FI81380C - Foerfarande foer framstaellning av amylas-negativ och moejligen sporfri mutant av bacillus subtilis, som aer anvaendbar som vaerd i vaerd-vektorsystem. - Google Patents

Description

1 81380

Menetelmä amylaasinegatiivisen ja mahdollisesti itiöttömän Bacillus subtilis-mutantin valmistamiseksi, joka on käyttökelpoinen isäntänä isäntä-vektori systeemissä 5 Tämä keksintö liittyy uuteen amylaasinegatiiviseen

Bacillus subtilisin mutanttiin, joka on käyttökelpoinen isäntänä, johon voidaan tuoda amylaasia koodaavia geenejä sisältäviä vektoreita yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen.

Suurin osa bakteerin geneettisestä materiaalista on 10 jättiläismäisinä DNA-molekyyleinä, jotka esiintyvät solun kromosomina. Tietty määrä geneettistä materiaalia voi esiintyä myös pienempien, rengasmaisten DNA-molekyylien muodossa, jotka tunnetaan plasmideina. Tiettyyn perinnölliseen ominaisuuteen liittyvää DNA-molekyylin osaa kutsu-15 taan geeniksi.

Geneettiseksi käsittelyksi kutsutuilla menetelmillä on mahdollista siirtää tietyn proteiinin tuotantoa koodaa-va geeni yhdestä mikro-organismista toiseen. Uuden geneettisen materiaalin vastaanottavaa mikro-organismia kutsu-20 taan isännäksi. Lukuisat tutkijat ovat käyttäneet näitä menetelmiä mikro-organismien aikaansaamiseen, jotka ovat erinomaisia tiettyjen spesifisten proteiinien, kuten entsyymien, tuottajia.

On havaittu, että plasmidit, jotka sisältävät sar-25 jän geenejä liittyneinä toisiinsa renkaan muotoon, voidaan poistaa mikro-organismin soluista ja sijoittaa toisen mikro-organismin soluihin suhteellisen helposti. Plasmideja voidaan myös käyttää vektoreina uuden geneettisen materiaalin viemiseksi isäntäorganismiin. Tämä tehdään katkai-30 semalla ensin plasmidi entsyymillä, joka tunnetaan restriktioendonukleaasin nimellä ja joka avaa DNA-renkaan. Vieraan DNA:n fragmentti, joka sisältää halutun geenin, sijoitetaan kohtaan, josta DNA-rengas oli katkaistu. Rengas suljetaan takaisin käsittelemällä DNA-ligaasilla. 35 Yhdistelmäplasmidi, uusi rengasmainen DNA-molekyyli, si- 2 81380 sältää alkuperäisen plasmidin geenit ja siihen sijoitetun DNA-palan mukana tulleen uuden geenin. Tämä plasmidi voidaan pakata isäntämikro-organismiin. Uuden geenin sisältävä plasmidi lisääntyy sitten isäntämikro-organismissa ja 5 tulee osaksi sen geneettistä materiaalia.

Jotta isäntämikro-organismi olisi soveltuva yhdis-telmä-DNA-tekniikassa käytettäväksi, sillä tulee olla kyky ottaa vastaan uusi DNA. Lisäksi tulee tuloksena olla elinkykyinen mikro-organismi, joka ilmentää siihen sijoitetun 10 geenin koodaamia ominaisuuksia. Jotta mikro-organismi tuottaisi käyttökelpoisia määriä proteiinia, tulee sen olla myös kasvatettavissa kaupallisessa mittakaavassa.

Uutta yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttävät kokeellisen työn tekijät ovat olleet huolissaan siitä, että uutta 15 geneettistä materiaalia sisältävät mikro-organismit voisivat tuottaa ihmiselle, eläimille tai kasveille haitallisia aineita. Tämän huolen takia the National Institute of Health (NIH) julkaisi vuonna 1978 ohjeet tutkimuksia varten, joissa käytetään yhdistelmä-DNA -molekyylejä ("Guide-20 Iines for Research Involving Recomibinant DNA Molecules" ). Nämä ohjeet edellyttävät erilaisia fysikaalisten varustusten tasoja laboratorioissa, joissa tehdään geenimanipulaa-tiokokeita. Ne vahvistivat myös biologisten varustusten tasot yhdistelmä-DNA:ta sisältäviä mikro-organismeja var-25 ten.

Biologiseen suojaukseen liittyy sellaisten isäntä-solujen ja vektoreiden käyttö, joilla on rajoitettu kyky pysyä hengissä, jos ne karkaavat laboratorioista luontoon. Itiöitä muodostamattomien mikro-organismien soluilla on 30 tällainen rajoitettu kyky säilyä hengissä.

Tässä kuvataan uutta itiötöntä B. subtilis Bl-109 -mutanttia, joka on käyttökelpoinen isäntänä isäntävektori -systeemissä. Tämän isännän lisäetuna on se, että se on amylaasinegatiivinen mutantti. Tämä mutantti on erityisen 35 hyvin soveltuva isännäksi sellaisille yhdistelmäplasmi-

II

3 81380 deille, jotka sisältävät spesifisten amylaasien, kuten lämpöstabiilien alfa-amylaasien, tuotantoa koodaavia geenejä. Nämä amylaasit ovat kaupallisesti tärkeitä, sillä niitä käytetään tärkkelyshydrolysaattien, glukoosin ja 5 korkean fruktoosipitoisuuden sisältävien siirappien valmistusprosesseissa .

Tässä kuvattu mukainen mutantti ottaa helposti vastaan lämpöstabiilia alfa-amylaasia vastaavan geenin sisältäviä plasmideja. Tuloksena oleva mikro-organismi on pallo jon parempi lämpöstabiilin alfa-amylaasientsyymin tuottaja kuin isäntävektorisysteemit, jotka on valmistettu aiemmin kuvatuista B. subtilisin amylaasinegatiivisista kannoista, kuten ATCC 39 096:sta, jotka kuvataan julkaistussa EP-ha-kemuksessa n:o 092 235, joka on jätetty 26.10.1983.

15 Tässä kuvataan itiöttömän B. subtilis Bl-109:n vil jelmää, joka on soveltuva käytettäväksi isäntäkomponentti-na isäntä-vektorisysteemissä ja jolle on tunnusmerkillistä se, ettei se sisällä amylaasia koodaavaa geeniä ja että sen muuttumistiheys itiöitä muodostaviksi muodoiksi on 20 pienempi kuin noin 10"7 kasvatettuna ilmastetuissa olosuhteissa ja että se sisältää seuraavat geneettiset markke-rit: spoIlA12, amyE ja sacA321. B. subtilis -kanta, jolla on nämä ominaispiirteet, on talletettu the American Type Culture Collectioniin numerolla ATCC 39 701.

25 Lisäksi kuvataan amylaasinegatiivisen B. subtilis

Bl-20:n viljelmää, joka kanta on soveltuva käytettäväksi isäntäkomponenttina isäntä-vektorisysteemissä ja käyttökelpoinen välivaiheena isäntä-vektorisysteemien amylaasi-negatiivisten isäntäkomponenttien valmistukseen ja jolle 30 on tunnusmerkillistä se, että se sisältää seuraavat geneettiset markkerit: metB5, amyE ja sacA321. B. subtilis -kanta, jolla on nämä luonteenpiirteet on talletettu the American Type Culture Collectioniin numerolla ATCC 39 706.

Keksintö koskee menetelmää B. subtilis -kannan 35 Bl-20 (ATTC 39 706), jolla on geneettiset markkerit metB5, 4 81380 amyE ja sacA321, valmistamiseksi, jossa menetelmässä transformoidaan B. subtilis -kannan 1A289 kompetentit solut B. subtilis -kannan 1A221 DNA:11a ja eristetään solut, jotka eivät tuota alfa-amylaasientsyymiä.

5 Keksintö koskee lisäksi menetelmää B. subtilis -kannan Bl-109 (ATCC 39 701) valmistamiseksi, jolla on geneettiset markkerit spoIIA12, amyE ja sacA321, jossa menetelmässä transformoidaan B. subtilis -kannan Bl-20 kompetentit solut B. subtilis -kannan 1S30 DNA:11a ja eriste-10 tään solut, jotka kasvavat ilman lisättyä metioniinia, eivät tuota alfa-amylaasientsyymiä eivätkä muodosta itiöitä lämpöshokin (90°C, 10 min) jälkeen.

Lisäksi kuvataan menetelmää B. subtilis -kantojen Bl-109 ja Bl-20 käyttämiseksi isäntinä isäntä-vektorisys-15 teemeissä, jossa menetelmässä transformoidaan halutun geneettisen materiaalin sisältävällä plasmidilla yhden tai useamman B. subtilis -kannan kompetentit solut ja kasvatetaan näitä soluja olosuhteissa, joissa plasmidi pysyy solujen sisällä.

20 Keksinnön mukaiset B. subtilis -kannat valmistet tiin sisällyttämällä niihin muiden B. subtilis -kantojen geneettistä materiaalia. Amylaasinegatiivinen B. subtilis -kanta 1A289 (ATCC 39711), joka sisälsi markkerit arol906, metB5, sacA321 ja amyE, muutettiin kannaksi, joka ei enää 25 tarvitse aromaattisia aminohappoja, sisällyttämällä siihen osa B. subtilis -kannan 1A221 (ATCC 39086) DNA:sta.

Kantaa 1A289 ovat kuvanneet Steinmetz et ai. [Mol. Gen. Genet. 148 (1976) 281-285]. Se on saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland 30 numerolla ATCC 39711.

Kantaa 1A221 ovat kuvanneet Dubnau ja Smith [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 65 (1970) 96-103]. Se on saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland, numerolla ATCC 39 086.

35 Tuloksena oleva transformantti, josta käytetään merkintää Bl-20, sisältää markkerit metB5, amyE ja

II

5 81 380 sacA321. Se on saatavissa the American Type Culture Col-lectionista numerolla ATCC 39706. Tämä amylaasinegatiivi-nen kanta on käyttökelpoinen välituote isäntä-vektorisys-teemien amylaasinegatiivisten isäntäkomponenttien valmis-5 tukseen. Se voi myös itse toimia isäntänä olosuhteissa, joissa itiöitä muodostava isäntä on hyväksyttävissä.

Osa itiöttömän B. subtilis -kannan DNArsta siirrettiin kantaan Bl-20, jolloin saatiin uusi kanta Bl-109. DNA:n luovuttajana käytetty itiötön kanta oli 1S30, jonka 10 luovutti the Bacillus Genetic Stock Center, Dept, of Microbiology, Columbus, Ohio. Tätä kantaa, joka sisältää markkerin spoIIA12, ovat kuvanneet Ionesco ja Schaeffer [Ann. Inst. Pasteur, Paris 114 (1968) 114]. Se on saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rocville, 15 Maryland, numerolla ATCC 39 712.

Tässä kuvatun itiöitä muodostamattoman, amylaasine-gatiivisen kannan Bl-109 muuttumistiheys itiöitä muodostavaksi muodoksi on pienempi kuin noin 10'7. Sitä voidaan kasvattaa teollisissa olosuhteissa, eikä se vaadi kalliita 20 kasvua edistäviä lisäaineita. Sillä on alhainen hengissä-säilymiskyky luonnossa tai karanneena ja hyvin pieni taipumus siirtää plasmideja muihin organismeihin luonnollisen geneettisen siirron kautta. Tämä organismi soveltuu hyvin plasmidien vastaanottamiseen käytettäessä klassisia trans-25 formointimenetelmiä. Erinomaisia transformaatiotuloksia saavutettiin käyttämällä kompetenteille soluille tarkoitettuja transformointimenettelyjä. Se toimii hyvin isäntänä erilaisille plasmidivektoreille, mikä tekee siitä käyttökelpoisen isäntäkomponentin B. subtilis -isäntä-vektori-30 systeemiin. Koska se on amylaasinegatiivinen, se on erityisen hyvin soveltuva käytettäväksi isäntänä yhdistelmä-plasmideille, jotka sisältävät amylaasien tuotantoa koo-daavia geenejä.

B. subtilis -kromosomin yksityiskohtaisen geenikar-35 tan ovat julkaisseet Henner ja Hoch [Microbiological

Reviews 44 (1980) 57-82]. Seuraavassa on lyhyt kuvaus ge- 6 81380 neettisistä markkereista, jotka mainitaan tämän keksinnön yhteydessä: (1) spoIIA12: Tämä on deleetiomutaatio, joka salpaa itiöiden muodostuksen varhaisimpia vaiheita. Tämä mutaatio 5 tuhoaa Bacillusten kyvyn muodostaa itiöitä, jossa muodossa se normaalisti säilyy hengissä luonnossa joutuessaan alttiiksi lämmölle, UV-säteilylle, kemikaaleille ja kuivumiselle.

(2) arol906: Tämä on mutaatio, joka saa mutantit 10 tarvitsemaan fenyylialaniinia, tyrosiinia ja tryptofaania.

Näiden aminohappojen puuttuessa mutantin sisältävä kanta lakkaa kasvamasta.

(3) amyE: Tämä markkeri liittyy puutteellisuuteen alfa-amylaasin tuotantoa koodaavassa rakennegeenissä. Sil- 15 le on luonteenomaista hyvin pieni muuttumistiheys.

(4) lin2: Tämän geneettisen markkerin sisältävät kannat kasvavat, kun vähimmäisalustaa sisältävät maljat täydennetään sopivilla aminohapoilla ja ne sisältävät lin-komysiiniä pitoisuutena 100 pg/ml. Markkeria sisältämättö- 20 mät kannat eivät kasva tällaisilla maljoilla.

(5) metB5: Tämä mutaatio saa mutantit tarvitsemaan metioniinia. Tämän aminohapon puutteessa lakkaavat tämän mutantin sisältävät kannat kasvamasta.

(6) sacA321: Tämä on mutaatio, joka estää mikro-or-25 ganismin sakkaroosimetabolialle välttämättömän entsyymin muodostuksen. Tämä estää isäntää kasvamasta alustalla, joka sisältää sakkaroosia hiililähteenä.

Seuraava esimerkki valaisee tämän keksinnön tiettyjä suoritusmuotoja. Ellei toisin mainita, kaikki osuudet 30 ja prosenttiosuudet ovat painon mukaan laskettuja. Kaikki kannat, joille on annettu ATCC-numero, ovat saatavissa the American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland. Nämä kannat on talletettu Budapestin sopimuksen sääntöjen, jotka koskevat mikro-organismien talletusta patenttitar-35 koituksiin, mukaisesti. Kaikki Difco-nimellä merkityt rea-

II

7 81 380 genssit ovat saatavissa yhtiöstä Difco Laboratories, Detroit, Michigan.

Esimerkki B. subtilis -kannan 1A289 (ATCC 39 711) muuttaminen 5 kannaksi, joka ei enää tarvitse täydentäviä aromaattisia aminohappoja kasvaakseen, tehtiin sisällyttämällä siihen B. subtilis -kannan 1A221 (ATCC 39 086) DNA:ta seuraavasti .

B. subtilis -kannan 1A289 (ATCC 39 711) soluja kas-10 vatettiin yön yli maljoilla, jotka sisälsivät tryptoosi-veriagaralustaa (Tryptose Blood Agar Base, Difco). Näiltä maljoilta eristetyillä soluilla inokuloitiin Penassay Broth -alusta (Difco) ja kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa ravistellen kierrosnopeudella 200 rpm. Solut erotettiin 15 sentrifugoimalla ja suspendoitiin 5-kertaiseen tilavuuteen kasvualustaa, joka sisälsi 0,5 % glukoosia, 0,6 % KH2P04, 1,4 % K2HP04, 0,1 % natriumsitraattia, 0,2 % (NH4)2S04 ja 0,07 % MgS04 täydennettynä leusiinilla, isoleusiinilla ja metioniinilla (50 pg/ml) ja histidiinillä, tryptofaanilla, 20 arginiinilla, valiinilla, lysiinillä, treoniinilla, gly- siinillä ja asparagiinihapolla (25 pg/ml). Viljelmän optisen tiheyden kasvua seurattiin spektrofotometrillä aallonpituudella 620 nm. Kun viljelmät saavuttivat siirtymävaiheen logaritmisen ja stationäärisen kasvun välillä (opti-25 sen tiheyden muutos alle 5 % 15 niinissä), ne käytettiin transformointiin DNA:11a.

Transformoiva DNA saatiin B. subtilis -kannasta 1A221 (ATCC 39 086) seuraavasti.

Kantaa 1A221 kasvatettiin 100 ml:ssa Penassay Broth 30 -alustaa (Difco). Seosta kasvatettiin 37 °C:ssa, kunnes seoksen optinen tiheys aallonpituudella 660 nm mitattuna oli 0,6. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan liuosta, joka sisälsi 0,005 mol/1 ety-leenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA) ja 0,05 mol/1 NaCl:a 35 ja 2 mg lysotsyymiä. Kun solut alkoivat hajota, ne pakas- 8 81 380 tettiin upottamalla astia hiilihappojääasetonihauteeseen. Sitten jäätyneisiin soluihin lisättiin 5 ml puskuriliuosta, joka sisälsi 0,03 mol/1 tris(hydroksimetyyli)aminome-taania (pH 8,0) ja 0,005 mol/1 EDTA:a, ja seos jäädytet-5 tiin ja sulatettiin kahdesti. Lisättiin yhtä suuri tilavuus fenolia ja seosta ravisteltiin 70 min 40°C:ssa. Saostunut proteiini poistettiin sentrifugoimalla. DNA seostettiin kirkkaasta supernatantista lisäämällä 0,12 ml 3 M natriumasetaattia (pH 8,0) ja 0,64 ml isopropanolia yhtä 10 millilitraa kohden liuosta. Saostunut DNA kerättiin kietomalla se lasisauvalle ja pestiin isopropanolilla. DNA liuotettiin takaisin liuokseen, joka sisälsi 0,015 mol/1 natriumkloridia ja 0,0015 mol/1 natriumasetaattia (pH 7) ja säilytettiin 4°C:ssa, kunnes ne käytettiin formointiin. 15 Edellä kuvatulla tavalla preparoidut kompetentit B.

subtilis 1A289 -solut (1,0 ml) sekoitettiin DNA:hän, jonka pitoisuus lopullisessa seoksessa oli 10 pg/ml, ja viljelmää ravisteltiin varovasti (100 rpm) 30 min 37°C:ssa. Sitten viljelmä laimennettiin 2 ml:11a Penassay Broth -alus-20 taa (Difco) ja inkuboitiin vielä 90 min 37 °C:ssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kerran tislatulla vedellä, suspendoitiin uudelleen alkuperäiseen tilavuuteen alustaa ja levitettiin maljoille, jotka sisälsivät Spizizenin vähimmäisalusta-agaria täydennettynä metionii-25 nilla (5 pg/ml). Spizizenin vähimmäisalusta on liuos, joka sisältää (a) 0,2 % ammoniumsulfaattia; (b) 1,4 % kaksi-emäksistä kaliumfosfaattia; (c) 0,6 % yksiemäksistä kaliumfosfaattia; (d) 0,1 % natriumsitraattia; ja (e) 0,02 % magnesiumsulfaattia ja jonka pH on säädetty arvoon 30 7,4. Niistä kahdesta pesäkkeestä, jotka kasvoivat, kun lisättiin 0,5 ml solususpensiota, toinen ei tuottanut amy-laasia. Se valittiin sillä perusteella, että sillä oli kyky kasvaa lisättyjen aromaattisten aminohappojen puuttuessa, ja sille annettiin merkintä Bl-20. Se sisälsi 35 markkerit metB5, amyE ja sacA321. Tämän kannan biologises-

II

9 81380 ti puhdas viljelmä on talletettuna the American Type Culture Collectionissa numerolla ATCC 39 706.

Kanta Bl-20 (metB5, amyE, sacA321) muutettiin itiöitä tuottamattomaksi kannaksi Bl-109 transformoimalla 5 se donorikannan 1S30 (ATCC 39 712) DNArlla. Transformointi tehtiin käyttämällä kompetentteja Bl-20 soluja.

Donori-DNA saatiin B. subtilis -kannasta IS30 (ATCC 39 712) seuraavasti. Soluja kasvatettiin yön yli 37°C:ssa 100 ml:ssa glukoosia sisältävää trypsiinipilkottu soija-10 alustaa (Tryptic Soy with glukose, TSG, Difco). Sitten lisättiin 40 mg lysotsyymiä ja seosta inkuboitiin 30 min 60°C:ssa. Sferoplastit erotettiin sentrifugoimalla 10 min nopeudella 4500 rpm ja suspendoitiin 40 ml:aan liuosta, joka sisälsi 0,15 mol/1 NaClra ja 0,1 mol/1 EDTA:a (pH 15 10,2). Lisättiin 3 ml 25-%:ista natriumdodekyylisulfaat- tiliuosta ja inkuboitiin 70°C:ssa 1 h. Proteiini seostettiin kahdesti lisäämällä liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/1 NaCl:a ja 0,003 mol/1 natriumsitraattia (pH 7) ja oli kylläinen fenolin suhteen. Supernatanttiin lisättiin 5 ml 3 M 20 natriumasetaattiliuosta. Liuoksen päälle lisättiin isopro-panolikerros. Faasien rajalle muodostunut DNA kiedottiin lasisauvalle. Sauvalla oleva DNA pestiin kahdesti kylmällä isopropanolilla ja liuotettiin liuokseen, joka sisälsi 0,03 mol/1 NaCl:a ja 0,003 mol/1 natriumsitraattia (pH 7). 25 Saatua liuosta dialysoitiin suurta tilavuutta vastaan liuosta, joka sisälsi 0,015 mol/1 NaCl:a ja 0,0015 mol/1 natriumsitraattia (pH 7), vaihtaen liuos tuoreeseen kolmesti 24 h:n aikana, minkä jälkeen tuote käytettiin transformoinein.

30 B. subtilis -kannan Bl-20 soluja kasvatettiin 37 °C:ssa yön yli maljoilla, jotka sisälsivät tryptoosi-veri-agaralustaa (Tryptose Blood Agar Base, Difco). Maljoilta eristetyt solut suspendoitiin sitten pieneen määrään kasvualustaa, ja seoksella inokuloitiin 60 ml kasvu-35 alustaan 500 ml:n erlenmeyerpullossa. Seosta kasvatettiin 10 81 380 33-37 °C:ssa ravistellen. Kasvualusta sisälsi seuraavat aineosat: 0,5 % glukoosia, 0,6 % KH2P04, 1,4 % K2HP04, 0,1 % natriumsitraattia, 0,2 % (NH4)2S04, 0,01 % MgS04, 0,02 % kasaminohappoja (Difco), 0,1 % hiivauutetta (Difco) ja 5 0,02 % L-tryptofaania. Kasvua seurattiin mittaamalla op tista tiheyttä aallonpituudella 620 nm. Kun viljelmät saavuttivat siirtymävaiheen logaritmisen ja stationäärikasvun välillä (optisen tiheyden muuttuminen alle 5 % 15 min:ssa), ne käytettiin transformointiin DNA:11a. Solusus-10 pensio laimennettiin kaksinkertaisella tilavuudella trans-formointiväliainetta, jolla oli muuten sama koostumus kuin kasvualustalla, mutta se sisälsi lisäksi 2 % 0,1 M MgCl2 ja 1 % 0,05 M CaCl2. Laimennus tehtiin esilämmitettyyn trans-formointiväliaineeseen lämpötilassa 33-37 °C. Seosta inku-15 boitiin tässä lämpötilassa 90 min ravistellen kierrosno-peudella 300 rpm. 5 min ennen inkubointijakson loppua lisättiin steriiliä 20 mM etyleeniglykoli-bis(beta-amino-etyylieetteri)-N,N,N',N'-tetraetikkahappoa loppupitoisuu-deksi 1 mmol/1.

20 Transformointi tehtiin sekoittamalla 2 μΐ kannasta IS30 edellä kuvatulla tavalla eristettyä DNA:ta 0,5 ml:aan kannan Bl-20 edellä kuvattuja kompetentteja soluja. Seosta inkuboitiin 30-37 °C:ssa 90 min ravistellen nopeudella 250 rpm. Viljelmät siirrostettiin agarmaljoille steriilil-25 lä vedellä laimentamisen jälkeen. Solut, joilla oli metionii-nipositiiviset, amylaasinegatiiviset ominaisuudet, valikoitiin kasvattamalla viljelmiä agarmaljoilla, jotka sisälsivät Spizizenin vähimmäisalustaa täydennettynä trypto-30 fäänillä (5 mg/ml) ja 1 %:lla Lintner-tärkkelystä. 600 pesäkkeestä tutkittiin itiöttömyysominaisuudet shokkikä-sittelemällä ne lämmöllä (10 min, 90 °C). Yksi pesäke, Bl-109, oli itiöitä muodostamaton. Sillä oli geneettiset markkerit spoIIA12, amyE ja sacA321. Tämän kannan biologi-35 sesti puhdas viljelmä on tallennettuna the American Type

II

il 813 80

Kanta Bl-109 vaatii kasvaakseen mineraalisuoloja, jotka sisältävät ammonium-, kalium-, fosfaatti- ja nat-riumioneja. Se käyttää hyväkseen erilaisia hiililähteitä glukoosi mukaan luettuna. Kanta ei muutu takaisin itiöitä 5 muodostaviksi muodoiksi, kuten seuraava testi osoittaa. Soluja kasvatettiin agarmaljoilla, jotka sisälsivät DSM-alustaa (Difco), 37°C:ssa. Solut suspendoitiin 24 h:n kuluttua trypsiinipilkottuun soija-alustaan, joka sisälsi 0,1 % glukoosia, ja pidettiin 90°C:ssa 10 min. Sitten so-10 lut laskettiin maljoilla, jotka sisälsivät tryptoosi-veri-agaralustaa (Tryptose Blood Agar Base, Difco). Elävien solujen kokonaismäärä määritettiin näillä maljoilla olevien pesäkkeitä muodostavien yksiköiden perusteella. Vertailukohtana käytettiin pesäkkeitä muodostavien yksiköiden 15 lukumäärää millilitrassa, kun laskenta tehtiin kuumentamattomille näytteille. Kuumentamattomat näytteet sisälsivät 1,27 x 108 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä millilitrassa, kun taas kuumennetut solut sisälsivät vain 5 pesäkkeitä muodostavaa yksikköä millilitrassa. Tämä osoittaa, 20 että kannan muuttumistiheys itiöitä muodostaviksi muodoiksi on alle noin 10~7 kasvatettuna ilmastusolosuhteissa.

Sekä kannalla Bl-20 että Bl-109 on hyvä ynteensopi-vuus plasmidien kanssa klassisissa transformaatioreak-tioissa. Plasmidivektorit pysyvät isäntäsoluissaan, vaikka 25 isäntäsoluja vektoreineen kasvatetaan jopa niin korkeassa lämpötilassa kuin 45 °C.

Kaikki tässä kuvatut tutkimukset tehtiin noudattaen NIH:n ohjeissa määriteltyjä fysikaalisia ja biologisia varusteluja koskevia vaatimuksia.

Claims (2)

12 81 380 1. Menetelmä Bacillus subtilis -kannan Bl-20 (ATTC 39 706), jolla on geneettiset markkerit metB5, amyE ja 5 sacA321, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että transformoidaan B. subtilis -kannan 1A289 kompetentit solut B. subtilis -kannan 1A221 DNA:11a ja eristetään solut, jotka eivät tuota alfa-amylaasientsyymiä. 2. Menetelmä Bacillus subtilis -kannan Bl-109 (ATTC 10 39 701), jolla on geneettiset markkerit spolIA12, amyE ja sacA321, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että transformoidaan patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistetun B. subtilis -kannan Bl-20 kompetentit solut B. subtilis -kannan 1S30 DNA:11a ja eristetään solut, jotka kas-15 vavat ilman lisättyä metioniinia, eivät tuota alfa-amylaa-sientsyymiä, eivätkä muodosta itiöitä lämpötilassa 90°C 10 min kestäneen lämpöshokkikäsittelyn jälkeen. Il 13 81 380

1. Förfarande för framställning av Bacillus sub-tilis-stammen Bl-20 (ATCC 39 706) med de genetiska markö-5 rerna metB5, amyE och sacA321, kännetecknat därav, att man transformerar kompetenta celler av B. sub-tilis-stammen 1A289 med DNA frän B. subtilis-stammen 1A221 och isolerar celler som inte producerar enzymet alfa-amy-las. 10

2. Förfarande för framställning av Bacillus sub tilis-stammen Bl-109 (ATCC 39 701) med de genetiska markö-rerna spoIIA12, amyE och sacA321, kännetecknat därav, att man transformerar kompetenta celler av den en-ligt patentkravet 1 framställda B. subtilis-stammen Bl-20 15 med DNA frän B. subtilis-stammen 1S30 och isolerar celler som växer utan tillsats av metionin, inte producerar enzymet alfa-amylas och inte bildar sporer efter en värme-chockbehandling vid temperaturen 90 °C i 10 min.