CZ279464B6 - Způsob hydroxylace methylových skupin v aromatických heterocyklech, hybridní plasmidy pL05 a p L04 uložené v mikroorganismech Pseudomonas putida a Escherichia coli - Google Patents

Abstract

Způsob využívající mikroorganismy obsahující geny, které tvoří aktivní xylenmonooxygenázu, netvoří žádnou účinnou chromosomálně nebo plasmidově kódovanou alkoholdehydrogenázu a tím jsou schopné hydroxylovat methylové skupiny aromatických pětičlenných nebo šestičlenných heterocyklů za vzniku odpovídajících hydroxymethylderivátů. Dále je popsáno použití těchto mikroorganismů k výrobě hydroxymethylovaných pětičlenných nebo šestičlenných heterocyklů. Dále je popsán způsob výroby hydroxymethylovaných pětičlenných nebo šestičlenných heterocyklů pomocí těchto mikroorganismů.ŕ

Description

Vynález se týká mikrobiologického způsobu hydroxylace methylových skupin v aromatických pětičlenných nebo šestičlenných heterocyklech. Vynález se také týká nových hybridních plasmidu a nových produkčních kmenů, které jsou zvlášť vhodné pro uvedený způsob.

Tyto hydroxymethylované heterocykly jsou například důležitými meziprodukty pro výrobu farmaceutických prostředků a chemikálií používaných v zemědělství.

Dosavadní stav techniky

Mikrobiologický způsob terminální hydroxylace alifatických vedlejších řetězců pomocí mikroorganismů změněných technikami genového inženýrství je znám z evropského patentu č. A 277 674. Tato reakce je katalyzována alkanhydroxylázou, která je kódována geny alkBA z OCT-plasmidu z Pseudomonas oleovorans.

Tyto mikroorganismy byly geneticky tak změněny, že již nejsou schopné dále oxidovat vzniklé hydroxylové skupiny na kyselinu. Přirozená exprese a regulace (alkR) těchto genů byla však ponechána. Tyto mikroorganismy nemají žádnou aktivitu pro oxidaci methylových skupin v heterocyklech, ale jen katalýzují hydroxylaci alkanů a alkylovaných sloučenin s alkylovými zbytky se 6 až 12 atomy uhlíku.

Dále je z Harayama a spol., J.Bacteriol. 171, 1989 str. 5048 až 5055 známo, že mikroorganismy druhu Pseudomonas putida s plasmidem pWWO mohou oxidovat ve třech krocích methylovou skupinu na toluenu za vzniku kyseliny benzoové. Působením xylenmonooxygenázy (xylMAj vzniká přitom nejdříve benzylalkohol, který se potom ve dvou dalších krocích katalyticky převádí pomocí alkoholdehydrogenázy (xylB) á aldehyddehydrogenázy (xylc) na kyselinu. V tomto kmeni jsou jak xyl-geny, které kódují enzymy pro odbourání xylenu, tak geny, které odpovídají za regulaci xyl-genů, na plasmidu pWWO.

Tím jsou z toho známy vlastnosti, identifikace, klonování, selekce stejně jako restrikční mapy genů xylMABCN, které jsou odpovědné za oxidaci methylových skupin. Funkce genu xylN je ještě neznámá. Není však znám žádný mikrobiologický způsob, který může hydroxylovat methylové skupiny v aromatických pětičlenných nebo šestičlenných heterocyklech.

Chemicky jsou navíc takovéto specificky hydroxymethylované heterocykly jen těžce dostupné.

Podstata vynálezu

Úlohou předloženého vynálezu je nalézt mikrobiologický způsob specifické hydroxylace methylových skupin v aromatických

-1CZ 279464 B6 pětičlenných nebo šestičlenných heterocyklech za vzniku odpovídajících čistých hydroxymethylovaných derivátů, přičemž produkty nesmějí být dále katabolizovány.

Tato úloha je řešena způsobem podle nároku 1. Podle vynálezu se způsob provádí s mikroorganismy, které

a) obsahují geny Pseudomonas TOL-plasmidu, které tvoří aktivní xylenmonooxygenázu

b) netvoří účinnou chromosomálně nebo plasmidově kódovanou alkoholdehydrogenázu.

Tím jsou mikroorganismy schopné hydroxylovat methylové skupiny pětičlenných nebo šestičlenných aromatických heterocyklů za vzniku odpovídajících hydroxymethylderivátů. Přitom heterocyklus slouží jako substrát pro reakci a nemá žádný substituent na přilehlém atomu uhlíku k hydroxylovatelné methylové skupině. Hydroxymethylderivát není dále katabolizován.

Mikroorganismy obsahují účelně geny pro tvorbu xylenmonooxygenázy z Pseudomonas TOL-plasmidu pWWO, které jsou charakterizovány následující restrikční mapou a jsou již popsány v J. Bacteriol. 171 (1989), Str. 5048-5055:

xyl M xyl A

Xhol (1,93)

() Kb

Zdroj genů xylenmonooxygenázy

Jako zdroj genů xylemmonooxygenázy lze použít Pseudomonas putida s TOL-plasmidem pWWO, který lze například získat pod ATCC 33015 uloženým v Americké sbírce typů kultur (Američan Type Culture Collection).

Genetickou informaci, potom získat tak, že a) se nismu, který slouží jako TOL-plasmid-DNA pro izolaci genová sekvence se potom c) která kóduje xylenmonooxygenázu, lze izoluje TOL-plasmid-DNA Z mikroorgazdroj DNA, potom b) se štěpí tato genu xylenmonooxygenázy a specifická vnese do expresního vektoru, a tím d) vznikne hybridní plasmid. Tento hybridní plasmid se potom vnese do vhodného mikroorganismu e) (hostitelského) s pomocí transformace f). Tento transformovaný hostitelský kmen tvoří potom produkční kmen g) (po selekci h)) pro způsob fermentace i) podle vynálezu.

2CZ 279464 B6

a) Izolace TOL-plasmid-DNA

TOL-plasmid-DNA lze získat metodami známými pro odborníka, jako například metodou podle Hansena a Olsena (J. Bacteriol. 135, 1978, str. 227 až 238) nebo podle Humphreyse a spol. (Biochim. Biophys. Acta 383, 1975, str. 457 až 483). Účelně se používá pro izolaci velkého množství TOL-plasmid-DNA metody podle Humphreyse a spol. (Biochim. Biophys. Acta 383, 1975, str. 457 až 483). Podle této metody se Pseudomonas putida (ATCC 33015) úplně lyžuje a následovně se izoluje TOL-plasmid odstředěním v gradientu hustoty.

b) Štěpení restrikčními enzymy a izolace DNA elektrofořežou na agarošovém gelu.

Po izolaci TOL-plasmid-DNA se TOL-plasmid-DNA štěpí restrikčními enzymy SA1I a HindlII, přičemž se potom izoluje fragment DNA, který kóduje xylenmonooxygenázu, elektroforézou na agarosovém gelu. Tento postup se provádí podle Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Néw York, 1987, odstavec 2.6 Izolace a čištění velkých restrikčních fragmentů DNA z agarosových gelů.

Tento fragment DNA je charakterizován následující restrikční mapou, jak už bylo dříve uvedeno, a neobsahuje žádné geny, které kódují účinnou alkoholdehydrogenázu:

xyl M xyl A

Xhol (1,93)

O Kb

c) Ligace fragmentu DNA do expresního vektoru

Takto získaný genový fragment se pomocí obvyklých molekulárně biologických technik liguje s DNA expresního vektoru předem stejně štěpenou, za vzniku hybridního plasmidu.

Expresní vektory obvykle obsahují vhodný, většinou regulovatelný promotor. Za tímto promotorem leží výhodně ve směru transkripce jedno nebo více singulárních míst štěpení pro restrikční enzymy. Do těchto míst štěpení se potom obvyklým způsobem inzeruje patřičný genový fragment, o jehož expresi je zájem.

Jako expresní vektory se účelně používají ty, které jsou uvedeny v tabulce 1. Jako expresní vektory se účelně podle vyná

-3CZ 279464 B6 lezu používají vektory se širokým hostitelským spektrem (broad host range), jako jsou pME285, pKT240, pMMB67EH nebo pMMB67EH*.

Účelně jsou tyto expresní vektory štěpeny restrikčními enzymy Sáli a HindlII, a vzniklé restrikční konce se ligují s izolovanou TOL-plasmid-DNA pomocí například T4-DNA-ligázy. Popřípadě je možné použít jiné metody ligace, jako se například popisuje v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1989, odstavec 3.16, Subklonování fragmentů DNA.

d) Hybridní plasmidy

Účelně takto vzniklé hybridní plasmidy pL03, pL04 a pL05 jsou také součástí vynálezu, vykazují široké hostitelské spektrum a mohou se tedy použít v hostitelských kmenech s vysokou tolerancí vůči substrátu a produktu.

Účelně jsou tyto hybridní plasmidy odpojovány přírodními regulačními systémy.

Hybridní plasmid pL04 (sestávající z expresního vektoru pMMB67EN a TOL-plasmid-genu popsaného shora uvedenou restrikční mapou) s promotorem P-t_aci je tedy řízen represorovým genem laclg.

Expresi TOL-plasmid-genu lze indukovat isopropylthiogalaktosidem (IPTG) .

Exprese TOL-plasmid-genu v hybridní plasmid pL05 (sestávajíci z vektoru exprese pMMB67EH a TOL-plasmid-genu a charakterizovaný restrikční mapou na str. 3) s promotorem P^-_act je stále (konstitutivně) indukována z důvodu chybějícího genu represoru laclg. Proto se účelně gen represoru laclg mutuje do pMMB67EH zavedením kanamycinové rezistence. Také je možné použít hybridní plasmid s Užším hostitelským spektrem. Účelně se jako hybridní plasmid s užším hostitelským spektrem používá pGSH2836 s promotorem lambda P_L, přičemž je exprese TOL-plasmid-genu stále (konstitutivně) indukována. Jestliže například slouží Escherichia coli (E.coli) K12* jako hostitel pro pGSH2836, musí se chromosomálně integrovaný gen represoru cI857 tepelně inaktivovat, aby se dosáhla exprese promotoru lambda P^.

Hybridní plasmid pGSH2836 je uložen v E.coli K12* pod číslem DSM 6154 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur /Deutsche Sammlung fůr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascherodeweg lb, D-3300 Braunschweig/. Hybridní plasmidy pL04 a pL05 jsou uloženy v E.coli K12* (pL04) nebo v Pseudomonas putida (pL05), jak je popsáno v dalších odstavcích.

e) Hostitelské kmeny

Na základě širokého hostitelského spektra mohou být takto vzniklé hybridní plasmidy (pL03, pL04, pL05) vneseny do velkého počtu hostitelských kmenů.

-4CZ 279464 B6

Účelně se používají hostitelské kmeny s vysokou tolerancí k substrátu a produktu, jako například rodu Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium nebo Escherichia.

f) Transformace

Vnesení hybridních plasmidů do dříve popsaných hostitelských kmenů lze uskutečnit pomocí obvyklých metod, výhodně podle metody Lederberga a Cohena (J.Bacteriol., 119, 1974, str. 1072 až 1074).

g) Produkční kmeny

Jako produkční kmeny jsou účelně používány všechny ty kmeny, které jsou uvedeny v tabulce 2. Mikroorganismy (tabulka 2) transformované hybridními plasmidy pL03, pL04 a pL05 jsou nové a jsou také součástí vynálezu.

Výhodně se používá mikroorganismus E.coli K12* transformovaný hybridním plasmidem pL04, uložený 29.8.1990 pod číslem DSM 6153 nebo mikroorganismus Pseudomonas putida JD7 transformovaný hybridním plasmidem pL05, uložený 29.8.1990 pod číslem DSM 6152, a jejich deszendenty a mutanty.

Mikroorganismy jsou uloženy u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig.

Jako produkční kmeny lze také použít takové mikroorganismy, které obsahují přírodní TOL-plasmid a u kterých je odstraněn nebo inaktivován gen, který kóduje účinnou alkoholdehydrogenázu. Inaktivaci případně odstranění genu lze uskutečnit klasickou mutací, například s acridinovou oranží pomocí inserce transposonu (Transposon-insertion) nebo metodou genového replacementu (Gene-replacements) s homologovou rekombinací (A. Zimmermann a spol., Molecular Microbiology 5, 1991, str. 1483 áž 1490).

V těchto produkčních kmenech se potom uskuteční exprese TOL-plasmid-genů, například indukcí sloučeninami jako jsou toluen, xylen nebo cymen a buněčných kultur, Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig.

Odstranění genu alkoholdehydrogenázy se účelně provádí tak, že se homologovou rekombinací vnese do přirozeného TOL-plasmidu předem připravený pomocný hybridní plasmid, ve kterém je již gen alkoholdehydrogenázy odstraněn (Gene-replacement homologovou rekombinací).

Tímto vnesením se v přirozeném TOL-plasmidu vhodně odstraní alkoholdehydrogenáza.

h) Selekce transformovaných mikroorganismů (produkčních kmenů)

Transformované mikroorganismy se vyberou obvyklým způsobem na minimálním médiu glukosa-agar vhodným antibiotikem s odpovídající inhibiční koncentrací. Použité známky resistence proti antibiotiku jsou uvedeny v tabulce 1.

-5CZ 279464 B6

i) Způsob fermentace

Produkční kmeny, jejich descendenty a mutanty, připravené podle dříve popsaných postupů, se podle vynálezu použijí pro způsob hydroxylace methylových skupin v pětičlenných nebo šestičlenných aromatických heterocyklech.

Jako substráty se pro reakci mohou používat methylované aromatické pětičlenné nebo šestičlenné heterocykly, které obsahují jeden nebo více heteroatomů ze skupiny kyslík, dusík, síra. Vhodnými pětičlennými heterocykly jsou například deriváty thiofenu, furanu, pyrrolu, thiazolu, pyrazolu a imidazolu, které nemají žádný substituent na sousedním atomu uhlíku k methylové skupině, která má být hydroxylována. Výhodně se jako pětičlenné heterocykly používají 3,5-dimethylpyrazol, 4-methylthiazol a 2,5-dimethylthiofen.

Vhodné šestičlenné heterocykly jsou například methylované deriváty pyridinu, pyrimidinu, pyrazinu a pyridazinu, které nemají žádný substituent na sousedním atomu uhlíku k methylové skupině, která má být hydroxylována. Výhodně se jako šestičlenné heterocyklý používají 2-chlor-5-methylpyridin, 2,5-dimethylpyrazin a 2,6-dimethylpyrimidin.

Před přidáním substrátu se buňky kultivují v kultivačním médiu na optickou hustotu 1 až 200 při 650 nm (OD₆₅₀), výhodně až na optickou hustotu 5 až 100.

Reakce se provádí bud' při jednorázovém, nebo kontinuálním přidání substrátu tak, aby koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhla 20 % (hmotn./obj.) popřípadě (obj./obj.) pro kapalné substráty, přičemž zkratka (hmotn./obj.) znamená hmotnost na objem a zkratka (obj./obj.) znamená objem na objem.

Výhodně se substrát přidává tak, aby koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhla 5 % (hmot./obj.) popřípadě (obj./obj.).

Reakce se obvykle provádí s buňkami v klidu při hodnotě pH od 4 do 11, Výhodně od 6 do 10.

Reakce se obvykle provádí při teplotě od 15 do 50 ’C, výhodně při teplotě od 25 do 45 °C.

Po reakci lze odpovídající hydroxymethylderiváty izolovat postupem známým v oboru.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování genů xylMA

1.1. Příprava plasmidu (Humphreyes a spol., Biochim. Biophys. Acta 383 (1975), str. 457-483).

Buňky z. 1 1 vyprané bakteriální kultury Pseudomonas putida pWWO (ATCC 3 30'15) se odstředí. Po resuspendování buněk v 10 ml 25 % sacharózy v 0,05 M tris-pufru, pH 8,0 se přidá 1,5 ml roztoku lysozymu (20 mg/ml v 0,25 M tris-pufru, pH 8,0). Následuje inkubace po dobu 5 min na ledu. Přidá se 10 ml 0,25 M Na₂EDTA (pH 8) a následuje další inkubace na ledu po dobu 5 min. Dále se přidá 15 ml roztoku Bri^ polyoxyethylenlaurylether/DCL (1 % Brij® 58, 0,4% natriumdesoxycholát v 0,01 M tris-pufru, 0,001 M

Na₂EDŤA, pH 8,0). Následuje dobré rovnoměrné promíchání, inkubace na ledu po dobu 30 min až k úplné buněčné lyse.

Po odstředění po dobu 45 min při 4 °C při 16 000 otáčkách za min se supernatant dekantuje do autoklávovaného odměrného válce. Přidá se 3% roztok NaCl (hmotn./obj.) a 10% PEG (polyethylenglykol). Opatrným obracením válce uzavřeného filmem parafinu se získá roztok, který se inkubuje 2 hodiny při 4 °C. Ten se potom odstředí 2 minuty při 5 000 otáčkách za minutu. Supernatant se potom dekantuje, a sraženina se rozpustí v 5 ml TES-pufru (0,05 M trís, 0,005 M Na₂EDTA, 0,05 M NaCl, pH 8,0) a přenese se do autoklávované 15 ml Corex-trubičky s 8,0 g chloridu vápenatého. Potom se přidá 0,6 ml roztoku bromidu ethidia (10 mg/ml) a inkubuje se 30 minut na ledu. Následuje odstředění po dobu 30 minut při 4 °C při 12 000 otáčkách za minutu, potom se opatrně dekantuje, aby se z roztoku odstranil vysrážený PEG. Roztok se potom podrobí ultracentrifugaci v uzavřených trubičkách s rotorem 50TI při 40 000 otáčkách za minutu po dobu 30 hodin a při teplotě 18 °C. Potom se pásy plasmidů isolují z gradientů CsCl₂ kanylou před UV-transiluminátorem. Potom se odstraní bromid ethidia z plasmidového preparátu vytřepáním s n-butanolem. Plasmid-DNA se vysráží isopropanolem a sraženina se suší v rychlovakuové odparce (Speed Va<^ Concentrator). Plasmidový preparát se resuspenduje v 0,01 M tris-pufru, 0,001 M Na₂EDTA, pH 8,0.

1.2. Isolace xylMA fragmentů DNA z agarosových gelů

Plasmid-DNA štěpená Sáli a HindlII (vždy 4 jednotky na μg plasmid-DNA) se podrobí preparativní elektroforéze na agarosovém gelu /0,6 % (hmot./obj.) agarosa v TBE-pufru (0,09 M tris-borát,

2,5 mM Na₂EDTA, pH 8,3, ethidiumbromid (100 pg/100 ml)/. Malé proužky membrány z DEAE-celulosy se připraví v H₂O a vloží se do zářezu v agarosovém gelu těsně před příslušným pásem fragmentu DNA. DNA se nechá shlukovat na membráně v napěťovém poli. Popřípadě se na další membráně zadržují vyšší pásy DNA. Nahloučená DNA

GZ 279464 B6 se z membrány vymyje 500 μΐ elučního pufru (20 mM tris, pH 7,5, 1 mM Na₂EDTA, 1,5 M NaCl) během 1 hodiny při 65 °C. Membrána se odstraní a opláchne. Ethiniumbromid se z roztoku DNA extrahuje n-butanolem nasyceným H₂O, DNA se precipituje isopropanolem. Sraženina se suší v rychlovakuové odparce (Speed Vac® Concentrator). Fragmentový preparát se resuspenduje v 0,01 M tris-pufru, 0,001 M Na₂EDTA, pH 8,0.

1.3. Ligace xylMA fragmentů DNA s expresními vektory (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1989), odstavec 3.16, Subklonování fragmentů DNA).

a) Příprava hybridního plasmidu pL04

Příprava DNA expresního vektoru

Před ligací se DNA vektoru pMMB67EH (2 μg) štěpí 10 jednotkami Sáli a HindlII v odpovídajícím ligačním pufru (20 mM tris-pufr, 10 mM DTT (dithioerythritol), 10 mM MgCl₂, 0,6 mM ATP, pH 7,2). Tato rozštěpená DNA se potom defosforyluje 4,8 jednotkami alkalické fosfatázy. DNA se opakovaně vysráží a promývá isopropanolem.

Ligace xylMA-DNA s DNA expresního vektoru

Jednotlivé vzorky DNA (v různých poměrech množství při nadbytku insertní DNA) se spojí a podrobí se srážení isopropanolem. Vysušené sraženiny se vnesou do 40 až 100 μΐ ligačního pufru (20 mM tris-pufr, 10 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 0,6 mM ATP, pH 7,2). K ligaci dojde po přidání 0,2 jednotek T4-DNA-ligázy na 1 μg DNA při inkubaci přes noc při 12 až 16 °C. Potom se ligační směs použije přímo pro transformaci.

b) Příprava hybridního plasmidu pL05 f

Shodně s příkladem 1.3.a) se připraví expresní vektor pMMB67EH a shodně podle přikladu 1.3.a).se potom do tohoto vektoru liguje xylMA-gen.

1.4. Transformace příslušných buněk DNA hybridního plasmidu (pL04)

a) Koncentrování DNA hybridního plasmidu (pL04)

Buňky 25 ml kultury E.coli S17-1 jako pomocného kmenu se pěstují při ODg₄₆ =2,0 a zpracují se podle metody Lederberga a Cohena (J.Bacteriol., 119 (1974), 1072 až 1074).

Po promytí těchto buněk v 10 ml 0,1 M MgCl₂ se buňky inkubují po dobu 30 minut v 10 ml 0,1 M CaCl₂ na ledu. Potom se tyto buňky odstředí a řesuspendují v 1 ml 0,1 M CaCl₂. Každých 0,2 ml buněčné suspense se smíchá s 0,5 μg ligované DNA hybridního plasmidu pro transformaci. Následuje inkubace po dobu delší než 30 minut na ledu a dvouminutový tepelný šok při 42 °C. Potom se buněčné suspense doplní na 5 ml předehřátým kvasinkovým živným

-8CZ 279464 B6 prostředím (Nutrient Yeast Broth, Oxoid, Wesel, BRD). Potom se suspense inkubuje 1 hodinu bez třepání a další hodinu s třepáním při optimální teplotě růstu buněk příjemce (E.coli S17-1) pro expresi genů. Alikvótní části transformovaných kultur se umístí na odpovídající selektivní média (živný agar, 100 μ9 ampicilinu na 1 ml).

b) Transformace pL04 do produkčního kmene

Z kmene E.coli S17-1 s pL04 se isoluje hybridní plasmid pL04 podle příkladu 1.1. a'1.2. Potom se E.coli K12* transformuje hybridním plasm-icidem pL04 podle metody uvedené v příkladu

1.4. aj. Selekce se provádí pomocí selektivního média (živný agar, loo μg ampicilinu na 1 ml).

1.5. Transformace příslušných buněk s hybridním plasmidem pL05

Hybridní plasmid pL05 v Pseudomonas putida JD7 se transformuje podle příkladu 1.4. Selekce se provádí pomocí selektivního média (živný agar, 50 μg kanamycinu na 1 ml).

Příklady 2 až 8

Hybridní plasmid pL03 se připraví podle příkladu 1.3. Hybridní plasmidy pGSH2836, pL03, pL04 a pL05 se transformují do hostitelských kmenu E.coli K12 , Pseudomonas aeruqinosa PAO25, Pseudomonas putida JD7 a Pseudomonas putida podle příkladů 1.4 a 1.5. Výtěžky reakce těchto produkčních kmenů jsou shrnuty v tabulce 2.

Příklad 9

Konstrukce mutantů xylB

9.1. Konstrukce plasmidu pLOlO

Geny xylMABCN se isolují z plasmidu pGSH2816 (Haramaya a spol., J.Bacteriol., 171, 1989) pomocí EcoRI a Hpal - restrikce a následuje ligace do vektoru pBR322 podobně rozštěpeného (Bolivar a spol., Gene 2, 1977, str. 95 ff).

9.1.1. Štěpení restrikčními enzymy a isolace DNA elektroforesou na agarosovém gelu.

pGSH2816-DNA štěpená pomocí EcoRI a Hpal (vždy 5 jednotek na 1 μg DNA) se rozdělí pomocí preparativní elektroforesy na agarosovém gelu (0,7 % agarosy v 0,09 M tris-borátu, 2,5 mM Na-EDTA, pH 8,3) a isolují se fragmenty DNA hledané velikosti (podle příkladu 1.2.).

9.1.2. Ligace fragmentu DNA s xylMABCN do pBR322 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York 1988: odstavec 3.16, Subklonování fragmentů DNA).

-9CZ 279464 B6

a. Příprava vektorové DNA

Před ligací se rozdělí pBR322-DNA (2^g) pokaždé s 10 jednotkami EcoRI a Scal preparativní elektroforesou na agarosovém gelu v restrikčním pufru (50 mM tris, 10 mM MgCl₂, 100 mM). Isolují se pruhy požadované velikosti 3850 bp, jak se popisuje v příkladu 9.1.1.

b. Ligace

Pro ligacd. se spojí vzorky DNA (v různých poměrech množství při přebytku insertní DNA), přidá se k nim ligační pufr (20 mM tris, 10 M DTT, 10 mM MgCl₂, 0,6 mM ATP, pH 7,2) a po přidání 1 jednotky T4-DNA-ligázy se inkubuje přes noc při 12 až 16 °C. Potom se tato ligační směs přímo použije pro transformaci.

c. Transformace E.coli C600 (podle příkladu 1.4.)

Selekce se provádí na živném agaru tetracyklinem (25 μg/μl). Po kontrole restrikce se čistí větší množství pLOlO-DNA pomocí gradientu CsCl.

9.2. Konstrukce plasmidu pLOll

9.2.1. Štěpení pLOlO-DNA restrikčními enzymy μg pLOlO-DNA se štěpí 22 jednotkami HindlII v restrikčním pufru (10 mM tris, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,5) a podrobí se preparativní elektroforese na agarosovém gelu. Isolují se dva fragmenty o velikosti 3,8 kb popřípadě 2,9 kb, jak je popsáno v příkladě 9.1.1. a vloží se do 45 popřípadě 30 μΐ vody. Fragmenty obsahují vektor pBR322 a rozsah xyl-genů kromě xylB.

9.2.2· Ligace

Oba fragmenty isolované podle příkladu 9.2.1. se použijí pro ligaci, jak je popsáno v příkladě 9.1.2b. K tomuto účelu se smíchá 45 μΐ fragmentu 3,8 kb, 30 μΐ fragmentu 2,8 kb, 10 μΐ ligačního pufru, 10 μΐ 10 mM ATP a 1 μΐ T4-DNA-ligázy. Směs se inkubuje přes noc při 12 až 16 °C. Potom se DNA sráží ethanolem a vnese do 10 μΐ vody.

9.2.3. Transformace E.coli HB101

DNA připravená podle příkladu 9.2.2. se přímo použije pro transformaci E.coli HB101 (podle příkladu 9.1.2c). Transformované buňky se podrobí selekci na živném agaru s tetracyklinem (25 μg/μl).

9.3. Převedení pLOll do E.coli HB101 obsahující pRK2013

E.coli HB101 obsahující pRK2013 je zvoleno jako hostitel pro pLOll. Pomocí funkce kódované na pRK2013 je možná mobilizace do jiných gram-negativních bakterií, jako například Pseudomonas putida JD7 s pWWO.

-10CZ 279464 B6

Isolovaná pLOll-DNA se transformuje do E.coli HB101 obsahující pRK2013 podle příkladu 9.1.2a. Selekce se uskutečňuje na živném agaru s tetracyklinem (25 μg/μl) a kanamycinem (25 μg/μl).

9.4. Konjugace E.coli HB101 obsahující pRK2013 pLOll s Pseudomonas putida JD7 obsahující pWWO

Z kultur obou partnerů konjugace pěstovaných přes noc se odstředí 2 ml, několikanásobně se promyjí 0,9% roztokem NaCl (solankou), zředí v 100 μΐ solanky a smíchají se na destičkách z živného agaru.. Pro konjugaci se destičky inkubují po dobu 6 hodin při 30 ’C.„Vzniklý bakteriální drn (trávník) se resuspenduje v 1 ml solanky a ve vhodném zředění se nanese na destičky z živného agaru s tetracyklinem (50 μg/μl). Ze získaných transkonjugátů se některé dostanou do TOL-plasmidu na základě homologní rekombinace pLOll.

9.5. Výměna markérů mezi pLOll a pWWO

Pro zamezení homologní rekombinace xylB na TOL-plasmid pWWO do Pseudomonas putida JD7, se kultivuje více než 100 generací dříve získaných transkonjugátů E.coli, které nebyly podrobeny selekci s tetracyklinem. Přitom je žádoucí vyloučení (odstranění) vektoru pBR322 a intakního genu xylB.

Ke zvýšení počtu mutantů xylB sensitivních na tetracyklin, se provede selekce proti integrovanému vektoru pBR322.

Buňky se umístí do 25 ml komplexního média tvořeného živným kvasinkovým prostředím (Nutrient Yeast Broth, Oxoid, Wesel, BRD) a tetracyklinem (50 μg/μl) a inkubují se až k optické hustotě přibližně 3,0 při OD₆₅₀ ^a P^ři teplotě 30 °C. Potom se přidá 500 μg/ml cykloserinu C a 100^g/ml piperacilinu. Po několikahodinové inkubaci při 30 °C se uskuteční téměř úplná buněčná lyse. Buňky, které přežijí, se odstředí, několikrát se promyjí solankou a ve vhodné koncentraci se nanesou na destičky živného agaru. Až 85 % získaných kolonií je senzitivních na tetracyklin.

9.6. Test kolonie na přítomnost xylB-delece

9.6.1. Důkaz delece pomocí Southern-Blot-hybridizace pWWO'-DNA z obdržených klonů se isoluje podle Kado a Liu (J.Bacteriol., 145, str. 1365 až 1373 /1981/). 1 ml kultury pěstované přes noc se odstředí a resuspenduje v 40 mM tris-acetátovém pufru, 2 mM EDTA, pH 7,9. Buňky se podrobí lyse přidáním 200 μΐ 3 % SDS, pH 12,6, potom se inkubují 1 hodinu při 65 °C a potom se několikanásobně extrahují fenol-chloroformem (1:1).

Vodný roztok DNA se zbaví fenolu opakovaným promýváním diethyletherem a smísí se s 3 M roztokem acetátu sodného o pH 4,8 v objemovém poměru 1:10.

Potom se DNA precipituje ethanolem a po sušení se přidá 100 μΐ vody.

-11CZ 279464 B6

Přibližně 40 μΐ vzorku DNA takto připraveného se nechá štěpit 100 jednotkami EcoRI a 5 jednotkami Hpal ve štěpném pufru (50 mM tris, 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,5) a podrobí se elektroforese na agarosovém gelu. DNA přemístěná na nitrocelulosovou membránu se hybridizuje proti 500 ng sondy pLOll značené ³²P-ATP. Delece xylB 1,4 kb je přímo rozeznatelná po autoradiografii.

Příklad 10

Příprava hydroxymethylovaných heterocyklů

E-coli K12* s pL04 (DSM č. 6153) se kultivují přes noc při 30 'C v kvasinkovém živném médiu (Nutrient Yeast Broth, Oxoid, Wesel, BRD) za přídavku odpovídajícího antibiotika uvedeného v tabulce 1 podle metody uvedené v příkladu 1.4. pro stabilizaci plasmidů. Alikvótní část se potom přenese do čerstvého média a inkubuje se další 2 hodiny při .30 °C, před tím než se indukují geny xylenmooxygenázy podle systému exprese (tabulka 1). To se stane přidáním 1 mM IPTG pro indukci exprese pomocí tac-promotoru. Indukční fáze trvá pokaždé mezi 2 až 4 hodinami. Suspense bakterií se odstředí a buněčný sbalek (peleta) se potom resuspenduje v čerstvém médiu bez antibiotika tak, aby se dosáhla hodnota optické hustoty 10 při OD_65Q. Tato suspense se pak přidá k 0,1 % roztoku (obj./obj. pro kapalné substráty, hmotn./obj. pro pevné substráty) heterocyklů, které mají být oxidovány, a dále se inkubuje při 30 °C. Po určité době se zjišťuje tvorba produktu v bakteriální suspenzi.

Příklad 11

Pseudomonas putida JD7 s pL05 se pěstuje podle příkladu 10. Z důvodu chybějícího receptorového genu laclg není třeba indukovat pomoci IPTG. Kmenu se používá pro reakci heterocyklů stejně jako v příkladu 10.

Příklad 12

E.coli KÍ2* s pGSH2836 (DSM č. 6154) se pro reakci použije ve shodě s příkladem 10. Indukce se uskuteční inaktivováním receptorového genu cI857 působením teploty 42 °C po 2 hodiny.

Příklady 13 a 14

Produkční kmeny připravené v příkladech 2 až 8 se použijí pro reakci podle příkladu 10.

Příklady 15 až 20

Údaje o výtěžcích reakce různých heterocyklů s produkčním kmenem z příkladu 12 jsou uvedeny v tabulce 3.

-12CZ 279464 B6

Tabulka 1

Vektory exprese (bez xylMA) popsané v hybridní charakterizovány plasmidy s xylMA velikost v kb

pLV85	J.Bacteriol.169 (1987) str.4457 . -4462	pGSH2836	ampicilin-resistentní promotor lambda PL	5,25
pME285	Gene 36 (1985) str. 27-36	pL02	kanamycin-sensitivní soli rtuti-resistentní mobí.	. 12,95
pKT240	Gene 26 (1983) str. 273-282	pL03	kanamycin-sensitivní ampicilin-resistentní mobí	15,25
pMMB67EN	Gene 48 (1986) str. 119-131	pL04	ampicilin-resistentní promotor P^ac,laclq±	11,15
pMMB67EH*	-	pL05	ampicilin-resistentní	13,5

promotor P_t laclq~ kanamycin-resistentní

Tabulka 2: Produkční kmeny pro hydroxylaci methylových skupin

Příklad	produkční kmeny	obsahující hybridní plasmid nebo mutovaný plasmid (pWO')	č. uložení výtěžek v í reakce
DSM	2-chlor-5-methyl-pyrimidinu jako substrátu v koncentraci 0,1 % (obj./obj.)
2	E.coli K12*	pGSB2836	6154	80
3	E.coli K12*	pL04	6153	80
4	E.coli K12*	pL03	-	80
5	E.coli K12*	pL05	-	80
6 ..	Pseudomonas aeruqinosa PA025	pL05	-	10
7	Pseudomonas putida JD7	pL05	6152	5
8	Pseudomonas putida	pL05		5

13CZ 279464 B6

Tabulka 3: Mikrobiologická oxidace methylovaných aromatických heterócyklů kmenem mikroorganismu: E.coli kl2*, který obsahuje vektor exprese pGSH2836

Příklad	substrát	koncentrace substrátu v kult, médiu	doba reakce v h.	konečný produkt	výtěžek v S
15	2-chlor-5-methylpyridin	0,1 % (obj./obj.)	16	2-chlor-5-hydroxymethylpyridin	80
16	2,5-dimethylpyrazin	0,1 % (obj./obj.)	16	2-hydroxymethyl- -5-methylpyrazin	50
17	2,6-dimethylpyrimidin	0,1 % (hmot./obj.)	16	2-hydroxymethyl- . -4-methylpyrimidin	10
18	3,5-dimethylpyrazol	0,1 % (hmot./obj.)	16	3-hydroxymethyl- -6-methylpyrazol	10
19	4-methylthiazol	0,1 % (obj./obj.)	16 '	4-hydroxyméthyl- thiazol	10
20	2,5-dimethylthiofen	. 0,1 % (obj./obj.)	16	2-hydroxymethyl- -5-methylthiofen	10

Průmyslová využitelnost

Mikroorganismy a mikrobiologický způsob hydroxylace methylových skupin lze použít všude tam, kde je zapotřebí vyrobit hydroxymethylované aromatické pětičlenné nebo šestičlenné heterocykly. Tyto hydroxymethylované heterocykly jsou například důležité meziprodukty'pro výrobu farmaceutických prostředků a chemikálií používaných v zemědělství.

Claims (11)

1. Způsob hydroxylace methylových skupin v aromatických heterocyklech, vyznačující se tím, že se přeměna provádí s mikroorganismy, které

a) obsahují geny Pseudomonas TOL-nlasmidu, které tvoří aktivní xylenmonooxygenázu a jsou charakterizovány následující restrikční mapou:

xyl M xyl A

Xhol (1,93)

O Kb

b) netvoří účinnou chromosomálně nebo plasmidově kódovanou alkoholdehydrogenázu, a tím jsou schopné hydroxylovat methylové skupiny aromatických pětičlenných nebo šestičlenných heterocyklů, které obsahují jeden nebo více heteroatomů z řady kyslík, dusík, síra, za vzniku odpovídajícího hydroxymethylderivátu, přičemž heterocyklus slouží jako substrát pro přeměnu a nemá žádný substituent na sousedním atomu uhlíku methylové skupiny, která se má hydroxylovat, a hydroxymethylderivát se dále nekatabolizuje.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující setím, že se přeměna provádí s mikroorganismy, které patří k rodu Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium nebo Escherichia.

Způsob podle nároku 1, že se přeměna provádí s TOL-plásmid, ve kterých vyznačující se tím, mikroorganismy obsahujícími přírodní je odstraněn nebo inaktivován gen, který kóduje účinnou alkoholdehydrogenázu.

4. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 2, vyznačující set í m, že se přeměna provádí s mikroorganismem druhu Escherichia coli K12* transformovaným hybridním plasmidem pGSH2836 DSM 6154, a/nebo s jeho spontánními mutanty.

-15CZ 279464 B6

5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 2, vyznačující se tím, že se přeměna provádí s mikroorganismem druhu Escherichia coli K12* transformovaným hybridním plasmidem pL04 DSM 6153, a/nebo s jeho spontánními mutanty.

6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 2, vyznačující se tím, že se přeměna provádí s mikroorganismem druhu Pseudomonas putida JD7 transformovaným hybridním plasmidem pLO5 DSM 6152, a/nebo s jeho spontánními mutanty.

7. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se přeměna provádí bud’ při jednorázovém, nebo kontinuálním přidáváni substrátu tak, že koncentrace substrátu v kultivačním médiu nepřesáhne 20 % hmot./objem nebo objem/objem.

8. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se přeměna provádí při hodnotě pH od 4 do 11 a při teplotě od 15 do 50 °C.

9. Hybridní plasmid pL04 DSM 6153 uložený v Escherichia coli K12*, který se skládá z expresního vektoru pMMB67EH a genů z Pseudomonas TOL-plasmidu podle nároku 1, o délce 2,35 Kb, které vykazují místo štěpení Sáli a HindlII.

10. Hybridní plasmid pL05 DSM 6152 uložený v Pseudomonas putida JD7, který se skládá z expresního vektoru pMMB67EH* a genů z Pseudomonas TOL-plasmidu podle nároku 1, o délce 2,35 Kb, které vykazují místo štěpení Sáli a HindlII.

11. Mikroorganismus druhu Escherichia coli K12 DSM 6153 transformovaný hybridním plasmidem pL04, který je Schopný hydroxylovat methylové skupiny v aromatických heterocyklech.

12. Mikroorganismus druhu Pseudomonas putida JD7 DSM 6152 transformovaný hybridním plasmidem pL05, který je schopný hydroxylovat methylové Skupiny v aromatických heterocyklech.