SK279052B6 - Mikroorganizmy na stabilizáciu plazmidov, spôsob i - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka mikroorganizmov, ktoré sú transformované hybridným plazmidom obsahujúcim DNA-fragment a spôsobu ich prípravy. Vynález sa tiež týka použitia týchto mikroorganizmov ako produkčných kmeňov so stabilnými plazmidmi.

Doterajší stav techniky

Na základe molekulárnej biológie sa všeobecne vie, že sa na výrobu určitých zlúčenín transformujú mikroorganizmy tzv. „umelým plazmidom“, do ktorého sa vložia gény, ktoré kódujú určitú zlúčeninu. Zvláštnym problémom týchto plazmidov je ich stabilita, to znamená ich vlastnosť, keď sú nekontrolovane prenášané na dcérske bunky v priebehu bunkového delenia mikroorganizmov. To spôsobuje, že sa v priebehu fermentácie vyskytuje stále viac, dcérskych buniek, ktoré neobsahujú žiadny plazmid, prípadne obsahujú menej plazmidov. V laboratórnom merítku je možné tejto strate plazmidov zamedziť tým, že sa do kultivačného média pridá antibiotikum, ktorého zodpovedajúci rezistentný gén k antibiotiku plazmid obsahuje. Pri fermentácii v priemyselnom meradle sa však pridanie zodpovedajúceho antibiotika ukázalo ako nevýhodné. Tak ukázali napríklad niektoré antibiotiká, ako je tetracyklín, nepriaznivý účinok na schopnosť rastu, delenia a pestovania mikroorganizmov obsahujúcich plazmid, ako sa uvádza v Bioscience Reports, 5, 1985, str. 29-37 a v Gene, 39, 1985, str. 173-180. Ďalšia nevýhoda stabilizácie antibiotikom spočíva v tom, že prídavok antibiotika v priemyselnom meradle je drahý. Navyše je prídavok antibiotika pri výrobe farmaceutických prostriedkov a rovnako aj pri výrobe potravinárskych a krmovinových prídavných látkach nežiaduci alebo neprípustný.

Ďalšia metóda na zamedzenie straty plazmidu je opísaná autormi H. Sakoda a T. Imanaka v J. Femient. and Bioeng., zv. 69, 1990, str. 75-78. Táto metóda zahŕňa stabilný „hostiteľský rekombinantný“ plazmidový systém, pri ktorom sa najprv deletuje tryptofan-operón v chromozóme hostiteľa a tým je hostiteľská bunka inaktívna na transport tryptofanu. Potom sa transformuje hostiteľská bunka s rekombinantným plazmidom, ktoiý má tento tryptofanoperón. Selekcia hostiteľských buniek s týmto nekombinantným plazmidom sa uskutočňuje cez transport tryptofanu.

Nevýhody tejto metódy spočívajú v tom, že i napriek selekcii tryptofanom môžu na základe difúzie pri vlastnej fermentácii rásť tiež bezplazmidové bunky. Tým pribúda dcérijných buniek, ktoré neobsahujú žiadne plazmidy.

Podstata vynálezu

Úlohou predloženého vynálezu je odstrániť uvedené nevýhody a poskytnúť mikroorganizmy s plazmidmi, ktorých plazmidy sú vytvorené tak, že sa dajú v priebehu celej fermentácie stabilizovať lacnou a ľahko dostupnou látkou. Súčasne musí byť zabezpečená dobrá schopnosť rastu, delenia a pestovania mikroorganizmov obsahujúcich plazmid.

Táto úloha je riešená pomocou mikroorganizmov podľa vynálezu podľa patentového nároku 1, ktoré sa vyznačujú tým, že obsahujú

a) hybridný plazmid s DNA-fragmentom s genetickou sekvenciou, ktorá kóduje zužitkovanic betaínu a je charakterizovaná reštrikčnou mapou na obr. 1,

b) mutáciu v chromozomálnom géne, ktorý kóduje zužitkovanie betaínu. Pod pojmom betaíny sa rozumejú zlúčeniny ako je betaín, cholín, dimctylglycín a sarkozín.

Výroba mikroorganizmov so stabilnými plazmidmi

Výroba mikroorganizmov podľa vynálezu sa uskutočňuje podľa patentového nároku 7, ktorý je podrobnejšie vysvetlený v nasledujúcom texte. Pri výrobe sa postupuje tak, že v stupni a)

I mikroorganizmy zužitkujúce betaín mutujú v chromozóme tak, že už nie sú schopné spracovať betaín

II izoluje sa DNA-fragment obsahujúci genetickú sekvenciu, ktorá kóduje zužitkovanie betaínu v stupni b):

III tento izolovaný DNA-fragment sa zavedie do expresného vektora, pritom ligáciou

IV vznikne hybridný plazmid, tento hybridný plazmid sa v stupni c):

V vnesie pomocou transformácie do mikroorganizmu (hostiteľského kmeňa) získaného v stupni I, čím sa po selekcii betaínom získajú mikroorganizmy so stabilnými plazmidmi, vzhľadom na zužitkovanie betaínu.

VI Tieto transformované mikroorganizmy predstavujú produkčný kmeň so stabilnými plazmidmi vzhľadom na zužitkovanie betaínu, ak ich hybridný plazmid obsahuje dodatočný gén, ktorý kóduje určitú reakciu.

I Chromozomálna mutácia mikroorganizmov zužitkujúcich betaín.

Ako mikroorganizmy zužitkujúce betaín sa môžu podľa vynálezu použiť všetky také, ktoré rastú s betaínom, prípadne s betaínmi ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie. Príklady takýchto mikroorganizmov, ktoré zužitkujú betaín sú: Pseudomonas sp., Rhizobium-ZAgrobacterium sp., alebo Rhizobium sp. Účelne sa ako mikroorganizmy zužitkujúce betaín používajú mikroorganizmy rodu Rhizobiurm-ZAgrobacterium. Výhodne sa používa mikroorganizmus Rhizobium-ZAgrobacterium sp. HK1349 s DSM č. 3944. Ten bol 4. 11. 1991 uložený do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH (DSM), Mascherodervweg 1 b, D-3300 Braunschweig.

Mutácia chromozomálneho génu kódujúceho zužitkovanie betaínu, ktorý sa ďalej označuje ako beu, je možné uskutočniť v odbore bežne používanými metódami. Príklady takýchto mutačných metód sú: delečná mutácia pomocou homológnej rekombinácie, mutácia „Frame shift“ s mutagenným činidlom alebo transposon-inzerčnou mutáciou.

Účelne sa deletuje gén beu, v prípade mikroorganizmu Rhizobium/Agrobacterium sp. HK1349, pomocou metódy homológnej rekombinácie cielenej z chromozómu mikroorganizmu.

Na tento účel sa najprv z chromozómu mikroorganizmov izoluje DNA-fragment, ktorý obsahuje gén beu a klonuje sa s tzv. „pomocnými“ plazmidmi v mikroorganizmoch. Z týchto „pomocných“ plazmidov sa potom deletuje požadovaný úsek DNA kódujúceho beu, ktorého izolácia a identifikácia sa ďalej opisuje v II). Pomocou tohto tzv. deletovaného „pomocného“ plazmidu sa potom bežnými metódami zavedie zodpovedajúca chromozomálna delécia cez výmenu pomocou homológnej rekombinácie, ako je uvedené v Mol. Gen. Genet., 210, 1987, str. 381-381 a v J. Bacteriol., 171,1989, str. 4617-4622.

Účelne sa mikroorganizmy Rhizobium-ZAorobacterium sp. HK1349 (DSM 3844) premenia na mutované mikroorganizmy HK1349.4 í>eu-inaktivne (Bou’) metódou delečnej mutácie pomocou homológnej rekombinácie.

II Izolácia DNA-fragmentu beu

Ako zdroj DNA-fragmentu beu môžu slúžiť mikroorganizmy už opísané v I). Výhodne ako zdroj DNA-fragmentu beu slúžia mikroorganizmy RhizobiumZAgrobacterium sp. KH 1349 s DSM č. 3944, ktoré sú uložené ako je uvedené.

Na izoláciu sa účelne najprv lokalizuje DNA-fragment obsahujúci genetickú sekvenciu, ktorá kóduje zužitkovanie betaínov na chromozóme RhizobiumZAgrobacterium HK 1349. Lokalizácia sa uskutoční bežnými metódami, ako napríklad vytvorením transpozon-inzerčného mutantu v zodpovedajúcom chromozóme mikroorganizmu. Pritom je hľadaný DNA-fragment beu označený transpozónom. Identifikácia zodpovedajúcich mutantov s týmto označením DNA-fragmentom sa potom uskutoční pomocou nezužitkovania betaínov ako zdroja uhlíka, dusíka a energie.

Chromozomálna DNA identifikovaných transpozon-inzerčných mutantov sa potom účelne štiepi pomocou reštrikčného enzýmu EcoRI. Fragmenty pritom získané sa klonujú cez plazmidy v E. Coli zvyčajnými metódami. Takto získané hybridné plazmidy podrobené selekcii vzhľadom na rezistenciu proti transpozonantibiotikám obsahujú EcoRI-DNA-fragment získaný z mikroorganizmy HK1349 značeného trasnpozónom. Veľkosť fragmentu je 18,2 kb (12,5 kb a 5,7 kb na zodpovedajúci transpozón).

Na vlastnú izoláciu intaktného (neoznačeného transpozónom) DNA-fragmentu beu sa najskôr izoluje DNA z Rhizobium-ZAgrobacterium HK 1349 metódami v odbore bežne používanými. Potom sa izolovaná DNA celkom rozštiepi účelne reštrikčným enzýmom EcoRI a rozdelí. Potom sa EcoRI-DNA-fragment s veľkosťou 12,0 až 13,0 kb klonuje v E.coli v odbore obvyklými metódami. Cez „PatchMating“ konjugáciu rôznych klonov s hcu-negatívnym mutantom označeným transpozónom môžu sa potom rozoznať a izolovať klony, ktoré obsahujú intaktný gén beu, pomocou komplementárne mutácie. Hľadaný hybridný plazmid sa potom nachádza v E.coli. Na základe komplementačného testu so subklonmi (klony, ktoré vykazujú deláciu v rôznych rozmedziach EcoRI-DNA-fragmentu) na transpozónových mutantoch sa identifikuje a izoluje DNA-fragment štiepený Pstl s veľkosťou 3 kb, ktorý obsahuje genetickú sekvenciu kódujúcu zužitkovanie betaínu. Tento DNA-fragment je súčasťou vynálezu a je charakterizovaný reštrikčnou mapou na obr. 1. Tento DNA-fragment sa nachádza v hybridnom plazmide pL032 a je uložený v mikroorganizme HK1349.4 DSM č. 6712).

III Ligácia DNA-fragmentu beu v expresných vektoroch

Takto získaný DNA-fragment beu sa môže bežnými molekulárnobiologickými technikami ligovať s vopred rovnomerne rozštiepenou DNA expresného vektora za vzniku hybridného plazmidu.

Expresné vektory obsahujú zvyčajne vhodný promótor (sekvenciu kontroly expresie). Za týmto promótorom leží vhodne v smere transkripcie jedno alebo viac miest štiepenia na reštrikčné enzýmy. Do týchto miest štiepenia sa potom obvyklým spôsobom inzeruje príslušný génový štep, o ktorého expresiu je záujem.

Na hybridné plazmidy podľa vynálezu je možné použiť expresné vektory so širokým hostiteľským spektrom („broad host range“). Príklady týchto expresných vektorov sú:

pKT240 (Gene, 26, 1983, str. 273 - 282) pME285 (Gene, 36, 1985, str. 27 - 36) pVKlOO (Plasmid, 8, 1962, str. 45 - 54).

Účelne sa na hybridné plazmidy podľa vynálezu štiepi expresný vektor pKT240 reštrikčným enzýmom Pstl a vzniknuté reštrikčné konce sa ligujú s DNA-fragmentom beu pomocou napríklad T4-DNA-ligázy.

IV Hybridné plazmidy

Vynález sa ďalej týka takto vzniknutých hybridných plazmidov, ktoré obsahujú DNA-fragment beu. Zásadne sú vhodné všetky hybridné plazmidy, ktoré sa replikujú vo zvolenom mikroorganizme a môže exprimovať DNA-fragment. Aby sa dosiahlo účinnej expresie v hybridnom plazmide, usporiada sa DNA-fragment beu v smere transkripcie k promótoru. Obzvlášť vhodný je hybridný plazmid pL032, ktorý sa skladá z DNA-fragmentu beu a expresného vektora pKT240, na ktorom je DNA-fragment beu usporiadaný v smere transkripcie k promótoru P_b|_a (je zodpovedný za ampicilínovú rezistenciu). Tento hybridný plazmid bol uložený 17. 09. 1991 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH, Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig, v mikrooranizme HK1349.4 (DSM č. 6712) Na obr. 2 je schéma hybridného plazmidu pL032.

V Transformácia

Mikroorganizmy získané v stupni I) sa transformujú takto získanými hybridnými plazmidmi. Tieto transformované mikroorganizmy sú taktiež súčasťou vynálezu.

Transformácia mikroorganizmov hybridnými plazmidmi podľa vynálezu sa uskutočňuje známym spôsobom. Izolácia, prípadne selekcia transformovaných mikroorganizmov sa uskutočňuje na selektívnom živnom médiu, ku ktorému sa pridá betaín ako zdroj uhlíka alebo dusíka. Ak sa výhodne použije hybridný plazmid pL032, uskutoční sa izolácia, prípadne selekcia transformovaných mikroorganizmov na živnom médiu, ku ktorému sa pridá betaín ako zdroj uhlíka alebo dusíka. Výhodne sa po transformácii získajú mikroorganizmy HK1349.4 s hybridným plazmidom pL032 (DSM č. 6712).

Na stabilizáciu týchto transformovaných mikroorganizmov sa pridajú účelne ku kultivačnému médiu betaíny s koncentráciou od 0,2 do 0,4 %. Ako kultivačné médium sa môžu použiť média bežne používané v odbore, ako napríklad médium obsahujúce minerálne soli podľa Kulla a spol., Árch. Microbiol., 135, 1983, str. 1 - 7.

VI Produkčné kmene s plazmidmi stabilnými proti zužitkovaniu betaínu

Vynález sa týka tak použitia DNA-fragmentu beu na výrobu plazmidov stabilných proti zužitkovaniu betaínu, ako aj použitiu mikroorganizmov získaných po transformácii s týmto stabilným plazmidom na výrobu produkčných kmeňov so stabilnými plazmidmi. Tým sú aj vzniknuté produkčné kmene súčasťou vynálezu.

Tieto produkčné kmene sa získajú transformáciou mikroorganizmov, mutáciou na chromozomálnom géne kódujúcom zužitkovanie betaínu, s hybridným plazmidom, ktorý obsahuje dodatkovo k DNA-fragmentu beu gén kódujúci určitú reakciu.

Tieto stabilné plazmidy, ktoré obsahujú beu a dodatkový gén, sa získajú metódami obvyklými v odbore, buď

- napríklad ligáciou dodatkového génu do hybridného plazmidu, ktorý obsahuje beu, alebo

- napríklad ligáciou DNA-fragmentu beu do hybridného plazmidu, ktorý už obsahuje gén kódujúci určitú reakciu.

Ak sa použije hybridný plazmid, ktorý už obsahuje dodatkový gén, je účelné, aby sa rozštiepil (linearizoval) reštrikčným enzýmom PstI a potom ligoval s Pstl-DNA-fragmentom beu za vzniku stabilného plazmidu.

Ak použitý hybridný plazmid už obsahuje DNA-fragment beu, uskutočni sa linearizácia účelne s reštrikčnými enzýmami, ktoré „napádajú“ dodatkový gén. Zodpovedajúcim spôsobom rozštiepený vektor s beu a dodatkový DNA-fragment sa podrobia religáci.

Po obnovenej transformácii na mikroorganizmy podľa vynálezu môžu tieto mikroorganizmy zabezpečiť požadovanú reakciu bez straty plazmidu v priebehu kultivácie s betaínmi.

Výhodne sa ako stabilný plazmid použije hybridný plazmid pL032, ktorý obsahuje dodatkový gén kódujúci určitú reakciu. Tento stabilný plazmid v podstate zodpovedá hybridnému plazmidu pL032. Výhodne sa potom tento stabilný plazmid transformuje do mikroorganizmu HK1349.9.

Ako príklad produkčného kmeňa so stabilnými plazmidmi slúži mikroorganizmus HK 1349.4, ktorý ako stabilný plazmid obsahuje plazmid pLOLOl. Na výrobu pLOLOl sa už v EP-A 0477 828 opísaný hybridný plazmid pL03, ktorý je zložený z expresného vektora pKT240 a génov xylMA (kódujú enzým xylénmonooxygenáza), linearizuje s reštrikčným enzýmom PstI a potom sa liguje s DNA-fragmentom beu. Tento plazmid v podstate zodpovedá hybridnému plazmidu pL032, pretože na rozdiel od pL032 obsahuje len dodatkový gén xylMA.

Po transformácii pLOLOl na mikroorganizmus HK1349.4 je tento produkčný kmeň schopný premeniť 2,5-dimetylpyrazín na 5-hydroxymetylpyrazín v prítomnosti betaínu bez straty plazmidu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Výroba transpozón(Tn5)-inzerčného mutantu a jeho fenotypická identifikácia

Kmeň Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349 (DSM 3944) sa vplyvom selekčného tlaku privedie k vyvinutiu spontánnej rezistencie proti streptomycínu (100 pg/ml). Táto rezistencia bola preukázateľne stabilná cez 50 generácií bez selekcie a použila sa ako selekčný znak.

0,2 ml Tn5-donorovej kultúry, E.coli S17-l/pSUP 2021 (rezistentný proti neomycínu, autori R. Šimon a spol., Biotechnology 1, 1983, str. 784 - 790) sa zmieša s 2 ml recipienčnej kultúry HK1349 a odstredí sa. Bunky sa premyjú v 0,9 %-nom roztoku NaCl a resuspendujú v 100 μΐ 0,9ného roztoku NaCl. Konjugácia recipienčného kmeňa s donorovým kmeňom sa uskutoční cez noc pri 30 °C na suchom živnom agare. Potom sa vypestované zriadené bunky umiestnia na doštičky uvedeného selekčného média pre recipient a transpozón. Tn5-mutanty HK1349 sa získajú selekciou na živnom agare so streptomycínom (100 pg/ml) a neomycinom (100 pg/ml). Fenotypická identifikácia sa uskutočni cez nezužitkovanie betaínov ako zdroj uhlíka alebo dusíka v médiu obsahujúcom minerálne soli, podľa autorov Kulla a spol., Árch. Microbiol., 135, 1983, str. 1 -

7.

Príklad 2

Klonovanie Tn5-značeného, DNA-fragmentu zgenomu HK1349

Známou metódou izolovaná chromozomálna DNA (J. Mol. Biol., 130, 1979, str. 161 - 173) z Tn5-mutovaného

HK1349 (5 pg) sa úplne podrobí štiepeniu s EcoRI (4 jednotky /pg). 2,5 pg plazmidu pBR325 (Gene, 2, 1977, str. 95 - 113) sa po úplnom štiepení pomocou EcoRI (1 jednotka/pg) spracuje (defosforyluje) alkalickou fosfatázou (0,1 jednotky/1-20 pmol koncovej DNA). Rekombinantné hybridné plazmidy sa získajú zmiešaním genomickej DNA a pBR325 s T4-DNA-ligázou (0,2 jednotky/pg DNA) v 400 pl ligačného tlmivého roztoku (20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM ditioerytritolu (DDT), 10 mM MgCl₂, 0,6 mM adenozíntrifosfátu (ATP)).

Nasleduje inkubácia cez noc pri 12 °C. Alikvotné časti ligačnej zmesi sa použijú v trasnformačnom pokuse podľa Cohena a spol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96 (1972), str. 2110 - 2114, s E.coli ED8654. Selekcia transformantov sa uskutočňuje na základe ich rezistencie oproti ampicilínu (100 pg/ml, pBR325) a kanamycínu (25 pg/ml), Tn5značený inzert, na živnom agare. Všetky klonované hybridné plazmidy majú HK1349-inzert (12,5 kb + 5,7 kb pre Tn5), ktorý je značený Tn5. Presné reštrikčné mapovanie doložilo transpozónovú inzerciu v rovnakom genomickom fragmente na rovnakom mieste vzhľadom na identický fenotyp Beu (inaktívny ňeu-gén kvôli Tn5-inzercii, genotyp beujselekcionovaných Tn5-mutantov. Tieto mutanty sa ďalej označujú ako HKV11.

Príklad 3

Klonovanie DNA-fragmntu beu (neznačeného) zgenomu HK1349

HK1349-DNA sa izoluje podľa príkladu 2 a celkom štiepi s EcoRI (4 jednotky/pg) a rozdelí elektroforézou na agarózovom géli. DNA-fragmenty vo veľkostnom rozmedzí od 12,0 kb do 13,0 kb (značený fragment má veľkosť 12,5 kb) sa izolujú z elektroforetických agarózových gélov. Izolovaná DNA sa podľa príkladu 2 štiepi s EcoRI a liguje defosforylovaným vektorom pVKlOO podľa príkladu 2 (Plasmid 8, 1982, str. 45 - 54). Alikvotné časti ligačnej zmesi sa použijú podľa príkladu 2 v transformačnom pokuse v E.coli S17-1 (biotechnology, 1, 1983, str. 1784 1791). Reansformanty sa podrobia selekcii na základe rezistencie proti tetracyklínu (25 pg/ml) a kanamycínu (25 pg/ml) na živnom agare. Získané transformanty sa preskúšajú pomocou tzv. „patch-mating“ konjugácie s transponzónovým mutantom HK4V11 (beu) ako kmeňom príjemcu na inzercii hľadaného štiepu DNA s génom beu: transformanty rezistentné proti antiobiotikám sa v stanovenom vzore naočkujú na selekčné médium (živný agar s kanamycínom 2 pg/ml). Súbežne sa naočkujú doštičky so živným agarom-dnom príjemcovho kmeňa HK4V1L Na konjugáciu sa transformanty označia ako jednotlivé klony na vyrastenom trávniku kmeňa príjemcu a inkubujú sa cez noc pri 30 °C.

Doštičky „Mating“ sa na záver preznačkujú na selekciu získaných transkonjugantov na médiu uvedenom v príklade 1 a obsahujúcom minerálne soli a betaín (0,2 % hmotnostných) ako substrát, ktorý nemôže dárca a príjemca zužitkovať. V rastúcich transkonjugantov sa mutovaný genomický štep DNA príjemcu (HK4V11) komplementuje (prípadne homológne rekombinuje) prijatím hybridného plazmidu so zodpovedajúcou inaktnou oblasťou DNA z kmeňa darcu. Komplementujúce hybridné plazmidy sa ozančujú pVKlOOs. K potlačeniu revertantov kmeňa HK4V11 sa k médiu pridá neomycín (100 pg/ml). Hybridizáciou oproti klonovaným, Tn5-značeným DNA-frag-mentom, je možné potvrdiť úspešné klonovanie komplementujúceho fragmentu s inaktným ňew-génom zgenomu HK1349 na hybridnom plazmide pVKlOOs.

Príklad 4

Identifikácia DNA-subfŕagmentu kódujúceho beu

Delečným klonovaním s rôznymi reštrikčnými enzýmami (BglII, Xhol, Sphl, PstI) na hybridnom plazmide pVKlOOs a nasledujúcou komplementáciou na beu Tn5-mutante HK4V11 sa môže na plazmide identifikovať DNA-štep s veľkosťou 3 kb štiepený pomocou PstI, ktorý kóduje zužitkovanie betaínu. Tento štiep je charakterizovaný reštrikčnou mapou uvedenou na obr. 1.

— PetI σ — Saal —Xhol “Spití — PstI

Obr. 1

Príklad 5

Stabilná mutácia beu v HK1349-genóme

Pretože je Tn-inzerčná mutácia so selekciou a bez selekcie antibiotikami v zásade veľmi nestabilná, zavedie sa do kmeňa HK1349 stabilná delečná mutácia. Postupuje sa podľa bežných metód pomocou homológnej rekombinácie: EcoRI-fragmcnt s veľkosťou 12,5 kb získaný v príklade 3 sa vkloňuje do Suizidvektora pACYC184, ktorý neexprimuje vHK-kmeňoch (J. Bacteriol., 134, 1978, str. 1141 1156). A z toho sa deletuje beu kódujúci pstl-fragment s veľkosťou 3 kb pomocou reštrikcie s PstI (1 jednotka/pg). Religácia sa uskutoční cez noc s 1 jednotkou/pg T4-DNA-ligázy. Delečný hybrid pCC6 sa transformuje v E.coli (HB101/pRK2013 (pomocný plazmid k mobilizovaniu pCC6) a z toho sa privedie do HK1349 konjugatívnym transferom. Získané transkojugáty sa podrobia selekcii proti auxotrofii donoru (Pro‘, prolin-negatívny) a na rezistenciu plazmidu proti antiobitkám (médium obsahujúci minerálne soli 0,4 % glukózy a tetracyklín (25 pg/ml)). Len bunky, ktoré chromozomálne integrovali plazmid cez homológnu rekombináciu, sú rezistentné proti tetracyklínu a môžu rásť na médiu. K opätovnému odstráneniu vektora pACYC184 a intaktného beu-génu z HK1349chromozómu cez druhú rekombináciu sa tieto transkonjugáty kultivujú cez 100 generácii v rovnakom médiu bez selekcie pomocou tetracyklínu. Aby sa potom zvýšil počet óeu-mutantov senzitívnych na tetracyklín, uskutoční sa selekcia proti integrovanému vektoru pACYC184 a intaktnému úen-génu: Na tento účel sa bunky dajú do 25 ml komplexového média NYB (Oxoid, Wesel, SRN) s tetracyklínom (10 pg/ml) a inkubujú sa 6 hod. pri 30 °C. Potom sa k usmrteniu rastúcich buniek rezistentných proti tetracyklínu pridá ku kultúre 0,5 mg/ml D-cykloserinu a 15 mg/ml penicilínu G. Po ďalšej inkubácii pri 30 °C počas 84 hod. sa bunky odstredia, 3-krát premyjú v čerstvom médiu NYB a vo vhodnom zriedení sa nanesú na doštičky živného agaru. 18 % získaných kolónií je citlivých na tetracyklín, z čoho tretina je súčasne tiež negatívna v zužitkovaní betaínu. Správne zavedenie delécie beu sa potvrdilo pomocou hybridizácie proti 12,5 kb fragmentu v hybridnom plazmide pVKlOOs z príkladu 3. (Značí sa len EcoRI-fragment skrátený o 3 kb). Vzniknutý mutant HK 1349.4 sa môže komplementovať pomocou 3 kb veľkého Pstl-fragmentu (beu) klonovaného do vhodných vektorov. Vektory sú opísané v nasledujúcom príklade 6.

Príklad 6

a) Klonovanie génu beu do rôznych vektorov so širokým hostiteľským spektrom („broad host range“)

Do známych expresných vektorov so širokým hostiteľským spektrom pKT240, pME285, pVKlOO sa klonuje Pstl-fragment s veľkosťou 3 kb, ktorý kóduje beu podľa Current Protocols in Molecular Biology, John Wilex and Sons, New York (1989), odstavec 3.16, Subklonovanie DNA-fŕagmentov. Pritom úlohu hrá správna orientácia inzertu k promótoru. V prípade pKT240 hrá pritom úlohu správna orientácia inzertu (usporiadanie v smere transkripcie) k promótoru P_b|_a (promótor z génu bla, ktorý je zdopovedný za rezistenciu proti ampicilínu).

b) Inzercia beu do pKT240 pKT240 sa „linearizuje“ pomocou PstI (1 jednotka/pg). Táto „linearizovaná“ DNA saliguje s 3 kb veľkým Pstlfragmentom (inzrt) s T4-DNA-ligázou (1 jednotka/pg) v ligačnom tlmivom roztoku (20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM DTT, 10 mM MgC12, 0,6 mM ATP). Ligácia sa uskutoční cez noc pri teplote 12 °C. Najprv sa získaná ligačná zmes konjuguje v E.coli S. 17 - 1 metódou podľa Lederberga a Cohena, J. Bacteriol., 119, 1974, str. 1072 - 1074. Selekcia sa uskutoční na médiu NYB s 25 pg/ml kanamycínu a proti 100 μ/ml ampicilínu. Hybridné plazmidy s inzertom (ampicilín-senzitivny, kanamycín-rezistentný) v smere transkripcie k promótoru P_bla sa označujú ako pL032.

c) Konjugácia pL032 do HK1349.4

Konjugačný prenos pL032 z E.coli S17-1 do HK1349.4 sa uskutoční rovnako podľa uvedenej metódy. Selekcia hybridného plazmidu pL032 obsahujúceho HK1349.4 sa uskutoční priamo podľa komplementáciou vzniknutého zužitkovania betaínu (médium obsahujúce minerálne soli podľa príkladu 1 a obsahujúce 0,2 % hmotnostných betainu).

Príklad 7

Stabilita pL032 v HK1349.4

Dlhodobá stabilita hybridného plazmidu v mikroorganizme HK 1349.4 sa testuje na rozličných médiách. JendoznaČne sa dosiahla až 100 % stabilizácia pri zužitkovaní jediného zdroja uhlíka, betaínu ako substrátu alebo iných betainov, ako napríklad cholínu a dimetylglycínu. Pri limitovaní dusíka, ako v bezdusíkovom médiu v kontinuálne recyklovanej kultúre, sa rovnako preukáže až 100 %-ná stabilizácia pri zužitkovaní betaínu ako jediného zdroja dusíka, v prítomnosti ďalších zdrojov uhlíka.
MÉDIUM	VŠETKY BUNKY BUNKY S PLA2M1DOM
MM (so síranom amónnym) 02%Glc (žiadna selekcia)	100%	5%
MM (bez síranu amonného) O,i%Bet 0,2 %Glu (žiadna selekcia	100%	20%
MM bez síranu amomébo) 0.2% Bet (C- a N-zdroj)	100%	100%
MM (so síranom amónnym) 0.2% M (C-zdrcj)	100%	100%
MM (bez síranu amonnäbo) 0,1 % Bet (N-zdroj) 0.2%Gic	100%	100%

skratky použité v tabuľke:

Glu = L-glutamát (C - & N-zdroj)

Glc = Glukóza (C - zdroj)

N = dusík +, Bet = betaíny (C & N-zdroj)

MM = minimálne médium (Kulla a spol., Árch. Microbiol. 1983, 135, str. 1-7)

Príklad 8

Stabilita hybridného plazmidu s biotransformačnými vlastnosťami

Ako príklad na stabilizujúci účinok ŕ>ew-génu kódujúceho plazmid v beu-negatívnom hostiteľskom kmeni HK1349.4 sa zvolí hybridný plazmid pL03, ktorý je už opísaný v EP-A0477 828.

Jedná sa o hybridný plazmid zložený z vektora pKT240 a Clal-HindlII-fragmentu (2,35 kg) TOL-plazmidu, ktorý kóduje gény xylMA a klonuje sa pod kontrolou promótora kanamycínfosfotransferázy.

a) Zavedenie novej kanamycínovej rezistencie (Km^R)

Kanamycinová rezistenčná kazeta (1,1 Kb) zpRMEl (harayama a spol., J. Bacteriol., 167, 1986, str. 455 - 461) sa vykrojí z EcoRI (4 jednotky/pg DNA) a izoluje sa gólovou elektroforézou na agaróze. 5'-prečnievajúce konce DNA-fragmentu sa naplnia reakciou podľa Klenowa (Current protocols in Molecular Biology, John Wiley, Now York 1987, oddiel 3.5) pL03-DNA sa štiepi sHpal (1 jednotka/ng DNA a defosforyluje 4,8 jednotkami alkalickej fosfotázy. Po vyzrážaní izopropanolom sa tento štiepený vektor so zarovnanými koncami („blunt end“)liguje s inzertom s už zarovnanými koncami (Km^R-kazeta) cez noc pri 15 °C. Ligačný tlmivý roztok je zložený z: 20 mM Tris, 10 mM MgCl₂, 0,6 mM ATP pH 7,2, 10 % PEG 6000, 0,5 jednotiek T4-DNA-Ligázy.

E.coli K12 sa podľa príkladu 2 transformuje s ligačnou zmesou a získané transformanty obsahujúce pL03 (Km^R) sa podrobia selekcii na živnom agare s 50 pg/ml Km.

b) Zavedenie génu beu do pL03 (Km^R)

Hybridný plazmid pL03 (Km^R) sa „linearizuje“ pomocou PstI (1 jednotka/pg DNA) (porovnaj príklad 6) a liguje sa s 3 Kb veľkým Pstl-fragmentom beu. Transformácia do E.coli a konjugácia do HK1349.4 sa uskutočni podľa príkladu 6. Hybridný plazmid sa označuje ako pLOLOl a zodpovedá pL032 s dodatkovou xylénmonooxygenázovou aktivitou (xylMA).

c) Biotransformácia so stabilizovaným hybridným plazmidom

Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349.4/pLOL01 sa pestuje pri 30 °C v médiu obshaujúcom minerálne soli (Árch. Microbiol., 135, 1983, str. 1-7) s 0,2 % betaínu ako jediným zdrojom uhlíka. Dokázala sa biotransformácia 0,1 % (objem/objem) 2,5-dimetylpyrazínu na 5-hydroxymetyl-2-metylpyrazín. Výťažok 5-hydroxymetyl-2-metylpyrazínu je po 2 dňoch 20 %.

d) Stabilita pLOLOl v HK1349.4

Zhodne s príkladom 7 sa testuje dlhodobá stabilita hybridného plazmidu v mikroorganizme HK 1349.4. Plazmid sa tiež môže pri biotransfomačných podmienkach v produkčnom kmeni udržovať 100 %-ne stabilný tak na zužitkovanie betaínu ako jediného zdroja uhlíka, ako aj jediného zdroja dusíka.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mikroorganizmy obsahujúce

   a) hybridný plazmid s DNA-fragmentom, ktorý obsahuje genetickú sekvenciu, ktorá kóduje zužitkovanie betaínov a je charakteirzovaná reštrikčnou mapou (obr. 1) — Pätí ω

   σ — Snaž ^Ibol ~’Sphl — Pst!

   Obr. 1 a

   b) mutáciu v chromozomálnom géne, ktorý kóduje zužitkovanie betaínu.
2. 2. Mikroorganizmy podľa nároku 1 s označením HK1349.4 obsahujúce hybridný plazmid pL032, uložený v zbierke DSM pod č. 6712.
3. 3. Hybridný plazmid zložený z DNA-fragmentu podľa nároku 1 a z expresného vektora.
4. 4. Hybridný plazmid podľa nároku 3 s označením pLO32 zložený z DNA-fragmentu podľa nároku 1 a z expresného vektora pKT240, ako je uložený v mikroorganizmoch s označením HK1349.4 pri DSM č. 6712.
5. 5. DNA-fragment obsahujúci genetickú sekvenciu, ktorá kóduje zužitkovanie betaínov a je charakterizovaná reštrikčnou mapou podľa nároku 1.
6. 6. DNA-fragment podľa nároku 5 nachádzajúci sa v hybridnom plazmide pL032 uloženom v mikroorganizmoch s označením HK1349.4 pri DSM č. 6712.
7. 7. Spôsob prípravy mikoorganizmov transformovaných plazmidmi stabilnými vzhľadom na zužitkovanie betaínu, vyznačujúci sa tým, že sa

   a) mikroorganizmy zužitkujúce betaín podrobia mutácii v chromozóme tak, že už nemôžu betaín zužitkovať,

   b) izolovaný DNA-fragment podľa nároku 5 kódujúci zužitkovanie betaínu sa liguje do expresného vektora za vzniku hybridného plazmidu a

   c) mikroorganizmus získaný v stupni a) sa transformuje s hybridným plazdmidom získaným v stupni b) a potom sa podrobí selekcii vzhľadom na zužitkovanie betaínu.
8. 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa t ý m , že sa

   a) ako mikroorganizmus zužitkujúci betaín podrobí mutácii mikroorganizmus s ozančením HK1349 v chromozóme tak, že vznikne mikroorganizmus HK1349.4,

   b) izoloaný DNA-fragment podľa nároku 5 kódujúci zužitkovanie betaínu liguje do expresného vektora pKT240 a

   c) mikroorganizmus získaný v stupni a) s označením HK1349.4 sa transformuje s hybridným plazmidom pL032 získaným v stupni b) a potom sa podrobí selekcii vzhľadom na zužitkovanie betaínu.
9. 9. Použitie DNA-fragmentu podľa nároku 5 na prípravu plazmidov stabilných vzhľadom na zužitkovanie betaínu.
10. 10. Použitie mikroorganizmov podľa nároku 1 na prípravu produkčných kmeňov s plazmidmi stabilnými vzhľadom na zužitkovanie betaínu.
11. 11. Produkčné kmene so stabilnými plazmidmi vzhľadom na zužitkovanie betaínu, ktoré sa získajú transformáciou mikroorganizmov obsahujúcich mutáciu v chromozomálnom géne, ktorý kóduje zužitkovanie betaínu, s hybridným plazmidom podľa nároku 3, ktorý obsahuje dodatočne gén kódujúci určitú reakciu.
12. 12. Produkčné kmene podľa nároku 11 získané transformáciou mikroorganizmov s označením HK1349.4 s hybridným plazmidom podľa nároku 4, ktorý obsahuje dodatočne gén kódujúci určitú reakciu.