HU218739B - Plazmidstabilizáló mikroorganizmus - Google Patents
Plazmidstabilizáló mikroorganizmus Download PDFInfo
- Publication number
- HU218739B HU218739B HU9203644A HU9203644A HU218739B HU 218739 B HU218739 B HU 218739B HU 9203644 A HU9203644 A HU 9203644A HU 9203644 A HU9203644 A HU 9203644A HU 218739 B HU218739 B HU 218739B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- microorganism
- dna fragment
- utilization
- beta
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/41—Rhizobium
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
A találmány tárgya mikroorganizmus, amely a) olyan DNS-fragmensselrendelkező hibrid plazmidot tartalmaz, amely betainvegyületekhasznosítását kódoló és az 1. ábra szerinti restrikciós térképpeljellemezhető genetikai szekvenciát tartalmaz, és b) a betainhasznosítását kódoló kromoszomális génben mutációt tartalmaz. Atalálmány továbbá olyan eljárásra is vonatkozik, amellyel a fentimikroorganizmus előállítható. A találmány szerint a) a betainthasznosító mikroorganizmusok kromoszómáját úgy módosítják, hogy amikroorganizmus többé nem tud betaint hasznosítani; b) azelkülönített, a betain hasznosítását kódoló DNS-fragmenst expressziósvektorba ligálják, majd c) az a) lépés szerint kapott mikroorganizmusta b) lépés szerint kapott hibrid plazmiddal transzformálják, és atranszformált egyedeket a betain hasznosítása alapján szelektálják. ŕ
Description
A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 2 lap ábra)
HU 218 739 Β
A találmány új mikroorganizmusokra vonatkozik, amelyek új DNS-fragmenst tartalmazó új hibrid plazmiddal transzformáltak. A találmány az említett mikroorganizmusok előállítására, valamint stabil plazmidot tartalmazó törzskénti alkalmazására is vonatkozik.
A molekuláris biológiából ismert, hogy bizonyos vegyületek előállítása céljából mikroorganizmusokat egy úgynevezett „mesterséges” plazmiddal transzformáinak; ez a plazmid tartalmazza az adott vegyületet kódoló géneket.
A plazmid fő problémája a stabilitás hiánya, azaz az a jelenség, hogy a mikroorganizmus sejtosztódása során a plazmidok nem öröklődnek ellenőrizhető módon az utódsejtekre. Ennek az a következménye, hogy a fermentálás során egyre több olyan sejt keletkezik, amelyben nincs plazmid, illetve kevés a plazmid.
Laboratóriumi mértékben a plazmidveszteség ellen azt az antibiotikumot adagolják a tenyészközegbe, amelynek antibiotikumrezisztencia-génjét a plazmid tartalmazza. Az ipari fermentálás során azonban bebizonyosodott, hogy az antibiotikum adagolása hátrányos. Egyes antibiotikumok, például a tetraciklin a plazmidtartalmú mikroorganizmusok növekedésére, osztódására és szaporodására hátrányos hatásokat fejt ki (Bioscience Reports, 5, 1985, 29-37. oldal; Gene, 39, 1985,173-180. oldal). Az antibiotikumadagolás másik hátránya, hogy nagyvolumenes fermentálás esetén túl költséges. Végül gyógyszerek, élelmiszerek és takarmányok előállításában az antibiotikumok adagolása nemkívánatos vagy eleve tilos.
A plazmidveszteség ellen H. Sakoda és T. Imanaka (J. Ferment. and Bioeng., Vol. 69, 1990, 75-78. oldal) is dolgozott ki módszert. A módszer stabil, „gazdarekombináns” plazmidrendszeren alapul, amely először a gazdasejt kromoszómájában a triptofánoperont kiiktatja, így a gazdasejt triptofántranszport szempontjából inaktívvá válik. Utána a gazdasejtet triptofánoperont hordozó rekombináns plazmiddal transzformálják. A rekombináns plazmidot tartalmazó gazdasejtek szelektálása a triptofántranszport alapján történik.
A módszer hátránya, hogy a triptofánnal végzett szelektálás ellenére a tulajdonképpeni fermentálási eljárásban (például diffúzió miatt) plazmidmentes sejtek is nőhetnek, és növekvő mértékben megjelennek a plazmidot nem tartalmazó utódsejtek.
A találmány feladata a fenti hátrányok kiküszöbölése és olyan mikroorganizmus kifejlesztése, amelynek plazmidjai olcsó és könnyen hozzáférhető anyaggal az egész fermentálás során stabilizálhatok a mikroorganizmusok jó növekedési, osztódási és szaporodási képességeinek megtartása mellet.
A fenti feladatot az 1. igénypont szerinti mikroorganizmussal oldottuk meg, amelyre jellemző, hogy a) betainvegyületek hasznosítását kódoló genetikai szekvenciát tartalmazó DNS-fragmenssel rendelkező hibrid plazmidot tartalmaz, amelynek restrikciós térképe az 1. ábrán megadott, és b) a bétáin hasznosítását kódoló kromoszómás génben mutációt tartalmaz.
Betainvegyületeken az alábbiakban olyan vegyületeket értünk, mint bétáin, kolin, dimetil-glicin és sarokozin.
Stabil plazmidot tartalmazó mikroorganizmus előállítása
A találmány szerinti mikroorganizmusokat a 7. igénypont szerint állítjuk elő. Az alábbiakban ezt részletesebben ismertetjük.
Az a) lépésben
I. betaint hasznosító mikroorganizmusok kromoszómáját úgy módosítjuk, hogy a mikroorganizmus többé nem tud betaint hasznosítani;
II. bétáin hasznosítását kódoló genetikai szekvenciát tartalmazó DNS-fragmenst izolálunk;
a b) lépésben
III. az izolált DNS-fragmenst expressziós vektorba juttatjuk,
IV. ligálással hibrid plazmidot állítunk elő, és a c) lépésben
V. ezt a hibrid plazmidot az I. szerint kapott mikroorganizmusba (gazdatörzsbe) juttatjuk, így betainnal végzett szelektálás után betainhasznosítás szempontjából stabil mikroorganizmusokat kapunk.
VI. Ha a hibrid plazmid egy további, meghatározott reakciót kódoló gént tartalmaz, a transzformált mikroorganizmus betainhasznosítás szempontjából stabil termelőtörzset alkot.
I. Betaint hasznosító mikroorganizmus kromoszómás mutációja
Betaint hasznosító mikroorganizmusként a találmány értelmében minden olyan mikroorganizmust alkalmazhatunk, amely betainen vagy betainvegyületeken mint egyetlen szén-, nitrogén- és energiaforráson nőnek. Ilyenek például Pseudomonas sp., Rhizobium/Agrobacterium sp. vagy Rhizobium sp. Betaint hasznosító mikroorganizmusként előnyösen Rhizobium/Agrobacterium nemzetségűt, különösen előnyösen a Rhizobium/Agrobacterium sp. HK.1349 mikroorganizmust alkalmazzuk, amelyet 1991. 11. 04-én a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-33OO Braunschweig, Mascheroder Weg lb gyűjteményben DSM 3944 szám alatt letétbe helyeztünk.
Az alábbiakban „beu” rövidítéssel szereplő, a bétáin hasznosítását kódoló kromoszómás gén mutációját szakember számára ismert módszerrel idézhetjük elő. Az ilyen módszerek példáiként a homológ rekombinációval végzett törlést, mutagén ágenssel végzett Frame shift mutációs kezelést, transzpozonbeépítéssel előidézett mutációt nevezünk meg.
A Rhizobium/Aqrobacterium sp. HK.1349 esetén a beu gént előnyösen a homológ rekombinálás módszerével töröljük a mikroorganizmus kromoszómájából.
Először a beu gént tartalmazó DNS-fragmenst a mikroorganizmus kromoszómájából izoláljuk, és úgynevezett „segéd”-plazmidokkal mikroorganizmusba klónozzuk. Utána a „segéd”-plazmidból a kívánt, a beu-t tartalmazó DNS-szakaszt kivágjuk. Elkülönítését és azonosítását a II) pontban írjuk le. Az így kapott hiányos „segéd”-plazmiddal a szakmában ismert módszerrel, homológ rekombinálással végzett csere útján, a hiányt a kromoszómába vihetjük (Mól. Gén. Génét., 210, 1987, 381-387. oldal; J. Bacteriol., 171, 1989, 4617-4622. oldal).
HU 218 739 Β
A Rhizobium/Agrobacterium sp. HK1349 (DSM 3944) mikroorganizmust célszerűen kivágással, majd homológ rekombinációval előidézett mutáció útján alakítjuk át a óeu-inaktív (beu~) HK1349.4 mikroorganizmussá.
II. A beu DNS-fragmens izolálása
A beu DNS-fragmens forrásaként az I. alatt már említett mikroorganizmusokat használhatjuk. Előnyösen a Rhizobium/Agrobacterium sp. HK.1349 számú, letétbe helyezett törzset alkalmazzuk a beu DNS-fragmens forrásaként.
Izolálás céljából először a bétáin hasznosítását kódoló genetikai szekvenciát tartalmazó DNS-szakaszt a Rhizobium/Agrobacterium sp. HK1349 számú törzs kromoszómáján lokalizáljuk. A lokalizálás szakember számára ismert módszerrel történik, például úgy, hogy a mikroorganizmus kromoszómájában transzpozon beépítésével mutációt idézünk elő, a beu fragmenst transzpozonnal jelölve. A megjelölt DNS-fragmenst tartalmazó mutáns azonosítása a bétáin (szén- és nitrogénes energiaforráskénti) nemhasznosítása alapján történik.
Az azonosított transzpozonos mutánst előnyösen az EcoRI restrikciós enzimmel vágjuk. A kapott fragmenseket a szakmában szokásos módon plazmidok segítségével E. coli-ba klónozzuk.
Az így kapott, transzpozonantibiotikum-rezisztencia alapján szelektált hibrid plazmid HK1349-ből származó, transzpozonnal jelzett, 18,2 kb méretű EcoRI-DNS-fragmenst tartalmaz (12,5 kb+5,7 kb, ami a transzpozon).
Az ép (nem transzpozonnal jelzett) beu DNS-fragmens tulajdonképpeni izolálására először a Rhizobium/Agrobacterium HK1349 DNS-ét szakember számára ismert módon izoláljuk. Az izolált DNS-t célszerűen EcoRI enzimmel teljesen emésztjük, és a ffagmenseket szétválasztjuk. A 12,0-13,0 kb méretű EcoRIfragmenst ismert módon E. coli-ba klónozzuk. A különböző kiónokat a úew-negatív, transzpozonnal jelölt mutánssal „Patch-Mating” konjugáció útján ötvözve a mutáció komplementálása alapján megtalálhatjuk, és izolálhatjuk azokat a kiónokat, amelyek a keresett hibrid plazmidot tartalmazzák. A hibrid plazmid ekkor az E. coli-b&n van.
Szubklónokkal (a törlést az EcoRI-DNS-fragmens különböző helyein tartalmazó klónokkal) egyrészt és a transzpozonmutánssal másrészt végzett komplementálótesztek alapján azonosítunk és izolálunk egy 3 kb méretű, PstI enzimmel vágott DNS-fragmenst, amelyen belül a bétáin hasznosítását kódoló genetikai szekvencia helyezkedik el.
A DNS-fragmens a találmány része; az 1. ábrán mutatott restrikciós térképpel jellemezhető, A pLO32 jelű hibrid plazmid a fenti fragmenst tartalmazza, a plazmid pedig a HK1349.4 (DSM 6712) számú mikroorganizmusban van letétben.
III. A beu DNS-fragmens ligálása expressziős vektorokba
A fentiek szerint nyert beu DNS-fragmenst a molekuláris biológia ismert módszereivel előzetesen szintén vágott expressziős vektor DNS-ével hibrid plazmiddá ligálhatjuk.
Az expressziős vektorok általában alkalmas promotort (az expressziót ellenőrző szekvenciát) tartalmaznak. A promotor után, előnyösen átírási irányban egy vagy több szinguláris vágóhely van restrikciós enzim számára. Két ilyen vágóhely közé azt a génszakaszt illesztik, amelynek kifejezését kívánják.
A találmány szerinti hibrid plazmid mint széles gazdaspektrumú („broad hőst rangé”) expressziős vektort alkalmazhatunk, például:
pKT240 (Gene, 26,1983, 273-282. oldal) pME285 (Gene, 36,1985, 27-36. oldal) pVKlOO (Plasmid, 8, 1982,45-54. oldal)
A találmány szerinti hibrid plazmid előállítására célszerűen a pKT240 expressziős vektort PstI restrikciós enzimmel vágjuk, és a kapott restrikciós végeket a beu DNS-sel ligáljuk például T4-DNS-ligáz segítségével.
IV. Hibrid plazmidok
A találmány a óew-DNS-fragmenst tartalmazó hibrid plazmidokra is vonatkozik. Alapvetően minden olyan hibrid plazmid alkalmas, amelyek a választott mikroorganizmusban szaporodnak és a beu DNS-fragmenst kifejezik.
Hatékony kifejezés elérése céljából a beu DNS-fragmenst a promoterhez viszonyítva átírási irányban helyezzük el a plazmidban.
Különösen előnyösen a pLO32 jelű hibrid plazmidot alkalmazzuk, amely a beu DNS-fragmensből és a pKT240 jelű expressziős vektorból áll, és amelyben a beu DNS-fragmens az (ampicillinrezisztenciáért felelős) Pbla promotorhoz viszonyítva átírási irányban helyezkedik el. Ezt a hibrid plazmidot 1991. 09. 17-én a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen gyűjteményben (Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig) DSM 6712 szám alatt letétbe helyeztük. A 2. ábra a pLO32 hibrid plazmid vázlatát mutatja.
V. Transzformálás
A kapott hibrid plazmiddal az I. pont szerint nyert mikroorganizmust transzformáljuk. A találmány a transzformáit mikroorganizmusokra is kiteljed.
A mikroorganizmusokat ismert módszerek segítségével transzformáljuk a találmány szerinti hibrid plazmiddal. A transzformált mikroorganizmusokat C- és Nforrásként betaint tartalmazó szelektív táptalajon szelektáljuk és azonosítjuk. A transzformálás során előnyösen a pLO32 (DSM 6712) hibrid plazmidot tartalmazó HK1349.4 mikroorganizmust állítjuk elő.
A transzformált mikroorganizmus stabilizálására előnyösen 0,4-0,4% betainvegyületet adunk a tenyészközeghez. Tenyészközegként a szakmában ismert és általában használt közegek szolgálhatnak, például a Kulla-féle ásványi só közeg (Kulla és munkatársai, Arch. Microbiol., 135m, 1983,1-7. oldal).
VI. Bétáin hasznosítása szempontjából stabil termelőtörzsek
A találmány a beu DNS-fragmens betainhasznosítás szempontjából stabil plazmidok előállítására, valamint a stabil plazmiddal előállított mikroorganizmusból fejlesztett termelőtörzsekre is vonatkozik.
HU 218 739 Β
A termelőtörzseket úgy állítjuk elő, hogy a bétáin hasznosítását kódoló kromoszómás génben defektet tartalmazó mikroorganizmusokat olyan hibrid plazmiddal transzformáljuk, amely a beu DNS-szakaszt és emellett egy, valamely reakciót kódoló egyéb gént is tartalmazza. A beu mellett még egyéb gént tartalmazó hibrid plazmidot a szakmában szokásos technikákkal állítjuk elő oly módon, hogy vagy
- a járulékos gént olyan hibrid plazmidba ligáljuk, amely beu szekvenciát már tartalmazza, vagy
- a beu fragmenst olyan hibrid plazmidba ligáljuk, amely már meghatározott reakciót kódoló gént tartalmaz.
Előnyös, ha olyan hibrid plazmidot alkalmazunk, amelyben a kívánt reakciót kódoló gén már benne van. A hibrid plazmidot PstI enzimmel nyitjuk (linearizáljuk), majd a beu Pstl-DNS-fragmenssel stabil plazmiddá ligáljuk.
Ha a hibrid plazmid már tartalmazza a beu DNSffagmenst, felnyitásához célszerűen azokat az enzimeket használjuk, amelyeknek a vágóhelyei a járulékos gént „körbeveszik”. A beu szekvenciát tartalmazó, megfelelően vágott vektort a járulékos DNS-fragmenssel ligáljuk.
A hibridvektorral újból mikroorganizmust transzformálva olyan törzset kapunk, amely betainvegyületek jelenlétében a kívánt reakciót plazmidveszteség nélkül biztosítja.
Hibrid plazmidként előnyösen a pLO32 hibrid plazmidot alkalmazzuk, amely azonban még egy járulékos, előre meghatározott reakciót kódol. Az a stabil hibrid plazmid lényegében a pLO32 plazmidnak felel meg; előnyösen a HK1349.9 számú mikroorganizmust transzformáljuk vele.
Stabil plazmidot tartalmazó termelőtörzs példája a HK1349.4 mikroorganizmus, amely stabil plazmidként a pLOLOl plazmidot tartalmazza. A pLOLOl plazmid előállítására a pKT240 expressziós vektorból és az xylMA génből (a xilol-monooxigenáz enzimet kódolja) álló, már a 0477 828 számú európai szabadalmi bejelentésben leírt pLO3 plazmidot a PstI restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd a beu DNS-fragmenssel ligáljuk. A kapott plazmid lényegében a pLO32 plazmidnak felel meg, egyetlen különbség, hogy járulékosan az xylMA gént tartalmazza.
A pLOLOl plazmiddal a HK1349.4 törzset transzformáljuk, miután a törzs képes lesz arra, hogy bétáin jelenlétében plazmidveszteség nélkül 2,5-dimetil-pirazint 5-hidroxi-metil-pirazinná alakítson.
1. példa
Beépített transzpozont tartalmazó Tn5-mutáns létrehozása, fenotípus alapján történő azonosítása
Az Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349 (DSM 3944) törzset szelekciós nyomással sztreptomicinnel szembeni rezisztencia (1000 pg/ml) spontán kifejlesztésére késztettük. Ez a rezisztencia kimutathatóan 50 nemzedéken keresztül szelekció nélkül stabil volt, ezért szelekciós bélyegként használtuk.
0,2 ml Tn5-donor-tenyészetet [£. coli SÍ7-1/ pSUP2021, neomicinrezisztens; R. Simon és munkatársai, Biotechnology 1 (1983), 784-790. oldal] 2 ml HK1349 befogadótenyészettel összekevertünk és centrifugáltunk. A sejteket 0,9%-os NaCl-oldattal mostuk, majd 100 μΐ 0,9%-os NaCl-oldatban szuszpendáltuk. A két törzs konjugációja éjjel, 30 °C-on, száraz tápagaron történik. Utána a sejteket szelektív táptalajon szélesztettük.
A HK.1349 törzs Tn5-mutánsai 1000 pg/ml sztreptomicint és 100 pg/ml neomicint tartalmazó tápagaron megmaradtak. A fenotípus azonosítása a betainvegyületek C- vagy N-forráskénti nemhasznosítása alapján történt (ásványi só közeg, Kulla és munkatársai, Arch. Microbiol., 135, 1983, 1-7. oldal).
2. példa
A Tn5-darabot tartalmazó DNS-fragmens kinyerése a HK1349-genomból
A Tn5-darabot tartalmazó HK1349-mutánsok ismert módon (J. Mól. Bioi., 130, 1979, 161-173) izolált DNS-ét (5 pg) EcoRI enzimmel (4 egység/pg) teljesen emésztettük. 2,5 pg pBR325 plazmidot szintén teljesen emésztettünk EcoRI enzimmel (1 egység/pg), majd alkalikus foszfatázzal (0,1 egység/1-20 pmol DNS-terminálisok) kezeltük, azaz defoszforileztük. A genomból kivett DNS-t T4-DNS-ligáz (0,2 egység/pg DNS) jelenlétében összekevertük a plazmid-DNS-sel 400 pl ligálási pufferben [20 mM trisz-HCl, pH 7,2, 10 mM ditioeritrit (DDT), 10 mM MgCl2, 0,6 mM adenozin-trifoszfát (ATP)], így kaptuk a rekombinált hibrid plazmidot.
A ligációs elegy felülúszójával E. coli ED8654 sejteket Cohen és munkatársai módszerével [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1972), 2110-2114. oldal] transzformáltunk egy éjszakán át 12 °C-on.
A transzformált sejteket tápagaron az ampicilinnel (100 pg/ml, pBR325) és kanamicinnel (25 pg/ml, Tn5öt tartalmazó beépített darab) szembeni rezisztenciájuk alapján szelektáltuk. Minden klónozott hibrid plazmid Tn5-ös HK1349-szakaszt tartalmaz (12,5 kb-l- 5,7 kb, ami a Tn5).
A pontos restrikciós feltérképezés kimutatta, hogy a transzpozondarab a szelektált Tn5-mutáns azonos beu fenotípusának (inaktivált úew-gén a Tn5-beépítés miatt; beu genotípus) megfelelően azonos helyen, ugyanabban a genomfragmensben helyezkedik el. Ezt a mutánst az alábbiakban HK4V11-nek nevezzük.
3. példa
A nem jelölt beu DNS-fragmens kinyerése a HK1349genomból
A 2. példa szerint izoláltuk a HK1349 DNS-ét, EcoRI enzimmel (4 egység/pg) teljesen emésztettük, és a fragmenseket agarózgélen végzett elektroforézissel szétválasztottuk. A 12,0 és 13,0 kb méretű DNSfragmenseket (ajelölt fragmens 12,5 kb-os volt) a gélből elkülönítettük, majd a 2. példában leírtak szerint EcoRI enzimmel vágtuk, és a 2. példa szerint defoszforilezett pVKlOO jelű vektorral [Plasmid 8 (1982), 45-54. oldal] ligáljuk. A ligációs elegy felülúszójával a 2. példa szerint E. coli sejteket (Biotechnology, 1, 1983, 1784-1791) transzformáltunk.
HU 218 739 Β
A transzformált sejteket tápagaron tetraciklinnel (25 pg/ml) és kanamicinnel (25 pg/ml) szembeni rezisztenciájuk alapján szelektáltuk.
A kapott transzformált sejteket „patch-mating” módszerrel konjugáltuk a befogadótörzsként alkalmazott HK.4V11 (beu) transzpozonmutánssal, hogy a beu-gént tartalmazó DNS-szakasz beépülését ellenőrizzük: antibiotikumrezisztens transzformált sejteket előre meghatározott mintában szelekciós táptalajra (2 pg/ml kanamicint tartalmazó tápagar) oltottunk, és párhuzamosan a befogadó HK4V11 törzsből sejtgyepet tenyésztettünk tápagarlemezeken.
Konjugáció céljából a transzformált egyedeket egyes kiónok formájában bélyegeztük a befogadótörzs sejtgyepjére, és a tenyészeteket 30 °C-on egy éjszakán át inkubáljuk. Végül a „mating”-lemezekről a sejteket szelektálás céljából az 1. példában említett, 0,2 tömeg% betaint tartalmazó ásványi só közegre bélyegeztük át, azaz olyan szubsztrátumra, amely sem a donortörzs, sem a befogadótörzs nem tud hasznosítani. A növekvő transzkonjugált egyedekben a befogadótörzs HK4V11) mutációval megváltoztatott genom-DNS-szakasza a donortörzsből származó ép DNS-tartományt tartalmazó hibrid plazmid felvételével komplementálódott, illetve homológ módon rekombinált. A komplementáló hibrid plazmidot pVKlOOs-nek neveztük. A HK4V11 törzs revertálóegyedeinek visszaszorítása érdekében 100 pg/ml neomicint adtunk a közeghez. A hibrid plazmid-DNS-t a klónozott Tn5-ös DNSfragmenssel hibridizálva kimutatható volt, hogy a pVKlOOs hibrid plazmidon a HK1349 genomjából származó ép beu-gén sikeresen kapcsolódott a komplementálófragmenshez.
4. példa
A bétáin hasznosítását klónozó DNS-szubfragmens azonosítása
Különböző restrikciós enzimekkel (BglII, Xhol, Sphl, PstI) a pVKlOOs hibrid plazmidból különböző deléciós kiónokat nyertünk, amelyeket a HK4V11 számú beu Tn5-mutánssal komplementáltunk, így 3 kb méretű, PstI enzimmel vágott DNS-szakaszt azonosítottunk a plazmidon; ez a szakasz a bétáin hasznosítását kódolja, restrikciós térképét az 1. ábra mutatja.
5. példa
A HK1349 genom stabil mutánsának előállítása
Tekintettel arra, hogy a Tn-inszerciós mutánsok antibiotikumos szelektálás nélkül, de vele együtt is nagyon instabilak, a HK1349 törzsbe stabil deléciós mutánst vezettünk be a homológ rekombinálás szokásos módszerével.
A 3. példa szerint kapott 12,5 kb méretű EcoRIfragmenst a HK-törzsekben nem exprimálható pACYC184 öngyilkos vektorba (J. Bacteriol., 134, 1978,1141-1156. oldal) klónozzuk, majd a bétáin hasznosítását klónozó beu Pstl-darabot (3 kb) 1 egység/pg mennyiségű PstI enzimmel kivágtuk. A megmaradt részt egy éjszakán át 1 egység/pg mennyiségű ligázzal újra összenövesztettük.
A pCC6 deléciós hibriddel az E. coli HB101/pRK2013 (segédplazmid pCC6 mobilizálására) törzset transzformáltuk, onnan a hibridet konjugatív transzfer útján a HK1349 törzsbe juttattuk. A kapott transzkonjugációs sejteket a prolinnegatív (Pro ) donor auxotrófiája, valamint a plazmid antibiotikum-rezisztenciája (ásványi só közeg, 0,4% glükóz, 25 pg/ml tetraciklin) alapján szelektáljuk. Ezen a közegen csak az a sejt marad meg, amely homológ rekombinálással a plazmidot beépítette a kromoszómájába, mert csak az ilyen sejt tetraciklinnel szemben rezisztens, és képes az adott összetételű közegen nőni.
A pACYC184 plazmidot és az ép óett-gént a HK1349-kromoszómából újból eltávolítottuk, mégpedig úgy, hogy a fenti transzkonjugált sejteket a megadott közegben tetraciklines szelektálás nélkül 100 nemzedéken keresztül tenyésztjük. A tetraciklinre érzékeny óew-mutánsok számának növelése érdekében a tenyészetet a beépített pACYC184 vektor és az ép óew-gén alapján szelektáltuk az alábbiak szerint: a sejteket 25 ml NYB komplex tápközegben (Oxoid, Wesel, NSZK) (10 pg/ml tetraciklin) felvettük, és 6 órán át 30 °C-on inkubáltuk. A kinövő (azaz tetraciklinrezisztens) sejteket 0,5 mg/ml D-cikloszerin és 15 mg/ml penicillin hozzáadásával megöltük. Az inkubálást 30 °C-on 84 órán át folytattuk, utána a sejteket centrifugáltuk, háromszor friss NYB-közeggel mostuk és alkalmas hígításban tápagaron szélesztettük.
A kapott telepek 18%-a tetraciklinre érzékeny volt, ennek egyharmada meg bétáin hasznosítására is képtelen. A óew-deléció pontos bevezetését hibridizálással mutattuk ki (a 3. példa szerinti, körülbelül 12,5 kb méretű fragmenssel): csak egy 3 kb-sal rövidebb EcoRIífagmenst sikerült kimutatni.
A kapott HK1349.4 mutánst az alkalmas vektorban klónozott 3 kb méretű Pstl-ffagmenssel (óeM-fragmenssel) lehetett komplementálni. A vektorokat az alábbi 6. példában írjuk le.
6. példa
a) A beu-gén bejuttatása számos széles gazdaspektrumú vektorba
A 3 kb méretű, a bétáin hasznosítását kódoló Pstlfragmenst a pKT240, pME285, pVKlOO széles gazdaspektrumú expressziós vektorokba juttattuk [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1989), 3.16 szakasz, Subcloning of DNAFragments]. A beépített darabnak a promotorhoz viszonyított orientációja itt fontos volt. A pKT240 plazmádban a beépített darabnak a Pb|a promotorhoz képest (az ampicillinrezisztenciát kölcsönző bla-gén promotorja) helyes orientációban (az átírás irányában) kell lennie.
b) beu beépítése a pKT240plazmidba
A pKT240 plazmidot 1 egység/pg mennyiségű PstI enzimmel linearizáltuk és a 3 kb méretű Pstl-fragmenssel ligálási pufferben [20 mM trisz-HCl, pH 7,2, 10 mM ditioeritrit (DDT), 10 mM MgCl2, 0,6 mM adenozin-trifoszfát (ATP)] 1 egység/pg T4-ligázzal ligáltuk 12 °C-on egy éjszakán át.
HU 218 739 Β
A kapott ligációs elegyet Lederberg és Cohen (J. Bacteriol., 119, 1974, 1072-1074, old.) módszerével E. coliS.\l-[ törzsben konjugáltuk, és az egyedeket 25 pg/ml kanamicint és 100 pg/ml ampicillint tartalmazó NYB táptalajon szelektáltuk. A beépített darabot (ampicillinre érzékeny, kanamicinnel szemben rezisztens) Pbb promotorhoz viszonyítva az átírás irányában tartalmazó hibridplazmidot pLO32-nek neveztük el.
c) pLO32 bejuttatása HK1349.4-be konjugáció utján
A pLO32 konjugációs transzferé E. coli SÍ7-1-ből HK1349.4-be szintén a fent említett módszer szerint történt. A pLO32 hibridplazmidot tartalmazó HK1349.4 sejteket közvetlenül a komplementálni kívánt betainhasznosítás alapján szelektáltuk (az 1. példa szerinti, 0,2 tömeg% betaint tartalmazó tápközegen).
7. példa
A pLO32plazmid stabilitása HK1349.4
A hibridplazmid hosszú időn keresztül megmaradó stabilitását (a HK1349.4 mikroorganizmusban) különböző közegeken vizsgáltuk. A 100%-os stabilizálás egyértelműen az egyetlen C-forrás, a betainszubsztrátum (vagy egyéb betainvegyületek, így például kolin vagy dimetil-glicin) hasznosítása révén történt. Ha a nitrogént limitáljuk és egyéb szénforrás mellett bétáin az egyetlen nitrogénforrás, akkor is 100%-os stabilitást tudtunk kimutatni.
A táblázatban használt rövidítések:
Glu: L-glutamát (C- és N-forrás)
Glc: glükóz (C-forrás); N: nitrogén +, Bet: bétáin (C- és N-forrás)
MM: minimális közeg (Kulla és munkatársai, Arch. Microbiol., 135, 1983,1-7. old.)
| Közeg | Az összes sejt | Plazmidtartalmú sejt |
| MM (ammónium-szulfáttal) 0,2% Glc Nincs szelektálás | 100% | 5% |
| MM (ammónium-szulfát nélkül) 0,1% Bet 0,2% Glu Nincs szelektálás | 100% | 20% |
| MM (ammónium-szulfát nélkül) 0,2% Bet (C- és N-forrás) | 100% | 100% |
| MM (ammónium-szulfáttal 0,2% Bet (C-forrás) | 100% | 100% |
| MM (ammónium-szulfát nélkül) 0,1% Bet (N-forrás) 0,2% Glc | 100% | 100% |
8. példa
Biotranszformált tulajdonságokkal rendelkező hibrid plazmid stabilitása
A plazmidban lévő úeu-génnek a óew-negatív HK.1349.4 gazdatörzsben kifejtett stabilizáló hatásának kimutatására a pLO3 hibridplazmidot választottuk, amelyet a 0477 828 számú publikált európai szabadalmi bejelentés már ismertet.
A pLO3 a pKT240 vektorból és egy, a TOL-plazmidból származó, 2,35 kb-os Clal-HindlII-ffagmensből áll, mely utóbbi a xylMA gént kódolja; a kanamicinfoszfotranszferáz promotor ellenőrzése alá klónozták.
a) Új kanamicinrezisztencia (Km9') kialakítása
A pRMEl plazmidból [Harayana és munkatársai, J. Bacteriol. 167 (1986), 455-461. oldal] 4 egység/pg DNS mennyiségű EcoRI enzimmel kivágtuk az 1,1 kb méretű rezisztenciakazettát, és agarózon végzett gélelektroforézissel elkülönítettük. A fragmens túlnyúló 5’-végét Klenow-reakció útján feltöltöttük (Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley, New York 1987, 3.5 számú szakasz). A pLO3 hibridplazmid DNS-ét Hpal enzimmel (1 egység/pg DNS) vágtuk, és 4,8 egység alkalikus foszfatázzal defoszforileztük. Izopropanolos kicsapás után a vágásból eredően tompa végű vektort és a feltöltésből eredően tompa végű KmR-kazettát egy éjszakán át 15 °C-on ligáltuk. Ligációs puffer: 20 mM Trisz, 10 mM MgCl2, 0,6 mM ATP, pH 7,2, 10% PEG 6000, 0,5 egység T4DNS-ligáz.
A kapott ligációs eleggyel az E. coli KI2 törzset a 2. példában leírtak szerint transzformáltuk. A pLO3 (KmR) plazmidot tartalmazó transzformált egyedeket 50 pg/ml kanamicint tartalmazó tápagaron szelektáltuk.
b) A beu-gén bevezetése pLO3 (Km9) plazmidba
A pLO3 (KmR) hibrid plazmidot PstI enzimmel (1 egység/pg DNS) linearizáltuk, és a 3 kb méretű beuPstl-ffagmenssel ligáltuk. Az E. coli-ba történő transzformálás és a HK1349.4 törzzsel végzett konjugálás a 6. példában leírtak szerint megy végbe. Az új hibrid plazmid neve: pLOLOl, a pLO3 plazmidnak felel meg, de járulékos xililmonooxigenázaktivitást (xylMA) tartalmaz.
c) Biotranszformáció stabilizált hibrid plazmiddal
Az Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349.4/ pLOLOl törzset egyetlen szénforrásként 0,2% betaint tartalmazó ásványi só közegben [Arch. Microbiol. 135 (1983), 1-7. oldal] 30 °C-on tenyésztettük. A 0,1 térfogat% koncentrációban jelen lévő 2,5-dimetil-pirazin 5-hidroxi-metil-2-metil-pirazinná történő átalakulása kimutatható volt. Két nap elteltével az 5-hidroxi-metil-2metil-pirazin hozama 20%.
d) A HK1349.4-ben lévő pLOLOl plazmid stabilitása
A 7. példában leírtak szerint megvizsgáltuk a hibrid plazmid stabilitását hosszú időn keresztül, aminek során betaint mint egyetlen szénforrást, egy másik kísérletben betaint mint egyetlen N-forrást alkalmaztunk. Mindkét esetben a plazmid fermentálást körülmények között is stabilan, 100%-osan maradt a termelőtörzsben.
Claims (8)
1. Mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy
a) olyan DNS-fragmenssel rendelkező hibrid plazmidot tartalmaz, amely betainvegyületek hasznosítását kódoló és az 1. ábra szerinti restrikciós térképpel jellemezhető genetikai szekvenciát tartalmaz, és
b) a bétáin hasznosítását kódoló kromoszomális génben mutációt tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy HK1349.4 nevű és a pLO32 plazmidot tartalmazó mikroorganizmus (DSM 6712).
3. DNS-fragmens, azzal jellemezve, hogy olyan genetikai szekvenciát tartalmaz, amely betainvegyületek hasznosítását kódolja, és az 1. ábra szerinti restrikciós térképpel jellemezhető.
4. A 3. igénypont szerinti DNS-fragmens, azzal jellemezve, hogy a pLO32 hibrid plazmidba beépítve a HK1349.4 (DSM 6712) mikroorganizmusban van letétbe helyezve.
5. Hibrid plazmid, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti DNS-fragmensből és egy expressziós vektorból áll.
6. Az 5. igénypont szerinti pLO32 nevű hibrid plazmid, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti DNS-fragmensből és a pKT240 jelű expressziós vektorból áll, és a HK1349.4 nevű mikroorganizmusban (DSM 6712) van letétbe helyezve.
7. Eljárás a bétáin hasznosítása szempontjából stabil plazmiddal transzformált mikroorganizmusok előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) betaint hasznosító mikroorganizmusok kromoszómáját úgy módosítjuk, hogy a mikroorganizmus többé nem tud betaint hasznosítani;
b) az elkülönített, a bétáin hasznosítását kódoló, 3. igénypont szerinti DNS-fragmenst expressziós vektorba Egáljuk, majd
c) az a) lépés szerint kapott mikroorganizmust a b) lépés szerint kapott hibrid plazmiddal transzformáljuk, és a transzformált egyedeket a bétáin hasznosítása alapján szelektáljuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy
a) betaint hasznosító mikroorganizmusként a HK1349 törzset mutációval a HK1349.4 mikroorganizmussá alakítjuk,
b) a bétáin hasznosítását kódoló, elkülönített, 3. igénypont szerinti DNS-fragmenst a pKT240 jelű expressziós vektorba Egáljuk, és
c) az a) lépés szerint kapott HK1349.4 törzset a b) lépésben kapott pLO32 hibrid plazmiddal transzformáljuk, és a transzformált egyedeket a bétáin hasznosítása alapján szelektáljuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH341291 | 1991-11-21 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9203644D0 HU9203644D0 (en) | 1993-01-28 |
| HUT63651A HUT63651A (en) | 1993-09-28 |
| HU218739B true HU218739B (hu) | 2000-11-28 |
Family
ID=4255432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203644A HU218739B (hu) | 1991-11-21 | 1992-11-20 | Plazmidstabilizáló mikroorganizmus |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5891710A (hu) |
| EP (1) | EP0543344B1 (hu) |
| JP (1) | JP3399993B2 (hu) |
| AT (1) | ATE170563T1 (hu) |
| CA (1) | CA2083407C (hu) |
| CZ (1) | CZ281078B6 (hu) |
| DE (1) | DE59209482D1 (hu) |
| DK (1) | DK0543344T3 (hu) |
| ES (1) | ES2121808T3 (hu) |
| HU (1) | HU218739B (hu) |
| IL (1) | IL103811A (hu) |
| MX (1) | MX9206630A (hu) |
| RU (1) | RU2099418C1 (hu) |
| SK (1) | SK279052B6 (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2698879B1 (fr) * | 1992-12-09 | 1995-01-13 | Rhone Poulenc Biochimie | gellules modifiées au niveau du catabolisme de la bétaïne, préparation et utilisations, notamment pour la production de métabolites ou d'enzymes. |
| KR100346293B1 (ko) * | 1993-10-08 | 2002-11-30 | 론자 아게 | 부티로베타인/크로토노베타인-l-카르니틴대사유전자와l-카르니틴의미생물학적제조에사용되는그것의용도 |
| ES2282399T3 (es) * | 2001-01-31 | 2007-10-16 | Lonza Ag | Procedimiento microbiologico para la obtencion de l-carnitina. |
| US7229792B2 (en) * | 2004-05-03 | 2007-06-12 | Vinod Pandiripally | Method of producing recombinant proteins |
| ES2757591T3 (es) | 2010-03-31 | 2020-04-29 | Stabilitech Biopharma Ltd | Estabilización de partículas virales |
| DK2552478T3 (en) * | 2010-03-31 | 2017-03-27 | Stabilitech Ltd | EXCIPIENTS FOR STABILIZING VIRUS PARTICLES |
| GB201117233D0 (en) | 2011-10-05 | 2011-11-16 | Stabilitech Ltd | Stabilisation of polypeptides |
| GB201406569D0 (en) | 2014-04-11 | 2014-05-28 | Stabilitech Ltd | Vaccine compositions |
| GB2562241B (en) | 2017-05-08 | 2022-04-06 | Stabilitech Biopharma Ltd | Vaccine compositions |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55156591A (en) * | 1979-05-23 | 1980-12-05 | Ajinomoto Co Inc | Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid |
| US4650761A (en) * | 1981-11-27 | 1987-03-17 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cell |
| JPS6158595A (ja) * | 1984-08-28 | 1986-03-25 | ジェネックス・コーポレイション | 徴生物によるタンパク質規模生産方法 |
| DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
| US5198343A (en) * | 1986-08-05 | 1993-03-30 | Transgene, S.A. | Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained |
| CZ279464B6 (cs) * | 1990-09-24 | 1995-05-17 | Lonza A.G. | Způsob hydroxylace methylových skupin v aromatických heterocyklech, hybridní plasmidy pL05 a p L04 uložené v mikroorganismech Pseudomonas putida a Escherichia coli |
-
1992
- 1992-10-13 RU SU925053267A patent/RU2099418C1/ru active
- 1992-11-17 DK DK92119635T patent/DK0543344T3/da active
- 1992-11-17 ES ES92119635T patent/ES2121808T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-17 EP EP92119635A patent/EP0543344B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-17 DE DE59209482T patent/DE59209482D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-17 AT AT92119635T patent/ATE170563T1/de active
- 1992-11-18 MX MX9206630A patent/MX9206630A/es unknown
- 1992-11-19 IL IL10381192A patent/IL103811A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-11-20 CZ CS923450A patent/CZ281078B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-11-20 HU HU9203644A patent/HU218739B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-11-20 JP JP31245092A patent/JP3399993B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-11-20 SK SK3450-92A patent/SK279052B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-11-20 CA CA002083407A patent/CA2083407C/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-21 US US08/897,416 patent/US5891710A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-01-29 US US09/239,524 patent/US6057146A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK279052B6 (sk) | 1998-06-03 |
| CA2083407A1 (en) | 1993-05-22 |
| DK0543344T3 (da) | 1998-11-09 |
| ATE170563T1 (de) | 1998-09-15 |
| JPH06153926A (ja) | 1994-06-03 |
| CZ281078B6 (cs) | 1996-06-12 |
| RU2099418C1 (ru) | 1997-12-20 |
| EP0543344A1 (de) | 1993-05-26 |
| IL103811A (en) | 2004-05-12 |
| US6057146A (en) | 2000-05-02 |
| IL103811A0 (en) | 1993-04-04 |
| CA2083407C (en) | 2002-07-30 |
| JP3399993B2 (ja) | 2003-04-28 |
| CZ345092A3 (en) | 1993-07-14 |
| SK345092A3 (en) | 1995-11-08 |
| HUT63651A (en) | 1993-09-28 |
| ES2121808T3 (es) | 1998-12-16 |
| EP0543344B1 (de) | 1998-09-02 |
| MX9206630A (es) | 1993-07-01 |
| US5891710A (en) | 1999-04-06 |
| DE59209482D1 (de) | 1998-10-08 |
| HU9203644D0 (en) | 1993-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Camilli et al. | Insertional mutagenesis of Listeria monocytogenes with a novel Tn917 derivative that allows direct cloning of DNA flanking transposon insertions | |
| JP2571338B2 (ja) | 形質転換された細菌 | |
| US6841366B1 (en) | Biotin biosynthesis in bacillus subtilis | |
| FI86439C (fi) | Stabiliserade plasmider. | |
| JPH0691827B2 (ja) | 新規ベクタ−プラスミド | |
| EP2389440A1 (en) | Method of double crossover homologous recombination in clostridia | |
| HU218739B (hu) | Plazmidstabilizáló mikroorganizmus | |
| FI118568B (fi) | Butyrobetaiini/krotonobetaiini-L-karnitiiniaineenvaihduntaan liittyviä geenejä ja niiden käyttö L-karnitiinin mikrobiologiseen valmistukseen | |
| EP0286303B1 (en) | Dna and its use | |
| US4703009A (en) | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes | |
| AU732074B2 (en) | Molecular genetic construction of vaccine strains of pasteurellaceae | |
| EP1252291A2 (en) | Flavobacterium heparinum expression system | |
| EP0165002B1 (en) | Recombinant dna, microorganisms containing same and their use in the production of amylases | |
| Gallori et al. | Resistance to (L)-azetidin-2-carboxylic acid in Bacillus subtilis | |
| JPH0511960B2 (hu) | ||
| AU743215B2 (en) | Food-grade cloning vector and their use in lactic acid bacteria | |
| US7358083B1 (en) | Food-grade cloning vector and their use in lactic acid bacteria | |
| Klingmüller et al. | Nif-hybrids of enterobacter: Selection for nif gene integration with chlorate | |
| US6410293B1 (en) | DNA fragments containing biotin biosynthetase gene and use of the same | |
| JPS61104790A (ja) | Ｌ−トリプトフアンの生合成に関与する遺伝情報を有する新規組換え体ｄｎａ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |