CN115724926B - 红曲菌转录因子mrTP5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一个来源于红曲菌的转录因子mrTP5及其应用。具体技术方案为：转录因子mrTP5，所述转录因子mrTP5的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次发现了一种新的来自红曲菌的转录因子mrTP5，该转录因子可显著抑制红曲菌及类似丝状真菌的生长和发育。

Description

红曲菌转录因子mrTP5及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及红曲菌转录因子mrTP5及其应用。

背景技术

红曲菌(Monascus spp.)是一种丝状真菌，在医药、食品等行业有着广泛应用。研究报道，红曲菌及其代谢产物具有降血脂、降血压、抗氧化等多种功效，且红曲菌代谢产生的红曲色素也具有巨大的工业价值。因此，对红曲菌的研究一直是行业热点。

通过基因工程改造红曲菌是获得高性能红曲菌株的重要方法。然而，现有技术中，对红曲菌进行基因工程改造时，可以使用的筛选标记较少，目前能够使用的只有潮霉素和新霉素等，这一问题极大限制了对红曲菌的改造。

如果能发掘一种新的与红曲菌生长高度相关的基因，将能够用于红曲菌基因改造过程中的重组菌株快速筛选，这对红曲菌的筛选、改造具有重要的研究价值和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供红曲菌转录因子mrTP5及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：转录因子mrTP5，所述转录因子mrTP5的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

相应的，利用所述转录因子mrTP5的DNA序列编码的氨基酸。

相应的，含有所述转录因子mrTP5的DNA的表达质粒。

优选的，所述表达质粒中包括诱导型启动子。

优选的，所述诱导型启动子为Ptef1、Ptet、PlacI和ParaC中的任意一种。

相应的，含有所述氨基酸的重组质粒。

相应的，含有所述DNA或所述氨基酸的宿主微生物。

相应的，所述DNA或所述氨基酸在抑制丝状真菌生长中的应用。

优选的，所述丝状真菌包括：红曲菌、米曲霉、黑曲霉、黄曲霉和青霉。

相应的，所述DNA或所述氨基酸在丝状真菌基因改造中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明首次发现了一种新的来自红曲菌的转录因子mrTP5，该转录因子可显著抑制红曲菌及类似丝状真菌的生长和发育。

附图说明

图1为重组质粒结构示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种新的来自红曲菌的转录因子mrTP5，所述转录因子mrTP5基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，在NCBI公共数据库中未发现同源基因，也未发现同源氨基酸序列。所述转录因子mrTP5的表达能够显著抑制红曲菌孢子的萌发和生长。本发明还基于转录因子mrTP5进一步构建提供了对应基因操作质粒。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。

实施例

1、提取总RNA，获得cDNA。将红曲菌ATCC 96218接种于PDA平板，28℃培养7天，刮取红曲菌菌丝，称取200mg并加入液氮迅速研磨。PDB培养基成分(g/L)：马铃薯浸粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖15g，氯化钠5g。除特别说明外，本实施例中PDB培养基成分与此相同。再向研磨好的菌丝粉末中加入TRIZOL溶液并立即震荡，静置5min。再加入氯仿溶液，剧烈震荡使其混匀后室温静置5min。随后12000r/min离心10min，吸取上清液，移至离心管中，加入等体积异丙醇混匀。再静置15min，随后12000r/min离心10min，移除上清液。加入75％乙醇洗涤沉淀，随后12000r/min离心并移除上清液，再加入双蒸水，得到红曲菌ATCC96218的总RNA溶液。

以提取的总RNA为模板，利用BeyoRT^TMII cDNA合成试剂盒，获得cDNA，储存于-80℃备用。

2、使用酚氯仿方法提取米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株的基因组，利用引物克隆得到启动子Ptef1的DNA片段(如SEQ ID NO.3所示)。所述引物包括：F：GTAGATTGTCACCGCTCAG；R：AGAGCTATTCCTAGTGAGCCCTTTGAAGGTGGTGCGAACTTT。需要说明的是：启动子并不限定于只能使用Ptef1，使用Ptet、PlacI和ParaC等诱导型启动子都可以。

以步骤1获得的红曲菌cDNA为模板，使用扩增引物克隆获得mrTP5基因的DNA序列全长，如SEQ ID NO.1所示。所述扩增引物包括：F：ATGCTGTCCCACCCGCGC；R：TCAATCAATCCATG。

使用限制性内切酶NspI通用质粒pCB301进行酶切得到线性质粒。利用多DNA片段重组试剂盒(HieffClone^TMMulti One Step Pcr Cloning Kit)将启动子Ptef1片段、mrTP5基因片段和线性pCB301质粒片段组装成一个重组质粒，结构如图1所示，以便利用启动子Ptef1调控mrTP5基因的转录表达。将获得的所述重组质粒转化大肠杆菌TOP10菌株，培养后挑取阳性菌株单菌落，进行培养并提取重组质粒。

将重组质粒与农杆菌EHA105感受态细胞混合，然后用液氮预冷5min，再37℃水浴5min，加入800μL的新鲜LB培养基，在28℃和120r/min条件下温育5h。将菌液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的平板上，28℃培养36h。提取阳性转化子的质粒，通过PCR验证，得到重组农杆菌。

将重组农杆菌接种到含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中，在28℃、150r/min下培养至OD₆₀₀约为1.0。离心收集菌体，用诱导培养基稀释农杆菌至OD₆₀₀为0.5，在28℃、150r/min下培养6h，得农杆菌菌液。诱导培养基组分为：NH₄NO₃ 0.5g/L，NaCl 0.3g/L，CaCl₂·2H₂O 0.01g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 1.3mg/L。

3、将红曲菌ATCC 96218接种到PDA平板28℃培养7d。PDA固体培养基是在PDB培养基的基础上添加2％琼脂粉获得的。用无菌水洗涤得到孢子悬液(5×10⁵个/mL)。用重组农杆菌液将红曲菌孢子稀释至10⁵个/mL，然后涂布于诱导培养基平板上，28℃培养2d。将单菌落接种到含有30mg/L潮霉素B的PDA培养基上。28℃培养3天后，挑取生长的单菌落接种到新的PDA平板上培养。培养5天后，使用酚氯仿方法提取基因组，通过PCR的方法使用引物验证启动子Ptef1和mrTP5基因片段正确整合进红曲菌ATCC 96218基因组，得到重组红曲菌株J1。所述引物包括：F：ATGCTGTCCCACCCGCGC；R：TCAATCAATCCATG。

4、将原始红曲菌ATCC 96218和重组红曲菌株J1分别接种到新鲜的mCD培养基(葡萄糖30g/L,NaNO₃ 10g/L,KH₂PO₄ 5g/L,Na₂HPO₄ 3g/L,MgSO₄ 0.1g/L,CaCl₂ 0.1g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.1g/L,FeSO₄·7H₂O 0.1g/L)中。此处所用培养基并不局限于mCD培养基，只要培养基中不含有诱导启动子的组分，即可抑制mrTP5基因的表达；本实施例使用启动子Ptef1，葡萄糖可抑制启动子Ptef1对下游基因的转录能力。在28℃与120rpm条件下培养3天，观察两种菌株的生长速度基本一致，原始红曲菌ATCC96218和重组红曲菌株J1的生物量分别为6.1g/L和6.0g/L。将mCD培养基中的葡萄糖成分替换为等量蔗糖，其他条件完全相同的情况下，分别培养原始红曲菌ATCC 96218和重组红曲菌株J1。培养3天后，原始红曲菌ATCC 96218和重组红曲菌株J1的生物量分别为6.1g/L和1.2g/L。证明在蔗糖诱导下，mrTP5基因能够显著抑制红曲菌生长，可用于基因工程改造红曲菌的筛选。

按照步骤3的方法，将启动子Ptef1和mrTP5基因片段整合到其他市购红曲菌(使用10种不同来源的红曲菌)中，获得10种重组红曲菌株。将各重组红曲菌与其对应原始红曲菌分别在28℃、120rpm在mCD培养基(葡萄糖)和mCD培养基(蔗糖替代葡萄糖)中培养3天。结果显示：在蔗糖诱导下，10种重组红曲菌相较于原始红曲菌，生物量均显著下降，分别下降至原始红曲菌生物量的12％～20％；而在葡萄糖诱导下生长没有显著差异。证明mrTP5基因能够显著抑制红曲菌生长具有普适性。

需要说明的是：mrTP5基因抑制红曲菌的生长和碳源(蔗糖/葡萄糖)没有关系，根据发明人的在先研究，蔗糖可以诱导启动子Ptef1对下游基因的转录能力，葡萄糖会抑制启动子Ptef1对下游基因的转录能力，因此使用蔗糖/葡萄糖作为单一碳源来源，可以控制启动子Ptef1的表达，进而实现mrTP5基因表达的控制，从而展示mrTP5基因表达对红曲菌生长的影响。发明人使用其它启动子例如Ptet代替Ptef1时，蔗糖/葡萄糖则相应不再表现出调控mrTP5表达的作用，但mrTP5基因表达时，仍然会显著抑制红曲菌的生长。

另外，发明人发现：mrTP5基因还可显著抑制米曲霉、黑曲霉、黄曲霉和青霉的生长。验证实验同上，不再赘述。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.转录因子mrTP5，其特征在于：所述转录因子mrTP5的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述转录因子mrTP5的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.含有权利要求2所述基因的表达质粒。

4.根据权利要求3所述表达质粒，其特征在于：所述表达质粒中包括诱导型启动子。

5.根据权利要求4所述表达质粒，其特征在于：所述诱导型启动子为Ptef1、Ptet、PlacI和ParaC中的任意一种。

6.含有权利要求2所述基因的重组质粒。

7.含有权利要求3～5任意一项所述表达质粒的宿主微生物。

8.权利要求1所述转录因子mrTP5或权利要求2所述基因在抑制丝状真菌生长中的应用，其特征在于，所述丝状真菌为红曲菌。

9.权利要求1所述转录因子mrTP5或权利要求2所述基因在丝状真菌基因改造中的应用，其特征在于：所述丝状真菌为红曲菌，所述基因改造用于诱导转录因子mrTP5的表达，抑制红曲菌的生长。