JPH0321152B2 - - Google Patents
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- JPH0321152B2 JPH0321152B2 JP57185435A JP18543582A JPH0321152B2 JP H0321152 B2 JPH0321152 B2 JP H0321152B2 JP 57185435 A JP57185435 A JP 57185435A JP 18543582 A JP18543582 A JP 18543582A JP H0321152 B2 JPH0321152 B2 JP H0321152B2
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- Japan
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- plasmid
- dna
- streptomyces
- molecular weight
- pof011
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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Description
本発明は組換DNA遺伝子工学に有用な新規な
放線菌由来のプラスミドに関する。 近年遺伝子操作技術を用いて種々の遺伝子
DNAにつき、その構造及び機能を解析したり、
特定の有用な構造遺伝子をベクターに組み込ませ
て異種DNAを作成し、これを宿主細胞系又は他
の微生物細胞系に取り込ませて、例えばインシユ
リン、ソマトスタチン等の動物ホルモンや、抗生
物質、酵素等の有用な代謝生成物を製造する試み
が種々研究開発されつつある。これらの組換え
DNA技術の多くは、宿主細胞として大腸菌
（Escherichiacoli）を使用するものである。一方
放線菌殊にストレプトミセス（Streptomyces）
属放線菌は、抗生物質を始めとする多種多様な二
次代謝産物を生産する菌群としてよく知られてお
り、、之等放線菌の抗生物質産生にプラスミド遺
伝子が関与することが最近明らかとなり、該放線
菌でのプラスミドの研究が急速に進展してきてい
る。 本発明はこの放線菌由来の新しいプラスミドを
提供するものである。 以下本発明プラスミドの製造法につき詳述す
る。 本発明プラスミドは、徳島県小松島市の土壌よ
り新たに分離され、ストレプトミセス・フアルボ
ビリデイスOFR1237（Streptomyces fulvoviridis
OFR1237）と命名された微生物から得ることが
できる。該微生物OFR1237株は、以下の菌学的
性質を示す。 （） 形態学的特徴 本菌株OFR1237を各種寒天培地上で28℃、２
週間培養すると気菌糸は単純分枝をなし、、胞子
鎖は波状をなす。培地によつては直線状が認めら
れる場合がある。胞子は10個以上連鎖をなしてお
り、その形態は球形で（0.6×1.1〜0.6×1.1）の
大きさもしている。胞子の表面構造は平滑状をな
している。鞭毛胞子及び胞子のうは認められな
い。 （） 各種培地に於ける生育状態 各種培地に於ける生育状態を下記第１表（28
℃、２週間培養後）に示す。色調の記載はカラ
ー・ハーモニー・マニユアル（Color Harmony
Mannual）〔コンテイナー・コーポレーシヨン・
オブ・アメリカ，シカゴ（Container
Corporation of America，Chicago）〕を参照し
た。
放線菌由来のプラスミドに関する。 近年遺伝子操作技術を用いて種々の遺伝子
DNAにつき、その構造及び機能を解析したり、
特定の有用な構造遺伝子をベクターに組み込ませ
て異種DNAを作成し、これを宿主細胞系又は他
の微生物細胞系に取り込ませて、例えばインシユ
リン、ソマトスタチン等の動物ホルモンや、抗生
物質、酵素等の有用な代謝生成物を製造する試み
が種々研究開発されつつある。これらの組換え
DNA技術の多くは、宿主細胞として大腸菌
（Escherichiacoli）を使用するものである。一方
放線菌殊にストレプトミセス（Streptomyces）
属放線菌は、抗生物質を始めとする多種多様な二
次代謝産物を生産する菌群としてよく知られてお
り、、之等放線菌の抗生物質産生にプラスミド遺
伝子が関与することが最近明らかとなり、該放線
菌でのプラスミドの研究が急速に進展してきてい
る。 本発明はこの放線菌由来の新しいプラスミドを
提供するものである。 以下本発明プラスミドの製造法につき詳述す
る。 本発明プラスミドは、徳島県小松島市の土壌よ
り新たに分離され、ストレプトミセス・フアルボ
ビリデイスOFR1237（Streptomyces fulvoviridis
OFR1237）と命名された微生物から得ることが
できる。該微生物OFR1237株は、以下の菌学的
性質を示す。 （） 形態学的特徴 本菌株OFR1237を各種寒天培地上で28℃、２
週間培養すると気菌糸は単純分枝をなし、、胞子
鎖は波状をなす。培地によつては直線状が認めら
れる場合がある。胞子は10個以上連鎖をなしてお
り、その形態は球形で（0.6×1.1〜0.6×1.1）の
大きさもしている。胞子の表面構造は平滑状をな
している。鞭毛胞子及び胞子のうは認められな
い。 （） 各種培地に於ける生育状態 各種培地に於ける生育状態を下記第１表（28
℃、２週間培養後）に示す。色調の記載はカラ
ー・ハーモニー・マニユアル（Color Harmony
Mannual）〔コンテイナー・コーポレーシヨン・
オブ・アメリカ，シカゴ（Container
Corporation of America，Chicago）〕を参照し
た。
【表】
【表】
（） 生理的性質
生育温度範囲
10〜38℃（至適生育温度29〜32℃）
生育PH範囲
５〜10（至適生育PH６〜８）
ゼラチンの液化（グルコース・ペプトン、ゼ
ラチン培地上） 陽性 スターチの加水分解（スターチ無機塩寒天培
地上） 陽性 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 凝固しない。ペプトン化する。 メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地、
ペプトン・イースト・鉄寒天上及びトリプト
ン・イーストエキス培地中） 陰性 硝酸塩還元作用 陽性 セルロース分解能 陰性 （） 炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリー
ブ寒天培地上） Ｌ−アラビノース ＋＋ Ｄ−キシロース ＋＋ Ｄ−グルコース ＋＋ Ｄ−フラクトース ＋＋ シユクロース ± イノシトール ＋ Ｌ−ラムノース ＋＋ ラフイノース − Ｄ−マンニツト ＋＋ 但し＋＋はよく利用するを、＋は利用するを、±
は利用が疑わしいを、−は利用しないを示す。 （） 細胞壁中のジアミノピメリン酸 LL−ジアミノピメリン酸 以上を要約すると本菌株OFR1237は、ストレ
プトミセス属に属する菌株であり、インターナシ
ヨナル・ストレプトミセス・プロジエクト（略称
ISP）の方法によれば、胞子形成菌糸の形態はセ
クシヨンレクテイフレクシビレス
（Rectiflexibiles）に属し、胞子表面は平滑状で、
成熟した気菌糸の色は灰色系統（Gray color
series）である。基生菌糸の色は無色〜黄色又は
茶色であり裏面の色は淡黄色〜黄色である。可溶
性色素はグルコース・アスパラギン寒天培地、チ
ロシン寒天培地、オートミール寒天培地において
淡黄色が認められるが他の培地においては特に認
められない。炭素源はＬ−アラビノース、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニツト、イノシトール
を利用し、ラフイノースを利用しない。 以上の性状及びその他の諸性状を“バージー
ズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・
バクテリオロジー（Bergeys Mannual of
Determinaitive Bacteriology）”第８版（1974
年）、S.A.ワツクスマン（S.A.Waksman）著
“ジ・アクチノミセーテス（The
Actinomycetes）”第２巻（1961年）並びにE.B.
シヤーリング（E.B.Shirling）及びD.ゴドリーブ
（D.Gottlieb）によるISPの報告であるインターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツ
ク・バクテリオロジー（International Journal
of Systematic Bacteriology）第18巻第69〜189
頁（1968年）、同第18巻第279〜392頁（1968年）、
同第19巻第391〜512頁（1969年）及び同第22巻第
265〜394頁（1972年）に検索した結果、ストレプ
トミセス・フアルボビリデイス（Streptomyces
fulvoviridis）〔バージーズ・マニユアル・オブ・
デイターミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版、第758頁、第759頁（1974年）〕及びアクチノ
ミセス・フアルボビリデイス（Actinomyces
fulvovirdis）〔インターナシヨナル・ジヤーナ
ル・オブ・システマテイク・バクテリオロジー第
18巻、第321頁、第322頁（1968年）〕が最も近縁
な菌種として挙げられる。ただし、ストレプトミ
セス・フアルボビリデイスとアクチノミセス・フ
アルボビリデイスとは同一菌株であり、以下スト
レプトミセス・フアルボビリデイスとして統一す
る。 即ち、本菌株OFR1237は、イノシトールの利
用性を除いては胞子形成菌糸の形態がセクシヨン
レクテイフレクシビレスに属し、胞子表面が平滑
である点、灰色系統の気菌糸を着生する点、黄色
糸の裏面を呈する点、メラニン様色素を産生しな
い点及びその他の諸性質において、上記ストレプ
トミセス・フアルボビリデイスとよく一致してい
る。このようにOFR1237株は、イノシトールの
利用性において相違が認められるのみであり、ス
トレプトミセス・フアルボビリデイスと同定でき
る。本発明者はこれをストレプトミセス・フアル
ボビリデイスOFR1237と命名し、公知菌株と区
別することとした。該OFR1237株は、工業技術
院微生物工業技術研究所に、ストレプトミセス
エス ピー OFR−1237（Streptomyces SP
OFR−1237として寄託されており、その寄託番
号は微工研菌寄第6525号（FERMP−6525）であ
る。 本発明方法は、上記OFR1237株又は他の本発
明プラスミドを保持する放線菌例えば該
OFR1237株の人工突然変異株等を利用して通常
の方法〔J.Antibiotics，33，88（1980）〕に準じて
実施される。即ち該方法は、基本的には、上記微
生物を適当な培地に培養し、採取した培養菌体を
常法に従い溶菌して、次いで該溶菌液中より所望
のプラスミドを通常の物理化学的手段により単離
することにより行なわれる。上記微生物の培養は
通常の栄養物及び添加物を含有する培地で行なわ
れる。培養基として一般に用いられる窒素源とし
ては、例えば大豆粉、綿実粉、コーンスチツプリ
カー、酵母エキス、乾燥酵母、肉エキス、カゼイ
ン加水分解物等を例示でき、炭素源としては、例
えばブドウ糖、グリセリン、麦芽糖、デンプン、
乳糖、糖蜜等を例示できる。また培地に添加され
る添加物としては例えば炭酸カルシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、リン酸等の無機塩
を例示でき、更に該培地は必要に応じて、鉄、
銅、マンガン、亜鉛等の金属の塩を微量含有して
いてもよい。好ましい培地の具体例は、後記実施
例に示す通りである。培養は、上記培養基を含有
する通常の水性培地で、表面培養でも深部通気攬
拌培養でも実施できるが、深部通気攬拌培養を行
うのが好ましい。培養条件は特に限定なく、通常
の放線菌の培養条件が採用される。具体的には例
えば通常の通気条件下に、液性がPH6.0〜8.0、好
ましくはPH6.5〜7.5及び培養温度15〜37℃、好ま
しくは28〜32℃で通常２〜４日間で有利に実施で
きる。培養後の培養菌体の採取も亦常法に従い、
例えば遠心分離法等により行なわれ、該菌体の溶
菌方法も亦常法に従い通常の各種の物理化学的手
段により行なうことができる。具体的な溶菌手段
としては、例えば上記菌体を適当な緩衝液中でホ
モジネートした後、遠心分離して得た菌体を、適
当な緩衝液中で可溶化剤を用いて処理することに
より行なわれる。用いられる可溶化剤としては、
一般に放線菌を溶菌可溶化できることの知られて
いる各種酵素類例えば細胞壁溶解剤としてのリゾ
チームやプロテナーゼＫ（ベーリンガーマンハイ
ム山の内(株)）等及び各種界面活性剤例えば、ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）、トライトン−X100
（和光純薬(株)）、ザルコシル（ソジウムラウリルザ
ルコシネート）、ブリツジ58（Brij58）（和光純薬
(株)）等を例示でき、又それらを適宜に組み合せて
使用してもよい。 かくして得られる溶菌液中からの所望のプラス
ミドの単離における物理化学的手段としては、例
えば、遠心分離法（密度勾配法）、電気泳動法、
ポリエチレングリコールやエタノール等の沈殿剤
を用いた処理法等、単離する所望のプラスミドの
物理的、化学的性質に基づいた通常の分離法を適
宜組み合わせて採用すればよい。之等単離操作に
先立つて、常法に従い蛋白分解酵素やRNA分解
酵素等による酵素処理や、SDS−NaCl等による
塩析、フエノール等による抽出を行なうことがで
きる。より好ましくは上記プラスミドの単離は、
まず上記溶菌液を遠心分離して所望のプラスミド
を含む上清（クリアードライセート）を得、これ
を塩析法により除蛋白後、RNaseA（シグマ社製）
等のRNA分解酵素及びプロナーゼＥ（科研化学社
製）等の蛋白分解酵素処理により混在するRNA
及び蛋白を分解処理し、次いでこれに例えばポリ
エチレングリコール、エタノール等の沈殿剤を加
えて遠心分離して所望のプラスミドを沈殿させ、
これを例えばセシユームクロライドの平衡密度勾
配遠心法に付して所望のプラスミドを単離精製す
ることにより実施され、かくして本発明のプラス
ミドpOF011を得る。この方法の詳細は後述する
実施例に示す通りである。 本発明プラスミドpOF011は、上記の通りスト
レプトミセス・フアルボビリデイスOFR1237か
ら得られる点及び下記各試験の結果よりその特徴
付けがなされる。 １ 電気泳動による分子量の測定 本発明プラスミドpOF011を下記組成のＥ−バ
ツフアーを用い、100Vで４時間泳動させ、その
分子量を次の通り測定した。 ＜Ｅ−バツフアー組成＞ トリス〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン〕 40mM 酢酸ナトリウム 20mM EDTA・2Na 2mM PH＝7.4 即ち分子量マーカーとなる既知の各種プラスミ
ドDNAを対照として用い、之等各マーカー（プ
ラスミドDNA）の移動度の対数と、それらの分
子量の対数をプロツトして、予め標準曲線を作成
しておき、同一試験により、本発明プラスミド
pOF011の移動度を求め、その対数を上記標準曲
線上にプロツトすることにより、該プラスミドの
分子量を求めた。尚すべての電気泳動は、水平型
装置（和研薬製、TWF−１型）を用いて試験し、
各プラスミドDNAの検出は、エチジウムブロマ
イド（EtBr）1μg／mlを含む0.7〜1.0％アガロー
ス（ドータイト、タイプ、同仁化学社製）上
で、上記組成のＥ−バツフアー中、80〜100V、
４〜６時間泳動後、紫外線照射により求めた。ま
た分子量マーカーとして用いたプラスミドDNA
及びその分子量は次の通りである。 pBR 322 2.7×106ダルトン pBR 328 3.2×106ダルトン （ベーリンガーマンハイム社） Col EI DNA（宝酒造） 4.2×106ダルトン RSF 1010 5.5×106ダルトン pM2 DNA 6.4×106ダルトン 上記により求められた本発明pOF011の分子量
は、5.3メガダルトンであつた。 ２ 電子顕微鏡による分子量測定 山岸の方法〔1975年東京化学同人社発行「生化
学実験法」第２巻、核酸の化学、第348頁〕に
従いサンプルを作製し、対照サンプルとしてプラ
スミドpBR322（分子量2.7メガダルトン）を用い、
透過型電子顕微鏡（日立Ｈ−500電子顕微鏡）で
検鏡、写真撮影し、その陽面（５〜10倍に引き伸
したもの）よりキルビメーターを用いて長さを測
定し、対照サンプルのそれを基準として、本発明
プラスミドpOF011の分子量を算出した。その結
果該プラスミドは分子量約5.2メガダルトンであ
り上記１）の電気泳動によるそれとほぼ一致し
た。 ３ 制限酵素によるプラスミドDNAの切断試験
反応液（宝酒造株式会社のマニユアルに従う）
50μlに本発明プラスミドpOF011の1μgと、これ
に対し過剰量の各制限酵素溶液（いずれも宝酒
造社製のものを用いた）とを加え、37℃下１時
間反応させて、プラスミドDNAの切断試験を
行なつた。また異なる二種以上の制限酵素溶液
を用いて以下の通り二重消化試験を行なつた。
即ちまず塩濃度が低い条件で活性のある制限酵
素を反応させた後、65℃で５分間加熱処理して
反応を停止させ、次いで他方の制限酵素が反応
できるように塩濃度を高めた後、該他方の制限
酵素を加えて同様に反応させるか或は、一方の
制限酵素を用いた反応後、フエノール処理を行
ない、DNAをエタノール中に沈殿させ、この
沈殿物を他方の制限酵素が反応できる条件に溶
解後、他方の制限酵素を加えて同様に反応させ
た。 上記各制限酵素による切断反応後の反応液につ
き、上記１）と同様にしてアガロースゲル電気泳
動法により、切断プラスミドDNAの検出（分子
量測定）を行なつた。尚この分子量測定において
はDNA分子量マーカーとして、DNA分子量マー
カー（λDNAのHind消化物、ベーリンガー
マンハイムGmbH（Boehringer Mannheim
GmbH）、バイオケミカ社製）とバクテリオフア
ージφ×174RF DNAのHae消化物（ニユーイ
ングランド バイオラド社製）を用いた。 上記切断試験の結果、本発明プラスミド
pOF011の各制限酵素による切断数は、下記第２
表に示す通りであつた。 第 ２ 表 制限酵素 切断数 BamHI ２ Bgl ０ EcoR ０ Hind ０ Hpa ０ Kpn ０ Pst １ Pvu １ Sal ３ Sma ４ Xho １ 上記表より本発明プラスミドpOF011は、Pst
、Pvu及びXhoでは１ケ所で切断され、
BamHでは２ケ所、Salでは３ケ所及びSma
では４ケ所で切断されることが判る。 また上記各制限酵素の二種を適宜組み合せて行
なつた二重消化試験の結果より、本発明プラスミ
ドpOF011は、以下の制限酵素地図を示すことが
明らかにされた。 上記の通り、本発明によればストレプトミセ
ス・フアルボビリデイスOFR1237を起源として、
約5.2〜5.3Mdの大きさを有し、上記制限酵素開
裂地図により特定される構造を有する新規なプラ
スミドが確立される。 本発明により確立されたプラスミドpOF011は、
組換DNA遺伝子工学分野において、例えば所望
の遺伝子をプラスミドに組入れて組換型プラスミ
ドを作成することができ、またかかる組換型プラ
スミドを適当な宿主中に変換させる際のDNA研
究でのクローン化ベクターを提供するものとして
有用なものである。上記方法は当分野で周知であ
り、例えば本発明プラスミドはこれを制限酵素例
えばPst、Pvu、Xho等により、之等制限
酵素の種類に応じて、特定の限られた位置で開裂
させることができ、またこの開裂により得られる
線状DNA分子（線状ベクター）は、同様にして
開裂された他の非ベクターDNA分子と、公知の
DNAリガーゼにより共有結合され、単一のDNA
環を形成させ得る。上記他の非ベクターDNA分
子としては、所望の遺伝子要素例えばソマトスタ
チン、インシユリン等の各種動物ホルモンや酵
素、抗生物質等の有用代謝産物をコードする遺伝
子を利用することができる。殊に本発明のプラス
ミドは、これが放線菌に由来することに基づいて
上記遺伝子要素として特に放線菌からの遺伝情報
例えば有用抗生物質の産生に関する情報例えば該
抗生物質の生合成経路全体の遺伝情報、該抗生物
質の生合成を調節する遺伝情報、上記生合成の速
度を決定する酵素等についての遺伝情報等をクロ
ーン化するのに適している。また上記で得られる
所望の遺伝子要素を含む組換型プラスミドは、該
遺伝子要素の表現のために、これを通常の方法例
えば代表的にはプロトプラストを用いるトランス
ホーメーシヨン（形質転換）技術に従い、適当な
宿主生物に導入することができ、これにより例え
ば有用抗生物質産生能を具備した宿主生物が提供
され、該生物の培養により有用抗生物質の採取が
可能となる。 尚本発明プラスミドpOF011は、工業技術院微
生物工業技術研究所への寄託が受付けられなかつ
たが、本発明者らにより、常に分壌可能な状態に
て保存されている。 以下本発明を更に詳しく説
明するため本発明プラスミドpOF011の製造例を
実施例として挙げる。 実施例 １ ストレプトミセス・フアルボビリデイス
OFR1237（Streptomyces Fulvoviridis
OFR1237）の胞子を20mlのGGCY培地（ブドウ
糖1.0％、グリシン0.1％、カザミノ酸（デイフコ
社製）0.4％、酵母エキス（デイフコ社製）0.05
％、硫酸マグネシウム・７水塩0.1％、塩化カル
シウム・２水塩0.01％、リン酸二水素カリウム
0.2％、リン酸一水素二ナトリウム．12水塩0.8
％、微量金属溶液（脱イオン水100mlあたり硫酸
第１鉄・７水塩0.1ｇ、塩化マンガン・４水塩
0.1g、硫酸亜鉛・７水塩0.1g）4ml／）の入つ
た100mlエルレンマイヤーフラスコに植菌し、30
℃で２日間、回転振盪培養機（200rpm）で培養
し、これを種培養として次に100mlのGGC培地
（グリセロール0.4％、グリシン0.1％、カザミノ
酸（デイフコ社製）0.4％、硫酸マグネシウム・
７水塩0.1％、塩化カルシウム・２水塩0.01％、
リン酸２水素カリウム0.2％、リン酸１水素２ナ
トリウム・12水塩0.8％、微量金属溶液４ml／）
の入つた500mlのエルレンマイヤーフラスコに種
培養を１ml植菌し、30℃で２日間回転振盪培養機
（150rpm）で培養する。培養後、菌糸体を低速遠
心（4700×ｇ、20min、４℃）で集める。この湿
菌体約１mlあたりに、10mlの２×TES緩衝液
（TES：トリス（ハイドロキシメチルアミノメタ
ン）25mM、EDTA.2ナトリウム塩25mM、
NaCl25mM）に懸濁後ポリトロン（Kinematica
社、スイス製）でホモジナイズし、遠心（7200×
ｇ、10min、４℃）により菌糸体を集め、これを
20mlの10mMEDTA・２ナトリウム塩を含む
0.1Nアンモニア水に懸濁させ、37℃で20分間放
置する。その後遠心（7200×ｇ、10min、４℃）
で集菌後、19mlの２×TES緩衝液に懸濁させ
0.25Mトリス−塩酸（PH8.0）に20mg／mlになる
ように溶かしたリゾチーム溶液を2.2ml加え、37
℃で1.5時間放置する。そして、10％SDSを2.6ml
加え、室温で20分間放置後、遠心（34000×ｇ、
30分、４℃）し、上清を分離する。この上清に
5M NaClを0.25容量加え０℃や一晩放置する。
遠心（10000×ｇ、20分、４℃）後、上清を分離
し、これに10mg／mlのリボヌクレアーゼＡを40μ
ｇ／mlの濃度になる様に加え、37℃で30分間反応
後10mg／mlのプロナーゼＥを100μｇ／mlの濃度
になる様に加え、更に37℃で30分間反応させる。
その後、ポリエチレングリコール6000を10％の濃
度になる様に加え、４℃で４時間以上放置後、遠
心（650×ｇ、20min、４℃）する。沈殿物をTE
緩衝液（10mMトリス−塩酸、1mM、EDTA・
２ナトリウム、PH8.0）に溶解させ、これを塩化
セシウムとエチジウムブロミドと混合し、密度を
1.57〜1.58にする。この溶液を平衡密度勾配遠心
（86000×ｇ、40h、15℃）する。遠心後、長波長
紫外線照射下で共有結合した閉環状プラスミド
DNA部分のバンドを分画し、塩化セシウムで飽
和したイソプロパノールでエチジウムブロミドを
除き、水相をTE緩衝液で４℃で透析し、本質的
に純粋なプラスミドpOF011を得る。
ラチン培地上） 陽性 スターチの加水分解（スターチ無機塩寒天培
地上） 陽性 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 凝固しない。ペプトン化する。 メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地、
ペプトン・イースト・鉄寒天上及びトリプト
ン・イーストエキス培地中） 陰性 硝酸塩還元作用 陽性 セルロース分解能 陰性 （） 炭素源の同化性（プリドハム・ゴドリー
ブ寒天培地上） Ｌ−アラビノース ＋＋ Ｄ−キシロース ＋＋ Ｄ−グルコース ＋＋ Ｄ−フラクトース ＋＋ シユクロース ± イノシトール ＋ Ｌ−ラムノース ＋＋ ラフイノース − Ｄ−マンニツト ＋＋ 但し＋＋はよく利用するを、＋は利用するを、±
は利用が疑わしいを、−は利用しないを示す。 （） 細胞壁中のジアミノピメリン酸 LL−ジアミノピメリン酸 以上を要約すると本菌株OFR1237は、ストレ
プトミセス属に属する菌株であり、インターナシ
ヨナル・ストレプトミセス・プロジエクト（略称
ISP）の方法によれば、胞子形成菌糸の形態はセ
クシヨンレクテイフレクシビレス
（Rectiflexibiles）に属し、胞子表面は平滑状で、
成熟した気菌糸の色は灰色系統（Gray color
series）である。基生菌糸の色は無色〜黄色又は
茶色であり裏面の色は淡黄色〜黄色である。可溶
性色素はグルコース・アスパラギン寒天培地、チ
ロシン寒天培地、オートミール寒天培地において
淡黄色が認められるが他の培地においては特に認
められない。炭素源はＬ−アラビノース、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、
Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニツト、イノシトール
を利用し、ラフイノースを利用しない。 以上の性状及びその他の諸性状を“バージー
ズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・
バクテリオロジー（Bergeys Mannual of
Determinaitive Bacteriology）”第８版（1974
年）、S.A.ワツクスマン（S.A.Waksman）著
“ジ・アクチノミセーテス（The
Actinomycetes）”第２巻（1961年）並びにE.B.
シヤーリング（E.B.Shirling）及びD.ゴドリーブ
（D.Gottlieb）によるISPの報告であるインターナ
シヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツ
ク・バクテリオロジー（International Journal
of Systematic Bacteriology）第18巻第69〜189
頁（1968年）、同第18巻第279〜392頁（1968年）、
同第19巻第391〜512頁（1969年）及び同第22巻第
265〜394頁（1972年）に検索した結果、ストレプ
トミセス・フアルボビリデイス（Streptomyces
fulvoviridis）〔バージーズ・マニユアル・オブ・
デイターミネイテイブ・バクテリオロジー第８
版、第758頁、第759頁（1974年）〕及びアクチノ
ミセス・フアルボビリデイス（Actinomyces
fulvovirdis）〔インターナシヨナル・ジヤーナ
ル・オブ・システマテイク・バクテリオロジー第
18巻、第321頁、第322頁（1968年）〕が最も近縁
な菌種として挙げられる。ただし、ストレプトミ
セス・フアルボビリデイスとアクチノミセス・フ
アルボビリデイスとは同一菌株であり、以下スト
レプトミセス・フアルボビリデイスとして統一す
る。 即ち、本菌株OFR1237は、イノシトールの利
用性を除いては胞子形成菌糸の形態がセクシヨン
レクテイフレクシビレスに属し、胞子表面が平滑
である点、灰色系統の気菌糸を着生する点、黄色
糸の裏面を呈する点、メラニン様色素を産生しな
い点及びその他の諸性質において、上記ストレプ
トミセス・フアルボビリデイスとよく一致してい
る。このようにOFR1237株は、イノシトールの
利用性において相違が認められるのみであり、ス
トレプトミセス・フアルボビリデイスと同定でき
る。本発明者はこれをストレプトミセス・フアル
ボビリデイスOFR1237と命名し、公知菌株と区
別することとした。該OFR1237株は、工業技術
院微生物工業技術研究所に、ストレプトミセス
エス ピー OFR−1237（Streptomyces SP
OFR−1237として寄託されており、その寄託番
号は微工研菌寄第6525号（FERMP−6525）であ
る。 本発明方法は、上記OFR1237株又は他の本発
明プラスミドを保持する放線菌例えば該
OFR1237株の人工突然変異株等を利用して通常
の方法〔J.Antibiotics，33，88（1980）〕に準じて
実施される。即ち該方法は、基本的には、上記微
生物を適当な培地に培養し、採取した培養菌体を
常法に従い溶菌して、次いで該溶菌液中より所望
のプラスミドを通常の物理化学的手段により単離
することにより行なわれる。上記微生物の培養は
通常の栄養物及び添加物を含有する培地で行なわ
れる。培養基として一般に用いられる窒素源とし
ては、例えば大豆粉、綿実粉、コーンスチツプリ
カー、酵母エキス、乾燥酵母、肉エキス、カゼイ
ン加水分解物等を例示でき、炭素源としては、例
えばブドウ糖、グリセリン、麦芽糖、デンプン、
乳糖、糖蜜等を例示できる。また培地に添加され
る添加物としては例えば炭酸カルシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、リン酸等の無機塩
を例示でき、更に該培地は必要に応じて、鉄、
銅、マンガン、亜鉛等の金属の塩を微量含有して
いてもよい。好ましい培地の具体例は、後記実施
例に示す通りである。培養は、上記培養基を含有
する通常の水性培地で、表面培養でも深部通気攬
拌培養でも実施できるが、深部通気攬拌培養を行
うのが好ましい。培養条件は特に限定なく、通常
の放線菌の培養条件が採用される。具体的には例
えば通常の通気条件下に、液性がPH6.0〜8.0、好
ましくはPH6.5〜7.5及び培養温度15〜37℃、好ま
しくは28〜32℃で通常２〜４日間で有利に実施で
きる。培養後の培養菌体の採取も亦常法に従い、
例えば遠心分離法等により行なわれ、該菌体の溶
菌方法も亦常法に従い通常の各種の物理化学的手
段により行なうことができる。具体的な溶菌手段
としては、例えば上記菌体を適当な緩衝液中でホ
モジネートした後、遠心分離して得た菌体を、適
当な緩衝液中で可溶化剤を用いて処理することに
より行なわれる。用いられる可溶化剤としては、
一般に放線菌を溶菌可溶化できることの知られて
いる各種酵素類例えば細胞壁溶解剤としてのリゾ
チームやプロテナーゼＫ（ベーリンガーマンハイ
ム山の内(株)）等及び各種界面活性剤例えば、ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）、トライトン−X100
（和光純薬(株)）、ザルコシル（ソジウムラウリルザ
ルコシネート）、ブリツジ58（Brij58）（和光純薬
(株)）等を例示でき、又それらを適宜に組み合せて
使用してもよい。 かくして得られる溶菌液中からの所望のプラス
ミドの単離における物理化学的手段としては、例
えば、遠心分離法（密度勾配法）、電気泳動法、
ポリエチレングリコールやエタノール等の沈殿剤
を用いた処理法等、単離する所望のプラスミドの
物理的、化学的性質に基づいた通常の分離法を適
宜組み合わせて採用すればよい。之等単離操作に
先立つて、常法に従い蛋白分解酵素やRNA分解
酵素等による酵素処理や、SDS−NaCl等による
塩析、フエノール等による抽出を行なうことがで
きる。より好ましくは上記プラスミドの単離は、
まず上記溶菌液を遠心分離して所望のプラスミド
を含む上清（クリアードライセート）を得、これ
を塩析法により除蛋白後、RNaseA（シグマ社製）
等のRNA分解酵素及びプロナーゼＥ（科研化学社
製）等の蛋白分解酵素処理により混在するRNA
及び蛋白を分解処理し、次いでこれに例えばポリ
エチレングリコール、エタノール等の沈殿剤を加
えて遠心分離して所望のプラスミドを沈殿させ、
これを例えばセシユームクロライドの平衡密度勾
配遠心法に付して所望のプラスミドを単離精製す
ることにより実施され、かくして本発明のプラス
ミドpOF011を得る。この方法の詳細は後述する
実施例に示す通りである。 本発明プラスミドpOF011は、上記の通りスト
レプトミセス・フアルボビリデイスOFR1237か
ら得られる点及び下記各試験の結果よりその特徴
付けがなされる。 １ 電気泳動による分子量の測定 本発明プラスミドpOF011を下記組成のＥ−バ
ツフアーを用い、100Vで４時間泳動させ、その
分子量を次の通り測定した。 ＜Ｅ−バツフアー組成＞ トリス〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン〕 40mM 酢酸ナトリウム 20mM EDTA・2Na 2mM PH＝7.4 即ち分子量マーカーとなる既知の各種プラスミ
ドDNAを対照として用い、之等各マーカー（プ
ラスミドDNA）の移動度の対数と、それらの分
子量の対数をプロツトして、予め標準曲線を作成
しておき、同一試験により、本発明プラスミド
pOF011の移動度を求め、その対数を上記標準曲
線上にプロツトすることにより、該プラスミドの
分子量を求めた。尚すべての電気泳動は、水平型
装置（和研薬製、TWF−１型）を用いて試験し、
各プラスミドDNAの検出は、エチジウムブロマ
イド（EtBr）1μg／mlを含む0.7〜1.0％アガロー
ス（ドータイト、タイプ、同仁化学社製）上
で、上記組成のＥ−バツフアー中、80〜100V、
４〜６時間泳動後、紫外線照射により求めた。ま
た分子量マーカーとして用いたプラスミドDNA
及びその分子量は次の通りである。 pBR 322 2.7×106ダルトン pBR 328 3.2×106ダルトン （ベーリンガーマンハイム社） Col EI DNA（宝酒造） 4.2×106ダルトン RSF 1010 5.5×106ダルトン pM2 DNA 6.4×106ダルトン 上記により求められた本発明pOF011の分子量
は、5.3メガダルトンであつた。 ２ 電子顕微鏡による分子量測定 山岸の方法〔1975年東京化学同人社発行「生化
学実験法」第２巻、核酸の化学、第348頁〕に
従いサンプルを作製し、対照サンプルとしてプラ
スミドpBR322（分子量2.7メガダルトン）を用い、
透過型電子顕微鏡（日立Ｈ−500電子顕微鏡）で
検鏡、写真撮影し、その陽面（５〜10倍に引き伸
したもの）よりキルビメーターを用いて長さを測
定し、対照サンプルのそれを基準として、本発明
プラスミドpOF011の分子量を算出した。その結
果該プラスミドは分子量約5.2メガダルトンであ
り上記１）の電気泳動によるそれとほぼ一致し
た。 ３ 制限酵素によるプラスミドDNAの切断試験
反応液（宝酒造株式会社のマニユアルに従う）
50μlに本発明プラスミドpOF011の1μgと、これ
に対し過剰量の各制限酵素溶液（いずれも宝酒
造社製のものを用いた）とを加え、37℃下１時
間反応させて、プラスミドDNAの切断試験を
行なつた。また異なる二種以上の制限酵素溶液
を用いて以下の通り二重消化試験を行なつた。
即ちまず塩濃度が低い条件で活性のある制限酵
素を反応させた後、65℃で５分間加熱処理して
反応を停止させ、次いで他方の制限酵素が反応
できるように塩濃度を高めた後、該他方の制限
酵素を加えて同様に反応させるか或は、一方の
制限酵素を用いた反応後、フエノール処理を行
ない、DNAをエタノール中に沈殿させ、この
沈殿物を他方の制限酵素が反応できる条件に溶
解後、他方の制限酵素を加えて同様に反応させ
た。 上記各制限酵素による切断反応後の反応液につ
き、上記１）と同様にしてアガロースゲル電気泳
動法により、切断プラスミドDNAの検出（分子
量測定）を行なつた。尚この分子量測定において
はDNA分子量マーカーとして、DNA分子量マー
カー（λDNAのHind消化物、ベーリンガー
マンハイムGmbH（Boehringer Mannheim
GmbH）、バイオケミカ社製）とバクテリオフア
ージφ×174RF DNAのHae消化物（ニユーイ
ングランド バイオラド社製）を用いた。 上記切断試験の結果、本発明プラスミド
pOF011の各制限酵素による切断数は、下記第２
表に示す通りであつた。 第 ２ 表 制限酵素 切断数 BamHI ２ Bgl ０ EcoR ０ Hind ０ Hpa ０ Kpn ０ Pst １ Pvu １ Sal ３ Sma ４ Xho １ 上記表より本発明プラスミドpOF011は、Pst
、Pvu及びXhoでは１ケ所で切断され、
BamHでは２ケ所、Salでは３ケ所及びSma
では４ケ所で切断されることが判る。 また上記各制限酵素の二種を適宜組み合せて行
なつた二重消化試験の結果より、本発明プラスミ
ドpOF011は、以下の制限酵素地図を示すことが
明らかにされた。 上記の通り、本発明によればストレプトミセ
ス・フアルボビリデイスOFR1237を起源として、
約5.2〜5.3Mdの大きさを有し、上記制限酵素開
裂地図により特定される構造を有する新規なプラ
スミドが確立される。 本発明により確立されたプラスミドpOF011は、
組換DNA遺伝子工学分野において、例えば所望
の遺伝子をプラスミドに組入れて組換型プラスミ
ドを作成することができ、またかかる組換型プラ
スミドを適当な宿主中に変換させる際のDNA研
究でのクローン化ベクターを提供するものとして
有用なものである。上記方法は当分野で周知であ
り、例えば本発明プラスミドはこれを制限酵素例
えばPst、Pvu、Xho等により、之等制限
酵素の種類に応じて、特定の限られた位置で開裂
させることができ、またこの開裂により得られる
線状DNA分子（線状ベクター）は、同様にして
開裂された他の非ベクターDNA分子と、公知の
DNAリガーゼにより共有結合され、単一のDNA
環を形成させ得る。上記他の非ベクターDNA分
子としては、所望の遺伝子要素例えばソマトスタ
チン、インシユリン等の各種動物ホルモンや酵
素、抗生物質等の有用代謝産物をコードする遺伝
子を利用することができる。殊に本発明のプラス
ミドは、これが放線菌に由来することに基づいて
上記遺伝子要素として特に放線菌からの遺伝情報
例えば有用抗生物質の産生に関する情報例えば該
抗生物質の生合成経路全体の遺伝情報、該抗生物
質の生合成を調節する遺伝情報、上記生合成の速
度を決定する酵素等についての遺伝情報等をクロ
ーン化するのに適している。また上記で得られる
所望の遺伝子要素を含む組換型プラスミドは、該
遺伝子要素の表現のために、これを通常の方法例
えば代表的にはプロトプラストを用いるトランス
ホーメーシヨン（形質転換）技術に従い、適当な
宿主生物に導入することができ、これにより例え
ば有用抗生物質産生能を具備した宿主生物が提供
され、該生物の培養により有用抗生物質の採取が
可能となる。 尚本発明プラスミドpOF011は、工業技術院微
生物工業技術研究所への寄託が受付けられなかつ
たが、本発明者らにより、常に分壌可能な状態に
て保存されている。 以下本発明を更に詳しく説
明するため本発明プラスミドpOF011の製造例を
実施例として挙げる。 実施例 １ ストレプトミセス・フアルボビリデイス
OFR1237（Streptomyces Fulvoviridis
OFR1237）の胞子を20mlのGGCY培地（ブドウ
糖1.0％、グリシン0.1％、カザミノ酸（デイフコ
社製）0.4％、酵母エキス（デイフコ社製）0.05
％、硫酸マグネシウム・７水塩0.1％、塩化カル
シウム・２水塩0.01％、リン酸二水素カリウム
0.2％、リン酸一水素二ナトリウム．12水塩0.8
％、微量金属溶液（脱イオン水100mlあたり硫酸
第１鉄・７水塩0.1ｇ、塩化マンガン・４水塩
0.1g、硫酸亜鉛・７水塩0.1g）4ml／）の入つ
た100mlエルレンマイヤーフラスコに植菌し、30
℃で２日間、回転振盪培養機（200rpm）で培養
し、これを種培養として次に100mlのGGC培地
（グリセロール0.4％、グリシン0.1％、カザミノ
酸（デイフコ社製）0.4％、硫酸マグネシウム・
７水塩0.1％、塩化カルシウム・２水塩0.01％、
リン酸２水素カリウム0.2％、リン酸１水素２ナ
トリウム・12水塩0.8％、微量金属溶液４ml／）
の入つた500mlのエルレンマイヤーフラスコに種
培養を１ml植菌し、30℃で２日間回転振盪培養機
（150rpm）で培養する。培養後、菌糸体を低速遠
心（4700×ｇ、20min、４℃）で集める。この湿
菌体約１mlあたりに、10mlの２×TES緩衝液
（TES：トリス（ハイドロキシメチルアミノメタ
ン）25mM、EDTA.2ナトリウム塩25mM、
NaCl25mM）に懸濁後ポリトロン（Kinematica
社、スイス製）でホモジナイズし、遠心（7200×
ｇ、10min、４℃）により菌糸体を集め、これを
20mlの10mMEDTA・２ナトリウム塩を含む
0.1Nアンモニア水に懸濁させ、37℃で20分間放
置する。その後遠心（7200×ｇ、10min、４℃）
で集菌後、19mlの２×TES緩衝液に懸濁させ
0.25Mトリス−塩酸（PH8.0）に20mg／mlになる
ように溶かしたリゾチーム溶液を2.2ml加え、37
℃で1.5時間放置する。そして、10％SDSを2.6ml
加え、室温で20分間放置後、遠心（34000×ｇ、
30分、４℃）し、上清を分離する。この上清に
5M NaClを0.25容量加え０℃や一晩放置する。
遠心（10000×ｇ、20分、４℃）後、上清を分離
し、これに10mg／mlのリボヌクレアーゼＡを40μ
ｇ／mlの濃度になる様に加え、37℃で30分間反応
後10mg／mlのプロナーゼＥを100μｇ／mlの濃度
になる様に加え、更に37℃で30分間反応させる。
その後、ポリエチレングリコール6000を10％の濃
度になる様に加え、４℃で４時間以上放置後、遠
心（650×ｇ、20min、４℃）する。沈殿物をTE
緩衝液（10mMトリス−塩酸、1mM、EDTA・
２ナトリウム、PH8.0）に溶解させ、これを塩化
セシウムとエチジウムブロミドと混合し、密度を
1.57〜1.58にする。この溶液を平衡密度勾配遠心
（86000×ｇ、40h、15℃）する。遠心後、長波長
紫外線照射下で共有結合した閉環状プラスミド
DNA部分のバンドを分画し、塩化セシウムで飽
和したイソプロパノールでエチジウムブロミドを
除き、水相をTE緩衝液で４℃で透析し、本質的
に純粋なプラスミドpOF011を得る。
Claims (1)
- １ 放射菌起源のプラスミドであつて、分子量約
5.2〜5.3メガダルトンであり、次の制限酵素開裂
地図を有することを特徴とするプラスミド
pOF011。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57185435A JPS5974989A (ja) | 1982-10-21 | 1982-10-21 | プラスミドｐＯＦ０１１ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57185435A JPS5974989A (ja) | 1982-10-21 | 1982-10-21 | プラスミドｐＯＦ０１１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974989A JPS5974989A (ja) | 1984-04-27 |
| JPH0321152B2 true JPH0321152B2 (ja) | 1991-03-22 |
Family
ID=16170736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57185435A Granted JPS5974989A (ja) | 1982-10-21 | 1982-10-21 | プラスミドｐＯＦ０１１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5974989A (ja) |
-
1982
- 1982-10-21 JP JP57185435A patent/JPS5974989A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5974989A (ja) | 1984-04-27 |
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