JPH0113359B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なプラスミドpSP−S1及びその製
造法に関する。 ペデイオコツカス属菌には、醤油、味噌等の醸
造、漬物類の熟成もしくは発酵、ソーセージ等の
畜産加工品の製造等に関与する有用微生物群が数
多く含まれているが、本属菌にプラスミドが存在
することは、従来全く知られていなかつたのが実
情である。 そして、本属菌よりベクターとして利用可能な
プラスミドを単離することは、組み換えDNA技
法による本属菌の育種・改良に必要な宿主−ベク
ター系を開発する上などから極めて重要な課題で
ある。 そこで、本発明者等は、ペデイオコツカス属の
微生物から遺伝的情報の担体として利用可能なプ
ラスミドを分離すべく種々検討した結果、上記属
の微生物より分子量が1.55±0.05Kbp（キロベース
ペアー）と極めて小さく、かつ遺伝的情報の担体
として用いる際、極めて有利な性質を示す新規プ
ラスミドpSP−S1を単離することに成功し、本発
明を完成した。 すなわち、本発明は、分子量が1.55±0.05Kbp
（キロベースペアー）であり、下記の制限酵素開
裂地図 によつて特徴づけられる新規なプラスミドpSP−
S1であり、また本発明はペデイオコツカス属に
属し、プラスミドpSP−S1を有する微生物を培地
に培養し、培養物からその菌体を集菌したのち溶
菌し、次いで溶菌物からプラスミドpSP−S1を単
離することを特徴とする新規なプラスミドpSP−
S1の製造法である。 以下、本発明を具体的に説明する。 先ず、本プラスミドを製造するにあたり、使用
される菌としては、ペデイオコツカス属に属し、
プラスミドpSP−S1を有する微生物であれば如何
なる菌でも良く、また、これらの菌の変種もしく
は変異株でもよい。 そして、ペデイオコツカス属に属し、プラスミ
ドpSP−S1を有する微生物の具体例としては、例
えばペデイオコツカス・ハロフイルス
（Pediiococcus halophilus）Ｒ−１等が挙げられ
る。 上記ペデイオコツカス・ハロフイルスＲ−１
は、本発明者等が、醤油諸味より新たに検索して
得た菌株で、その菌学的性質は、以下に示す通り
である。 ペデイオコツカス・ハロフイルスＲ−１の菌学的
性質 (a) 形態〔本菌株の生育は、肉汁のみでは不良で
あるため肉汁培地に、更にグルコース1.0％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.5％（Ｗ／Ｖ）及び食
塩５％（Ｗ／Ｖ）を添加した培地を用いた。〕 細胞の大きさ：球菌で直径0.6〜0.8μ、テ
トラツド（Tetrad）を作り、二連状のもの
も有り。 細胞の多形性の有無：− 運動性の有無：− 胞子の有無：− グラム染色性：＋ 抗酸性：なし (b) 次の各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：表面には生育せずに、
内部に生育し、白色ピンヘツドコロニーを形
成する。色素は生成せず。 肉汁寒天斜面培養：表面には生育せず。 肉汁液体培養：生育をはじめると全体が一
様に濁り、次いで白色の沈渣を形成する。な
お液表面には生育せず。 肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺孔に沿つて一
様に生育し、ゼラチンは液化しない。 リトマス・ミルク：中性。 (c) 生理学的性質 硝酸塩の還元：− 脱窒反応：− MRテスト：＋ VPテスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成：− デンプンの加水分解：− クエン酸の利用：−（Koserの培地） 無機窒素酸の利用：− 色素の生成：− ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− カタラーゼ：− 生育の範囲：PH5.5〜9.0の範囲で生育し、
最適PHは7.0、温度は20〜30℃で良く生育し、
45℃以上では生育しない。 酸素に対する態度：通性嫌気性で、むしろ
嫌気的条件を好む。 Ｏ−Ｆテスト（イーストエキス添加）：発
酵型 下記の糖類から酸及びガスの生成の有無 【表】 【表】 (d) その他の諸性質 糖類の分解生成物：グルコースを発酵し、
１モルのグルコースから約２モルのＬ−乳酸
を生成する。 アルギニンの分解：分解する。 塩化ナトリウムの耐性：塩化ナトリウム５
〜６％で最も良く生育し、塩化ナトリウム20
％を含む培地でも生育し、強い耐塩性を有す
る。 その他 本菌株の特徴は、染色体DNA以外に、細胞中
にプラスミドpSP−S1を保有することである。 上記した本菌株の諸性質を、バージーズ・マニ
ユアル・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリ
オロジー（1974年、第８版）における分類基準に
照した結果、該菌株は塩化ナトリウムに対し強い
耐性を有すること、及びPH5.5〜9.0の範囲で生育
すること等により、ペデイオコツカス・ハロフイ
ルスに属するものと認められたが、Ｌ−アルギニ
ンを分解しＬ−オルニチンを生成すること、及び
グリセリンより酸を生成すること等から、従来の
ペデイオコツカス・ハロフイルスに属する菌株と
は異なり、ペデイオコツカス・ハロフイルスに属
する新菌株であると判断された。 なお、本ペデイオコツカス・ハロフイルスＲ−
１は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第6951号（FERM Ｐ−6951）として寄託さ
れている。 次に、ペデイオコツカス属菌からプラスミド
pSP−S1を製造するための菌体培養法としては、
如何なる培養法でも良いが、例えば液体培養法を
採用するのが望ましい。 本発明に使用される培地としては、ペデイオコ
ツカス属に属し、プラスミドpSP−S1を有する微
生物が生育することの可能な培地であれば、如何
なるものでも良く、例えば、通常の乳酸菌の培養
に用いられる培地が使用される。 本発明に用いられるペデイオコツカス属菌は、
アミノ酸又はビタミン類等に対し、多くの栄養要
求性を有する場合が多く、例えばグルコース、シ
ユークロース、グリセリン、デキストリン、糖
蜜、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素
源、及びカルシウム塩、マグネシウム塩、カリウ
ム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄
塩、コバルト塩等の無機塩類のみより成る培地で
はほとんど生育しないことが多いので、これらの
培地成分の他に、更に例えばアミノ酸、ビタミン
類、酵母エキス、肉エキス、麹汁、ポリペプト
ン、蛋白質部分加水分解物等より選ばれた１種以
上を適宜添加したものが好適に用いられる。 本発明に用いられるペデイオコツカス属菌は、
乳酸菌であるため、培養中に培地に多量の乳酸を
生成し、生育が抑制され易い。従つて、効率良く
菌体を得るためには乳酸による培地のPHの低下を
極力防止しつつ培養することが好ましい。 そして、培地PHの低下を低減あるいは防止する
方法としては、例えば培地にトリス緩衝液、ヘペ
ス（HEPES）緩衝液等の緩衝液を添加する方
法、或いは培養途中の培地に、水酸化ナトリウ
ム、炭酸ナトリウム等のアルカリを添加して乳酸
等の酸類を中和しつつ、培地PHを調整する方法等
が挙げられる。 なお、培地の初発PHは、例えば約4.5〜8.0、好
ましくは約6.5〜7.5程度に調整し、培養温度は、
通常15〜42℃、好ましくは約25〜35℃程度で、１
〜７日間、好ましくは２〜３日間程度培養する。
そして、非好気的条件下、例えば液体静置培養法
により、培養することが好ましい。 次いで、このようにして得た培養物より菌体を
集菌したのち溶菌し、溶菌物（lysate）を得る。 培養物より菌体を集菌する方法としては、如何
なる方法でも良く、例えば通常の遠心分離法もし
くは濾過法等が挙げられる。なお、集菌した菌体
には培地成分等が付着しているので、必要により
通常の方法により培地成分等を洗浄して除去する
ことが望ましい。 また、集菌して得た菌体を溶菌する方法として
は、本発明に用いられる菌体を溶菌し、プラスミ
ドDNAを完全な形で抽出することの出来る方法
であれば、如何なる方法でも良く、例えばリゾチ
ーム等の溶菌酵素剤を用いて菌体を溶菌する方法
等が好ましい。なお、この際、超音波処理等の物
理的方法により菌体を溶菌しても差し支えない。 なおまた、前記酵素剤中には、プラスミド
DNAを分解するDNA分解酵素等、特に障害とな
る酵素成分等が混入されていないことが必要であ
る。 更に、必要により前記酵素剤の他に、プロテア
ーゼ等の酵素剤、ラウリル硫酸ナトリウム等の界
面活性剤等を併用添加するか、或いは凍結融解処
理等を施すことにより、本発明に用いられる菌体
の溶菌を一層容易にすることが可能である。 そして、このようにして得た溶菌物からプラス
ミドpSP−S1を単離し、本発明のプラスミドpSP
−S1を得る。 先ず、溶菌物からプラスミドpSP−S1を含む
DNA区分を精製するには、例えば溶菌物を、通
常のフエノール抽出処理、除蛋白処理、プロテア
ーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理等を施して精製
すれば良い。 次に、本プラスミドを含むDNA区分からペデ
イオコツカス属菌のプラスミドpSP−S1を単離す
る方法としては、如何なる方法でも良く、例えば
アガロースゲル電気泳動等、密度勾配遠心法等が
挙げられる。 なお、前記遠心操作において用いられる塩化セ
シウム溶液の比重は、屈折率（Reflactive
Index）≒1.384〜1.393であることが必要で、好
ましくは1.387〜1.389である。 本発明プラスミドpSP−S1は、分子量が極めて
小であり、コピー数も数多く、更に、複数の制限
酵素に対し、夫々１個所のみの開裂部位を有して
いるため、目的とする遺伝情報の組み込みが著し
く容易であり、これをそのまま、或いは適宜誘導
し、有用なベクターとして開発することが可能で
ある。更に、本発明プラスミドそのものを宿主微
生物に取り込ませ、本発明プラスミド自体の遺伝
的性質を発現させることも可能である。 また、本発明プラスミドをベクターとして用
い、その開裂部位に、目的とする遺伝情報、例え
ばキシロースイソメラーゼ遺伝子、アミラーゼ遺
伝子、インターフエロン違伝子等を組み込み、組
み換え体DNAを調製し、これを用いて適当な宿
主微生物を形質転換し、得られた微生物を培養す
ることにより、目的とする有用な物質を、菌体の
内外に多量生成蓄積せしめ、この培養物より目的
とする物質を分離、精製し、有用物質を生産する
こも可能である。 更に、本発明プラスミドは、乳酸菌であるペデ
イオコツカス属菌起源のプラスミドであるため、
乳酸菌を宿主とする系を始め、他のグラム陽性
菌、例えばバチルス（Bacillus）属、コリネバク
テリウム（Corynebacterium）属等の細菌群等の
ベクターとしても使用可能性を有する。 以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明す
る。 実施例 ペデイオコツカス・ハロフイルス
（Pediococcus halophilus）Ｒ−１からプラス
ミドpSP−S1の単離 トツド・ヘヴイツト・ブロス（Todd Hewitt
Broth）（デイフコ社製、培地の商標名）３％
（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム５％（Ｗ／Ｖ）及びト
リスアミノメタン50ｍＭからなる組成の液体培地
（PH7.5）３mlをキヤツプ付試験管に分注したもの
を、常法により滅菌し、次いで、これにペデイオ
コツカス・ハロフイルスＲ−１（微工研菌寄第
6951号、FERM Ｐ−6951）を接種したのち、温
度30℃で48時間静置培養し、培養物を得た。 次いで、前述したと全く同一組成の培地１を
三角フラスコ（容量：３）に分注し、これを常
法により滅菌したものに、前記培養物の全量を接
種し、これを温度30℃で48時間静置培養し、得ら
れた培養物を8000r.p.m.で15分間遠心分離して菌
体を集菌し、滅菌水を用いて２回洗浄して湿潤菌
体を得た。 そして、上記湿潤菌体を25％（Ｗ／Ｖ）シユー
クロース液〔50ｍＭトリス緩衝液にEDTA（エチ
レンジアミンテトラアセテート）を１ｍＭ濃度と
なる如く溶解したもの（PH7.5）にシユークロー
スを25％（Ｗ／Ｖ）となる如く溶解した溶液〕20
mlに懸濁し、これにリゾチーム液〔上記25％
（Ｗ／Ｖ）シユークロース液にリゾチム（シグム
社製）濃度が150mg／mlとなる如く溶解した溶液〕
２mlを混和したものを、温度37℃で30分間ゆるく
振とうしつつ反応を行ない反応終了液を得た。 この反応終了液に、ジエチルパイロカーボネー
ト100μ及びTESS溶液〔10ｍＭトリス緩衝液、
10ｍＭ EDTA、100ｍＭ塩化ナトリウム及び0.2
％（Ｗ／Ｖ）SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）（PH
7.5）〕を夫々添加したものを、室温で15分間振と
うし、更に、これに5M塩化ナトリウム６mlを添
加したのち、氷上で30分間冷却し、次いで、これ
を15000r.p.m.で30分間遠心分離し、上清を採取
した。 更に、この上清に、これと等容量のフエノール
を添加し、充分撹拌したものを、8000r.p.m.で30
分間遠心分離して水層を採取し、これに、２倍量
の冷却エタノールを添加したものを温度−20℃で
一夜放置したのち、更に8000r.p.m.で30分間遠心
分離して沈殿物を採取した。 次いで、この沈殿物より残存するエタノールを
完全に除去したものを、0.1Mトリス緩衝液／50
ｍＭ EDTA（PH8.0）10mlに溶解し、これに0.1
mlのリボヌクレアーゼＡ（５mg／ml、シグマ社製）
を混和し、温度30℃で20分間反応させたのち、反
応終了液に、該終了液の1/10容量の10％ラウリル
硫酸ナトリウム及び該終了液の1/20容量のプロテ
イナーゼＫ（２mg／ml、シグマ社製）（予め、温度
37℃で15分間放置したもの）を順次混和し、温度
50℃で１時間反応を行ない反応終了液を得た。 この反応終了液に、等容量のフエノールを添加
し、充分混合したものを、3000r.p.m.で10分間遠
心分離して水層を採取し、これに等容量のエーテ
ルを混和させたものを、3000r.p.m.で10分間遠心
分離して水層を採取し、この水層に、この1/10容
量の3M酢酸ナトリウム溶液（PH7.5）を添加し、
更に2.5倍の冷却エタノールを混和したのち、温
度−20℃で１時間以上放置したものを12000r.p.
m.で10分間遠心分離して沈殿物を採取した。 次いで、EDTAを５ｍＭ含有する25ｍＭトリ
ス緩衝液（PH7.5）１mlに、前記沈殿物に減圧下
で残在するエタノールを完全に除去したものを溶
解し、得られた溶液に、固体の塩化セシウム及び
エチジウムブロマイド溶液（0.5mg／ml）１mlを
夫々混和し、この溶液の密度が屈折率
（Reflactive Index）≒1.388となる如く調整した
溶液を超遠心分離機（日立製作所製、SCP−55H
型）により温度15℃、37000r.p.m.で42時間遠心
分離を行なつたところ、プラスミド区分は紫外線
（波長：302nｍ）下で螢光バンドとして検出され
た。 そして、該螢光バンドを注射器を用いて採取
し、このバンド画分を、上述と全く同一条件で再
度超遠心分離を行ない、螢光バンドを注射器によ
り採取してプラスミド画分を得た。 以上の如くして得たプラスミド画分に、この画
分と等容量のｎ−ブタノールを混和してエチジウ
ムブロマイドを抽出除去し、得られた水層区分を
TES溶液〔20ｍＭトリス緩衝液、10ｍＭ塩化ナ
トリウム、10ｍＭ Na−EDTA（PH7.5）〕に対し
て２回透析を行ない、目的とするプラスミドpSP
−S1を約0.5mg得た。 次いで、プラスミドpSP−S1を、EcoＲ、
Hind、BamＨ、Xho、Pvu、Sal、
Bgl及びPst〔いずれも宝酒造(株)製、制限酵
素〕を夫々用い単一消化及び二重消化して得られ
たDNA断片をアガロースゲル電気泳動法により
移動度パターンを分析し、得られた移動度パター
ンと、λDNAを、前記Hindにより消化して得
られたDNA断片の標準移動度パターンとを対比
することによつて得られた分子量は、1.55±
0.05Kbp（キロベースペアー）であり、〔ジヤーナ
ル・オブ・モレキユラー・バイオロジー
（Journal of Molecular Biology）第98巻、551
〜564頁、1975年参照〕、また、制限酵素開裂地図
は、以下に示すとおりである。 そしてプラスミドpSP−S1は、上記した制限酵
素に対し下記第１表に示す開裂個所数を有してい
る。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分子量が1.55±0.05Kbp（キロベースペアー）
   であり、下記の制限酵素開裂地図 によつて特徴づけられる新規なプラスミドpSP−
   S1。 ２ ペデイオコツカス属に属し、プラスミドpSP
   −S1を有する微生物を培地に培養し、培養物か
   らその菌体を集菌したのち溶菌し、次いで溶菌物
   からプラスミドpSP−S1を単離することを特徴と
   する新規なプラスミドpSP−S1の製造法。