位色氨酸突变为甘氨酸，所述成熟序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是以pET系列载体表达嗜热菌蛋白酶Npr。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109或大肠杆菌W3110。
5.一种权利要求1~4任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将嗜热菌蛋白酶编码基因序列与载体连接，构建表达载体；
（2）将步骤（1）构建得到的表达载体转入大肠杆菌宿主中，得到表达嗜热菌蛋白酶的重组大肠杆菌。
6.一种权利要求1~4任一项所述的重组大肠杆菌在全细胞转化合成阿斯巴甜中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是以重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，催化苯丙氨酸甲酯和苄氧羰基天冬氨酸反应生成苄氧羰基阿斯巴甜。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的全细胞催化剂是将重组大肠杆菌在发酵培养基中培养收集得到的菌体，采用缓冲液配制成的细胞悬液；其中，所述的培养是在400~600rpm，25~30℃，通气量为0.8~1.2vvm条件下，培养至菌体OD600为0.5~0.7时，添加0.3~0.5 mM的IPTG诱导目的基因表达。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基为酵母粉20~25 g·L-1，胰蛋白胨10~15 g·L-1，甘油3~7 mL，15~20 mM磷酸氢二钾和70~75 mM磷酸二氢钾混合溶液80~120 mL。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的催化的体系为300~350mM苯丙氨酸甲酯，70~90 mM苄氧羰基天冬氨酸和20~30 g·L-1全细胞催化剂，催化的条件为31~37℃，200~250 rpm，反应时间为20~30 h。
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