JPS61181374A - 中性プロテア−ゼの産生法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は１分子生物学の分野に属し、特には遺伝子工
学技術により大量の蛋白を産生ずる株の形成に関する。

更に詳細には、外分泌性の中性プロテアーゼの産生法に
関する。その特徴は、中性プロテアーゼをコードする遺
伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドを形成すること
、枯草菌の変異株を調製すること、前記ハイブリドプラ
スミドを前記変異株に導入すること、前記ハイブリドプ
ラスミドを含むコローンを単離すること、好気条件下で
液体培地中にてクローンを増殖させること、および培地
から中性プロテアーゼを単離することである。

〔従来技術とその問題点〕

産業上、例えば食料および化学工業の分野特に界面活性
剤の製造の面で、細菌起源の中性プロテアーゼを使用す
ることは周知である。発酵によりこれらの酵素を産生さ
せることも知られてｂる。その発酵法とは、酵素をコー
ドする遺伝子を天然に含む微生物を、適当な培地中で増
殖させることである。プロテアーゼを産生ずる微生物中
ではバチルス（Ｂａｅｉｌｌｕｓ　）属に属するものが
特に興味が°ある。これら既知の方法は。

数多くの段階を踏まなければならず、とりわけ回収率が
低いため好ましいとは言えな込。

組換えＤＮＡ技術の出現に伴なって、今や多量の蛋白を
産生ずる微生物をつ〈シ出せるようになっている。米国
特許第４２３７２２４によれば、特定の蛋白をコードす
る遺伝子が供与体株から単離され、ベクターと呼ばれる
特殊なりＮＡの使用により適当な宿主細胞へ導入された
。遺伝子工学の実験に使用されるベクター分子は、宿主
細胞中で自律的に複裏し得る。その結果、一般的に３０
ないし５０コピーが末端に存在するようだなる。外来遺
伝子がベクターに挿入され、［ｊされたベクター（すな
わち組換体ハイブリドプラスミド）が宿主細胞に導入さ
れると、細胞内での遺伝子のコピー数はベクターのそれ
と等しくなる。この結果、「遺伝子量」として知られる
現象によりクローニング産物の合成が高まる。

周知のことではあるが、ＤＮＡは細胞内でＲＮＡｆ　Ｉ
ＪメラーゼによりｍＲＮＡに転写され、続いて。

これがＩＪ　、Ｉｒソーム上で蛋白に翻訳される。特定
遺伝子のコピー数が増加して、細胞の転写および翻訳の
効率が高まれば、遺伝子産物の産生もそれに伴って増大
する。

従って、この発明の主題はａ）中性プロテアーゼをコー
ドする遺伝子を含む組換体−・イブリドプラスミドを構
成し、 ｂ）枯草菌の突然変異株を調製し、 Ｃ）前記組換体ハイブリドプラスミドを前記突然変異体
中に導入し、 ｄ）　　へイブリドシラスミドを含むクローンを単離し
、 ｅ）前記クローンを液体培地中で培養し、ｆ）前記培地
中から中性プロテアーゼを単離する工程から成ることを
特徴とする中性プロテアーゼの産生法である。

この発明によれば、組換体ハイブリッドプラスミへ然に
存在する供与体微生物からのＤＮＡを用いて既知の方法
により調製される。その微生物は、天然の中性プロテア
ーゼをコードする遺伝子を含んでいるものである。従っ
て、この発明の特徴はカ　クロモシームＤＮＡを供与体
微生物から単離および精製し。

イ）前記ＤＮＡを制限酵素で部分的に切断し、つ）適当
な長さ１．５ないし４×１０　塩基対のクロモシームＤ
ＮＡのフラグメントを単離し、工）あるプラスミド全特
異的制限酵素で切断し、ＤＮＡフラグメントのそれと同
一の粘着末端を形成し。

オ）　ウ）段階で得られたＤＮＡフラグメントと工）段
階で得られた直鎖ＤＮＡとをリガーゼにより結合して、
組換体ノ・イブリドプラスミドｔ−ｖＩｌｔｌｌするこ
とである。

この目的に適した供与体微生物はバチルス属に属するも
のである。この中でも枯草菌（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ　）が好ましｂ６！！！ｆに好まし５
株は、枯草菌ＢＧＳＣ（米国、オ・・イオ州、バチルス
遺伝子貯蔵センターから入手）である。この細菌はその
クロモシーム上に中性プロテアーゼをコードしている遺
伝子を有する。この株のクロモシームＤＮＡを、既知の
方法のどれか１つの方法により単離、精興する。得られ
たＤＮＡを、続いて特異的制限酵素により消化させる。

制限酵素Ｍｂｏ）が特に好ましい。

クロモシームＤＮＡの部分消化により、様々表大きさの
フラグメントが生じる。この中から、目的の遺伝子を含
む１．５ないし４　Ｘ　１０３塩基対のフラグメントを
、ショ糖密度勾配法により単離する。宿主微生物に有効
に入るどのようなベクターでも、この発明の組換体ハイ
ブリドプラスミドを形成することができる。このような
プラスミドは、ベクターにマーカーがあれば容易に固定
することができる。抗生物質に耐性を示すマーカーを含
むベクターが特に好ましい。このベクターのうち、黄色
ブドウ球菌から単離されたプラスミドが好ましいが、こ
れらのうちカナマイシン耐性を示す遺伝子を含むグラス
ミドｐＵＢ　−１１０（ＢＧＳＣＩＦ５　）が好ましい
。前記プラスミドは制限酵素ＢａｍＨＩにより切断され
、粘着末端を生じる。これは制限酵素Ｍｂｏｌにより生
じる末端と同じであり、続いてこれらを結合させること
ができる。この発明によれば、５）段階の反応すなわち
一定の長さのＤＮＡフラグメントと直線プラスミドｐＵ
Ｂ　−１１０との結合反応は、すｆ−ゼ存在下で既知の
方法により実施する。この目的に適するリガーゼとして
、市販のＴ４　ＤＮＡリガーゼが挙げられる。反応を上
記の条件下で進め、組換体ノ・イブリドプラスミドを得
る。続いて、これを用いて適当な微生物の宿主細胞を形
質転換する。この発明によれば、この目的Ｋ特に適する
宿主細胞として、枯草菌ＢＧＳＣ１Ａ３４１の突然変異
から得られるものが挙げられる。

得られた突然変異体は、８Ｍ８１０８と呼ばれるが、２
つの基本的な性質を有する。

１）ゲノム中に中性プロテアーゼの構造遺伝子に突然変
異が起きている。

２）枯草菌中で対応する組換が起きないようなｒｖｅ　
Ｅ４突然変異が生じている。

中性プロテアーゼの構造遺伝子に突然変異が生じると、
中性グロテアーゼマイナスグノタイプ（ｎｐｒ−）とな
る。これは、その株が中性プロテアーゼをコードする遺
伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドにより形質転換
されたとき、容易にその株を同定することができること
を意味する。

微生物の染色体遺伝子をクローニングするＫは、方法の
１つとして「シ、トカン法」とじて知られるものが使用
される。この方法は、制限酵素で染色体ＤＮＡ　ｔ−切
断し、得られ念フラグメン）を適当な制限酵素で切断さ
れたベクターであるプラスミド＆ＣＴ４　ＤＮＡリガー
ゼを吊込て結合させるものである。この方法によれば、
プラスミドＤＮＡと１つ以上の染色体ＤＮＡ断片によ〕
構成される多数のバイブリド分子が得られる。

前記の分子を宿主細胞に挿入することにより単離する。

挿入は、既知の方法により、ノ・イブリドプラスミドを
微生物細胞すなわち前記宿主細胞に接触させることによ
９行なうことができる。プラスミドＤＮＡは、細胞壁お
よび細胞膜を通過し、細胞質に入る。そこで機能を発現
する。

このような場合を細胞゛の形質転換という。グラスミド
による形質転換の効率は低く、平均してただ１つの組換
体ハイブリドプラスミドが、単一細胞の中で機能するよ
うＫなる。このようＫして、単一の組換体ハイブリドプ
ラスミドを有し、固体培地中でコロニーを形成し得る細
胞集団を得ることができる。目的の遺伝子含むコロニー
の同定が簡単であればあるほど、選択テストはより効果
的でかつ迅速になる。

特に、中性プロテアーゼの遺伝子を含む組換体ハイブリ
ドプラスミドの入り九形質転換コロニーの同定を容易に
するために、構造遺伝子に突然変異が起きているので中
性プロテアーゼを産生じ得ない枯草菌１Ａ３４１の突然
変異株を用いれば有利であると考えられている。細菌の
増殖に必要な成分にカゼインを加えた固型培地上で増殖
するこの突然変異株のコロニーは、肉眼テ見える典型的
なハローを形成しない。一方、親株ＢＧＳＣ１Ａ３４１
のコロニーの回ルにはハローが形成される。突然変異株
がカゼイン分解活性を欠くということは、中性プロテア
ーゼをコードする遺伝子に機能的な欠陥があるというこ
とである。

この発明において、これらの突然変異細胞が形質転換過
程に用いられると、その中に中性プロテアーゼをコード
する遺伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドが存在す
るかは、カゼインを含む固型培地の上でコロニーの回シ
にハローが現われるかどうかで分かる。

親株である枯草菌ＢＧＳＣ１Ａ３４１を突然変異させる
ことは、当該分野で知られている突然変異誘起物質のど
れか１つで処理すればよ込。特に、Ｎ−／チル−ジ−ニ
トロ−ニトロングアニジンを用いるのがよい。該化合物
での処理は、３７℃にて約３０分間緩衝液（ＰＨ６，０
）中で行なう。

表現屋として中性プロテアーゼが現われない遺伝子突然
変異は、形質転換によって枯草菌５Ｍ５００３の細胞に
伝達される。このようにしてｎｐｒ″″を得る。−枯草
菌ＳＭ８００３株は、７エデラル・すｔ−’ｙ−−コレ
クシ璽ン、ノース・セントラル・リーラ１ン、ノーすン
゛拳リージ冒ナル・リサーチ−センタ（ｔｈ＠Ｆ＠ｄ＠
ｒａｌ　Ｒｓ＋５ｓａｒｃｈ　Ｃｏ１１＠ｃｔｉｏｎｓ
Ｎｏｒｔｈ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｒｅｇｉｏｎ　＃　Ｎｏ
ｒｔｈｅｒｎ　Ｒ＠ｇｉｏｎａｌＲｅｓ＠ａｒｃｈ　Ｃ
ｅｎｔ＠ｒ　）　（イリノイ州、ペオリア）Ｋ１９８４
年９月４日、番号ＮＮＲＬ−Ｂ−１５８９７として寄託
された。

本発明によれば、突然変異種ａｐｒ−は枯草菌において
同種組換えを防止するｒｅｅＥ４突然変異の導入により
さらに修飾される。枯草菌の細胞中に外生ＤＮＡを導入
したとき、これが染色体ＤＮＡと同種の領ｋｊｔｔ−有
するとき、ｒ＠ｃＥ遺伝子生産物の存在下で組換えされ
易くなる。

この組換えは外生ＤＮＡ断片の細胞ゲノムへのるプラス
ミド中に同種ＤＮＡ断片が挿入されると、このプラスミ
ドは組換えにより、このＤＮＡ断片を放出することがで
きる。

しかし、ｒｅｃ−Ｅ遺伝子の機能が宿主細胞中でなる。

したがって、この発明により同種組換えを防止するｒｅ
ｃＥ４突然変異を突然変異種５Ｍ５００３　ｎｐｒ−中
に導入することが極めて有利であることが見出された。

ｒｅｃＥ４突然変異体は枯草菌種ＢＧＳＣ１Ａ４６の染
色体ＤＮＡから公知の方法により分離され、そののち形
質転換により突然変異種ＳＭ８００３　Ｋ導入される。

この得られた種は”　ｈｉｓ”ｅ　”ｌｅｕ’　ｅ　”
　ｍａｔ’５ｒｅａＥ４　ａ　ｎｐｒ−？−カーで特徴
づけられ、５Ｍ８１０８として指名されて、寄託番号順
Ｌ−Ｂ−１５８９８を以って１９８４年９月４日付けで
北部地区リサーチセンタのＦｅｄｅｒａｌ　Ｒ＠ｓ＠ａ
ｒｃｈ　Ｃｏ１１＠ｃｔｉｏｎ（−ｅオリア、イリノイ
州、米国）に寄託されている。

本発明によれば上述のようにして得られた雑種組換型プ
ラスミドはステージ（Ｃ）において、文献Ｍｏ１．　Ｇ
ａｎ、　Ｇｏｎｅｔ、皿、　（１９７９）、第２５１〜
２５８頁（Ｓｌｌ　Ｃｏｎｔ＠ｎｔ＊およびり、　Ｄｕ
ｂｎａｕ　）に記載された方法により゛被感染能力をも
たせた枯草菌ＳＭ８１０８の細胞中に導入される。

中性プロテアーゼについての遺伝子を持ったクローンは
カナマイシンおよびカゼインを添加この方法によればカ
ナマイシンに対する抵抗についての決定素を有する雑種
組換型プラスミドを含む細胞のみを得ることができ、こ
れからハロの存在で特定できる（第１図参照）中性プロ
テアーゼについての遺伝子を有する細胞を容易に分離す
ることができる。この中性プロテアーゼについての遺伝
子を含む雑種組換型グラスミドはついでハロにより囲ま
れた２つのクローンから分離される。このプラスミドは
ｐＳＭ　１２６およびｐＳＭ　１２７として指名され、
第２図に示す１０８　（ｐＳＭ　１２７　）と指名され
た上記プラスミドを分離させる細胞はそれぞれ寄託番号
ＮＮＲＬ−Ｂ−１５８９９およびＮＮＲＬ−Ｂ−１５９
００′ｔ−以って１９８４年９月４日付けで北部地区リ
サーチセンタのＦ＠ｄｅｒａｌ　Ｒｅｓ＠ａｒｃｈ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ｄオリア、イリノイ州、米国）
Ｋ寄託されている。

これら８Ｍ８１０８　（９８Ｍ　１２６　）およびＳＭ
Ｓ　１０８（ｐＳＭ　１２７　）についで炭素源、窒素
源、鉱物塩条件下で中性プロテアーゼが高収率で得られ
るい。

同じく窒素源としては有機および無機アンモニウム塩、
たとえば硫酸アンそニウム、塩化アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、こはく酸アンモニウム
、尿素等を通常用いることができる。さらに上記無機質
塩類としてはシん酸カリウム、ルん酸ナトリウム、硫酸
マグネシウム、炭酸カルシウム、硫酸第一鉄。

硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛等を吊込ることかできる。

これら塩類の使用量は通常の発酵プロセスにおりて用い
られる糧度でよい。本発明にお込てから、ろ過又は遠心
分離により取シ除かれ、得られた中性プロテアーゼは上
澄液中において。

により決定される。８Ｍ３１０８　（ｐＳＭ　１２６　
）およびＳＭＳ　１０８　（ｐＳＭ　１２７　）につい
て得られた値はそれぞれ１８９５（単位／４）および２
０９７（単位／−）であった。

この上澄液の両分をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　
）−ポリアクリルアミドのｒル上での分析をＬａｅｍｎ
ｌＩ　Ｕ、に、　（Ｎａｔｕｒｅ　２７７　、６８０（
１９７０）　）　−の方法でおこなった結果、これら双
方の種について、枯草菌ＢＧＳＣ１Ａ３４１　Ｋより得
られる中性プロテアーゼのものと同等の分子−１１，Ｍ
Ｗ３９．０ＯＯｔ−有するタンパク質の存在を示し念。

この中性プロテアーゼのコードを示す遺伝子のヌクレオ
チド連鎖が本発明により決定された。

この分析はプラスミドｐＳＭ　１２７中に存在する中性
プロテアーゼについての遺伝子の制限断片Ａ。

Ｍ１３ｒｎｐ８およびＭ１３ｍｐ９　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒから得られたもの）中に挿入し
、おこなわれた。

枯草菌の細胞外中性プロテアーゼの最初の１６のアミノ
酸の末端アミノ連鎖について、Ｐ、　Ｍａｒ＋、ｔｓａ
ｌａおよびＨ，ＺａｌｋｉｎはＪ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏ
Ｌ１４．４９３−５０１（１９８０）において、ＡＡａ
−Ａｔａ−Ａｔａ−Ｔｈｒ−Ｇｔｙ−８ｅ　ｒ−Ｇｔｙ
−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ｇｔｙ−Ａｔａ
−Ｔｈｒ−Ｖａｔ−Ｐｒｏであると報告している。

本発明者等が決定したヌクレオチド連鎖（第３図に示す
）をこのデータと比較すると、この中性プロテアーゼ中
の１６のアミノ酸の連鎖が上記ＤＮＡから得られたタン
ノ臂り質中においてアミノ酸残基２２２から始まる部分
に存在することが理解できる。このことは本発明者等が
クローン培養し、枯草菌ＳＭ８１０８として表わした遺
伝子が中性プロテアーゼのものであることを示唆してい
る。この酵素は枯草菌ＳＭ８１０８により先駆物質の形
で合成され、のちに２２１−２２２の位置で切断され、
成熟したプロテアーゼとすることができる。

実施例１ 突然変異種枯草菌ＳＭ８１０８の製造 中性プロテアーゼを形成する枯草菌ＢＧＳＣＩＡ３４１
の細胞を３７℃で一晩、攪拌下でｖｙ培って、下記組成
のもゆであった。

（組成） ・ＤＩＦＣＯイースト抽出液　　　　　５１１／ＪＩＩ
Ｈ２０１！ ののち１分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍａｒ・モデ
ル５５１８）を用い、光路１　ｃｍ　、　１　ｍｌ細胞
中における６　５０　ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、　）
を測定した。・０．７又は約０．７のＯ，Ｄ　６５０の
値で、培養物１０−をペックマ／（モデル４２２６）遠
心分離機により５．　ＯＯＯｒｐｍで２０分間遠心分離
した。ついで細胞を５−のトリスマレ−）（ＴＭ）緩衝
液で洗った。なおこの緩衝液（ｌｌ中）の組成は以下の
通りであった。

（組成） ト　　リ　　ス　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５Ｍマレイン
２　　　　　　　　　０．０５　ＭＦ　＠ＳＯ４φ７Ｈ
２００，２５ダ ｐＨ６，０ 次に、これをＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソ
グアニジン３００μｇ、〆ｄを含む１Ｍ緩衝液１０＋ｊ
中に再懸濁させ、これを攪拌下、３７℃にて３０分間保
った。

反応の終点において、懸濁液を遠心分離し、細胞を５ｄ
のＴＭバッファーで洗浄し、そしてそれぞれ全攪拌しつ
つ３７℃で１晩成長させた。

次に、それぞれの分割液に２００μ！の無菌グリセロー
ルを加え、ドライアイス−エタノール浴中で冷凍した後
−８０℃に維持した。

突然変異体を単離するために１種々の分割液を３７℃に
昇温し、次いでスピツィーツエン（５ｐｉｚｊｚｅｎ　
）　ミネラル培地で希釈し、それぞれの希釈液を１ｊあ
たり次の組成を有する培地皿に入れ念。

ＤＩＦ’ＣＯ栄養液　　　　　　　　　　　８１ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２００，２５ｇ ＫＣＬｌ　、９ ＤＩＦＣＯ寒天　　　　　　　　　　１５ＪＦＦｅＳＯ
４’７Ｈ２００，２８１ ＭｎＣＬ　　　　　　　　　　　　　１．２５１ｒ９Ｃ
ａ（Ｎｏ３）２１６４１Ｗ カゼイン　　　　　　　　　　　　　１０ＩＩＨ２０１
７ 培養皿ｔ−４８℃で１晩インキエーペートシて一ハロー
で囲まれていないコロニーを選択した。

選択された約１３，０００のコロニーの中で、わずか１
０のコロニーが中性プロテアーゼを産生じない突然変異
体であることがわかった。

これらの突然変異体の１つは、ＳＭＳ　１０４と名づけ
られた。

中性プロテアーゼ表現型に帰因する遺伝子突然変異は１
次いで形質転換によって、本発明者の研究所で単離され
た菌株Ｂ、サブチリス５Ｍ５００３のコンピテント細胞
に転換した。

公知の方法で単離され、かつ実施例２に記載された菌株
ＳＭＳ　１０４の゛染色体ＤＮＡを、１μ、９／Ｍの濃
度の、コンピテントとされ念菌株ＳＭＳ　００３の細胞
に加えた。次に適切な濃度の形質転換混合物をカゼイン
皿上に置いた。３７℃で１晩インキエペートし念後、得
られた５００（７）：ｆｆｌ：ｌニーのうちの１つは、
カゼイン活性のノヘローに囲まれたものではなかった。

突然変異ＲｓｃＥ４をＳＭＳ　１０７と命名されたこの
クローンに導入した。

Ｂ、サブチリスＢＧＳＣＩＡ４６　（ＴｒｐＣ２、ｒａ
ｃＥ４　。

Ｔｈｒ−５）の染色体ＤＮＡを抽出し、公知の方法で精
製し、濃度１μｌ／ｍｌでＳＭＳ　１０７のコンピテン
ト細胞に形質転換するために用いた。

次いで形質転換混合物を５０μｉ／ｒｒｔｌのヒスチジ
ンおよびロイシンが追加され念最小の培地（スビツィー
ツエンミネラル培地）に加えた。

このようにして、メチオニンなしで培地に生育可能なＳ
ＭＳ　１０７細胞が選別され念。

実施例２ ３Ｉ／のアーレンメイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　）
フランキエベートした。

懸濁液を激しく攪拌しつつ３７℃に維持した。

ｉＱ−キン　エル？　−（Ｐｅｒｋｉｎ　ｇｌｍａｒ　
）モデル５５１Ｓのスイクトルホトメーターを用いて光
学的密度（０，Ｄ、　）の測定を行な−、成育を確認し
た。

この場合、１ｃＩＩＬの光路で１１１Ｌｔの細胞におい
て６５０　ｎｍであった。０Ｄ６５ｏ値が１のとき、モ
デルＧＳ３のローターを具備するツルバール（Ｓｏｒｖ
ａｌｌ）遠心分離機により、培地’ｊ５．００　Ｏｒｐ
ｍで２０分間遠心分離し念。次に、細胞を０．１Ｍのテ
トラ酢酸エチレンジアミン（ＥＤＴＡ　）と０．０５　
ＭのＮａＣＬ　（ｐＨ６，９）の溶液１０ｄ中に再懸濁
し、その後、この懸濁液に０．１　ＭのＥＤＴＡ、　０
．０５　ＭのＮａＣ２（ｐＨ６，９）および１０〜／ｍ
のリソジム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇａｒ　Ｍａｎｈｅｉｍか
ら得られた）を含む溶液ＩＭを加えた。

懸濁液を攪拌しつつ３７℃１ｃ３０分間維持した。この
期間の終点でソジウムドデシルサルフェートの１０１溶
液１Ｎを加え、懸濁液を６５℃に１０分間維持した。こ
のようにして得た溶液に、あらかじめ０．１５　Ｍ　Ｎ
ａＣｔと０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムを含む溶液（
ＳＳＣ）中で３７℃で・３０分間インキエペートされた
プロナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｌｍか
ら得念）ヲ加え、最終濃度１■／−とした。

完全に清澄化するまで溶液？３７℃に維持し、最終濃度
ＩＭまでＮａＣｔｆ：加えた。

析出したＤＮＡ　ｆガラス棒上に採取し、３容量部の冷
エタノールを含む１００−のビーカー中に懸濁させ念。

次に、ＤＮＡを１０プのＳＳｃ　０．ＩＸに再懸濁させ
、ゆるやかに攪拌しつつ室温（２０〜２５℃）に１晩保
った。

この期間の終了時に、スイ臓ＲＮＡａ・（１０μＩ／／
ｍｌ　）およびＲＮＡＢ＠　ＴＬ　（５μユニット／−
）を加え、混合物を３７℃で３０分間インキエペートシ
タ。

混合物中に存在するタンノ４り１（ｓｓｃで飽和した等
量のフェノールで２回抽出して除去し、ＤＮＡ　ｔ−含
む溶液ｔ−８ＳＣバツフアーに対し透析した。

次に高分子量ＤＮＡ　（染色体ＤＮＡ　）を、１／１０
容量部の３　Ｍ　ＣＨＣＯＯＮＨ４，１崖のＥＤＴＡ　
（ｐＨ７，５）および０．５４容量部のイソデロノ母ノ
ールを加えることによって精製した。こうして得たＤＮ
Ａを回収し、　ＳＳＣバッファー中に再懸濁させて最終
濃度１ｍｐ／ｍｌとし、４℃に維持し友。

実施例３ Ｍｂｏｌによる染色体ＤＮＡの部分消化およびそのアラ
クシ１ネー・シ嘗ン 実施例２に示す方法により得た染色体ＤＮＡ１００　ｔ
ｔｌを、１００ユニツトの酵素Ｍｂｏｌ（ＢＲＬ）の存
在下で、トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　、　１００
威のＮａＣ２および６ｍＭのＭｇＣｌ２０６ｍＭ溶液ｌ
ｄ中に懸濁させた。

３７℃で３０分間反応を実施し、次いでブロックし、１
０分間温度ｔ−６５℃に保った。。

部分的に消化したＤＮＡを含む溶液を３つに分割１．．
３０　ｍＮのトリス−（ヒドロキンメチル）アミノメタ
ン塩酸塩（トリス−ＨＣＬ　）　（ｐＨ８，１）。

１０ｍＭのＫＤ’ｒＡ　、　Ｉ　ＭのＮａＣ２の存在下
で、プリフォームされた１０−４０１のサッカロース密
度勾配上に積層させ、そしてペックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎｎ　）型５Ｗ２７遠心分離機によ、！７２５．００Ｏ
ｒｐｍで２０時間遠心分離した一 種・々の長さの染色体ＤＮＡのフラグメントを含む２ｄ
の７ラクシ四ンを回収し念。それぞれのフラクシヨンを
適切な分子量標準を用すたアガローゼグルにより分析し
、個々のフラクシ璽ン中罠存在するＤＮＡ　フラグメン
トの長さを決定した。

１、５　Ｘ　１０３〜４　Ｘ　１０３塩基対＋（ｂｐ）
の寸法を有するＤＮＡフラグメントを含む７ラクシ冒ン
を一緒にし１等量の水で希釈した。この溶液に２容量部
の水を加えた。溶液をドライアイス−エタノール浴（Ｔ
＝−８０℃）中で１５分間維持した。析出したＤＮＡを
１０．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離して混合物から分離し
た。

得念ＤＮＡを７０係のエタノールで洗浄し、真空乾燥し
た。

実施例４ 中性プロテアーゼのための遺伝子を含む／）イブリアド
ブラスミドの構造 カナマイシンに対する耐性のための決定物質を含む５μ
ＩのプラスミドＰＵＢ　１１０　（ＢＧＳＣＩＦ５　）
を、６ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　、　１
００　ｍＶのＮａＣＬおよび６ｍＭのＭｇＣ１，ｌ’を
含む５０　ｔｉｊの溶液中で、限定酵素ＢａｍＭｌ　（
ＢＲＬ　Ｋよ〕供給）を用いて、３７℃で１時間直線状
にした。

実施例３に−示す方法で得た５μＩの１．５Ｘ１０３〜
４　Ｘ　１０　　ｂ、ｐ−の長さの染色体ＤＮＡ　フラ
グメントと上述のｐＵＢ　１１０５　ａｌとを、２０　
ｍＭのトリス−ＨＣＬ　（ＰＨ７，６）　、　１０　ｍ
ＭのＭｇＣｌ２．１０城のジチオトレイトールおよび０
．６　ｍＭのアデノシントリフォスフニー）　（ＡＴＰ
　）を含す溶液１００μ！中で混合し、ＤＮＡ　ＩＪ　
ｆｆ−ゼＴ４の１０Ｕを用すてリンクさせた。混合物を
室温（２０〜２５℃）で３時間保持した。

実施例５ Ｂ、サブチリスＳＭ８１０８細胞の形質転換Ｂ、サブチ
リスＳＭ８１０８の細胞をデクブナウ（Ｄｕｂｎａｕ　
）他（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ、　Ｍｏｔ、　ＢｉｏＡ、　）　５６　、２０９−
２２１．１９７１）の方法によって形質転換させ喪。

実施例４と同様にして得た連結反応混合物２０μ！ヲ、
コンピテントの状態にされたＢ、すブチリスＳＭＳ　１
０８細胞１ｄを形質転換させるために用い念。

上記形質転換混合物を３７℃で３０分間保ち。

実施例１に組成が示されているガゼイン培地を含むプレ
ート上に散布した。

上記プレートを３７℃で１６時間インキエペートシ念。

この時間の終シに、コロニーが生成し、そのいくつかは
ノーシ斗よりて取）囲まれていた。これらは、カナマイ
シン耐性の決定基と、存在するカゼインの酵素加水分解
を誘起する細胞外中性プロテアーゼ用遺伝子とを有する
ハイブリドプラスミドを含有するＢ、サブチリス５Ｍ８
１０８のコロニーであった。１３０，０００のトランス
フォーマントのうち、１２個がカゼイン分解（ｅａａｓ
ｉｎｏｌｙｔｉｃ　）活性の・ヘシ≦よって取、りＴＭ
ｉまれていた。

実施例６ 実施例５で得たカゼイン分解活性を有する２つのトラン
スフォーマントから、グリフ・ツアン（Ｇｒｙｃｚａｎ
　）他の方法（ジャーナル、オデ、２４クテリオロジ−
１３４，３１８，３２９−１９７８）によってバイブリ
ドシラスミドｐＳＭ１２６およびｐＳＭ　１２７　（こ
の制限地図は第２図に示しである）１単離した・ これらプラスミドは約２４００の塩基対（ｂｐ）のＤＮ
Ａの共通領域を有していた。こうして単離されたプラス
ミドＢ、サブチリスＳＭ８１０８のコンピテント細胞に
別々に再導入した。

この形質転換混合物を、３７℃で３０分間増殖させた後
、既に述べた組成を有するカゼイン培地を含むプレート
上に散布し九。３７℃で１６時間保持した後、カナマイ
シン耐性を有する全てのトランス７オーマントが蛋白分
解活性を有するへ艷ハよって取り囲まれていた。

このことは、２つのハイツリドブラスミドｐＳＭ　１２
６およびｐＳＭ　１２７上に細胞外プロテアーゼをフー
ドする遺伝子が存在することを証明するものである。

同一の実験において、Ｂ、サブチリスＳＭ８１０８細胞
をカナマイシン耐性決定基を有するシラスミドｐＵＢ　
１１０によって形質転換さ讐た。

カゼインを含有する培地を含むプレート上に散布したと
ころ、形質転換された細胞は３７℃で１６時間経過後、
　−’　ｋＲ影形成見られなかった。このことは、これ
らトランスフォーマントがカゼイン分解活性をコードす
る遺伝子を持念ないことを示している。

実施例７ び特性決定 ｖＹ培地１０−を収容する１００２１１４エルレンマイ
ヤーフラスコ４個（このうち初めの３個にはカナマイシ
ン５μｇ／−を加えである）に、それぞれ、Ｂ６サブチ
リスＳＭＳ　１０８　（ｐＳＭ　１２６　）　。

８Ｍ８１０８　（ｐＳＭ　１２７　）　、　ＳＭＳ　ｔ
ｏｅ　（１）ＵＢ　１１０　）。

およびＢ、サブチリスＢＧＳＣ１Ａ３４１　ｔ−接種し
た。

これらフラスコを激しく攪拌しながら３７℃で２４時間
保持し念。

２４時間後、遠心によって細胞を培地から取〕出し、上
置液を、２ｍＭの酢酸カルシウムを含有する１　０ｍＭ
のトリス−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ７，５）Ｋ対して４℃で
２４時間透析した。

培養ブイヨン中の各棟によって再生される酵素の活性を
測定するために、各上澄液１００μを２ｍＭの酢酸カル
シウムを含む１０ｒｎＭのトリス−Ｈｃｔ緩衝液（Ｔｉ
Ｉ４．５）で適当に稀釈し。

５０ｍＭのトリス−ＨＣ″を緩衝液中０．６憾カゼイン
溶液（メルク）０．５ｍ７と混合した。

この混合物ｆ：３７℃で３０分間インキエペートした。

加水分解されなかったカゼインを、室温（２０ないし２
５”Ｃ）で３０分間、０．１１　Ｍのトリクロロ酢酸、
０．３３Ｍの酢酸および０、２２　Ｍの酢酸ナトリウム
を含む溶液０．５１を添加することによって沈殿させた
。

３０分後、沈殿物を、１０．００　Ｏｒｐｍで１０分間
の遠心によって分離し、上澄液の吸光度を２７５　ｎｍ
でｌＪ定した（ペルキン鳴エルマー囃モデル５５１８分
光光度計を使用）。

プロテアーゼ単位は、上に述べた条件下。

３７℃で１分以内に、１μｉのトリプシンと透過の２７
５　ｎｍにおける吸光度の増加を引き起す酵素の量とし
て定義した。

個々の株によって産生されたプロテアーゼの特性決定は
、同一溶液中で、中性プロテアーゼの活性およびセエイ
ンプロテアーゼ活性全別々に測定することＫよっておこ
なった。

初めのものは、上澄液ｆ　５　ｍＭのＥＤＴＡの存在下
、０℃で１時間予めインキユベートすることによって抑
制された。２番目のものは、上澄液ｆ　１　ｍＭのフェ
ニルメチルスルホニルフルオリト（ＰＳＭＦ　）の存在
下、０℃で１時間維持することによって抑制された。

種々の株についての上澄液の分析結果を表１に示す。

表　　　１ 培地中の蛋白活性　（単位／ｄ） Ｉ　Ｎ、Ｄ、　　・・・　測定不能 多量の中性プロテアーゼの存在下では、セリンプロテア
ーゼのために活性を測定することはできない 表１のデータから、本発明の株は、元の株よりも５〜６
倍の収率で中性プロテアーゼを産生ずることがわかる。

【図面の簡単な説明】

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）中性プロテアーゼをコードする遺伝子を含む
   組換体ハイブリドプラスミドを構成し、ｂ）枯草菌の突
   然変異株を調製し、 ｃ）前記組換体ハイブリドプラスミドを前記突然変異体
   中に導入し、 ｄ）ハイブリドプラスミドを含むクローンを単離し、 ｅ）前記クローンを液体培地中で培養し、 ｆ）前記培地中から中性プロテアーゼを単離する工程か
   ら成ることを特徴とする中性プロテアーゼの産生法。
2. （２）ア）クロモゾーム（染色体）ＤＮＡを供与体微生
   物から単離および精製し、 イ）前記ＤＮＡを制限酵素で部分的に切断し、ウ）適当
   な長さ１．５ないし４×１０＾３塩基対のクロモゾーム
   ＤＮＡのフラグメントを単離し、エ）あるプラスミドを
   特異的制限酵素で切断し、 オ）ウ）段階で得られたＤＮＡフラグメントとエ）段階
   で得られた直鎖ＤＮＡとをリガーゼにより結合して、組
   換体ハイブリドプラスミドを調製することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）前記ア）段階の供与体微生物が枯草菌ＢＧＳＣ１
   Ａ３４１である特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）前記イ）段階の制限酵素がＭｂｏＩである特許請
   求の範囲第２項記載の方法。
5. （５）前記ウ）段階でのフラグメントの単離を、ショ糖
   濃度勾配法により行う特許請求の範囲第２項記載の方法
   。
6. （６）前記エ）段階で用いられるプラスミドがｐｕＢ１
   １０（ＢＧＳＣ１Ｅ６）であり、制限酵素がＢａｍＨＩ
   である特許請求の範囲第２項記載の方法。
7. （７）前記オ）段階で用いられるリガーゼが、ＴＡ　Ｄ
   ＮＡリガーゼである特許請求の範囲第２項記載の方法。
8. （８）前記組換体プラスミドが、プラスミドｐＳＭ１２
   ６およびｐＳＭ１２７である特許請求の範囲第１項ない
   し第７項のいずれか１項に記載の方法。
9. （９）プラスミドｐＳＭ１２６およびｐＳＭ１２７が第
   ２図の制限酵素切断地図で示される特許請求の範囲第７
   項記載の方法。
10. （１０）前記ｂ）段階の突然変異株には、中性プロテア
    ーゼの構造遺伝子における突然変異、およびｒｅｃＥ４
    突然変異が起きている特許請求の範囲第１項記載の方法
    。
11. （１１）Ａ）中性プロテアーゼを産生し得る株を突然変
    異誘起物質で処理し、 Ｂ）枯草菌のある株に遺伝子を移入し、 Ｃ）ｒｅｃＥ４突然変異を、Ｂ）段階で得られる突然変
    更株に導入する工程により突然変異が生じる特許請求の
    範囲第１０項記載の方法。
12. （１２）中性プロテアーゼを産生する株が、枯草菌ＢＧ
    ＳＣ１Ａ３４１である特許請求の範囲第１１項記載の方
    法。
13. （１３）前記Ａ）段階の突然変異誘起物質が、Ｎ−メチ
    ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンである特許
    請求の範囲第１１項記載の方法。
14. （１４）前記Ｂ）段階で用いられる株が、枯草菌ＳＭＳ
    ００３（ＮＲＲＬ…）である特許請求の範囲第１１項記
    載の方法。
15. （１５）Ｃ）段階でのｒｅｃＥ４突然変異の導入を、形
    質転換により行なう特許請求の範囲第１１項記載の方法
    。
16. （１６）ｒｅｃＥ４突然変異を、枯草菌ＢＧＳＣ１Ａ４
    ６から単離する特許請求の範囲第１５項記載の方法。
17. （１７）前記突然変異株が、枯草菌（ＳＭＳ１０８）で
    ある特許請求の範囲第１０項ないし第１６項のいずれか
    １項に記載の方法。
18. （１８）前記ｃ）段階での組換体ハイブリドプラスミド
    の導入を、形質転換により行なう特許請求の範囲第１項
    記載の方法。
19. （１９）前記ｄ）段階でのハイブリドプラスミドを含む
    クローンの単離を、カナマイシンとカゼインが添加され
    た培地上に播種することによって行なう特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
20. （２０）選択されたクローンが、枯草菌ＳＭＳ１０８（
    ｐＳＭ１２６）および枯草菌ＳＭＳ１０８（ｐＳＭ１２
    ７）である特許請求の範囲第１９項記載の方法。
21. （２１）前記段階ｃ）での増殖を、液体培地中、好気条
    件下、窒素、炭素、鉱物塩の存在下にて２０℃ないし４
    ０℃の温度範囲で行なう特許請求の範囲第１項記載の方
    法。