FI79139B - Foerfarande foer klonande av en gen, som kodar foer ett vaermebestaendigt -amylas, in i escherichia coli och bacillus subtilis. - Google Patents

Description

1 79139

Menetelmä lämmönkestävää α-amylaasia koodaavan geenin kloonaamiseksi Escherichia coliin ja Bacillus subtilikseen 5 Keksintö koskee kimeerisiä plasmideja, jotka sisäl tävät termostabiilia α-amylaasi-entsyymiä koodaavan geenin sekä niiden tuottamismenetelmää. Kuvataan myös geenin kloonausta Escherichia coliin tai Bacillus subtilikseen sekä syntyvien mikro-organismien käyttöä lämmönkestävän 10 α-amylaasi-entsymin tuottamiseksi.

Maissitärkkelyksen entsymaattisen hydrolyysin avulla tuotetaan suuria määriä glukoosia sisältävää siirappia. Tämän menetelmän ensimmäinen vaihe suoritetaan tavallisesti käsittelemällä tärkkelys-vesiseosta a-amylaasi-entsyy-15 millä veden kiehumispistettä lähellä olevissa lämpötiloissa. Lämmönkestävä a-amylaasi on tehokkain näissä lämpötiloissa. Tästä syystä on erittäin hyödyllistä saada tämän lämmönkestävän entsyymin halpa lähde.

α-amylaasia, jota käytetään kaupallisesti, tuote-20 taan erilaisten mikro-organismien avulla. On tunnettua, että nämä mikro-organismit tuottavat geneettistä materiaalia, joka koodaa organismin entsyymien tuottoa. Tämä geneettinen aine on läsnä solun sisällä deoksiribonukleii-nihapon muodossa, jota tässä yhteydessä myöhemmin nimite-25 tään DNA:ksi.

Suurin osa bakteerin geneettisestä materiaalista on läsnä jättiläismäisinä DNA-molekyyleinä, jotka sijaitsevat solussa kromosomeina. Kuitenkin tietty määrä geneettistä ainetta saattaa olla myös DNA:n pienempien rengas-30 maisten molekyylien muodossa, jotka tunnetaan plasmideina.

Geneetikon tuntemin menetelmin on mahdollista siirtää osa DNA:sta organismilta toiselle. Monet ovat yrittäneet käyttää näitä menetelmiä kehittääkseen mikro-organismeja, jotka ovat ensiluokkaisia a-amylaasin tuottajia.

35 Yksi menetelmä, jota on käytetty, on koko DNA:n, 2 79139 ts. kromosomi- sekä plasmidi-DNA:n poistaminen mikro-organismista, jonka tiedetään tuottavan amylaasia. Tämän DNA:n fragmentit liitetään sitten bakteriofaagin DNA:han. Tätä yhdistettyä DNA:ta sisältävää bakteriofaagia käytetään 5 toisen mikro-organismin infektointiin, jolloin bakterio-faagi siirtää tämän geneettisen aineen mikro-organismin kromosomi-DNA:han. Infektoidun organismin soluista, jotka ottavat vastaan DNA:ta sisältävän amylaasigeenin aktiivisessa muodossa, tulee amylaasin tuottajia. Nämä solut voi-10 daan valita ja kasvattaa seuraavaa käyttöä varten.

Muuhun geenimanipulaatioon liittyvään tekniikkaan, jota on käytetty lämmönkestävien a-amylaasien yhteydessä, sisältyy koko DNA:n uuttaminen mikro-organismista, jonka tiedetään tuottavan tällaisia amylaaseja. DNA:n joitakin 15 osia siirretään uuteen isäntämikro-organismiin, jolloin ne liitetään isäntämikro-organismin kromosomiin. Kaikki solut, joihin on liitetty DNA, joka sisältää aktiivista amylaasia koodaavaa geneettistä materiaalia, valitaan ja kasvatetaan.

20 Tiedetään, että DNA, joka koodaa lämmönkestävää a- amylaasia, voi olla luonnossa esiintyvässä plasmidissa. Edelleen on havaittu, että tällainen luonnossa esiintyvä geneettinen materiaali, joka sisältää lämmönkestävää a-amylaasia koodaavan geenin, voidaan yhdistää suoraan toi-25 seen plasmidiin, joka tunnetaan plasmidivektorina, synteettisen plasmidin saamiseksi, jota tämän jälkeen sanotaan kimeeriseksi plasmidiksi. Tämä kimeerinen plasmidi voidaan sijoittaa uuteen isäntämikro-organismiin, jossa se voi lisääntyä. Tämä suo mikro-organismien kehittymisen, 30 jotka ovat ensiluokkaisia a-amylaasin tuottajia, joita voidaan kasvattaa helposti kaupallisessa mittakaavassa. Keksinnön kohteena ovat äskettäin keksityt, luonnossa esiintyvät plasmidit, jotka sisältävät a-amylaasi-geenejä, niiden geneettisen materiaalin sisältävien kimeeristen 35 plasmidien muodostaminen sekä näitä kimeerisiä plasmideja I! 3 79139 sisältävien uusien mikro-organismien kehittäminen.

FI-patenttijulkaisun 64814 kohteena on kimeerinen plasmidi, joka sisältää B. amyloliquefaciens'in a-amylaa-sigeenin.

5 FI-kuulutusjulkaisu 70424 koskee toisen a-amylaasi- geenin, B. coagulans'ista saadun geenin kloonausta. Kummassakaan julkaisussa ei käytetä termostabiilin a-amylaa-sigeenin sisältävää luonnossa esiintyvää B. stearothermo-philus-plasmidia lähtöaineena.

10 FI-patenttijulkaisun 58157 mukaan B. stearothermo- philuskannat tuottavat termostabiilia a-amylaasia. Julkaisussa ei kuitenkaan mainita kimeerisiä plasmideja eikä tämän hakemuksen mukaista yllättävää havaintoa, että näiden kantojen amylaasigeeni on plasmidissa, joka voidaan 15 eristää bakteerin muusta DNA:sta ja käyttää suhteellisen puhtaana lähtöaineena kimeeristen plasmidien valmistuksessa.

Keksinnön menetelmän mukaisesti termostabiilia a-amylaasia koodaavaa geeniä sisältävä kimeerinen plasmidi 20 valmistetaan siten, että a) pilkotaan luonnossa esiintyvä mikro-organismipe-räinen DNA, joka sisältää termostabiilia α-amylaasia koo-daavan geenin, restriktioendonukleaasilla Hind III α-amy-laasigeeniä sisältävän lineaarisen DNA-sekvenssin saami- 25 seksi; b) pilkotaan sopiva E. coli- tai B. subtilis-vek-torin restriktioendonukleaasilla Hind III toisen DNA-sek-venssin saamiseksi; ja c) yhdistetään vaiheessa a) ja b) saadut lineaari-30 set DNA-sekvenssit T4-DNA-ligaasilla. Tunnusomaista on, että luonnossa esiintyvä mikro-organismiperäinen DNA on Bacillus stearothermophilus-kannasta saatua plasmidi-DNA:ta.

Keksinnön mukaiselle kimeeriselle plasmidille, on 35 tunnusomaista, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka si- 4 79139 sältää Bacillus stearothermophilus-kannasta saadun plas-midi-DNA:n a-amylaasigeenin ja sopivan E.coli- tai B-sub-tilis-vektorin DNA:ta. Kimeerisen plasmidin valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että 5 a) pilkotaan äsken mainitulla menetelmällä valmis tettu plasmidirestriktioendonukleaasilla Hind III α-amy-laasigeeniä sisältävän lineaarisen DNA-sekvenssin saamiseksi ; b) pilkotaan sopiva E. coli- tai B. subtilisvektori 10 restriktioendonukleasilla Hind III toisen lineaarisen DNA- sekvenssin saamiseksi ja c) yhdistetään vaiheessa a) ja b) saadut lineaariset DNA-sekvenssit T4-DNA-ligaasilla.

Lopuksi keksinnön mukaisesti tarjotaan menetelmä 15 lämmönkestävän a-amylaasin valmistamiseksi suurina saantoina. Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää vaiheet, joissa a) vähintään yksi patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen kimeerinen plasmidi viedään isäntämikro-organis- 20 miin, joka on E. coli tai B. subtilis; b) kimeeristä plasmidia sisältävä mikro-organismi viljellään sopivalla alustalla; ja c) viljellyn mikro-organismin tuottama a-amylaasi eristetään.

25 Keksintö tarjoaa lämmönkestävää a-amylaasia koodaa- van geenin multippeleiden kopioiden valmistusmenetelmän yhdessä ainoasssa solussa. Se tarjoaa myös keinot amylaa-sigeenin siirtämiseksi mikro-organismeihin, joita voidaan kasvattaa helpommin kuin donorimikro-organismeja. Täten 30 saadaan helposti entsyymin lisääntyneitä saantoja.

Patenttihakemuksen selventämiseksi esitetään seu-raavat määritelmät tässä yhteydessä käytetyille erikoistermeille: 1. Luonnossa esiintyvä plasmidi 35 Termillä "luonnossa esiintyvä plasmidi", jota tässä

II

5 79139 hakemuksessa on käytetty, tarkoitetaan mitä tahansa plas-midi-DNA:ta, joka on läsnä luonnossa esiintyvässä mikro-organismissa.

2. Kimeerinen plasmidi 5 Termiä "kimeerinen plasmidi" käytetään yleisesti tarkoittamaan rekombinantti-DNA:n plasmidia, joka on muodostettu donorimikro-organismista sekä sopivasta vektori-plasmidista jollakin genetiikkaan liittyvällä menetelmällä.

10 3. Lämmönkestävä g-amylaasi Tässä hakemuksessa käytetty termi lämmönkestävä "a-amylaasi" tarkoittaa jokaista α-amylaasivalmistetta, joka voi säilyttää ainakin noin 60 % alkuaktiivisuudesta, kun sitä on pidetty 90°C:ssa ja pH 6,0:ssa 45 minuutin ajan 15 kalsiumionin läsnäollessa.

4. g-amylaasi-geeni DNA-segmentti, joka koodaa solussa tuotetun a-amy-laasin sekä sisältää katalyyttisesti aktiivisen a-amylaa-sin synteesiä koskevan välttämättömän säätelyinformaation. 20 Keksinnön mukaiset kimeeriset plasmidit valmiste taan käyttämällä DNA:ta, joka on saatu luonnossa esiintyvästä donorimikro-organismista, joka sisältää lämmönkes-tävää α-amylaasia koodaavan geenin. Sopivia donorimikro-organismeja löytyy termofiilisten bakteereiden joukosta, 25 jotka on luokiteltu Bacillus stearothermophilukseksi. B. stearothermophilus-kannat, jotka erityisesti soveltuvat käytettäviksi donori-DNA:n lähteinä, ovat kannat, jotka on valittu ryhmästä, joka käsittää B. stearothermophilus-kannat, ATCC 31 195; 31 196; 31 197; 31 198; 31 199 sekä 30 31 783.

On havaittu, että plasmideja, joissa on lämmönkes-tävää α-amylaasi-entsyymiä koodaava geeni, on läsnä monessa mikro-organismissa. Plasmidi-DNA soveltuu erityisesti donori-DNA:n lähteeksi, koska se voidaan helposti puhdis-35 taa ultrasentrifugin avulla. Täten saadaan DNA-lähde mene- 6 79139 telmää varten, jossa amylaasigeenit ovat voimakkaasti konsentroidut eikä niissä ole paljon asiaankuulumatonta ja ei-toivottua geneettistä materiaalia.

Jokaista isäntämikro-organismin kanssa yhteen sopi-5 vaa vektoria voidaan käyttää keksinnön mukaisten kimeeris-ten plasmidien muodostamiseen. Nämä plasmidit havaitaan helpommin, jos vektorissa on markkeri. Erityisen käyttökelpoisia ovat vektorit, joissa on antibioottiresistenssi-markkeri. Helposti on saatavissa Escherichia colin, lyhen-10 nettynä E. colin plasmideja, jotka sisältävät tällaisia antibioottiresistenssimarkkereita. Sopivia plasmideja ovat pBR322, pBR325 sekä pWL625. Käyttökelpoisia ovat myös Bacillus subtiliksen, lyhennettynä B. subtiliksen plasmidit, kuten esimerkiksi plasmidi pC194, joka sisältää geenin, 15 joka antaa kloramfenikoliresistenssin.

Tällaisten vektoreiden käytön etuna on, että ne voivat olla solun sisällä useampina kopioina. Sen tähden, kun a-amylaasia koodaava geeni on liitetty näihin vekto-reihin, geeni on soluissa myös useampina kopioina. Tästä 20 seuraa suurempi a-amylaasin tuotto solua kohti. Kun isän-täorganismina käytetään E. coli-kantoja, geenin edelleen vahvistaminen on mahdollista. Se suoritetaan käyttämällä D.B. Clewellin, J. Bacteriology, 110, 667-676 (1972), kloramfenikoli-geenin vahvistusmenetelmää.

25 Keksinnön mukaiset kimeeriset plasmidit muodoste taan sopivan restriktioendonukleaasin avulla pilkkomalla ensin luonnossa esiintyvä DNA, joka sisältää lämmönkestä-vän α-amylaasi-entsyymin. Donori-DNA, joka pilkotaan, on mieluummin plasmidi-DNA. Tämä plasmidi voidaan pilkkoa 30 ennen tai sen jälkeen, kun se erotetaan donorin kromosomi-DNArsta. Endonukleaasin täytyy olla sellainen, joka pilkkoo donori-DNA:n, mutta jättää koskemattomaksi geenin, joka koodaa a-amylaasi-entsyymiä. Entsyymi Hind III:n on todettu olevan sopiva tähän tarkoitukseen.

35 On tarpeellista pilkkoa myös vektorit, jotka ovat

II

7 79139 välineitä, joihin α-amylaasia koodaava geeni liitetään. On sopivaa pilkkoa nämä vektorit endonukleaasilla, jota on käytetty donorimikro-organismin DNA:n pilkkomiseen. Kuitenkin vektori voidaan pilkkoa millä tahansa endonuk-5 leaasilla, joka antaa lineaarisen DNA:n, jossa on päät, jotka voidaan yhdistää donori-DNA:n fragmenttien päihin.

Pilkkominen voidaan suorittaa donori-DNA:n ja vektorin seokselle tai donori-DNA ja vektori voidaan pilkkoa erikseen. Kummassakin tapauksessa saadaan lineaaristen 10 DNA-sekvenssien seos. Jotkut donorimikro-organismista peräisin olevista lineaarisista sekvensseistä sisältävät α-amylaasia koodaavan geenin.

Donori-DNA:ta ja vektoria pilkkomalla saadut lineaariset DNA-sekvenssit sekoitetaan ja liitetään yhteen 15 uuden plasmidin, kimeerisen plasmidin muodostamiseksi.

Lineaaristen DNA-sekvenssien yhdistäminen suoritetaan li-gaasin avulla käyttämällä tutkimustyössä hyvin tunnettua tekniikkaa. Tähän tarkoitukseen sopiva ligaasi on kaupallisesti saatava T4-DNA-ligaasi.

20 Keksinnön mukaiset kimeeriset plasmidit tehdään biologisesti aktiivisiksi siirtämällä ne sopivan mikro-organismin isäntäsoluihin. Sopiviin isäntiin kuuluvat amy-laasin suhteen negatiiviset E. coli-kannat RRl ja C600 sekä amylaasin suhteen negatiiviset B. subtilis-kannat 25 ATCC 31 785 sekä Bacillus Genetic Stock Center nro 1A289. Siirtäminen suoritetaan hyvin tunnetuin menetelmin. Näihin menetelmiin kuuluu komponenttien solujen suorittama plas-midien absorptio, protoplastifuusio ja CaCl2:lla, käsiteltyjen E. coli-solujen suorittama absorptio.

30 Haluttuja plasmideja sisältävät solut valitaan seu lomalla solut, joilla on donorin amylaasiaktiivisuutta. Jos vektori sisältää antibioottiresistenssimarkkerin, alustava seulonta suoritetaan sopivasti viljelemällä solut antibioottia sisältävillä agarmaljoilla. Silloin kasvavat 35 vain ne solut, joilla on toivottu resistenssi. Amylaasi- 8 79139 aktiivisuus määritetään lisäämällä maljoihin liukoista tärkkelystä. Kasvatuksen jälkeen levyjä käsitellään jodi-liuoksella tai jodikaasulla. Ainoastaan ne pesäkkeet, joilla on haluttua amylaasiaktiivisuutta, tuottavat kirk-5 kaita alueita, jossa tärkkelys on hajotettu eikä siitä syystä värjäydy jodilla.

Jos rekombinanttiplasmideja sisältävät solut tuottavat a-amylaasia solunsisäisesti, solut on hajotettava ennen kuin entsyymin läsnäolo voidaan havaita. E. coli-10 solut voidaan hajottaa bakteriofaagi T4:llä tai D-syklose-riinillä.

On todettu, että kun B. subtilis-kantoja käytetään kimeeristen plasmidien isäntinä, solujen tuottama a-amy-laasi-entsyymin erittyy soluista elatusaineeseen. Tämä 15 havainto on tärkeä entsyymin kaupallista tuottoa ajatellen, koska vältytään kalliilta solujen hajottamisvaiheel-ta. B. subtilis on myös erityisen toivottu isäntäorganis-mi, koska se kuuluu teollisiin käymisiin sovellettaviin lajeihin.

20 Isäntäsolujen tuottamat kimeeriset plasmidit eris tetään helposti tunnetuin menetelmin. Yksi tällainen menetelmä on Clewellin ja Helinskin kirkkaan solu-uutten standardimenetelmä, Biochemistry, 9, 4428-4440 (1970). Plasmidit voidaan puhdistaa CsCl-tiheysgradienttiultrasentri-25 fugoinnin avulla.

a-amylaasi-geenin sisältäviä kimeerisiä plasmideja saatetaan käyttää näiden geenien donoreina. Plasmidit pilkotaan sopivan restriktioendonukleaasin avulla, jotta saadaan α-amylaasi-geenin sisältävä lineaarinen DNA. Lineaa-30 rinen DNA saatetaan puhdistaa sakkaroositiheysgradientti-ultrasentrifugoinnin avulla. Tämä geneettinen materiaali yhdistetään toisen vektorin kanssa, jotta saadaan erilainen kimeerinen plasmidi.

Kimeerisen plasmidin sisältämien isäntäsolujen 35 tuottama a-amylaasi säilyttää lämmönkestävät ominaisuuten- li 9 79139 sa. Tämä pitää paikkansa, vaikka isäntämikro-organismi itse on mesofiilinen eikä termofiilinen. Kloonatusta mikro-organismista peräisin olevan amylaasin tärkkelyksestä aikaansaamat tuotteet näyttävät olevan identtisiä donori-5 mikro-organismin amylaasin tuotteiden kanssa.

Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää transformoimaan samaan isäntämikro-organismiin kaksi tai useampia erilaisia kimeerisiä plasmideja, jotka sisältävät lämmönkestävää α-amylaasia koodaavia geenejä. Esim. E. 10 coli RR1 modifioitiin lämmönkestävän α-amylaasi-geenin ja vektoreiden pBR325 sekä pWL625 yhdistämisen avulla saatujen kimeeristen plasmidien insertiolla. Isäntäsolut omaksuvat, replikoivat ja ekspressoivat molemmat plasmidit.

Seuraavat esimerkit valaisevat kyseessä olevan kek-15 sinnön tiettyjä patentin suoritusmuotoja. Jollei muuta ole ilmoitettu, kaikki suhteet ja prosenttimäärät perustuvat painoon.

Kaikki kannat, joilla on ATCC-numerot, ovat saatavissa American Type Culture Collectionista, Rockville, 20 Maryland.

Esimerkki 1 α-amylaasi-geenejä sekä antibioottiresistenssi-markkerin sisältävien plasmidien valmistus

Kokonais-DNA, joka sisälsi geenit α-amylaasia var-25 ten, eristettiin Bernsin ja Thomasin yleisellä menetelmällä, J. Molec. Biol., 11, 476-490 (1965), B. stearothermo-philus-kannan ATCC nro 31 783 soluista. Kyseessä olevassa menetelmässä solut suspendoitiin seokseen, jossa oli 50 mM tris(hydroksimetyyli)aminometaanin hydrokloridia (merki-30 tään jäljempänä Tris-HCl) pH 8:ssa, 0,6 mM etyleenidia-miinitetraetikkahappoa (merkitään jäljempänä EDTA) sekä 25 % sakkaroosia normaalin keittosuolaliuossitraatin tilalla. Soluja käsiteltiin myös lysotsyymillä (2 mg/ml) tunnin ajan 0°C:ssa ennen solujen liukenemista. Plasmidi 35 pBR322 DNA, restriktioentsyymi Hind III sekä T4 DNA-ligaa- 10 791 39 si saatiin Bethesda Research Laboratories:sta, Bethesda, Maryland.

Seosta, jossa oli 7,5 pg B. stearothermophiluksesta saatua kokonais-DNA: ta, seitsemän yksikköä (U) restriktio-5 entsyymi Hind III:a sekä 10 pg härän seerumin albumiinia 100 pl:ssa liuosta, joka sisälsi 50 mM NaClra, 6 mM Tris-HCl:a pH 7,5:ssä sekä 5 mM MgCl2:a, inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuutin ajan. 2,2 pg plasmidi pBR322 DNA:ta sekä 7 U Hind III:a digestoitiin 20 pl:ssa samanlaista liuosta tun-10 nin ajan 37°C:ssa. Agaroosigeelillä suoritettu DNA-analyy-si ilmaisi digestion olevan täydellinen.

6,75 pg digestoitua B. stearothermophilus DNA:ta sekä 1,8 pg digestoitua pBR322 DNA:a sekoitettiin sitten 0,3 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 66 mM Tris-HCl:a (pH 15 7,6), 6,6 mM MgCl2:a, 10 mM ditiotreitolia sekä 0,067 mM

adenosiinitrifosfaattia (merkitty jäljempänä ATP) ja yhdistettiin 0,28 yksikön avulla T4-DNA-ligaasia. Ligaation jälkeen suoritettu DNA:n analyysi agaroosigeelillä osoitti ligaation olevan täydellinen ilman, että jäljelle jäi ha-20 väittävää määrää lineaarista pBR322 DNA:a.

Esimerkki 2 a-amylaasi-geenejä sekä antibioottiresistenssimark-kerin sisältävien plasmidien transformaatio E. coliin.

E. coli RR1:n viljelmää, joka on saatavana kantana 25 PRC 399 Plasmid Reference Centeristä, Stanford University Medical Center, Stanford, California, kasvatettiin seuraa-valla elatusaineella: g/litra

Tryptonia 10,0 30 Hiivauutetta 5,0

Natriumkloridia 5,0

Glukoosia 1,0

Viljelmää kasvatettiin putkessa yön yli 37°C:ssa. Sitten se laimennettiin yhdeksällä osalla samaa elatusai-35 netta ja inkuboitiin 37°C:ssa vielä 135 minuutin ajan voi- 11 79139 makkaasti ravistellen. Solut koottiin sentrifugoiden ja pestiin kylmällä O,IM NaCl-liuoksella. Kootut E. coli-so-lut valmistettiin transformaatiota varten Cohenin et ai. kalsiumkloridimenetelmällä, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 5 69, 2110-2114 (1972).

Esimerkissä 1 valmistetusta, ligatoidusta DNA:sta puolet transformoitiin E. coli RR1:n soluihin. Soluja kasvatettiin maljoilla, jotka sisälsivät samaa elatusainetta, jolla E. colin solut olivat kasvaneet, paitsi että elatus-10 aine sisälsi ampisilliiniä konsentraationa 50 pg/ml. Tällä tavoin saatiin vain E. coli-soluja, jotka sisälsivät plas-midin pBR322 (ampisilliiniresistenssigeenein).

Yhdistelmä-DNA:n sisältävien solujen lukumäärän määrittämiskeinona tutkittiin ampisilliinille resistentit 15 solut tetrasykliiniresistenssin suhteen. Koska DNA:n osasen insertio pBR322:n Hind III:n pilkkomiskohtaan tavallisesti inaktivoi plasmidin tetrasykliiniresistenssigee-nin, tetrasykliiniherkkyyden frekvenssi antaa solupopulaatioon sisältyvien solujen lukumäärän, joissa on yhdistel-20 mä-DNA. Transformaatio tuotti 3,6 x 104 ampisilliinille resistenttiä solua millilitraa kohti sekä 3,0 x 104 tetra-sykliinille resistenttiä solua millilitraa kohti. Sen tähden soluista noin 16 % oli tetrasykliinille herkkiä osoittaen, että niissä oli yhdistelmä-DNA:n sisältäviä plasmi-25 deja.

Esimerkki 3 a-amylaasia tuottavien E. coli-pesäkkeiden eristäminen

Valmistettiin elatusaine, jolla oli sama koostumus 30 kuin E. colin kasvatukseen käytetyllä elatusaineella, paitsi että siihen lisättiin agaria 15 g/1 sekä ampisilliiniä (50 pg/ml). Elatusaine valettiin 130 petrimaljalle ja siirrostettiin laimennetulla, transformoidulla E. co-lilla, joka oli valmistettu esimerkin 2 mukaisesti. Nämä 35 maljat tuottivat keskimäärin 113 pesäkettä maljaa kohti.

i2 791 39

Pesäkkeiden annettiin kasvaa, kunnes ne olivat läpimitaltaan noin 1-2 mm, ennen kuin niiden replikointisiirrostus suoritettiin tärkkelyselatusaineelle, jolla oli seuraava koostumus: 5 g/litra

Na2 HP04 6 KH2 P04 3

NaCl 0,5 nh4 Cl 1 10 Hiivauute 1

Peptoni 10

Agar 15

Lintnerin tärkkelys 10

Kolmen tunnin pituisen kasvatuksen jälkeen bakte-15 riofaagi T4 , joka on saatavissa ATCC nro 11303-B4:na, lisätään maljoille tärkkelystä sisältävässä päällysteessä. Käytettiin noin 1 x 107 T4 : ää maljaa kohti kasvavan E. colin, lyysaamiseksi, jolloin vapautettiin kaikki solun-sisäiset entsyymit. Yli yön suoritetun kasvatuksen ja lyy-20 sauksen jälkeen maljoille kaadettiin 2,5 % Lugolin jodi-liuosta amylaasiaktiivisuuden tuottamien kirkkaiden vyöhykkeiden havaitsemiseksi.

Arviolta noin 15 OOOrsta läsnäolevasta pesäkkeestä 18 pesäkettä tuotti kirkkaita vyöhykkeitä ilmaisten amy-25 laasin läsnäolon. Amylaasiaktiivisuutta sisältävät pesäkkeet replikointisiirrostettiin ja niiden osoitettiin jälleen sisältävän amylaasiaktiivisuutta. Kuitenkin amylaasi-aktiivisuus osoitettiin ainoastaan solun lyysausta varten suoritetun T4-lisäyksen jälkeen, mikä ilmaisi amylaasia 30 tuotetun solunsisäisesti. Lisäkokeilu osoitti, että D-syk-loseriini oli solujen lyysissä yhtä tehokas kuin T4, kun lääkettä lisättiin päällyskerroksena olevaan elatusainee-seen konsentraationa 600 pg/ml.

E. coli RRl:n kanta, joka sisältää plasmidivektorin 35 pBR322:n, jossa on amylaasigeeni, on saatavissa ATCC nro 31 789:nä.

Il 13 791 39

Esimerkki 4 α-amylaasigeenejä sekä antibioottiresistenssimark-kerin sisältävien plasmidien transformaatio toiseen E. coli-kantaan 5 Kasvatettiin E. colin C600, ATCC nro 23 724 viljel mää ja solut koottiin ja valmistettiin transformaatiota varten esimerkin 2 menetelmän mukaisesti.

Esimerkissä 3 saatua viittä erilaista amylaasikloo-nia viljeltiin ja rekombinanttiplasmideja uutettiin Cle-10 Weilin ja Helinskin, Biochemistry, 9, 4428-4440 (1970), kirkkaan solu-uutteen standardimenetelmällä. Osittain puhdistettu plasmidi-DNA suspendoitiin seokseen, jossa oli 10 mM Tris-HCl:a ja 1,0 mM EDTA:a pH 7,5:ssä, ennen transformaatiota CaCl2:lla käsiteltyihin E. coli -soluihin. 15 Tämä DNA analysoitiin ja sen osoitettiin olevan steriili, niin että mitkään amylaasia tuottavat pesäkkeet eivät voineet johtua niiden solujen ekspressiosta, joihin oli siirretty DNA:ta. Transformoituja soluja kasvatettiin ampisil-liiniä sisältävällä elatusaineella, jolla ainoastaan plas-20 mideja sisältävät solut saattoivat kasvaa. Kun pesäkkeet tutkittiin amylaasiaktiivisuuden suhteen, vallitsi 100-%:inen korrelaatio plasmidien läsnäolon ja amylaasiaktiivisuuden välillä. Täten plasmidi-DNA:n on selvästi osoitettu transformoivan molempia E. coli-kantoja amylaasin 25 tuottajien saamiseksi, osoittaen, ettei ilmiö ole kannasta riippuvainen, mutta että se edellyttää rekombinanttiplas-midia.

E. colin C600 kanta, joka sisältää plasmidivektorin pBR322, jossa on amylaasigeeni, on saatavissa ATCC nro 30 31 788:na.

Esimerkki 5 a-amylaasin lämmönkestävyys

Esimerkin 3 mukaisesti saatua, neljää amylaasikloo-nia sekä yhtä E. coli RR1:n kontrolliviljelmää kasvatet-35 ti in 15 ml: n viljelmissä käyttäen esimerkin 2 mukaista elatusainetta. Solut lyysattiin lisäämällä D-sykloserii- i4 791 39 niä, ennen kuin solujännökset poistettiin sentrifugoimal-la. Supernatanttinesteisiin lisättiin natriumasetaattia ja kalsiumkloridia, jotta saatiin 50 mM ja 2,5 mM vastaavat konsentraatiot ja pH säädettiin 6,0:ksi. Entsyymi-5 liuokset pantiin kierrekorkeilla varustettuihin koeputkiin, jotka sidottiin Teflon-nauhalla. Liuoksista määritettiin amylaasiaktiivisuus ennen 90°C:n ja 45 minuutin kuumennusta ja sen jälkeen. Amylaasiaktiivisuus määritettiin tärkkelyksen hydrolyysin nopeutena, mikä heijastui 10 jodivärjäyskapasiteetin vähenemisnopeudessa, spektrofoto-metrisesti mitattuna B.W. Smithin ja J.H. Rowen, J. Biol. Chem., 179, 53 (1949) menetelmän mukaisesti. E. coli-kont-rolli ei ilmaissut mitään amylaasiaktiivisuutta. Lämmön-kestävyyden standardeiksi E. colin kontrollisolulysaattiin 15 lisättiin puhdistettuja amylaaseja, jotka olivat peräisin B. stearothermophilus, ATCC nro 31 783:sta, B. subtilik-sesta, joka on saatavissa Sigma Chemical Co:lta, St. Louis, Missouri, Sigma A6380:na [vaikka Sigma Chemical Companyn luettelo merkitsee tämän entsyymin B. subtilik-20 sesta saaduksi a-amylaasiksi, H. Chung ja F. Freiberg, Biochem. J., 185, 387-395 (1980) ovat osoittaneet sen olevan peräisin Bacillus amyloliquefaciensilta] sekä Terma-mylia, lämmönkestävää a-amylaasia, joka on saatavissa Novo Laboratoriesilta, Inc., Wilton, Conn. Analyysien tulokset 25 on esitetty taulukossa I.

Il 15 791 39

Taulukko I

Lämmönkestävyyttä koskevat tiedot Soluliuotteen lähde Alkuaktii- Aktiivisuus % jäljelle visuus 45 min kul. jäänyt ak- 5 Yks./ml 90°C, tiivisuus

Yks./ml E. coli RR1 (kontr.) 0 0

Kontrolli + B. stea-rothermophilus 10 a-amylaasi (ATCC

31 783:sta) 0,21 0,15 71,4

Kontrolli + Termamyl 0,39 0,34 87,2

Kontrolli + B. subtilis α-amylaasi (Sigma A6380) 15 Kontrolli + Klooni 1 0,45 0,38 84,4

Kontrolli + Klooni 2 0,22 0,18 81,8

Kontrolli + Klooni 3 0,36 0,29 81,0

Kontrolli + Klooni 4 0,42 0,35 83,3 20 Kloonien tuottaman amylaasin on havaittu olevan vä hintään yhtä lämmönkestävä kuin donorin B. stearothermo-philuksen tuottama entsyymi. Se on lämmönkestävyyden suhteen verrattavissa kaupalliseen, lämmönkestävään a-amylaa-siin, Termamyl, ja se on lämmönkestävyyden suhteen selväs-25 ti parempi kuin kaupallisesta B. subtiliksesta saatu a-amylaasi.

Kullakin amylaasilla tärkkelystä pilkkomalla saadut hydrolysaatit analysoitiin ohutlevykromatografian avulla tuotettujen pienimolekyylipainoisten sokereiden identi-30 fioimiseksi. E. colin klooneista saaduilla amylaaseilla muodostuneiden pienimolekyylipainoisten sokereiden suhteelliset määrät olivat samankaltaiset kuin sokereiden määrät, jotka olivat muodostuneet kontrolleina käytettyjen, tunnettujen a-amylaasien avulla.

35 Nämä tulokset osoittavat, että lämmönkestävää ent syymiä tuottava geeni, joka on saatu äärimmäisen termofii- ie 79139 lisestä bakteerista, on saatu tarkasti ekspressoituraaan mesofiilisessa isäntäbakteerissa lämmönkestävää entsyymi-tuotetta muodostaen. Täten on todettu, että geeni, joka on peräisin erittäin termofiilisestä bakteerista, voidaan 5 ekspressoida mesofiilisessa bakteerissa yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttämällä. Edelleen, aktiivin, lämmönkestävän entsyymin synteesi tapahtuu normaaleissa, mesofiilisissa lämpötiloissa (suunnilleen 20-40°C:ssa).

Esimerkki 6 10 α-amylaasi-geenejä sisältävien, luonnossa esiinty vien plasmidien eristäminen

Kokonais-DNA eristettiin B. stearothermophilus, ATCC nro 31 783:n soluista esimerkissä 1 annetun menetelmän mukaisesti. Plasmidi-DNA erotettiin kokonais-DNA:sta 15 CsCl-etidiumbromidi-ultrasentrifugoinnin avulla käyttämällä R. Radloffin, W. Bauerin ja J. Vinogradin menetelmää, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 57, 1514-1521 (1967). Tämän plamidi-DNA:n osoitettiin sisältävän a-amylaasia ja käytettiin seuraavaa menetelmää: 20 Plasmidi-DNA pilkottiin käyttämällä restriktioent- syymiä Hind III, kuten esimerkissä 1. Kloonit muodostettiin siirtämällä tämä DNA E. coliin, kuten esimerkeissä 1-3 on esitetty. Tetrasykliinille resistentin fenotyypin analyysi ilmaisi, että 3,3 % soluista oli tetrasykliinille 25 herkkiä, minkä vuoksi ne sisälsivät kloonatun DNA:n. Solujen tutkiminen a-amylaasi-aktiivisuuden suhteen ilmaisi, että 0,42 %:lla tai noin yhdellä joka kahdeksannesta solusta, joka sisälsi kloonatun DNA:n, oli amylaasigeeni. B. stearothermophilus-plasmidien pilkkominen Hind III:11a 30 tuotti DNA:n lineaarisia osasia, jotka agaroosigeelillä suoritetun elektroforeesin avulla erosivat kahdeksak si, helposti havaittavaksi vyöhykkeeksi. Amylaasiosasen (1/8) kloonauksen frekvenssi on suunnilleen odotetun mukainen, jos yhdellä 35 kahdeksasta vallitsevasta vyöhykkeestä oli amylaasigeeni. Edelleen näiden plasmidivyöhykkeiden analyysi osoitti, 17 791 39 että yksi näistä vyöhykkeistä on noin 3,6 Md, samaa kokoa kuin DNA:n kloonattu osanen, joka saatiin esimerkin 1 mukaisten plasmidien analyysistä.

Tämä koe osoittaa selvästi, että ainakin yksi a-5 amylaasigeeni sijaitsee luonnossa esiintyvässä plasmidissa käyetyllä B. stearothermophilus-kannalla.

Esimerkki 7

Erilaisia kimeerisiä plasmideja sisältävien E. Colin kantojen valmistus ja eristäminen 10 A. Esimerkissä 3 eristetyn, amylaasia tuottavan E.

colin, ATCC nro 31 789, viljelmää kasvatettiin yön yli esimerkissä 2 käytetyssä elatusaineessa. Plasmidi-DNA:ta lisättiin D.B. Clewellin menetelmän mukaisesti, J. Bacteriology, 110, 667-676 (1972), käyttämällä 170 pg kloram-15 fenikolia millilitraa kohti. Lisäämiseen käytettiin seu-raavaa elatusainetta.

g/litra

Na2 HP04 6,0 KH2 P04 3,0 20 NaCl 0,5 NH4 Cl 1,0

Kaseiinin aminohappoja 5,0

Glukoosi 2,0

CaCl2 · 2H2 0 0,015 25 MgS04 · 7H2 0 0,246

Vitamiini Bx 0,001

Plasmidi-DNA eristettiin sitten kirkkaan solu-uut teen standardimenetelmällä, jonka Clewell ja Helinski, Biochemistry 9, 4428-4440 (1970), ovat esittäneet. Eris-30 tetyt plasmidit puhdistettiin esimerkin 6 mukaisella CsCl, etidiumbromidimenetelmällä ja uuttamalla sitten isopropa-nolilla sekä perusteellisen dialyysin avulla 10 mM Tris + 1 mM EDTA:aan pH 7,5:ssä.

E. colin RR1, PRC 399, viljelmää, joka sisälsi 3,9 35 Md-plasmidia pBR325, kasvatettiin ja plasmidi-DNA:ta lisättiin, eristettiin ja puhdistettiin edellisissä kappa- ie 79139

Kahdesta lähteestä saatua plasmidi-DNA:ta pilkottiin restriktioentsyymi Hind 111:11a. Pilkottujen plasmi-dien liuokset sekoitettiin ja plasmidit ligatoitiin 0°C:ssa 18 tunnin kuluessa esimerkin 1 mukaisella yleisel-5 lä menetelmällä.

Sidottu DNA transformoitiin E. coli RRlteen esimerkissä 2 kuvatulla menetelmällä. Solut laimennettiin ja levitettiin agarmaljoille, jotka sisälsivät kloramfenikolia 25 pg/ml:n konsentraationa. Tällä tavalla saatiin ainoas-10 taan E. colin soluja, jotka sisälsivät plasmidin pBR325 (kloramfenikolille resistentein geenein). Solujen muodostamat pesäkkeet, jotka tulivat näkyviin, tutkittiin amy-laasiaktiivisuuden suhteen esimerkissä 3 kuvatun menetelmän avulla käyttämällä D-sykloseriiniä solujen liuottami-15 seen.

Kolmesta amylaasiaktiivisuutta osoitettavasta ja kloramfenikoliresistentistä pesäkkeestä saatu yhdistelmä-plasmidi-DNA, uutettiin kirkkaan solu-uutteen menetelmällä esimerkin 4 mukaisesti. Yhdistelmäplasmidien erottaminen 20 agaroosigeeleillä ilmaisi niiden olevan sopivan kokoisia plasmidi pBR325:n plus amylaasigeenin sisältävän 3,6 Md-fragmentin yhdistämiselle. Plasmidin digestio Hind III-entsyymillä tuottaa 3,6 Md-fragmentin sekä pBR325:n lineaarisen muodon. Tämä esimerkki osoittaa, että amylaasi-25 geeni voidaan uudelleen kloonata eri vektoriin, pBR325, sen amylaasia tuottavan aktiivisuuden häviämättä. Syntyvä E. coli-kanta on saatavissa ATCC nro 31 792:na.

B. Osassa A tuotettua kloramfenikolille ja ampisil-liinille resistenttiä kimeeristä plasmidia käytettiin a-30 amylaasi-geeniä sisältävän DNA-fragmentin donorina. Tämä fragmentti yhdistettiin 10 Md-vektoriplasmidin pWL625:n kanssa osan A yleisen menetelmän avulla. W. Goebel, et ai., Molec. Gen. Genet., 157, 119-129 (1977), kuvaavat plasmidi pWL625:a. Se voidaan eristää E. coli, ATCC nro 35 31 787-kannan viljelmästä tämän esimerkin osan A mukaisel la eristysmenetelmällä. Tämä vektori antaa resitenssin

II

i9 791 39 antibiootteja, ampisilliiniä ja kanamysiiniä kohtaan.

DNA:n insertio pWL625:een Hind III:n kohdassa hävittää kanamysiiniresistenssin.

E. coli RR1:n soluja, jotka oli transformoitu re-5 kombinantti-DNA:11a, kasvatettiin ampisilliiniä sisältävillä agarmaljoilla. Analyysiä varten valittiin pesäkkeet, jotka olivat resistenttejä ampisilliinille, mutta eivät olleet resistenttejä kloramfenikolille pBR325:n vuoksi ja osoittivat amylaasiaktiivisuutta. Pesäkkeistä eristettiin 10 plasmidi-DNA. Agaroosigeeleillä, ennen ja jälkeen Hind ΙΙΙ-entsyymillä suoritetun hajottamisen, tehty analyysi osoitti, että amylaasigeenin sisältävä DNA:n fragmentti kloonattiin pWL625-plasmidissa uuden plasmidin tuottamiseksi. E. coli-kanta, joka sisältää tämän kimeerisen plas-15 midin, on saatavissa ATCC nro 31 791:nä.

Esimerkki 8

Kahden erilaisen kimeerisen plasmidin transformaatio yhteen E. coli-kantaan

Amylaasia tuottavaa E. coli-kantaa, joka oli val-20 mistettu esimerkissä 7B, kasvatettiin ja valmistettiin transformaatiota varten esimerkin 2 mukaisella menetelmällä. Esimerkissä 7A valmistettu, puhdistettu plasmidi transformoitiin näihin soluihin. Kun syntyviä soluja kasvatettiin kloramfenikolia sisältävillä agarmaljoi11a, kai-25 kiila pesäkkeillä oli amylaasiaktiivisuutta. Yhdestä pesäkkeestä eristettiin plasmidi-DNA, jota analysoitiin agaroosigeeleillä. Esimerkeissä 7A ja 7B kuvattujen molempien plasmidien havaittiin olevan läsnä. Tämä koe havainnollisti, että E. coli voi kasvattaa ja pitää yllä kahta eri-30 laista kimeeristä, α-amylaasigeenejä sisältävää plasmidia. Näiden plasmidien yhdistelmän pitkäaikaista pysyyttä ei ole tutkittu. Nämä kaksi kimeeristä plasmidia sisältävä E. coli-kanta on saatavissa ATCC nro 31 790:nä.

Esimerkki 9 35 Plasmideja sisältävien a-amylaasi-geenien ja anti- bioottiresistenssimarkkerin transformaatio erääseen B. subtili s-kantaan 20 79139 bioottiresistenssimarkkerin transformaatio erääseen B. subtilis-kantaan A. Donori-DNA-valmiste: Esimerkissä 7B tuotettua kimeeristä plasmidia käytettiin a-amylaasi-geenin sisäl- 5 tävän DNA-fragmentin donorina. Se uutettiin Clewellin ja Heisinkin kirkkaan solu-uutteen menetelmällä. Biochemistry 9, 4428-40 (1970). Tämä plasmidi-DNA pilkottiin restrik-tioentsyymi Hind 111:11a. Uute sekoitettiin pienen määrän kanssa etidiumbromidia ja erotettiin käyttämällä El-Gewe-10 lyn ja Hellingin sakkaroosigradienttimenetelmää, Anal. Biochem. 102, 423-428 (1980). a-amylaasi-geenin sisältävä 3,6 Md-fragmentti uutettiin kaksi kertaa n-butyyli-alko-holilla, saostettiin yhtä suurella tilavuudella isopropyy-lialkoholia ja suspendoitiin 10 mM Tris plus 1 mM 15 EDTAraan pH 7,5:ssä ja pidettiin -20°C:ssa käyttöön saakka.

B. Vektori-valmiste: B. subtilis-kanta, joka on saatavissa Bacillus Genetic Stock Centeristä, Dept, of Microbiology, Ohio State University, Columbus, Ohio, kan- 20 tana nro 1E17, joka sisältää 2,0 Md-plasmidin pC194, jossa on kloramfenikoliresistenssin aikaansaava geeni, levitettiin tryptiselle soija-agarille, joka on saatavissa Difco Laboratoriesiltä, Detroit, Michigan (tässä yhteydessä myöhemmin lyhennettynä Difco) sekä kloramfenikolia 50 25 pg/ml sisältävälle maljalle. Solut siirrostettiin sitten 150 ml:aan Penassay-lihalientä (Difco), joka oli yhden litran vetoisessa pullossa, ja soluja kasvatettiin yön yli 37°C:ssa samalla ravistellen. Solut koottiin ja suspendoitiin 10 ml:aan protoplasteja muodostavaa puskuria (25 % 30 sakkaroosia, 0,1 M NaCl-0,05 M Tris*HCl:a pH 7,5:ssä ja 0,05 M EDTA:ta pH 8,13:ssa). Viisi mg munanvalkuaislysot-syymiä (Sigma Chemical Company) lisättiin 30 minuutin ajaksi 37°C:ssa. Seuraavaksi sekoitettiin varovasti 13 ml 2 % natriumdodekyylisulfaattia, joka oli 0,7 M NaClrssa, 35 tämän jälkeen lisättiin 2,4 ml 5 M NaCl:a. Seosta jäähdy-

II

2i 79139 tettiin jäävedessä, ja sitä sentrifugoitiin nopeudella 12 100 x g 20 minuutin ajan.

DNA seostettiin yhtä suurella tilavuudella isopro-pyylialkoholia. Kiinteää ainetta pidettiin jäävedessä 60 5 tunnin ajan, ennen kuin se koottiin sentrifugoiden ja se suspendoitiin liuokseen, joka sisälsi 0,01 M Tris hydro-kloridia ja 0,001 M EDTA:a pH 7,5:ssä. Plasmidi-DNA erotettiin CsCl-etidiumbromidiultrasentrifugoinnin avulla käyttämällä Radloffin et ai. menetelmää, Proc. Natl. Acad. 10 Sei., U.S.A., 57, 1514-1521 (1967). 2 Md-plasmidia käsiteltiin uuttaen isopropyylialkoholilla sekä perusteellisella, 10 mM Tris plus 1 mM EDTA:hän pH 7,5:ssä suoritetulla dialyysillä.

C. Kimeerinen plasmidi-valmiste: 2 Md-vektori, joka 15 saatiin osasta B, pilkottiin Hind III restriktioentsyymil- lä ja sekoitettiin osasta A saadun 3,6 Md DNA-fragmentin kanssa. Vektorin ja donori-DNA:iden konsentraatiot olivat vastaavasti 6 pg/ml. Ligaatio suoritettiin esimerkin 1 yleisellä menetelmällä. Kunkin lineaarisen 3,6 Md-fragmen-20 tin puuttuminen agaroosigeelielektroforeesissa ligaation jälkeen osoitti ligaation olevan täydellinen.

D. Kimeerisen plasmidin transformaatio B. subtilikseen: B. subtiliksen, ATCC nro 31 785, joka ei sisällä amylaasigeeniä, viljelmää kasvatettiin yön 25 yli maljalla, joka sisälsi tryptoosi-veriagariperusseosta Tryptose Blood Agar Base, (Difco) sekä 1 % liukoista tärkkelystä. Maljalle lisättiin 2 ml seuraavaa elatusainetta: prosenttia (NH4)2S04 0,2 30 K2 HP04 1,4 KH2P04 0,6

Natriumsitraatti·2H20 0,1

MgS04‘7H20 0, 12

Glukoosi 0,5 35 Kasaminohappoja (Casamino 22 791 39

Noin 0,1 ml näin saatua solususpensiota lisättiin 10 ml:aan samaa elatusainetta, joka oli 250 ml:n pullossa, ja sitä inkuboitiin 37°C:ssa voimakkaasti ravistellen neljän tunnin ajan. Sitten lisättiin 1 ml viljelmää 9 ml:aan 5 etukäteen lämmitettyä transformaatioalustaa 37°C:ssa, ja inkubointia samalla ravistellen jatkettiin 90 minuutin ajan. Transformaatioalusta oli sama kuin kasvatuselatus-aine, paitsi että se sisälsi 0,01 % kasaminohappoja sekä 0,0005 % L-tryptofaania. 0,25 ml:aan soluja, jotka sisäl-10 sivät noin 1 x 10® solua/ml, lisättiin 5 μΐ osasta C saatua kimeerisen plasmidin liuosta, joka sisälsi 0,12 pg plasmidia. Seosta ravistettiin varovaisesti 37°C:ssa 30 minuutin ajan. Seos laimennettiin yhtä suurella tilavuudella Penassay-lihalientä (Difco) ja ravistelua jatkettiin 15 37°C:ssa vielä 90 minuutin ajan. Soluja, 0,1 ml:n erät, levitettiin maljoille, jotka sisälsivät tryptoosiveri-agariperusseosta (Tryptose Blood Agar Base , Difco), 1 % liukoista tärkkelystä sekä kloramfenikolia 20 pg/ml. Samalle elatusalustalle sijoitettiin kontrolleina B. subti-20 liksen soluja, joihin ei ollut lisätty plasmidia, sekä B. subtiliksen soluja, joissa oli vektoriplasmidi pC194.

Mitään pesäkkeitä ei nähty maljoilla, joilla solut eivät sisältäneet lisättyä plasmidia. Kolme pesäkettä nähtiin maljoilla, joissa solut sisälsivät plasmidi pC194:a, 25 mutta näillä soluilla ei ollut amylaasiaktiivisuutta.

Yksi pesäke havaittiin maljoilla, joille oli levitetty osasta C saadun kimeerisen plasimdi-DNA:n sisältäviä soluja. Jodikaasukäsittelyn jälkeen pesäkkeen ympärille muodostui kirkas vyöhyke, mikä osoitti, että nämä solut 30 tuottivat ekstrasellulaarista amylaasientsyymiä. Ollakseen stabiileja, solut vaativat kloramfenikolin läsnäoloa. Tämä viljelmä on saatavissa ATCC nro 31 786:na.

Amylaasia sisältävän pesäkkeen DNA-näyte erotettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. Havaittiin noin 5,6 23 791 39

Md:n plasmidivyöhyke. Tämä vastaa osasta C saadun kimeeri-sen plasmidin kokoa.

Puhdistettu kimeerinen plasmidi pilkottiin Hind III restriktioentsyymillä, ja sille suoritettiin agaroosi-5 geelielektroforeesi. Saatiin kaksi, noin 2,0 Md:n ja 3,6 Md:n fragmenttia. Nämä vastaavat osasta A saadun donori-DNA:n sekä osasta B saadun vektori-DNA:n kokoja.

E. Kimeerisen plasmidin tranformaatio toiseen B. subtili s-kantaan 10 Osassa D saadun, amylaasia tuottavan pesäkkeen so luista eristettiin amylaasigeenin sisältävä kimeerinen plasmidi menetelmän avulla, jota oli käytetty osassa B pC194-plasmidin eristämiseen. Eristetty kimeerinen plasmidi transformoitiin toiseen, amylaasin suhteen negatii-15 viseen B. subtilis-kantaan, kanta nro lA289:ään, joka on saatavissa Bacillus Genetic Stock Centeristä, Dept, of Microbiology, Ohio State University, Columbus, Ohio. Transformaatio suoritettiin protoplastifuusiomenetelmällä, jonka ovat esittäneet S. Chang ja S.N. Cohen, Molec. Gen. 20 Genet., 118, 111-115 (1979). Kun solut kasvatettiin maljoilla osan D mukaisesti, maljoilla, joilla ei ollut klor-amfenikolia, oli nähtävissä noin 1 x 10® pesäkettä/ml. Kloramfenikolia sisältävillä maljoilla oli nähtävissä noin 1 x 103 pesäkettä/ml. Tärkkelys-jodi-kokeen perusteella 25 kaikki nämä pesäkkeet osoittivat amylaasin läsnäolon. Tämä amylaasia sisältävä B. subtilis on saatavissa ATCC nro 31 784:nä.

Esimerkki 10

Kimeerisen plasmidin sisältävän B. subtiliksen 30 tuottaman a-amylaasin lämmönkestävyys

Esimerkin 9E mukaisen kimeerisen plasmidin sisältävää B. subtilista, ATCC nro 31 784, kasvatettiin yhdessä litrassa elatusainetta, joka oli 2,8 litran vetoisessa Fernbach-pullossa ja käytettiin seuraavaa elatusainetta: 24 791 39

Fernbach-pullossa ja käytettiin seuraavaa elatusainetta: prosenttia

Maissitärkkelys 9,0

Maissin liuotusneste 6,0 5 Hiiva-autosylaatti (Yeast Autoslate)a) 0,35 (NH4 )2HP04 1,0 KH2P04 0,1

CaCl2 · 2H2 0 0,06 10 MnCl2-4H20 0,05

Maissiöljy 1,0

Termamyl (0,05 yks./ml) a) Prymex 154 saatavissa Amber Laboratories'ilta, Juneau, Wisconsin.

15 Elatusaine autoklavoitiin 30 minuutin ajan 121°C:ssa, mikä hajottaa Termamyl-aktiivisuuden ja tämän jälkeen se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Elatusainee-seen lisättiin sitten 0,01 mg kloramfenikolia millilitraa kohti ennen solujen siirrostusta. Lihaliemi sentrifugoi-20 tiin ja lämmönkestävyyskoe suoritettiin supernatanttines-teen laimennetulle näytteelle käyttämällä esimerkin 5 mukaista yleistä menetelmää. Vertailun vuoksi mitattiin B. stearothermophiluksesta ja B. subtiliksesta saatujen amy-laasien sekä myös kaupallisen Termamylin lämmönkestävyys 25 inkubointialustassa, joka sisälsi 50 mM natriumasetaattia ja 2,5 mM CaCl2 . (Nämä olivat samat vertailuamylaasit kuin oli käytetty esimerkissä 5.) Kokeiden tulokset on esitetty taulukossa II.

30

II

25 791 39

Taulukko II

Lämmönkestävyyttä koskevat tiedot Entsyyminäyte Alkuaktii- Aktiivisuus % Jäljelle visuus 45 min kul. jäänyt aktii- 5 yks/ml 90°C, yks/ml visuus B. stearothermo- philus 1,81 1,16 64 B. subtilis 1,34 0 0

Termamyl 1,26 0,79 63

10 Entsyymi ATCC

nro 31 784:stä 1,58 1,07 68 Tässä kokeessa B. subtilis kloonin, ATCC nro 31 784, tuottaman amylaasin todetaan olevan vähintään yhtä lämmönkestävä kuin donori B. stearothermophiluksen tuot-15 tama entsyymi. Se on lämmönkestävyydeltään verrattavissa kaupalliseen, lämmönkestävään α-amylaasiin Termamyyliin, ja se on lämmönkestävyydeltään selvästi parempi kuin B. subtiliksesta saatu a-amylaasi.

Täten käy ilmi, että keksinnön mukaisesti on saatu 20 menetelmä kimeeristen plasmidien valmistamiseksi, jotka sisältävät lämmönkestävää α-amylaasi-entsyymiä koodaavan geenin, sekä menetelmä, jossa ne käytetään lämmönkestävän α-amylaasi-entsyymin valmistukseen ja nämä menetelmät tyydyttävät täysin edellä esitetyt kohteet, päämäärät ja 25 edut.

Claims (8)

26 791 39

1. Kimeerinen plasmidi, jossa on termostabiilia d-amylaasia koodaava geeni tunnettu siitä, että se 5 sisältää DNA-sekvenssin, joka sisältää Bacillus stearother- mophilus-kannasta saadun plasmidi-DNA:n ^l-amylaasigeenin ja sopivan E.coli-tai B-subtilis-vektorin DNA:ta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kimeerinen plasmi-di, tunnettu siitä, että ^-amylaasigeeniä sisältä- 10 vä DNA-sekvenssi saadaan B.stearothermophilus-kannasta ATCC 31 195, 31 196, 31 197, 31 198, 31 199 tai 31 783.

3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen termostabiilia Ä-amylaasia koodaavaa geeniä sisältävän kimeeri-sen plasmidin rakentamiseksi, jossa menetelmässä 15 a) pilkotaan luonnossa esiintyvä mikro-ogranismipe- räinen DNA, joka sisältää termostabiilia öl-amylaasia koo-daavan geenin, restriktioendonukleaasilla Hind III ö(-amylaasi-geeniä sisältävän lineaarisen DNA-sekvenssin saamiseksi; b) pilkotaan sopiva E. coli- tai B. subtilis-vektorin 20 restriktioendonukleaasilla Hind III toisen DNA-sekvenssin saamiseksi; ja c) yhdistetään vaiheessa (a) ja (b) saadut lineaariset DNA-sekvenssit T^-DNA-ligaasilla; tunnettu siitä, että luonnossa esiintyvä mikro-or- 25 ganismiperäinen DNA on Bacillus stearothermophilus-kannasta saatua plasmidi-DNA:ta.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on plasmidi, joka on E. coli-plasmidi pBR322, pBR325 tai pWL625 tai B. subtilis-plasmidi 30 pC194.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luonnossa esiintyvä mikro-or-ganismiperäinen termostabiilia öl-amylaasia koodaavaa geeniä sisältävä DNA on plasmidi-DNA:ta, joka on saatu B. 35 stearothermophilus-kannasta ATCC 31 195, 31 196, 31 197, 31 198, 31 199 tai 31 783. 27 791 39

6. Menetelmä termostabiilin Λ-amylaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, jossa a) vähintään yksi patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukai-5 nen kimeerinen plasmidi viedään isäntämikro-organismiin, joka on E. coli tai B. subtilis; b) kimeeristä plasmidia sisältävä mikro-organismi viljellään sopivalla alustalla; ja c) viljellyn mikro-organismin tuottama Ot-amylaasi 10 eristetään.

7. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen termosta-biilia o(-amylaasia koodaavaa geeniä sisältävän kimeerisen plasmidin rakentamiseksi, tunnettu siitä, että a) pilkotaan jonkin patenttivaatimuksista 3-5 mukai-15 sella menetelmällä valmistettu plasmidi restriktioendonuk- leaasilla Hind III Ä-amylaasigeeniä sisältävän lineaarisen DNA-sekvenssin saamiseksi; b) pilkotaan sopiva E. coli- tai B. subtilisvektori restriktioendonukleaasilla Hind III toisen lineaarisen DNA- 20 sekvenssin saamiseksi ja c) yhdistetään vaiheessa (a) ja (b) saadut lineaariset DNA-sekvenssit T^-DNA-ligaasilla.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on plasmidi, joka on E. coli 25 plasmidi pBR322, pBR325 tai pWL625; tai B. subtilis-plasmi-di pC19 4. 28 791 39