CN116063420B - 转录因子MrMrl3突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，具体涉及转录因子MrMrl3突变体及其应用。具体技术方案为：转录因子突变体MrMrl3，在转录因子MrMrl3基础上突变获得，所述突变至少包括：将第22位Arg突变为Lys，第30位Arg突变为Ile，第35位Asp突变为Lys，将第47位Ser突变为Leu；所述转录因子MrMrl3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明将突变体基因MrMrl3通过农杆菌介导的同源重组方法，替换红曲菌基因组中的原始MrMrl3基因，得到突变菌株。突变菌株不仅大幅降低了桔霉素产量，还一定程度上提升了红曲色素的产量。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及转录因子MrMrl3突变体及其应用。
背景技术
红曲菌(Monascus spp.，也称红曲霉)能够产生红曲色素，是重要的天然食品着色剂之一。但红曲菌株在产生红曲色素的同时，也会产生一种真菌毒素：桔霉素(也称橘霉素或桔青霉素，citrinin)。桔霉素具有肾脏毒性，会污染红曲菌发酵产品。为此各国制定了相关产品中的桔霉素限量标准，如我国国标GB 1886.66-2015《食品安全国家标准食品添加剂红曲黄色素》规定：红曲黄色素产品中桔霉素的最高限量为1.0mg/kg。
红曲菌中，与桔霉素的生物合成相关的基因至少有16个，其中，转录因子MrMrl3能够调控这些桔霉素生物合成基因的转录表达，从而控制桔霉素的合成与积累，因此转录因子MrMrl3是影响红曲产品中桔霉素含量的关键基因。目前有研究希望通过敲除MrMrl3基因来消除桔霉素的合成，但结果表明这一方法不但不能消除桔霉素，反而还会导致红曲色素产量下降，其中的科学原理尚不清楚。所以，急需找到一种新的方法来降低桔霉素含量且不影响红曲色素产量。
发明内容
本发明的目的是提供转录因子MrMrl3及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：转录因子突变体MrMrl3，在转录因子MrMrl3基础上突变获得，所述突变至少包括：将第22位Arg突变为Lys，第30位Arg突变为Ile，第35位Asp突变为Lys，将第47位Ser突变为Leu；所述转录因子MrMrl3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
相应的，转录因子突变体MrMrl3，所述转录因子突变体MrMrl3的氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
相应的，编码所述转录因子突变体MrMrl3的DNA序列。
相应的，编码所述转录因子突变体MrMrl3的DNA序列。
相应的，含有所述转录因子突变体MrMrl3的氨基酸序列的重组质粒。
相应的，含有所述DNA序列的表达质粒。
相应的，含有所述重组质粒或含有所述表达质粒的宿主微生物。
相应的，所述转录因子突变体MrMrl3或所述DNA序列在降低微生物的桔霉素表达量和/或提高微生物的红曲色素表达量中的应用。
优选的，所述微生物为红曲菌。
相应的，一种重组微生物，利用所述转录因子突变体MrMrl3替换原始转录因子MrMrl3。
本发明具有以下有益效果：本发明对MrMrl3中的4个氨基酸残基(22位Arg、30位Arg、35位Asp、47位Ser)分别进行了定点突变，再将突变体基因MrMrl3通过农杆菌介导的同源重组方法，替换红曲菌基因组中的原始MrMrl3基因，得到突变菌株。突变菌株不仅大幅降低了桔霉素产量，还一定程度上提升了红曲色素的产量。
具体实施方式
本发明提供了转录因子MrMrl3突变体，在原始MrMrl3基础上做了如下突变：将第22位Arg突变为Lys，第30位Arg突变为Ile，第35位Asp突变为Lys，将第47位Ser突变为Leu。原始MrMrl3的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。MrMrl3突变体的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。使用ATCC 96218有效降低红曲菌的桔霉素产量。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
1、引物1从红曲菌ATCC 96218基因组中通过PCR技术克隆得到MrMrl3的DNA片段。
引物1包括：F:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCATGGCCTCCACCGCAC；R:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCAGTCATTGCAGGGCAGTGA。
将MrMrl3的基因片段与通用质粒pCB301用HindⅢ与EcoRⅠ分别进行双酶切，所得两种酶切产物用DNA浓度测定仪测定浓度，然后按DNA浓度1:1进行混合，在16℃下用T4 DNA连接酶进行酶连，获得酶连产物。利用酶连产物转化大肠杆菌TOP10，将转化菌株通过卡纳霉素抗性平板筛选，能够生长的大肠杆菌菌株包含有正确的重组质粒。培养大肠杆菌菌株后，提取重组质粒。
以重组质粒DNA为模板，利用引物2通过PCR技术进行序列扩增，所得扩增产物转化化大肠杆菌TOP10，挑取大肠杆菌单菌落进行培养，提取重组质粒，测序验证MrMrl3基因上的突变是否正确。正确的突变序列DNA则作为下一次突变的模板DNA。依照该方法，依次对设计的突变位点使用引物3、4、5进行突变，得到含有4个位点突变的重组质粒。
引物2包括：F：GACAACGGACAGGAAAAGCGTGCGAGGAATGCC；R：CATTCCTCGCACGCTTTTCCTGTCCGTTGTCGCT。将第22位的Arg突变为Lys。
引物3包括：F:GAGGAATGCCGGCGAATTAAACTACGCTGTGACGGAC；R：CGTCACAGCGTAGTTTAATTCGCCGGCATTCCTCG。将第30位的Arg突变为Ile。
引物4包括：F：GCAAACTACGCTGTAAAGGACAGCAACCGCGG；R：CCGCGGTTGCTGTCCTTTACAGCGTAGTTTGCGTCG。将第35位的Asp突变为Lys。
引物5包括：F：CGGAGTTTGTGTGGATCTGGGTGTAACCTGCGAGGT；R：CTCGCAGGTTACACCCAGATCCACACAAACTCCGCAC。将第47位的Ser突变为Leu。
2、取5μL重组质粒加入100μL农杆菌EHA105感受态细胞中，将混合物浸入液氮5min，然后在37℃下水浴5min。随后加入800μL的新鲜LB培养基，在28℃、120r/min下温育3h。然后将菌液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，28℃培养36h，培养至长出单菌落。提取阳性转化子的质粒，通过PCR验证确定正确的重组农杆菌。
3、将红曲菌ATCC 96218接种到CYA培养基斜面上，28℃培养5d。随后用无菌水洗下孢子，得到孢子悬液(5×105个/mL)。将重组农杆菌接种到5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中，28℃、150r/min振荡培养至OD600约为0.8。收集菌体，并用诱导培养基稀释农杆菌至OD600为0.5，再在28℃、150r/min下培养6h，得农杆菌液。诱导培养基组分为：NH4NO30.5g/L，NaCl 0.3g/L，CaCl2·2H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.5mg/L，Na2-EDTA·2H2O 1.3mg/L。
用所述农杆菌液将所述红曲菌孢子悬液稀释至105个/mL，然后吸取200μL涂布于新的诱导培养基平板(在诱导培养基基础上增加琼脂)上，28℃下培养2d。将长出的单菌落挑至含30mg/L潮霉素B的PDA培养基上。继续在28℃下培养，再挑取生长的单菌落接种到新的含潮霉素B的PDA平板上培养。培养5天后，取单菌落提取基因组，通过PCR的方法使用所述引物1验证突变MrMrl3基因，得到重组红曲菌株M1。
4、将原始红曲菌株ATCC 96218和重组红曲菌株M1分别接种到新鲜PDB培养基中，分别在28℃、120rpm下培养7天。随后分别过滤收集菌丝体，迅速加入液氮冷却后研磨成细粉，加入80％浓度的乙醇溶液，在40℃条件下萃取1小时，然后离心除去沉淀物，获得含有红曲色素和桔霉素的上清液。
对上述各上清液利用HPLC分别测定原始红曲菌株和重组红曲菌株M1产物中红曲色素和桔霉素的浓度。原始红曲菌株提取液中的红曲色素和桔霉素浓度分别为6840U/L和2.3mg/L，重组红曲菌株M1中红曲色素和桔霉素浓度分别为7130U/L和0.3mg/L，桔霉素浓度下降87％，红曲色素产量提高5％。
按上述方法，在10种不同来源的红曲菌中均使用转录因子MrMrl3突变体替代原始MrMrl3，获得10种重组红曲菌株。将各重组红曲菌与其对应原始红曲菌分别在28℃、120rpm下在PDB培养基中培养7天，相同条件下测试红曲色素浓度和桔霉素浓度。结果显示：各重组红曲菌相较于原始菌株，红曲色素浓度上升3％～11％，桔霉素浓度下降79％～93％。
另外，发明人发现：对于其他含有桔霉素的生物合成相关的必需基因(citC、citE、mrl5、citD、MrMrl3/ctnA、citB、citA/ctnB、citS和mrr1)的微生物，按如上方式相应将转录因子MrMrl3替换为转录因子MrMrl3突变体，也可有效降低桔霉素的产量。发明人在桔青霉(Penicillium citrinum)、红色红曲菌(Monascus ruber)和紫色红曲菌(Monascuspurpureus)中进行了相应转录因子替换试验，桔霉素产量均极显著下降(桔霉素浓度下降71％～89％)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.转录因子突变体MrMrl3，其特征在于：所述转录因子突变体MrMrl3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.编码权利要求1所述转录因子突变体MrMrl3的DNA。
3.含有表达权利要求1所述转录因子突变体MrMrl3对应氨基酸的核苷酸的重组质粒。
4.含有权利要求2所述DNA的表达质粒。
5.含有权利要求3所述重组质粒或含有权利要求4所述表达质粒的宿主微生物。
6.权利要求1所述转录因子突变体MrMrl3或权利要求2所述DNA在降低微生物的桔霉素表达量和/或提高微生物的红曲色素表达量中的应用，其特征在于：所述微生物为红曲菌。
7.一种重组微生物，其特征在于：利用权利要求1所述转录因子突变体MrMrl3替换原始转录因子MrMrl3。
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