JPS60180590A - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
- Publication number
- JPS60180590A JPS60180590A JP59034909A JP3490984A JPS60180590A JP S60180590 A JPS60180590 A JP S60180590A JP 59034909 A JP59034909 A JP 59034909A JP 3490984 A JP3490984 A JP 3490984A JP S60180590 A JPS60180590 A JP S60180590A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- alanine dehydrogenase
- heat
- resistant
- Prior art date
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝子を有
する新規プラスミドに関するものである。
する新規プラスミドに関するものである。
Ｌ−アラニン脱水素酵素は、臨床検査や食品分析のし一
アラニ゛ンの定量やＬ−アラニンの酵素合成等に利用さ
れる非常に重要な酵素である。このＬ−アラニン脱水酵
素を生産できる微生物としては、常温菌であるバチルス
・スフエリカス（坦匹↓ｆｌｕｓ ｓ劇匡μ」旦すュ）
のようなバチルス菌の細菌が知れている（ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（［ｉｕｒ、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｔ １００＋２９〜３９ （１
９７９） ）。しかし、これらの菌より得られるし一ア
ラニン脱水素酵素は、室温の水溶液中で１〜３週間のう
ちに活性をほとんどを失うのが通例であり、熱安定性及
び長期の安定性に欠けるものであるという大きな欠点を
有している。
アラニ゛ンの定量やＬ−アラニンの酵素合成等に利用さ
れる非常に重要な酵素である。このＬ−アラニン脱水酵
素を生産できる微生物としては、常温菌であるバチルス
・スフエリカス（坦匹↓ｆｌｕｓ ｓ劇匡μ」旦すュ）
のようなバチルス菌の細菌が知れている（ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（［ｉｕｒ、
Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｔ １００＋２９〜３９ （１
９７９） ）。しかし、これらの菌より得られるし一ア
ラニン脱水素酵素は、室温の水溶液中で１〜３週間のう
ちに活性をほとんどを失うのが通例であり、熱安定性及
び長期の安定性に欠けるものであるという大きな欠点を
有している。
それゆえ、Ｌ−アラニン脱水素酵素を用いる臨床検査の
分析法等の利点を最大限に発揮するうえで、熱に安定で
、室温で長時間活性を失わないし一アラニン脱水素酵素
の出現が熱望されていた。
分析法等の利点を最大限に発揮するうえで、熱に安定で
、室温で長時間活性を失わないし一アラニン脱水素酵素
の出現が熱望されていた。
このため、バイオケミ力・エト・バイオフィジカ・アク
タ（Ｂｉｅｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙａｉｃ
ａ Ａｃｔａ ）６１５．３４〜４７ （１９８０）に
は、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ）属に属する細菌から
熱に安定で、室温で長期間活性を失わない耐熱性のし一
アラニン脱水素酵素が得られていることが記載されてい
る。
タ（Ｂｉｅｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙａｉｃ
ａ Ａｃｔａ ）６１５．３４〜４７ （１９８０）に
は、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ）属に属する細菌から
熱に安定で、室温で長期間活性を失わない耐熱性のし一
アラニン脱水素酵素が得られていることが記載されてい
る。
しかし、この好熱性のザーマス属に属する細菌は、耐熱
性のし一アラニン脱水素酵素の生産性が低く、この酵素
を効率良く得るには、十分満足できるものではなかった
。
性のし一アラニン脱水素酵素の生産性が低く、この酵素
を効率良く得るには、十分満足できるものではなかった
。
一方、ニジエリチア（口５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）屈に
属す細菌は２本来し一アラニン脱水素酵素生産能を全く
有していない。
属す細菌は２本来し一アラニン脱水素酵素生産能を全く
有していない。
近年、遺伝子組換技術により、異種生物の蛋白質を大腸
菌で生産し得るようになっており、また。
菌で生産し得るようになっており、また。
組換ＤＮＡＪ伝子工学に有用なプラスミド及びそれによ
って形質転換された微生物は良く知られζいる。例えば
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ） １９８巻。
って形質転換された微生物は良く知られζいる。例えば
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ） １９８巻。
１０５６頁（１９７８年）には、プラスミＦ ｐＨＲ３
２２にラクトースプロモーターをつないだプラスミドを
導入した大腸菌内で動物タンパク質が生産されることが
記載されている。
２２にラクトースプロモーターをつないだプラスミドを
導入した大腸菌内で動物タンパク質が生産されることが
記載されている。
また、特開昭５６−５０９３号公報には、ザーマス属に
属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとし
てプラスミドｐＢＲ３２２が用いられている。）を導入
することにより形質転換されたニジエリチア（Ｉｉｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌を用いて耐熱性の
酵素を調製することが記載されているが、耐熱性のし一
アラニン脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミドについ
ては、全く何も記載されていないし、また、その創製に
成功したとの報告もなされていない。
属する細菌の遺伝子を有するプラスミド（ベクターとし
てプラスミドｐＢＲ３２２が用いられている。）を導入
することにより形質転換されたニジエリチア（Ｉｉｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌を用いて耐熱性の
酵素を調製することが記載されているが、耐熱性のし一
アラニン脱水素酵素の遺伝子を有するプラスミドについ
ては、全く何も記載されていないし、また、その創製に
成功したとの報告もなされていない。
そこで２本発明者らは、耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵
素の生産性を向上させるために常温微生物内で耐熱性の
し一アラニン脱水素酵素が発現できるプラスミドをめて
鋭意研究した結果、好熱性の微生物からし一アラニン脱
水素酵素の遺伝子を分離し、この遺伝子が公知のプラス
ミドＤＮＡに導入しうろこと及びこのようにして遺伝子
を導入して得たプラスミドが前記の性質を有することを
見い出し１本発明を完成した。
素の生産性を向上させるために常温微生物内で耐熱性の
し一アラニン脱水素酵素が発現できるプラスミドをめて
鋭意研究した結果、好熱性の微生物からし一アラニン脱
水素酵素の遺伝子を分離し、この遺伝子が公知のプラス
ミドＤＮＡに導入しうろこと及びこのようにして遺伝子
を導入して得たプラスミドが前記の性質を有することを
見い出し１本発明を完成した。
すなわち１本発明は、耐熱性のし一アラニン脱水素酵素
の遺伝子を有するプラスミドである。
の遺伝子を有するプラスミドである。
本発明のプラスミドを得るには例えば、ンくイオケミカ
・エト・バイオロジー・アクタ（［ｌｉｏｃｈｅｍ。
・エト・バイオロジー・アクタ（［ｌｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ） ７２．６１９〜６２９
（１９６３）に記載の方法に従い、耐熱性のし一アラニ
ン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を取得し
、取得した遺伝子とベクターとしての役割を有するＤＮ
Ａとをジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ、Ｍｏ１．旧ｏ１） ９６１’７１〜１８４ （１
９７５）に記載の方法に従い、制限酵素で消化し１次い
でリガ−ゼを用いて結合することにより調整することが
できる。
（１９６３）に記載の方法に従い、耐熱性のし一アラニ
ン脱水素酵素の遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を取得し
、取得した遺伝子とベクターとしての役割を有するＤＮ
Ａとをジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ、Ｍｏ１．旧ｏ１） ９６１’７１〜１８４ （１
９７５）に記載の方法に従い、制限酵素で消化し１次い
でリガ−ゼを用いて結合することにより調整することが
できる。
本発明に好ましく用いられる耐熱性のし一アラニン脱水
素酵素の遺伝子としては、好熱性の微生物の染色体ＤＮ
Ａ由来のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝子があげられる
。この好熱性の微生物としては、サーマス（亘肛煕し）
属に属する細菌や好熱性のバチルス属に屈する細菌があ
げられるが、特に好熱性のバチルス属に属する細菌が好
ましい。
素酵素の遺伝子としては、好熱性の微生物の染色体ＤＮ
Ａ由来のＬ−アラニン脱水素酵素の遺伝子があげられる
。この好熱性の微生物としては、サーマス（亘肛煕し）
属に属する細菌や好熱性のバチルス属に屈する細菌があ
げられるが、特に好熱性のバチルス属に属する細菌が好
ましい。
その中でもＬ−アラニン脱水素酵素の活性が高いバチル
ス・ステアロカーモスフィルス（Ｂａ（：１ｌｌｕｓヨ
１朋ｐ卦μヨ咀吐旦朋）が好ましい。ステアロカーモス
フィルスの具体例としては、ＩＰＯ１２５５０゜ＡＴＣ
Ｃ７９５３，７９５４，８００５，１０１９４，１２９
８０，ＮＣＡｌ３Ｏ３などがある。
ス・ステアロカーモスフィルス（Ｂａ（：１ｌｌｕｓヨ
１朋ｐ卦μヨ咀吐旦朋）が好ましい。ステアロカーモス
フィルスの具体例としては、ＩＰＯ１２５５０゜ＡＴＣ
Ｃ７９５３，７９５４，８００５，１０１９４，１２９
８０，ＮＣＡｌ３Ｏ３などがある。
また、ベクターとしての役割を有するＤＮＡとしては１
例えばプラスミドＤＮΔがあげられ、特にプラスミドｐ
ＢＲ３２２が好ましい。また、制限酵素としては１例え
ばＳａｌ Ｉがあげられ、リガーゼとしては９例えばＴ
４ＯＮ！リガーゼがあげられる。
例えばプラスミドＤＮΔがあげられ、特にプラスミドｐ
ＢＲ３２２が好ましい。また、制限酵素としては１例え
ばＳａｌ Ｉがあげられ、リガーゼとしては９例えばＴ
４ＯＮ！リガーゼがあげられる。
本発明のプラスミドとしては１例えば、前記した方法で
プラスミドｐＢＲ３２２に、バチルス・ステアロサーモ
フィルスの染色体ＤＮＡ由来のし一アラニン脱水素酵素
の遺伝子を導入したプラスミドｐｌｃＲ３及びｐｌｃＲ
３０１があげられる。なお、このプラスミドｐｌｃＲ及
びｐｌｃＲ３０１を昭和５９年２月１４日に通産省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続を行ったが、
このプラスミドは受託されなかった。次にこのプラスミ
ドｐｌｃＲ３及びｐＨＲ３２２の理化学的性質を示す。
プラスミドｐＢＲ３２２に、バチルス・ステアロサーモ
フィルスの染色体ＤＮＡ由来のし一アラニン脱水素酵素
の遺伝子を導入したプラスミドｐｌｃＲ３及びｐｌｃＲ
３０１があげられる。なお、このプラスミドｐｌｃＲ及
びｐｌｃＲ３０１を昭和５９年２月１４日に通産省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託の手続を行ったが、
このプラスミドは受託されなかった。次にこのプラスミ
ドｐｌｃＲ３及びｐＨＲ３２２の理化学的性質を示す。
（１）常温微生物内で耐熱性のし一アラニン脱水素酵素
を発現させることができる。
を発現させることができる。
（２）下記制限酵素に対し１次の切断感受性を有する。
制限酵素 切断部位数
ｐｌｃＲ３ｐｌｃＩ？ ３０１
ＨｃｏＲＩ ２ ２
Ｉｌｉｎｄ Ｉ［ｌ ２ １
Ｓａ４ １ ４ ３
制限酵素の名称は１次の菌種から得られる制限酵素の略
称である。
称である。
ｋ飢Ｉ；ニジエリチア・コリ
Ｉｆ ＋ ｎ ｄ ＩＩＩ ；ヘモフィラス・・インフ
ルエンザＳａｌ Ｉ ；ストレプトマイセス・アルプス
制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素存在下で
プラスミｌ” ｐｌｃＩ？ ３及びｐｌｃＲ３０１を消
化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ１分
離可能な断片の数から決定される。
ルエンザＳａｌ Ｉ ；ストレプトマイセス・アルプス
制限酵素による切断部位数は、過剰の制限酵素存在下で
プラスミｌ” ｐｌｃＩ？ ３及びｐｌｃＲ３０１を消
化し、その消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ１分
離可能な断片の数から決定される。
（３）分子量
プラスミドｐｌｃＲ３は約７メガダルトンで、プラスミ
ドｐｌｃＲ３０１は約５メガダルトンである。
ドｐｌｃＲ３０１は約５メガダルトンである。
（４）プラスミドｐｌｃＲ３０１は、プラスミドｐｌｃ
Ｒ３のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子をそのままにし、
それ以外のものを一部取り除いて小型化したプラスミド
で、このプラスミドが導入されたニジエリチア コリＣ
６００ｐＩＣＲ３０１株のし一アラニン脱水素酵素活性
が、プラスミドｐｌｃＲ３が導入されたニジエリチア
コリＣ６００ｐＩＣＲ３株の活性よりも約３倍高い値を
示す。
Ｒ３のＬ−アラニン脱水素酵素遺伝子をそのままにし、
それ以外のものを一部取り除いて小型化したプラスミド
で、このプラスミドが導入されたニジエリチア コリＣ
６００ｐＩＣＲ３０１株のし一アラニン脱水素酵素活性
が、プラスミドｐｌｃＲ３が導入されたニジエリチア
コリＣ６００ｐＩＣＲ３株の活性よりも約３倍高い値を
示す。
本発明のプラスミドは９例えば、常温で生育する細菌に
導入することができ、このプラスミドを導入することに
より、形質転換された細菌を得ることができる。この常
温で生育する細菌としては例えば、ニジエリチア（ＩＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌があげられ。
導入することができ、このプラスミドを導入することに
より、形質転換された細菌を得ることができる。この常
温で生育する細菌としては例えば、ニジエリチア（ＩＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）属に属する細菌があげられ。
特にニジエリチア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ並
旦）が好ましい。そのニジエリチア・コリの具体例とし
て、ニジエリチア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−があげられる
。
旦）が好ましい。そのニジエリチア・コリの具体例とし
て、ニジエリチア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−があげられる
。
また９本発明のプラスミドを１例えば、上記常温で育成
する細菌に導入するには２例えば、ジャーナル・オブ・
モレキュラ・バイオロジー（Ｊ、Ｍ。
する細菌に導入するには２例えば、ジャーナル・オブ・
モレキュラ・バイオロジー（Ｊ、Ｍ。
１、旧ｏ１． ） ５３．１５９〜１６２ （１９７０
）の方法に従って。
）の方法に従って。
０℃付近の温度で塩化カルシウム処理した上記細菌と本
発明のプラスミドとを接触させることにより行えばよい
。
発明のプラスミドとを接触させることにより行えばよい
。
以上のようにして形質転換された細菌の例として、プラ
スミｌ”ｐｌｃＲ３及びｐＩＣＲ３０１が導入されたニ
ジエリチア コリ Ｃ６００−ｐｌｃＲ”３株（微工研
菌寄第７４４７号）及びＣ６００−ｐｌｃＲ３０１株（
微工研菌寄第７４４８℃）があげられる。この菌株は公
知のニジエリチア コリ Ｃ６００（Ｎａｔｕｒｅ ２
１７．１１１０〜１１１４ （１９８６）を参照。〕と
、耐熱のし一アラニン脱水素酵素生産能及びアビシリン
耐性を有する意思外は同じ菌学的性質を有している。こ
の菌体ば、非伝達性を伝達性に変えることなく、また非
病原性を病原性に変えることな（安全性が保持されてい
る。
スミｌ”ｐｌｃＲ３及びｐＩＣＲ３０１が導入されたニ
ジエリチア コリ Ｃ６００−ｐｌｃＲ”３株（微工研
菌寄第７４４７号）及びＣ６００−ｐｌｃＲ３０１株（
微工研菌寄第７４４８℃）があげられる。この菌株は公
知のニジエリチア コリ Ｃ６００（Ｎａｔｕｒｅ ２
１７．１１１０〜１１１４ （１９８６）を参照。〕と
、耐熱のし一アラニン脱水素酵素生産能及びアビシリン
耐性を有する意思外は同じ菌学的性質を有している。こ
の菌体ば、非伝達性を伝達性に変えることなく、また非
病原性を病原性に変えることな（安全性が保持されてい
る。
本発明のプラスミドは、上記したよ・）に有用な微生物
９例えば、常温で生育する細菌を形質転換して耐熱性の
し一アラニン脱水酵素生産能を賦与することができ、形
質転換された細菌から耐熱性のし一アラニン脱水素酵素
を大量に、しかも容易に得ることができるので、非常に
有用である。
９例えば、常温で生育する細菌を形質転換して耐熱性の
し一アラニン脱水酵素生産能を賦与することができ、形
質転換された細菌から耐熱性のし一アラニン脱水素酵素
を大量に、しかも容易に得ることができるので、非常に
有用である。
次に本発明を実施例により具体的に説明する。
なお、耐熱性のＬ−アラニン脱水素酵素の活性は、（コ
ーロビアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー［
［ｉｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｂｅｍ、１００．２９−３９（
１９７９） ）に記載されているし一アラニン脱水素酵
素活性の測定法、すなわち ｐＨ１１，３の１００μｍ
ｏｌｅのグリシン−ＭＣＩ −［０１１９衝液中で、
１．２５ｐ ｍｏｌｅのＮＡＤと、１０μｍｏｌｅの
ＮＡＤと＋ １０ＩＩｍｏｌｅのし一アラニンを含む混
合液を調製し、その混合液に適当量の粗酵素抽出液を加
えて、最終容量を０．８１とし、２５℃あるいは５５℃
における還元型ＮＡＤの単位時間あたりの増加を３４０
ｎｍの吸光度の増加として測定する方法で行った。
ーロビアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー［
［ｉｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｂｅｍ、１００．２９−３９（
１９７９） ）に記載されているし一アラニン脱水素酵
素活性の測定法、すなわち ｐＨ１１，３の１００μｍ
ｏｌｅのグリシン−ＭＣＩ −［０１１９衝液中で、
１．２５ｐ ｍｏｌｅのＮＡＤと、１０μｍｏｌｅの
ＮＡＤと＋ １０ＩＩｍｏｌｅのし一アラニンを含む混
合液を調製し、その混合液に適当量の粗酵素抽出液を加
えて、最終容量を０．８１とし、２５℃あるいは５５℃
における還元型ＮＡＤの単位時間あたりの増加を３４０
ｎｍの吸光度の増加として測定する方法で行った。
また、実施例及び参考側中の％は、容量％を示す。
実施例１．２
（１）バチルス・ステアロサーモフィルスの染色体１）
ＮＡの分離。
ＮＡの分離。
バチルス・ステアロサーモフィルス１１フ０１２５５０
株から、ハイオケミカ・工Ｆ・バ・イオフィジカ・アク
タ（Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ）
７２． Ｇ１９〜６２９ （１９６３）に記載の方法に
準し、染色体ＤＮＡを分離した。
株から、ハイオケミカ・工Ｆ・バ・イオフィジカ・アク
タ（Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ）
７２． Ｇ１９〜６２９ （１９６３）に記載の方法に
準し、染色体ＤＮＡを分離した。
まず、バチルス・ステアロザーモフィルスＩＩ’０１２
５５０株をグリセロール培地（ポリペ１８フ１０ｇ／ρ
、酵母エキス２．５ ｇ／β、肉エキス２ｇ／ｐ、グリ
セロール２ ｇ／β、塩化すトリウム５ｇ／ｌ リン酸
■カリウム ２ｇ／ｌ リン酸２カリウム ２ ｇ ／
ｐ、硫酸マグネシウム ０．１ｇ／！、ビオヂン４μ
ｇ／ （１、そしてｐｌ＋ ７．２に調製）２７！で
１５５°Ｃて１２時時間表う培養した後。
５５０株をグリセロール培地（ポリペ１８フ１０ｇ／ρ
、酵母エキス２．５ ｇ／β、肉エキス２ｇ／ｐ、グリ
セロール２ ｇ／β、塩化すトリウム５ｇ／ｌ リン酸
■カリウム ２ｇ／ｌ リン酸２カリウム ２ ｇ ／
ｐ、硫酸マグネシウム ０．１ｇ／！、ビオヂン４μ
ｇ／ （１、そしてｐｌ＋ ７．２に調製）２７！で
１５５°Ｃて１２時時間表う培養した後。
遠心分離にて集菌した。
次に］２ｍｇのりゾ千−ムを６０１１のサリン（ｓａｌ
ｉｎｅ） −ＥＤＴＡ溶液（０，１５Ｍ ＮａＣ１と
０．１ＭＥＤＴ八 を含み、 ｐｌ＋ ８．０に８固装
。）にン容かし。
ｉｎｅ） −ＥＤＴＡ溶液（０，１５Ｍ ＮａＣ１と
０．１ＭＥＤＴ八 を含み、 ｐｌ＋ ８．０に８固装
。）にン容かし。
この溶液に集菌した菌株を加え、よく攪拌した。
これを３７℃で約１０分間加温し、菌体が溶菌し始めた
ところで直ちに凍結した。
ところで直ちに凍結した。
この凍結した菌体に５０ｍ ｌのトリス−３Ｏ３緩衝液
（１％ＳＯ３Ｉ Ｏ，Ｉ Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨ９，
０に調製された０、１Ｍビリス緩衝液。）を加えて攪拌
し、さらに６０°Ｃに加温し、完全に溶菌させた。
（１％ＳＯ３Ｉ Ｏ，Ｉ Ｍ ＮａＣ１を含むｐＨ９，
０に調製された０、１Ｍビリス緩衝液。）を加えて攪拌
し、さらに６０°Ｃに加温し、完全に溶菌させた。
この溶菌液に５６ｍ１の８０％フェノールを加えて。
約２０分間振とうさ−Ｕ、フＪノール抽出を行い。
夾雑蛋白質を除去した。この抽出された粗ＤＮＡ溶液に
２倍容量の冷エタノールを加えてガラス棒で繊維状の沈
殿を巻き取り、 ７０．８０．９０％のエタノール各１
０ｍ１中に、順次、数分ずつ浸漬したｌＬ２０ｍｌの希
ザリンーサイトレート（ｓａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ
） 溶液（０，０１５Ｍ ＮａＣ１，０，００１５Ｍ
Ｎａ３−クエン酸にεＩ！ｉｌ製。）にン容かし、さ
らに濃５ａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ ｉ９液（１，５
Ｍ ＮａＣｌ、 ０．１５Ｍ Ｎａ３−クエン酸に調製
。）を２ｍｌ加えて、粗ＯＮｉ液を８固装した。
２倍容量の冷エタノールを加えてガラス棒で繊維状の沈
殿を巻き取り、 ７０．８０．９０％のエタノール各１
０ｍ１中に、順次、数分ずつ浸漬したｌＬ２０ｍｌの希
ザリンーサイトレート（ｓａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ
） 溶液（０，０１５Ｍ ＮａＣ１，０，００１５Ｍ
Ｎａ３−クエン酸にεＩ！ｉｌ製。）にン容かし、さ
らに濃５ａｌｉｎｅ−ｃｉｔｒａｔｅ ｉ９液（１，５
Ｍ ＮａＣｌ、 ０．１５Ｍ Ｎａ３−クエン酸に調製
。）を２ｍｌ加えて、粗ＯＮｉ液を８固装した。
この１且ＤＮＡ液を５００μ ｇ／ｍ１位にうすめて。
リボヌクレア−ゼ（ＲＮａ５ｅＡ （シグマ社製））を
５０μ ｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間
加温した。冷却後１等量の８０％フェノールを加え、フ
ェノール抽出を行い、抽出１１Ｎ＾をエタノール沈殿に
て回収し、さらに上記の希５ａｌｉｎｅ−ｃｉＬｒａｔ
ｅ熔液２０ｍ ｌに溶解し、さらに上記の１ｓａｌｉｎ
ｅ −ｃｉｔｒａＬｅ熔液を２ｍｌ加えることにより。
５０μ ｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間
加温した。冷却後１等量の８０％フェノールを加え、フ
ェノール抽出を行い、抽出１１Ｎ＾をエタノール沈殿に
て回収し、さらに上記の希５ａｌｉｎｅ−ｃｉＬｒａｔ
ｅ熔液２０ｍ ｌに溶解し、さらに上記の１ｓａｌｉｎ
ｅ −ｃｉｔｒａＬｅ熔液を２ｍｌ加えることにより。
染色体ＤＮＡの抽出液を調製した。
（２）ベクタープラスミツドｐＢＲ３２２の８固装。
プラスミツドｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｂｅａｄａ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を導入した
ニジエリチア・コリ０６００株を、２！のＬ〜培地（ポ
リペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ ｇ／β、グルコ
ースＩｇ／’＋塩化すＩ・リウム５ｇ／６てｐＨ７，２
に１ｌｌｉＩ製。）で対数増殖前期になるまで３７℃で
通気培養した後、 １０ｍ１のクロラムフェニコール溶
液（３，６ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールで調製。
ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を導入した
ニジエリチア・コリ０６００株を、２！のＬ〜培地（ポ
リペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ ｇ／β、グルコ
ースＩｇ／’＋塩化すＩ・リウム５ｇ／６てｐＨ７，２
に１ｌｌｉＩ製。）で対数増殖前期になるまで３７℃で
通気培養した後、 １０ｍ１のクロラムフェニコール溶
液（３，６ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールで調製。
）を添加し、さらに３７℃で１５分間通気培養してプラ
スミドｐＢＲ３２２を増殖させた。
スミドｐＢＲ３２２を増殖させた。
次に遠心分離にて集菌した菌を８０ｍ１のＴＥ−シュク
ロース緩衝液（２０％シュクロース、 ２０ｍＭＩＥＤ
Ｔ＾を含み、 ｐＨ８，０に調製された０、０５旧リス
緩衝液。）に懸濁し、さらに８ｍｌのりゾチーム溶液（
５ｍｇ／ｍｌとなるように上記ＴＥ−シュクロース緩衝
液にて調製。）を添加し、さらに２８ｍ ｌの５ＭＮａ
Ｃ１熔液と４ｍｌの４％ＳＤＳ熔液を加えた。
ロース緩衝液（２０％シュクロース、 ２０ｍＭＩＥＤ
Ｔ＾を含み、 ｐＨ８，０に調製された０、０５旧リス
緩衝液。）に懸濁し、さらに８ｍｌのりゾチーム溶液（
５ｍｇ／ｍｌとなるように上記ＴＥ−シュクロース緩衝
液にて調製。）を添加し、さらに２８ｍ ｌの５ＭＮａ
Ｃ１熔液と４ｍｌの４％ＳＤＳ熔液を加えた。
この混合液を３７℃で２時間反応させた。さらに、０°
Ｃで約１５時間保った後、遠心分離にて粗プラスミドＯ
Ｎへを分離した。
Ｃで約１５時間保った後、遠心分離にて粗プラスミドＯ
Ｎへを分離した。
次に、２容量の８０％フェノールを加えてフェノール処
理を行い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プラ
スミドを冷イソプロパツールにて沈殿回収し、さらにＴ
Ｅ緩衝液（０，１４Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭ ＥＤＴＡを
含む、 ｐＨ７，５に８周製された２０１ＩＩＭトリス
緩衝液。）に溶解した。この混合液に２ｍｇのＲＮａ５
ｅ＾を添加し、３７℃で２時間反応させ、上記と同様の
方法でフェノール処理にて夾雑ＲＮＡを除去した。
理を行い、夾雑蛋白質を除去した。この抽出した粗プラ
スミドを冷イソプロパツールにて沈殿回収し、さらにＴ
Ｅ緩衝液（０，１４Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭ ＥＤＴＡを
含む、 ｐＨ７，５に８周製された２０１ＩＩＭトリス
緩衝液。）に溶解した。この混合液に２ｍｇのＲＮａ５
ｅ＾を添加し、３７℃で２時間反応させ、上記と同様の
方法でフェノール処理にて夾雑ＲＮＡを除去した。
この抽出された粗プラスミドを２倍容量のエタノール沈
殿にて回収した。これを、さらに１０ｍ１の上記のＴＩ
Ｅ緩衝液に溶解させ、アガロースゲル濾過にて夾雑ＲＮ
Ａをさらに除去し、得られた粗ＤＮへをエタノール沈殿
にて再び回収した。
殿にて回収した。これを、さらに１０ｍ１の上記のＴＩ
Ｅ緩衝液に溶解させ、アガロースゲル濾過にて夾雑ＲＮ
Ａをさらに除去し、得られた粗ＤＮへをエタノール沈殿
にて再び回収した。
この沈殿を２３．１ｍｌの０．０２ Ｍ）リス緩衝液（
ｐ１１８．０に調製。）に溶解し、さらに２３．７ｇの
塩化セシウムと０．６ｍｌのエチジウムフ゛ロマイｌ’
ン容液（１０ｍｇ／ ｍｌに調製。）を加え、約４０
時間超遠心することにより、プラスミドＤＮ＾を分離し
１次にノルマルブタノールにより、エチジウムブロマ・
イドを除去した。この分離したプラスミドを０．０１
ＭのＴ ＥＩ’ｉｋ ｆｉｉ液（０，１ｍＭ ＥＤＴ＾
を含むｐＨ７，５に調製された０、０１ Ｍ）リス緩衝
液。）で透析することにより、精製プラスミドｐＢＲ３
２２を得た。
ｐ１１８．０に調製。）に溶解し、さらに２３．７ｇの
塩化セシウムと０．６ｍｌのエチジウムフ゛ロマイｌ’
ン容液（１０ｍｇ／ ｍｌに調製。）を加え、約４０
時間超遠心することにより、プラスミドＤＮ＾を分離し
１次にノルマルブタノールにより、エチジウムブロマ・
イドを除去した。この分離したプラスミドを０．０１
ＭのＴ ＥＩ’ｉｋ ｆｉｉ液（０，１ｍＭ ＥＤＴ＾
を含むｐＨ７，５に調製された０、０１ Ｍ）リス緩衝
液。）で透析することにより、精製プラスミドｐＢＲ３
２２を得た。
（３）プラスミドｐｌｃＲ１３の創製（実施例１）。
（１）の方法で得られたバチルス・ステアロサーモフィ
ルスの染色体［１１１１八５μｇと制限酵素静上−Ｉ（
宝酒造社Ｗ） ２０ユニノ１を＋ ７ｍＭ ＭｇＣｌ２
＋ １５０ｍＭ ＮａＣ１，０，２ｍＭ Ｅｌ）Ｔ＾、
７ｍＭ ２〜メルカプトエタノール、 ｏ、ｏｉ％Ｂ
Ｓ八を含むｐ）１７．５に調製した１０ｍ旧・リス緩衝
液１００．ｃ＋ Ｉｔに入れ、３７℃で２．５時間反応
させてＤＮ八を消化させた後、６５℃で５分間加熱し、
」１１を不活性化し、冷エタノールにて消て消化ＤＮへ
断片を沈殿回収した。
ルスの染色体［１１１１八５μｇと制限酵素静上−Ｉ（
宝酒造社Ｗ） ２０ユニノ１を＋ ７ｍＭ ＭｇＣｌ２
＋ １５０ｍＭ ＮａＣ１，０，２ｍＭ Ｅｌ）Ｔ＾、
７ｍＭ ２〜メルカプトエタノール、 ｏ、ｏｉ％Ｂ
Ｓ八を含むｐ）１７．５に調製した１０ｍ旧・リス緩衝
液１００．ｃ＋ Ｉｔに入れ、３７℃で２．５時間反応
させてＤＮ八を消化させた後、６５℃で５分間加熱し、
」１１を不活性化し、冷エタノールにて消て消化ＤＮへ
断片を沈殿回収した。
次に、（２）の方法で得られたプラスミドｐＢＲ３２２
１μｇに制限酵素５ａｌ１３ユニソ１−を加え、上記と
同様の緩衝液中で３７°Ｃで１０時間反応させ。
１μｇに制限酵素５ａｌ１３ユニソ１−を加え、上記と
同様の緩衝液中で３７°Ｃで１０時間反応させ。
上記と同様の方法で消化プラスミドＤＮＡを回収した。
こうして得られた消化染色体及びプラスミドのＤＮＡを
混合し、 Ｔ４ＤＮ＾リガーゼ（宝酒造社製）を用い、
６．６ｍＭ ＭｇＣｈ 、 １０ｍＭ ＤＴＴ、 ６
６ｇＭ ＡＴＰを含むｐｌ＋７．６に調製した６６ｍＭ
トリス緩衝液中で、１３℃で１９時間反応さセ、消化
ＤＮＡを再結合することにより、プラスミドｐｌｃＲ３
を得た。
混合し、 Ｔ４ＤＮ＾リガーゼ（宝酒造社製）を用い、
６．６ｍＭ ＭｇＣｈ 、 １０ｍＭ ＤＴＴ、 ６
６ｇＭ ＡＴＰを含むｐｌ＋７．６に調製した６６ｍＭ
トリス緩衝液中で、１３℃で１９時間反応さセ、消化
ＤＮＡを再結合することにより、プラスミドｐｌｃＲ３
を得た。
（４）プラスミドｐｌｃＲ３０１の創製（実施例２）。
（３）の方法にて創製されたプラスミドｐｌｃＲ３１ｇ
ｇに１ｌｒｌＪ限酵素１１ｉｎｄ ｌｌ＋ ３ユ−ット
を加え、 ’７ｍＭＭｇＣＩ２＋ ６０ｍＭ Ｎａｃｌ
を含むｐｌ＋７．５に調整した１０ｎ＋Ｍｌ−リス緩衝
液１０μｐに入れ、３７℃で１０時間反応させたのち、
（３）と同様の方法にて、消化ＤＮ＾を回収し、 Ｔ４
ＤＮＡリガーニテ再結合させることにより、プラスミド
ｐｌｃＲ３０１を得た。
ｇに１ｌｒｌＪ限酵素１１ｉｎｄ ｌｌ＋ ３ユ−ット
を加え、 ’７ｍＭＭｇＣＩ２＋ ６０ｍＭ Ｎａｃｌ
を含むｐｌ＋７．５に調整した１０ｎ＋Ｍｌ−リス緩衝
液１０μｐに入れ、３７℃で１０時間反応させたのち、
（３）と同様の方法にて、消化ＤＮ＾を回収し、 Ｔ４
ＤＮＡリガーニテ再結合させることにより、プラスミド
ｐｌｃＲ３０１を得た。
参考例１，２
実施例１，２で得たプラスミドｐｌｃＲ３及びｐｌｃＩ
＋ ３０１の発現性を調べるため１次の１ランスフォ−
メーシリン処理を行った。
＋ ３０１の発現性を調べるため１次の１ランスフォ−
メーシリン処理を行った。
（５）トランスフメーメーション。
まず、宿主菌のニジエリチア・コリＣ６００ｒ ｍ −
株を５０ｍ１の上記のし一培地にて培養し、遠心分離に
て集菌後、 ’５０ｍ１の０．１ Ｍ ｈｃ１＋ ｆｉ
ｊ液に懸濁し。
株を５０ｍ１の上記のし一培地にて培養し、遠心分離に
て集菌後、 ’５０ｍ１の０．１ Ｍ ｈｃ１＋ ｆｉ
ｊ液に懸濁し。
さらに遠心分離を行って最終的には２．５ｍｌのＯ，１
ＭＭｇＣＩ２溶液に懸濁させた。
ＭＭｇＣＩ２溶液に懸濁させた。
このようにして得られたニジエリチア・コリＣ６００ｒ
ｍ−株の懸濁液０．２ｍｌに（３）及び（４）の方法
で得たプラスミドｐｌｃＲ３又はｐｌｃＲ３０１を含む
混合物を０．１ｍｌ加え、０°Ｃて３０分間処理したの
ち、４２℃で２分間処理した。 次にこれに３ｍｌの前
記したし一培地を加え、３７℃で１時間１８養し、さら
にアンピシリン（１５ｇｇ／ｍｌに調製。）の入った１
、−寒天培地（Ｌ−培地１ρ当り、１５ｇの寒天を加え
たもの。）で３７℃で培養後、生じたコロニーを。
ｍ−株の懸濁液０．２ｍｌに（３）及び（４）の方法
で得たプラスミドｐｌｃＲ３又はｐｌｃＲ３０１を含む
混合物を０．１ｍｌ加え、０°Ｃて３０分間処理したの
ち、４２℃で２分間処理した。 次にこれに３ｍｌの前
記したし一培地を加え、３７℃で１時間１８養し、さら
にアンピシリン（１５ｇｇ／ｍｌに調製。）の入った１
、−寒天培地（Ｌ−培地１ρ当り、１５ｇの寒天を加え
たもの。）で３７℃で培養後、生じたコロニーを。
さらにテトラサイクリン（２５μｇ ／ ｒｒｔ １に
調製。）の入ったし一寒天培地で培養後、生えてこない
コロニーをＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ、双、 ２２７４−２２７８（１９７５）に記載の
方法に従い、 ｉ＋！紙上に分離し。
調製。）の入ったし一寒天培地で培養後、生えてこない
コロニーをＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ、双、 ２２７４−２２７８（１９７５）に記載の
方法に従い、 ｉ＋！紙上に分離し。
ＮＢＴ にトロブルーテトラゾリウム）及びＰＭＳ（フ
ェナジシメソサルフェート）を含む反応液にて１反応さ
せることにより、Ｌ−アラニン脱水素酵素活性を有する
コロニーを見出すことによりプラスミドｐｌｃＲ３及び
ｐｌｃＲ３０１の導入されたニジエリチア・コリＣ６０
０−ｐｌｃＲ３又はＣ６００−ｐｌｃＲ３０１が得られ
た。
ェナジシメソサルフェート）を含む反応液にて１反応さ
せることにより、Ｌ−アラニン脱水素酵素活性を有する
コロニーを見出すことによりプラスミドｐｌｃＲ３及び
ｐｌｃＲ３０１の導入されたニジエリチア・コリＣ６０
０−ｐｌｃＲ３又はＣ６００−ｐｌｃＲ３０１が得られ
た。
次にこうして得られたニジエリチア・コリ Ｃ６００ｐ
ｌｃＲ３又はＣ６００−ＰＩＣＲ３０１のコロニーより
。
ｌｃＲ３又はＣ６００−ＰＩＣＲ３０１のコロニーより
。
アンピシリン（１５ｇｇ／ｍｌに調製。）の入った上記
のグリセロール培地１００ ｍｌで３７℃で１６時間、
振とう培養を行った。これを遠心分離にて集菌、洗浄後
＋５ｍｌの０．０１％２−メルカプトエタノールを含み
、 ｐ ＩＩ ７ 、４に調製した０、０１ Ｍのリン
酸緩衝液に想濁し、０℃で５分間の超音波処理に゛ζ菌
体を破砕 、遠心分ｇｌｔにて粗酵素抽出液を得た。
のグリセロール培地１００ ｍｌで３７℃で１６時間、
振とう培養を行った。これを遠心分離にて集菌、洗浄後
＋５ｍｌの０．０１％２−メルカプトエタノールを含み
、 ｐ ＩＩ ７ 、４に調製した０、０１ Ｍのリン
酸緩衝液に想濁し、０℃で５分間の超音波処理に゛ζ菌
体を破砕 、遠心分ｇｌｔにて粗酵素抽出液を得た。
このようにして得た粗酵素抽出液の１ｌｉＪ熱性のし−
アラニン脱水素酵素の活性を測定したところ。
アラニン脱水素酵素の活性を測定したところ。
ニジエリチア・コリＣ６００−ｐｌｃＲ３株では、０６
８ユニット／ｍｇプロティンで、ニジエリデア・コリＣ
６００−ｐｌｃＲ３０１株では、２．４ユニソｌ／ｍｇ
・プロティンであった。これはＤＮＡ供与菌であるバチ
ルス・ステアロサーモフィルスＩＦＯ１２５５０ｔｆｆ
ｉのＬ−アラニン脱水素酵素の活性（０，０７０ユニツ
ト／ｌ１１８・プロティン）よりもそれぞれ１０倍ない
し３０倍の値であった。
８ユニット／ｍｇプロティンで、ニジエリデア・コリＣ
６００−ｐｌｃＲ３０１株では、２．４ユニソｌ／ｍｇ
・プロティンであった。これはＤＮＡ供与菌であるバチ
ルス・ステアロサーモフィルスＩＦＯ１２５５０ｔｆｆ
ｉのＬ−アラニン脱水素酵素の活性（０，０７０ユニツ
ト／ｌ１１８・プロティン）よりもそれぞれ１０倍ない
し３０倍の値であった。
また、このＬ−アラニン脱水素酵素を含む粗酵素抽出液
は、２−メルカプトエタノールを０．０１％含む９１１
７．２の１０１リン酸緩街ｌ夜中、７０°〔“で６０分
間加熱処理したところ、８０％以上の残存活性を有しζ
いた。
は、２−メルカプトエタノールを０．０１％含む９１１
７．２の１０１リン酸緩街ｌ夜中、７０°〔“で６０分
間加熱処理したところ、８０％以上の残存活性を有しζ
いた。
次にこの菌株から前記（２）と同様の方法でプラスミｌ
”ｐｌｃＲ３及びＣ６００−ｐｌｃＲ３０１を分離して
、水平型アガロースゲル電機泳動でプラスミ、ＦｐｌＣ
Ｒ３及びｐｌｃＲ３０１の性質を調べた。
”ｐｌｃＲ３及びＣ６００−ｐｌｃＲ３０１を分離して
、水平型アガロースゲル電機泳動でプラスミ、ＦｐｌＣ
Ｒ３及びｐｌｃＲ３０１の性質を調べた。
電気泳動に用いた緩衝液として、 ２．５．ｍＭ ＥＤ
ＴＡ−Ｎａ、 ８９ｍＭのほう酸を含みｐｌ＋ ８．３
に調整した８９ＩＩＩＭのトリス緩衝液を用い、ゲルと
してこの緩衝液に０．７％のアガロースと０．５ｍｇ／
Ｅに調整したエチジウムブロマイドを加えたものを用
い、これに。
ＴＡ−Ｎａ、 ８９ｍＭのほう酸を含みｐｌ＋ ８．３
に調整した８９ＩＩＩＭのトリス緩衝液を用い、ゲルと
してこの緩衝液に０．７％のアガロースと０．５ｍｇ／
Ｅに調整したエチジウムブロマイドを加えたものを用
い、これに。
プラスミドｐｌｃＲ３及びｐｌｃ［＋ ３０１とプラス
ミドｐＢＲ３２２，さらに分子量マーカーとしてのラム
ダファージＤＮＡの１Ｉｉｒ＋＋ＪＩ［［（宝酒造者性
）消化断片を各約ｌμｇ ＤＮ＾を同一アガロースゲル
上で同時に中１ｃｍ当り、７Ｖの定付加電圧で３〜４時
間、泳動させた。次に紫外線ランプでバンドを判定し、
プラスミドｐｌｃＲ３及びｐｐｌｃＲ３０１の大きさを
調べた結果１分子量がプラスミドｐｌｃＲ３は、約７メ
ガダルトンで、 ｐＩＣＲ３０１では約５メガダルトン
であった。なお、プラスミドｐＢＩ＋ ３２２の分子量
は、２．８メガダルトンである。
ミドｐＢＲ３２２，さらに分子量マーカーとしてのラム
ダファージＤＮＡの１Ｉｉｒ＋＋ＪＩ［［（宝酒造者性
）消化断片を各約ｌμｇ ＤＮ＾を同一アガロースゲル
上で同時に中１ｃｍ当り、７Ｖの定付加電圧で３〜４時
間、泳動させた。次に紫外線ランプでバンドを判定し、
プラスミドｐｌｃＲ３及びｐｐｌｃＲ３０１の大きさを
調べた結果１分子量がプラスミドｐｌｃＲ３は、約７メ
ガダルトンで、 ｐＩＣＲ３０１では約５メガダルトン
であった。なお、プラスミドｐＢＩ＋ ３２２の分子量
は、２．８メガダルトンである。
また、このプラスミドｐｌｃＲ３及びｐｌｃＲ３０１を
制限酵素に吐１ ＋ １Ｉｔｎｄｌ［＋錘しＩ各々の制
限酵素の適正条件で反応させ、プラスミドｐｌｃＩ？
３及びｐｌｃｌｌ ３０１を消化させた。
制限酵素に吐１ ＋ １Ｉｔｎｄｌ［＋錘しＩ各々の制
限酵素の適正条件で反応させ、プラスミドｐｌｃＩ？
３及びｐｌｃｌｌ ３０１を消化させた。
各制限酵素にて得られた消化試料は、上記と同様の方法
でアガロースゲル電気泳動を行い、各制限酵素による切
断部位数を調べた結果、プラスミドρ？ＣＩ？ ３及び
ｐｌｃＲ３０１は以下の切ｌ＆ｌｉ感受性部位を有する
ことが判明した。
でアガロースゲル電気泳動を行い、各制限酵素による切
断部位数を調べた結果、プラスミドρ？ＣＩ？ ３及び
ｐｌｃＲ３０１は以下の切ｌ＆ｌｉ感受性部位を有する
ことが判明した。
制限酵素 切断部位数
ｐｌｃＲ３ｐｌｃＲ３０１
」μ琲−！ ２ ２
１１ｉｎｄ ｍ ２ １
Ｓａｌ Ｉ ４ ３
さらに、プラスミドｐｌｃＲ３は、 Ｓａｌ Ｉ切断部
位にて、バチルス、ステアロサーモフィルス ＩＰＯ１
２５５０株のし一アラニン脱水素酵素の遺伝子を含む染
色体ＩＮＮ＾ 断片とプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ＾と
が結合しており、プラスミドｐｌｃｌ？ ３０１は、其
吋■と」■切断部位にて、前記の１．−アラニン脱水素
酵素の遺伝子を含む染色体ｏＡＮｌｌｉ片とプラスミＦ
ｐＢＲ３２２ＤＮ＾が結合していることが明らかでで
ある。
位にて、バチルス、ステアロサーモフィルス ＩＰＯ１
２５５０株のし一アラニン脱水素酵素の遺伝子を含む染
色体ＩＮＮ＾ 断片とプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮ＾と
が結合しており、プラスミドｐｌｃｌ？ ３０１は、其
吋■と」■切断部位にて、前記の１．−アラニン脱水素
酵素の遺伝子を含む染色体ｏＡＮｌｌｉ片とプラスミＦ
ｐＢＲ３２２ＤＮ＾が結合していることが明らかでで
ある。
特許出願人 ユニ壬力株式会社
Claims (4)
- （１）耐熱性のし一アラニン脱水素酵素の遺伝子を有す
るプラスミド。 - （２）耐熱性のし一アラニン脱水素酵素の遺伝子が。 好熱性の微生物の染色体ＤＮＡ由来のし一アラニン脱水
素酵素の遺伝子である特許請求の範囲第１項記載のプラ
スミド。 - （３）好熱性の微生物が好熱性のバチルス属に属する細
菌である特許請求の範囲第２項記載のプラスミド。 - （４）好熱性のバチルス属に属する細菌がノλチルス・
ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌセ徂２Ｉ旦鉦旦月
咀ｒｍｏ担迂但」Ω−である特許請求の範囲第３項記載
のプラスミド”。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59034909A JPH0679556B2 (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59034909A JPH0679556B2 (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60180590A true JPS60180590A (ja) | 1985-09-14 |
| JPH0679556B2 JPH0679556B2 (ja) | 1994-10-12 |
Family
ID=12427323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59034909A Expired - Lifetime JPH0679556B2 (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0679556B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63112978A (ja) * | 1986-10-31 | 1988-05-18 | Daicel Chem Ind Ltd | エシエリチア・コリ |
| JPS63112985A (ja) * | 1986-10-31 | 1988-05-18 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規プラスミド |
| US5116748A (en) * | 1988-09-27 | 1992-05-26 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Process for the production of l-alanine dehydrogenase from 78-3 ferm bp-2517 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS565093A (en) * | 1979-06-22 | 1981-01-20 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Preparation of heat-resistant enzyme |
-
1984
- 1984-02-24 JP JP59034909A patent/JPH0679556B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS565093A (en) * | 1979-06-22 | 1981-01-20 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Preparation of heat-resistant enzyme |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63112978A (ja) * | 1986-10-31 | 1988-05-18 | Daicel Chem Ind Ltd | エシエリチア・コリ |
| JPS63112985A (ja) * | 1986-10-31 | 1988-05-18 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規プラスミド |
| US5116748A (en) * | 1988-09-27 | 1992-05-26 | Toyo Jozo Kabushiki Kaisha | Process for the production of l-alanine dehydrogenase from 78-3 ferm bp-2517 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0679556B2 (ja) | 1994-10-12 |
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