CN113308443A - 一种红曲霉单加氧酶突变体及其应用 - Google Patents
一种红曲霉单加氧酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于单加氧酶领域，具体涉及一种红曲霉单加氧酶突变体及其应用。具体技术方案为：一种单加氧酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与野生型单加氧酶相比，本发明提供的单加氧酶突变体可更高效率地催化生成产物嗜氮酮。反应产物嗜氮酮的合成效率由44.2％提高到92.8％，分离纯化后嗜氮酮含量高于99％。本发明提供的单加氧酶催化产生的嗜氮酮产量更高、纯度更高、分离更简单。
Description
技术领域
本发明属于单加氧酶领域，具体涉及一种红曲霉单加氧酶突变体及其应用。
背景技术
嗜氮酮是一类具有吡喃醌双环结构的化合物，主要由微生物或植物产生。嗜氮酮的分子结构中，氧原子容易被有机氮化合物中的氮原子取代，因此得名嗜氮酮。这类化合物被发现具有抗癌、抗菌、消炎、减肥、降血压和降血脂等多种医疗功能。
目前最常用的制备嗜氮酮类化合物的方法是从植物中提取。但该方法受植物种植面积、植物品种以及气候变化等因素影响，导致嗜氮酮的产量和质量并不稳定。而如果利用微生物生产嗜氮酮，则能够克服上述缺点；且微生物发酵的生产成本更低。
微生物合成嗜氮酮的过程中，最关键的步骤是单加氧酶催化分子内的羰基与醛基缩合，得到嗜氮酮化合物。红曲霉能够产生大量嗜氮酮(红曲色素，Azanigerone E)，其分子结构式如下所示：
因此，红曲霉中能够催化合成嗜氮酮的单加氧酶(monooxygenase)，具有较高的潜在应用价值。但该酶的催化活性较低，阻碍了相关应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种红曲霉单加氧酶突变体及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种单加氧酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
相应的，一种单加氧酶突变体，将野生型单加氧酶第176位的精氨酸突变为丙氨酸，野生型单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
相应的，所述单加氧酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
(1)从红曲霉中提取、获得野生型单加氧酶编码DNA片段，如SEQ ID NO.3所示；
(2)使用基因技术，对野生型单加氧酶编码DNA片段进行点突变，获得带有单加氧酶突变体基因的重组质粒；
(3)将重组质粒转化到微生物中，培养微生物，获得所述单加氧酶突变体。
优选的，步骤(2)制备重组质粒的方法为：设计并合成带有点突变的引物，引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，以质粒pET30a(+)-WT为模板，通过PCR技术实现质粒滚环复制，利用引物获得带有单加氧酶突变体基因的重组质粒。
优选的，步骤(3)所述微生物为大肠杆菌。
相应的，所述单加氧酶突变体在催化制备嗜氮酮中的应用。
优选的，将2-醛基-苯乙酮溶于PBS缓冲液，加入单加氧酶突变体和NADPNa进行反应，即得产物嗜氮酮。
优选的，反应完成后，加入乙酸乙酯萃取提纯产物。
本发明具有以下有益效果：与野生型单加氧酶相比，本发明提供的单加氧酶突变体可更高效率地催化生成嗜氮酮。反应产物中，嗜氮酮的生成效率由44.2％提高到92.8％，分离纯化后嗜氮酮含量高于99％。本发明提供的单加氧酶所产生的嗜氮酮产量更高、纯度更高、分离更简单。
具体实施方式
本发明提供了一种红曲霉单加氧酶突变体，具体为：一种单加氧酶，在野生型单加氧酶的基础上，将野生型单加氧酶第176位的精氨酸突变为丙氨酸。野生型单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变后的单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
1、构建野生型单加氧酶及其突变体的大肠杆菌表达菌株。
在PDB培养基中培养红曲霉10天后，过滤获得菌丝体。称取200mg菌丝体，置于液氮中预冷处理。随后将菌丝体放入研钵内，加入液氮迅速进行研磨，然后加入1mL TRIZOL溶液并立即震荡，提取获得总mRNA。再通过反转录酶获得总cDNA。
通过PCR技术扩增获得单加氧酶的编码DNA片段，如SEQ ID NO.3所示，所用引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。利用限制性内切酶(HindIII与EcoRI)在37℃分别对单加氧酶的DNA片段和空载的pET30a(+)的DNA片段进行双酶切。再用DNA片段回收试剂盒纯化回收两种DNA片段，在T4 DNA连接酶的作用下,将两种DNA片段进行过夜酶连，得到酶连产物。利用所述酶接产物转化大肠杆菌菌株后，将转化菌株涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上，37℃下培养24小时。挑取单菌落，PCR验证是否含有单加氧酶DNA片段，以确定包含有重组质粒的大肠杆菌菌株。用质粒提取试剂盒，提取获得重组质粒pET30a(+)-WT。设计并合成带有点突变的引物，引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，以质粒pET30a(+)-WT为模板，通过PCR技术实现质粒滚环复制，利用引物获得带有单加氧酶突变体基因的重组质粒pET30a(+)-MU。将2种重组质粒分别转化进大肠杆菌BL21(DE3)细胞，得到2种对应的重组大肠杆菌。
2、单加氧酶的表达与纯化。将两种重组大肠杆菌分别接种到LB培养基中，培养到OD600≈1.0时，加入0.5mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，18℃诱导培养24小时后，离心除去上清液获得菌体。用PBS缓冲液(50mM，pH＝7.0)重悬大肠杆菌菌体。然后利用超声波破碎方法破碎菌体，离心弃去沉淀，得上清液，即为单加氧酶的溶液。向上清液中加入500mM的NaCl和30mM的咪唑，然后加入到镍亲和层析柱中，保持30min，使用洗脱液(洗脱液组成：50mM的PBS，500mM的NaCl，250mM的咪唑，pH＝7)以1ml/min的流速冲洗镍亲和层析柱。将洗脱得到的蛋白样品通过透析的方法除去NaCl与咪唑，再进行冷冻干燥，即分别得到野生型单加氧酶和单加氧酶突变体。
3、利用单加氧酶催化生成嗜氮酮。将5.0mg的2-醛基-苯乙酮溶于2mL的PBS缓冲液(pH＝7.0)，并加入5mg野生型单加氧酶或单加氧酶突变体，并加入0.5mg NADPNa，在35℃下反应1h。加入2mL乙酸乙酯，震荡萃取产物，加入无水Na2SO4干燥，然后通过减压蒸馏除去乙酸乙酯，所得1.5mg固体样品用3mL甲醇溶解。通过HPLC与LC-MS/MS对提取样品进行分析，与Azanigerone E嗜氮酮标准物的HPLC保留时间以及分子量一致，确认产物的确为嗜氮酮Azanigerone E(红曲色素)。5.0mg底物2-醛基-苯乙酮理论上能够转化为4.96mg的产物Azanigerone E。利用Azanigerone E标准物建立HPLC的标准曲线，通过HPLC测定样品中的Azanigerone E峰面积，计算得到Azanigerone E的质量浓度。野生型单加氧酶合成嗜氮酮的产率为44.2％(2.19mg)，单加氧酶突变体催化合成嗜氮酮的产率为92.8％(4.60mg)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种红曲霉单加氧酶突变体及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 436
<212> PRT
<213> 野生型单加氧酶(monooxygenase)
<400> 1
Met Pro Gly Val Thr Lys Glu Glu Pro Gln Leu Asp Leu Ala Ile Ile
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ile Thr Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu Ser Arg
20 25 30
Asn Ile His Val Thr Ile Tyr Glu Arg Ala Arg Gln Phe Arg Glu Ile
35 40 45
Ala Gly Ala Ile Leu Phe Thr Pro Asn Ala Glu Arg Ser Met Ile Gly
50 55 60
Val Asp Pro Arg Val His Gly Leu Phe Lys Asn Leu Gly Thr Pro Asn
65 70 75 80
Glu Thr Asp Val Phe Arg Trp Val Asp Ala Tyr Thr His Tyr Ser Asp
85 90 95
Glu Arg Tyr Glu Glu Val Ala Phe Glu Thr Asp Leu Gly Lys Arg Gly
100 105 110
Phe Glu Gly Cys His Arg Ala Gln Phe Leu Asp Glu Leu Val Lys Leu
115 120 125
Ala Pro Glu Lys Asn Ala Arg Val Gly Lys Thr Ala Arg Arg Val Thr
130 135 140
Glu Lys Val Asp Gly Glu Lys Val Ala Gly Glu Phe Glu Asp Ala Ser
145 150 155 160
Thr Ala Glu Ala Asp Gly Leu Ile Ala Cys Asp Gly Ile Arg Ser Arg
165 170 175
Val Arg Gln Leu Ile Val Ala Glu Asp Asn Pro Gly Ser Tyr Pro Arg
180 185 190
Tyr Ser His Lys Ser Gly Phe Arg Gly Leu Val Pro Met Asp Arg Gly
195 200 205
Val Asp Val Met Gly Arg Glu Lys Val Ala Thr Arg His Met His Leu
210 215 220
Gly Gln Asp Ala His Leu Val Thr Phe Pro Val Gly Met Ala Lys Leu
225 230 235 240
Leu Asn Val Val Ala Phe Ala Thr Asp Pro Ala Glu Trp Pro His Glu
245 250 255
Glu Lys Val Ser Ala Pro Ala Ser Lys Glu Glu Gly Leu Gln Ala Phe
260 265 270
Ser Gly Phe Gly His Val Val Arg Gly Gly Met Asp Val Ala Pro Asp
275 280 285
Thr Leu Asp Arg Trp Leu Val Phe Asp Thr Tyr Asp His Pro Ala Ser
290 295 300
Thr Tyr Val Arg Gly Arg Met Cys Ile Gly Ala Asp Ala Ala His Leu
305 310 315 320
Ser Ser Pro His His Ala Val Ala Leu Gly Thr Gly Ile Glu Asp Gly
325 330 335
Gly Val Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Gly Ser Glu Thr Ala Ser Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Thr Lys Ala Glu Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Thr Tyr
355 360 365
Asp Gly Ile Arg Val Glu Arg Ser Gln Trp Ala Gly Gln Ser Ser Arg
370 375 380
Ile Leu Ala Glu Val Tyr Glu Trp Gln Tyr Glu Pro Thr Ala Arg Asp
385 390 395 400
Gly Val Lys Cys Gly Ala Glu Leu Tyr Trp Arg Ser His Gln Ile Trp
405 410 415
Asp Tyr Asp Leu Asp Asp Met Ala Arg Arg Thr Gly Glu Asp Tyr Arg
420 425 430
Arg Arg Val Glu
435
<210> 2
<211> 436
<212> PRT
<213> 单加氧酶突变体(monooxygenase)
<400> 2
Met Pro Gly Val Thr Lys Glu Glu Pro Gln Leu Asp Leu Ala Ile Ile
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ile Thr Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Leu Leu Ser Arg
20 25 30
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35 40 45
Ala Gly Ala Ile Leu Phe Thr Pro Asn Ala Glu Arg Ser Met Ile Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Glu Arg Tyr Glu Glu Val Ala Phe Glu Thr Asp Leu Gly Lys Arg Gly
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Glu Lys Val Asp Gly Glu Lys Val Ala Gly Glu Phe Glu Asp Ala Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Val Arg Gln Leu Ile Val Ala Glu Asp Asn Pro Gly Ser Tyr Pro Arg
180 185 190
Tyr Ser His Lys Ser Gly Phe Arg Gly Leu Val Pro Met Asp Arg Gly
195 200 205
Val Asp Val Met Gly Arg Glu Lys Val Ala Thr Arg His Met His Leu
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Gly Gln Asp Ala His Leu Val Thr Phe Pro Val Gly Met Ala Lys Leu
225 230 235 240
Leu Asn Val Val Ala Phe Ala Thr Asp Pro Ala Glu Trp Pro His Glu
245 250 255
Glu Lys Val Ser Ala Pro Ala Ser Lys Glu Glu Gly Leu Gln Ala Phe
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Thr Tyr Val Arg Gly Arg Met Cys Ile Gly Ala Asp Ala Ala His Leu
305 310 315 320
Ser Ser Pro His His Ala Val Ala Leu Gly Thr Gly Ile Glu Asp Gly
325 330 335
Gly Val Leu Gly Gly Val Leu Gly Gly Gly Ser Glu Thr Ala Ser Ser
340 345 350
Leu Ala Lys Thr Lys Ala Glu Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Thr Tyr
355 360 365
Asp Gly Ile Arg Val Glu Arg Ser Gln Trp Ala Gly Gln Ser Ser Arg
370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
Arg Arg Val Glu
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<210> 3
<211> 1308
<212> DNA
<213> 野生型单加氧酶(monooxygenase)
<400> 3
atgcccggcg tgaccaagga ggagccccag ctggacctgg ccatcatcgg cggcggcatc 60
accggcctga gcctggccgc cggcctgctg agcaggaaca tccacgtgac catctacgag 120
agggccaggc agttcaggga gatcggcgcc ggcatcggct tcacccccaa cgccgagagg 180
agcatgatcg ccctggaccc cagggtgcac gccgccttca agaacgtggc cacccccaac 240
gagaccgacc tgttcaggtg ggtggacggc tacacccact acagcgacga gaggtacgag 300
gagctgctgt tcgagaccga cctgggcaag aggggcttcg agggctgcca cagggcccag 360
ttcctggacg agctggtgaa gctgatcccc gagaagaacg tgaggctggg caagaccctg 420
aggagggtga ccgagaaggt ggacggcgag aagctgctgc tggagttcga ggacggcagc 480
accgccgagg ccgacgccgt gatcggctgc gacggcatca ggagcagggt gaggcagctg 540
atcctgggcg aggacaaccc cgccagctac cccaggtaca gccacaagag cgccttcagg 600
ggcctggtgc ccatggacag ggccgtggac gccatgggca gggagaaggc cctgaccagg 660
cacatgcacc tgggccagga cgcccacgtg ctgaccttcc ccgtggccat gggcaagctg 720
ctgaacgtgg tggccttcgt gaccgacccc ggcgagtggc cccacgagga gaagctgagc 780
gcccccgcca gcaaggagga ggccgtgcag gccttcagcg gcttcggcca cgtggtgagg 840
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caccccgcca gcacctacgt gaggggcagg atgtgcatcg ccggcgacgc cgcccacgcc 960
agcagccccc accacggcgc cggcgccggc accggcatcg aggacgccgc cgtgctggcc 1020
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ctgagggccg ccctggccac ctacgacgcc atcaggctgg agaggagcca gtgggtggtg 1140
cagagcagca ggatcctggg cgagctgtac gagtggcagt acgagcccac cggcagggac 1200
gccgccaagt gcggcgccga ggtgtactgg aggagccacc agatctggga ctacgacgtg 1260
gacgacatgc tgaggaggac cgccgaggac tacaggagga ggctggag 1308
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 扩增野生型单加氧酶的正向引物(monooxygenase)
<400> 4
attcgcgaat tcatgcccgg cgtgaccaag gag 33
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 扩增野生型单加氧酶的反向引物(monooxygenase)
<400> 5
ggctataagc ttctccagcc tcctcctgta gtcc 34
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 扩增单加氧酶突变体的正向引物(monooxygenase)
<400> 6
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<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 扩增单加氧酶突变体的反向引物(monooxygenase)
<400> 7
gctgcctcac ggcgctcctg atgc 24
Claims (8)
1.一种单加氧酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种单加氧酶突变体，其特征在于：将野生型单加氧酶第176位的精氨酸突变为丙氨酸，野生型单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述单加氧酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)从红曲霉中提取、获得野生型单加氧酶编码DNA片段，如SEQ ID NO.3所示；
(2)使用基因技术，对野生型单加氧酶编码DNA片段进行点突变，获得带有单加氧酶突变体基因的重组质粒；
(3)将重组质粒转化到微生物中，培养微生物，获得所述单加氧酶突变体。
4.根据权利要求3所述的单加氧酶突变体的制备方法，其特征在于：步骤(2)制备重组质粒的方法为：设计并合成带有点突变的引物，引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，以质粒pET30a(+)-WT为模板，通过PCR技术实现质粒滚环复制，利用引物获得带有单加氧酶突变体基因的重组质粒。
5.根据权利要求3所述的单加氧酶突变体的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述微生物为大肠杆菌。
6.权利要求1或2所述单加氧酶突变体在制备嗜氮酮中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：将2-醛基-苯乙酮溶于PBS缓冲液，加入所述单加氧酶突变体和NADPNa进行反应，即得产物嗜氮酮。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：反应完成后，加入乙酸乙酯萃取提纯产物。
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