JPH0458884A - 新規制限酵素 - Google Patents
新規制限酵素Info
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- JPH0458884A JPH0458884A JP2166164A JP16616490A JPH0458884A JP H0458884 A JPH0458884 A JP H0458884A JP 2166164 A JP2166164 A JP 2166164A JP 16616490 A JP16616490 A JP 16616490A JP H0458884 A JPH0458884 A JP H0458884A
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- enzyme
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- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、二重鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）中の特
定の８塩基配列を特異的に認識、切断する■型制限酵素
に関する。
定の８塩基配列を特異的に認識、切断する■型制限酵素
に関する。
制限酵素とはＤＮＡ中のある特定の塩基配列を認識し、
切断することのできるエンド型ヌクレアーゼであり、数
多くの制限酵素が見出されている。分子遺伝学や、生化
学の発展により、ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体である
ことが明らかになって以来、制限酵素は遺伝病解明のた
めの利用や、遺伝子操作での利用等現在広く用いられて
いる有用な酵素である。近年、染色体ＤＮＡなどの巨大
ＤＮＡを解析する研究が注目されｆｉす、制限酵素はそ
の重要性が高まっている。
切断することのできるエンド型ヌクレアーゼであり、数
多くの制限酵素が見出されている。分子遺伝学や、生化
学の発展により、ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体である
ことが明らかになって以来、制限酵素は遺伝病解明のた
めの利用や、遺伝子操作での利用等現在広く用いられて
いる有用な酵素である。近年、染色体ＤＮＡなどの巨大
ＤＮＡを解析する研究が注目されｆｉす、制限酵素はそ
の重要性が高まっている。
しかしながら、今までの制限酵素は、はとんどが４塩基
ないし６塩基認識であり、巨大なりＮＡを解析するには
ＤＮＡ上の切断部位数が多く、解析の困難なことが多い
。そのため巨大なりＮＡを解析するには、切断部位の出
現頻度の少ない、すなわち８塩基認識以上の制限酵素が
要望されている。しかし現在までのところ、下記の３種
類の８塩基認識制限酵素 ↓ Ｎｏｔ Ｉ ｉ ５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’、
↓ Ｓｆｉ Ｉ ｉ ５’−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣ
Ｃ−３’、↓ Ｆｓｅ Ｉ ｉ ５’−ＣＧＣＧＣＧＣＧ −３’
〔式中Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示し、ＮはＧ、Ｃ
，チミン（Ｔ）、又はアデニン（Ａ）のいずれでも良い
〕 が見出されているのみである。
ないし６塩基認識であり、巨大なりＮＡを解析するには
ＤＮＡ上の切断部位数が多く、解析の困難なことが多い
。そのため巨大なりＮＡを解析するには、切断部位の出
現頻度の少ない、すなわち８塩基認識以上の制限酵素が
要望されている。しかし現在までのところ、下記の３種
類の８塩基認識制限酵素 ↓ Ｎｏｔ Ｉ ｉ ５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’、
↓ Ｓｆｉ Ｉ ｉ ５’−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣ
Ｃ−３’、↓ Ｆｓｅ Ｉ ｉ ５’−ＣＧＣＧＣＧＣＧ −３’
〔式中Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを示し、ＮはＧ、Ｃ
，チミン（Ｔ）、又はアデニン（Ａ）のいずれでも良い
〕 が見出されているのみである。
上記３種の８塩基認識Ｈ型制限酵素は、いずれもＧＣの
みの認識であり、特には乳動物より分離されたＤＮＡは
、５’−ＣＧ−３’配列の内、Ｃがメチル化されている
場合が多く、必ずしも認識配列のすべてが切断されると
はいえないという問題点を有している。
みの認識であり、特には乳動物より分離されたＤＮＡは
、５’−ＣＧ−３’配列の内、Ｃがメチル化されている
場合が多く、必ずしも認識配列のすべてが切断されると
はいえないという問題点を有している。
本発明の目的は、ＤＮＡ中の８塩基配列、及びその周辺
配列中に５’−ＣＧ−３’を含まない塩基配列を認識し
、かつ切断する能力を有する遺伝子工学に有用な制限酵
素を提供することにある。
配列中に５’−ＣＧ−３’を含まない塩基配列を認識し
、かつ切断する能力を有する遺伝子工学に有用な制限酵
素を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は制限酵素に
関し、この制限酵素は二重鎖ＤＮＡ中の下記塩基配列を
特異的に認識し、かつ特異的に切断する能力を有するこ
とを特徴とする。
関し、この制限酵素は二重鎖ＤＮＡ中の下記塩基配列を
特異的に認識し、かつ特異的に切断する能力を有するこ
とを特徴とする。
また、本発明の第２の発明は遺伝子工学用試薬に関し、
第１の発明の制限酵素を含有することを特徴とする。更
に、本発明の第３の発明は、第１の発明の制限酵素の製
造方法に関し、ストレプトマイセス属に属し、該制限酵
素を生産する菌株を培養し、培養物より該制限酵素を採
取することを特徴とする。そして、本発明の第４の発明
は、第１の発明の制限酵素生産菌に関し、ストレプトマ
イセス属に属することを特徴とする。
第１の発明の制限酵素を含有することを特徴とする。更
に、本発明の第３の発明は、第１の発明の制限酵素の製
造方法に関し、ストレプトマイセス属に属し、該制限酵
素を生産する菌株を培養し、培養物より該制限酵素を採
取することを特徴とする。そして、本発明の第４の発明
は、第１の発明の制限酵素生産菌に関し、ストレプトマ
イセス属に属することを特徴とする。
本発明の■型制限酵素としては上記塩基配列を特異的に
認識し、かつ切断する能力を有する酵素であれば良く、
これらの酵素は上記二重鎖ＤＮＡの８塩基を認識する制
限酵素生産能を有する菌株、あるいは、これらの菌株の
変異株、あるいはこれら菌株より、通常の遺伝子操作手
法を用いて、本酵素生産能をコードする遺伝子を単離し
、他の生物に導入した組換え体のいずれによっても生産
することができる。
認識し、かつ切断する能力を有する酵素であれば良く、
これらの酵素は上記二重鎖ＤＮＡの８塩基を認識する制
限酵素生産能を有する菌株、あるいは、これらの菌株の
変異株、あるいはこれら菌株より、通常の遺伝子操作手
法を用いて、本酵素生産能をコードする遺伝子を単離し
、他の生物に導入した組換え体のいずれによっても生産
することができる。
上記８塩基認識制限酵素生産能を有する菌株の具体例と
しては、例えば、ストレプトマイセス エスピー８３８
７ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ５ｐ８３８７）が挙
げられる。本菌は、土壌中より本発明者らが新たに検索
して得た菌株で、その菌学的性質は次のとおりである。
しては、例えば、ストレプトマイセス エスピー８３８
７ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ５ｐ８３８７）が挙
げられる。本菌は、土壌中より本発明者らが新たに検索
して得た菌株で、その菌学的性質は次のとおりである。
（１）形態的性質
基生菌糸は、長く伸長し、よく分岐するが、通常は分断
しない。胞子は、オートミール寒天。
しない。胞子は、オートミール寒天。
培地、イースト・麦芽寒天培地で良く形成される。顕微
鏡で観察すると、気菌糸の分岐方法は、単純分岐で、輪
生分岐は見られない。気菌糸先端の形状は、直状ないし
かぎ型である。
鏡で観察すると、気菌糸の分岐方法は、単純分岐で、輪
生分岐は見られない。気菌糸先端の形状は、直状ないし
かぎ型である。
胞子は通常３０〜５０個の連鎖が認められ、表面はスム
ーズである。胞子の形状は円筒形ないし橢円形で、その
大きさは０．８〜０．９Ｘ１．５〜２．０μｍである。
ーズである。胞子の形状は円筒形ないし橢円形で、その
大きさは０．８〜０．９Ｘ１．５〜２．０μｍである。
胞子のう、運動性胞子、菌核などは観察されない。
（２）各種培地上での生育状態
各種培地に２７℃で１４日間培養したときの肉眼での観
察結果を第１表に示す。
察結果を第１表に示す。
（３）生理的性質
（イ）生育温度範囲（酵素・麦芽寒天培地）：１０〜３
７℃の温度範囲で生育し、２５〜３０℃で良好に生育す
る。
７℃の温度範囲で生育し、２５〜３０℃で良好に生育す
る。
（ロ）ゼラチンの液化：陰性
（ハ）スターチの加水分解：良好
に）脱脂乳のペプトン化：陰性
脱脂乳の凝固：陰性
（ホ）メラニン様色素の生育：陰性
（４）炭素源の利用（ブリドハム・ゴドリープ寒天培地
上で２７℃、１４日間培養） （イ）利用する：フルクトース、グルコース、ラフィノ
ース、カラクトース、マンノース（ロ）利用りない：イ
ノシトール、スクロース、キシロース、ラムノース 以上の性状により、本菌株は、放線菌の中でストレプト
マイセス属に属し、気菌糸の色調は°°白色°°〜°１
灰色°゛シリーズ、気菌糸先端は直状ないしかぎ型で、
胞子表面はスムーズ、コロニー裏面の色調は白色〜淡褐
色で、メラニン様色素を生産しない菌株と要約される。
上で２７℃、１４日間培養） （イ）利用する：フルクトース、グルコース、ラフィノ
ース、カラクトース、マンノース（ロ）利用りない：イ
ノシトール、スクロース、キシロース、ラムノース 以上の性状により、本菌株は、放線菌の中でストレプト
マイセス属に属し、気菌糸の色調は°°白色°°〜°１
灰色°゛シリーズ、気菌糸先端は直状ないしかぎ型で、
胞子表面はスムーズ、コロニー裏面の色調は白色〜淡褐
色で、メラニン様色素を生産しない菌株と要約される。
本発明者らは、本菌株をストレプトマイセスエスピー８
３８７と称し、本菌株はｓｅｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ
８３８７と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研［真寄第１１４９６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１４
９６）として、寄託されている。
３８７と称し、本菌株はｓｅｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ
８３８７と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研［真寄第１１４９６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１４
９６）として、寄託されている。
ストレプトマイセス エスピー８３８７株の生産する８
塩基認識制限酵素は下記塩基配列を認識し、矢印の箇所
： を切断し、５ｅｅ８３８７１と命名されている。
塩基認識制限酵素は下記塩基配列を認識し、矢印の箇所
： を切断し、５ｅｅ８３８７１と命名されている。
本発明による制限酵素Ｓｓｅ ８３８７ Ｉの製造方法
について更に詳細に説明する。まず、培養の際、培地に
加える栄養源は使用する菌株が利用し、５ｓｅ８３８７
Ｉを生産するものであればよく、炭素源としては、例え
ばグルコース、マルトース、グリセリンなどが利用でき
、窒素源としては、酵母工午ス、ペプトン、コーンスチ
ーブリカー、肉エキスなどが適当である。その他にリン
酸塩、カリウム塩、マダイ・シウム塩などの無機質及び
金属塩類を加えても良い。
について更に詳細に説明する。まず、培養の際、培地に
加える栄養源は使用する菌株が利用し、５ｓｅ８３８７
Ｉを生産するものであればよく、炭素源としては、例え
ばグルコース、マルトース、グリセリンなどが利用でき
、窒素源としては、酵母工午ス、ペプトン、コーンスチ
ーブリカー、肉エキスなどが適当である。その他にリン
酸塩、カリウム塩、マダイ・シウム塩などの無機質及び
金属塩類を加えても良い。
Ｓｓｅ ８３８７１の生産量は、培養条件により変動す
るが、一般に培養温度２０〜３５’Ｃ，培地のｐＨ６〜
８が良く、１〜３日間の通気かくはん培養で制限酵素Ｓ
ｓｅ ８３８７ Ｉの生産は最高に達する。培養条件は
使用する菌株、培地組成などに応じ、生産量が最大にな
る様設定するのは当然である。
るが、一般に培養温度２０〜３５’Ｃ，培地のｐＨ６〜
８が良く、１〜３日間の通気かくはん培養で制限酵素Ｓ
ｓｅ ８３８７ Ｉの生産は最高に達する。培養条件は
使用する菌株、培地組成などに応じ、生産量が最大にな
る様設定するのは当然である。
本発明の菌株の培養によって生成された制限酵素Ｓｓｅ
８３８７ Ｉは主に菌体内に存在する。
８３８７ Ｉは主に菌体内に存在する。
培養液からの菌体の分離は、例えば遠心分離によって行
うことができる。本酵素の抽出、精製は、一般の制限酵
素精製法に従った方法で実施しうる。例えば菌体を緩衝
液に懸濁後、超音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽
出を行う。
うことができる。本酵素の抽出、精製は、一般の制限酵
素精製法に従った方法で実施しうる。例えば菌体を緩衝
液に懸濁後、超音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽
出を行う。
次に、細胞残渣を超遠心分離により除去後、抽出液を硫
酸アンモニウムで塩析する。沈殿物を、緩衝液Ａ（２０
ｍＭ）リス−ＨＣ１ｐＨ７，５，１０ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、５％グリセリン）に溶解し、同緩衝液に
て透析後、イオン交換クロマト方法、分子ふるいクロマ
ト方法、及び７フイニテイークロマト方法等による精製
を行い、本制限酵素を得ることができる。
酸アンモニウムで塩析する。沈殿物を、緩衝液Ａ（２０
ｍＭ）リス−ＨＣ１ｐＨ７，５，１０ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、５％グリセリン）に溶解し、同緩衝液に
て透析後、イオン交換クロマト方法、分子ふるいクロマ
ト方法、及び７フイニテイークロマト方法等による精製
を行い、本制限酵素を得ることができる。
制限酵素Ｓｇｅ ８３８７ Ｉの活性測定法を以下に示
す。
す。
下記第２表に示す組成の反応液５０μｌを予め３７゛Ｃ
で予熱した後、本酵素を加え酵素反応を進める。１０分
後に酵素反応停止液（１％ＳＤＳ、５０％グリセロール
、０．０２％ブロムフェノールブルー）を５μ！添加し
て反応を停止させる。
で予熱した後、本酵素を加え酵素反応を進める。１０分
後に酵素反応停止液（１％ＳＤＳ、５０％グリセロール
、０．０２％ブロムフェノールブルー）を５μ！添加し
て反応を停止させる。
第 ２ 表
１０ｍＭ） リ ス − ＨＣＩ、 ｐＨ８，０
１０ｍＭ ＭｇＣＭｇ Ｃ７−７ＩＩＩメルカプトエタノール ５０ ｍＭＮａＣｌ １．０μｙ λ−ＤＮＡ 反応液を０．７％アガローススラブゲルに重層し、１０
ｖ／ｃｒｒＬの定電圧下で約１時間から２時間、電気泳
動を行う。電気泳動用緩衝液は９０ｒｎＭトリスーはう
酸緩衝液（ｐＨ８，３） ２．５ ｍＭＥＤＴＡを用い
る。ゲルに前もって０．５μｇ／ｒｎｌのエチジウムブ
ロマイドを含ませておくことにより、υＶ照射でＤＮＡ
のバンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメントのバン
ドの数と量が変化しなくなった時を終点とする。
１０ｍＭ ＭｇＣＭｇ Ｃ７−７ＩＩＩメルカプトエタノール ５０ ｍＭＮａＣｌ １．０μｙ λ−ＤＮＡ 反応液を０．７％アガローススラブゲルに重層し、１０
ｖ／ｃｒｒＬの定電圧下で約１時間から２時間、電気泳
動を行う。電気泳動用緩衝液は９０ｒｎＭトリスーはう
酸緩衝液（ｐＨ８，３） ２．５ ｍＭＥＤＴＡを用い
る。ゲルに前もって０．５μｇ／ｒｎｌのエチジウムブ
ロマイドを含ませておくことにより、υＶ照射でＤＮＡ
のバンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメントのバン
ドの数と量が変化しなくなった時を終点とする。
活性の定義は３７℃で１時間に１〜のλ−ＤＮＡを完全
に切断する酵素活性を１単位とする。
に切断する酵素活性を１単位とする。
制限酵素Ｓｓｅ ８３８７１は、以下のような理化学的
性質を持っている。
性質を持っている。
（１）作用及び基質特異性
本酵題は二本鎖ＤＮＡ配列中の
■
という塩基配列を認識し、かつ矢印の位置で切断する酵
素である。
素である。
本発明の制限酵素Ｓｓｅ ８３８７１の認識部位の決定
は以下の様に行った。
は以下の様に行った。
制限酵素Ｓｓｅ ８３８７．Ｉは、λ−ＤＮＡを５カ所
、ＡＤ −２ＤＮＡ ヲ３ カ所、ｐｕｃ １８ ＤＮ
Ａ％Ｍ、１３ ｍｐ１８ ＤＮＡを各１カ所切断した。
、ＡＤ −２ＤＮＡ ヲ３ カ所、ｐｕｃ １８ ＤＮ
Ａ％Ｍ、１３ ｍｐ１８ ＤＮＡを各１カ所切断した。
しかし、ＳＶ ４０、Ｃｏｌ ＥＩ、ｐＢＲ３２２、φ
ｘ１７４ＤＮＡは切断しなかった。この結果、及び得ら
れたＤＮＡ断片の鎖長を検索したところ、この酵素は、
ＤＮＡ配列中の ５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧ −３’ を認識している事が示唆された。この８塩基間列には、
内部に、６塩基認識制限酵素Ｐｓｔ Ｉ（ｓ’−ＣＴＧ
ＣＡＧ −ｓ’ ）を含んでいる事より、λ−ＤＮＡ％
ＡＤ−２ＤＮＡ％ｐＵｃ ｌ Ｂ ＤＮＡ、、Ｍ １３
ｍｐ１８ＤＮＡそれぞれを、Ｐｓｔ １で切断後、更に
Ｓｓｅ ８３８７ Ｉで切断を行ったが、得られるＤＮ
Ａ断片のパターンに全く変化がなく、制限酵素Ｓｓｅ
８３８７ Ｉは、ダーＣＣＴＧＣＡＧＧ −３’を認識
していると結論された。
ｘ１７４ＤＮＡは切断しなかった。この結果、及び得ら
れたＤＮＡ断片の鎖長を検索したところ、この酵素は、
ＤＮＡ配列中の ５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧ −３’ を認識している事が示唆された。この８塩基間列には、
内部に、６塩基認識制限酵素Ｐｓｔ Ｉ（ｓ’−ＣＴＧ
ＣＡＧ −ｓ’ ）を含んでいる事より、λ−ＤＮＡ％
ＡＤ−２ＤＮＡ％ｐＵｃ ｌ Ｂ ＤＮＡ、、Ｍ １３
ｍｐ１８ＤＮＡそれぞれを、Ｐｓｔ １で切断後、更に
Ｓｓｅ ８３８７ Ｉで切断を行ったが、得られるＤＮ
Ａ断片のパターンに全く変化がなく、制限酵素Ｓｓｅ
８３８７ Ｉは、ダーＣＣＴＧＣＡＧＧ −３’を認識
していると結論された。
制限酵素Ｓｓｅ ８３８７ Ｉの切断部位の決定はＭ１
３ｍｐ１８−重鎖ＤＮＡと、５′末端塩基を放射性リン
酸化したブライマー （５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）を
７二−）しＬ 大ｍｒＡ ＤＮＡポリメラーゼＩクレノ
ー断片により、二本鎖を合成し、その二本鎖ＤＮＡを本
酵素により切断し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、切断断片の鎖長を測定すで切断されたスポッ
トとして検出され、またＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによ
るプランティング処理により４ｂｐ短いスポットとして
検出されたことより、本酵素は、 ■ を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
３ｍｐ１８−重鎖ＤＮＡと、５′末端塩基を放射性リン
酸化したブライマー （５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）を
７二−）しＬ 大ｍｒＡ ＤＮＡポリメラーゼＩクレノ
ー断片により、二本鎖を合成し、その二本鎖ＤＮＡを本
酵素により切断し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、切断断片の鎖長を測定すで切断されたスポッ
トとして検出され、またＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによ
るプランティング処理により４ｂｐ短いスポットとして
検出されたことより、本酵素は、 ■ を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
（２）至適酵素活性条件
■）至適温度
Ｓｓｅ ８３８７ Ｉの至適温度は約３７℃であった。
■）至適ｐＨ
５ｓｅ ８３８７ Ｉの至適ｐＨは、ｐＨ７，０〜９．
０の範囲にある。
０の範囲にある。
■）塩濃度
Ｓｓｅ ８３８７ Ｉの至適塩濃度は、ＮａＣ１の場合
、０〜１５０ｍＭであった。
、０〜１５０ｍＭであった。
■）ＭｇＣｊ！、 ａ度
Ｓｓｅ ８３８７ ＩはＭｇＣＪ、濃度が５ｍＭ〜２０
ｍＭの存在下で酵素反応が活性化された。
ｍＭの存在下で酵素反応が活性化された。
■粉子量
Ｓｓｅ ８３８７ Ｉはセファデックスに −２００を
用いたゲルろ過方法で、分子量１２万〜１４万である。
用いたゲルろ過方法で、分子量１２万〜１４万である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 １
３０１容のジャーファーメンタ−に下記第３表に示す培
地２０１を仕込み常法により培地を滅菌した。
地２０１を仕込み常法により培地を滅菌した。
上記と同じ培地で３０℃で４８時間振とぅ培養したスト
レプトマイセス エスピー８３８７（ＦＥＲＭＰ−１１
４９６）の種培養液５． ＯＯｒｎｌを上記ジャーファ
ーメンタ−に移植し、通気量０、５ ＶＶＯＩ １かく
はん数２５ Ｏｒｐｍ、 ３０℃で１８時間培養を行っ
た。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液２０
１がら湿重址にして約４８０ｇの菌体が得られた。
レプトマイセス エスピー８３８７（ＦＥＲＭＰ−１１
４９６）の種培養液５． ＯＯｒｎｌを上記ジャーファ
ーメンタ−に移植し、通気量０、５ ＶＶＯＩ １かく
はん数２５ Ｏｒｐｍ、 ３０℃で１８時間培養を行っ
た。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液２０
１がら湿重址にして約４８０ｇの菌体が得られた。
第 ３ 表
グルコース １０ｇ
酵母エキス １０ｇ
ポリペプトン ＩＯＪ
食塩 ５ｇ
脱イオン水 ｌｌ
ｐＨ７，２
得られた菌体のうち、７２Ｉの菌体を３６０ゴの緩衝液
Ａに懸濁し、超音波破砕機を用いて破砕後、１００００
０Ｘｐで１時間遠心分離を行い、残渣を除去、抽出液４
００ｄを得た。得られた抽出液に４ｇのストレプトマイ
シンを添加し、４℃、１時間放置後、１００ＯＯＸ、９
で１０分遠心分離を行い、上清を回収した。得られた上
清に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加え、
沈殿物を遠心分離にて集め、緩衝液Ａ ＋０．２ Ｍ
ＫＣＩに溶解後、同緩衝液で一晩透析を行った。
Ａに懸濁し、超音波破砕機を用いて破砕後、１００００
０Ｘｐで１時間遠心分離を行い、残渣を除去、抽出液４
００ｄを得た。得られた抽出液に４ｇのストレプトマイ
シンを添加し、４℃、１時間放置後、１００ＯＯＸ、９
で１０分遠心分離を行い、上清を回収した。得られた上
清に硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように加え、
沈殿物を遠心分離にて集め、緩衝液Ａ ＋０．２ Ｍ
ＫＣＩに溶解後、同緩衝液で一晩透析を行った。
次に透析内液を予め０．２ＭＫＣ７を含む緩衝液Ａで平
衡化させておいたホスホセルロース（ソットマン製品ｐ
Ｈ）１００−のカラムに吸着させ、０．２ＭＫＣ７を含
む緩衝液Ａで洗浄後、０．２Ｍ〜１．０ＭＫＣ／の直線
濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させた。得られた活性画
分を合せ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で平衡化し
たヒドロ午シアパタイト（バイオラッド製品）３０ゴの
カラムに吸着させ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で
洗浄後、１０〜５００ｍＭの直線濃度勾配を持つリン酸
カリウム緩衝液で溶出させた。
衡化させておいたホスホセルロース（ソットマン製品ｐ
Ｈ）１００−のカラムに吸着させ、０．２ＭＫＣ７を含
む緩衝液Ａで洗浄後、０．２Ｍ〜１．０ＭＫＣ／の直線
濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させた。得られた活性画
分を合せ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で平衡化し
たヒドロ午シアパタイト（バイオラッド製品）３０ゴの
カラムに吸着させ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で
洗浄後、１０〜５００ｍＭの直線濃度勾配を持つリン酸
カリウム緩衝液で溶出させた。
得られた活性画分を合せ緩衝液Ａで４時間透析後、透析
内液を予め緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セファロー
ス（ファルマシア製品）３０ｔｎｌのカラムに吸着させ
、緩衝液Ａで十分洗浄後、０．２〜０．８ＭのＫＣｌの
直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出し、本酵素の標品を
得た。
内液を予め緩衝液Ａで平衡化したヘパリン−セファロー
ス（ファルマシア製品）３０ｔｎｌのカラムに吸着させ
、緩衝液Ａで十分洗浄後、０．２〜０．８ＭのＫＣｌの
直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出し、本酵素の標品を
得た。
この酵素標品には非特異的なりＮＡ分解酵素及びホスフ
ァターゼはきょう雑してぃなかった。
ァターゼはきょう雑してぃなかった。
以上述べた方法により７２９の湿菌体より５０万単位の
活性が得られた。
活性が得られた。
以上詳細に説明したとおり、本発明により二重鎖ＤＮＡ
の８塩基配列認織し、切断する制限酵素が提供された。
の８塩基配列認織し、切断する制限酵素が提供された。
本発明の酵素は遺伝子工学の分野において、長鎖ＤＮＡ
の解析等に非常に有用である。
の解析等に非常に有用である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、二重鎖デオキシリボ核酸中の下記塩基配列を特異的
に認識し、かつ特異的に切断する能力を有することを特
徴とする制限酵素。 ５′−ＣＣＴＧＣＡＧＧ−３′ ３′−ＧＧＡＣＧＴＣＣ−５′ （式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｔはチミン、Ｃ
はシトシンを示す） ２、該制限酵素が下記理化学的性質を有する制限酵素Ｓ
ｓｅ８３８７Ｉである請求項１記載の制限酵素。 （イ）至適温度：約３７℃ （ロ）至適ｐＨ：７．０〜９．０ （ハ）分子量：１２万〜１４万 ３、請求項１記載の制限酵素を含有していることを特徴
とする遺伝子工学用試薬。 ４、ストレプトマイセス属に属し、請求項１に記載の制
限酵素を生産する菌株を培養し、培養物より請求項１に
記載の制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の
製造方法。５、ストレプトマイセス属に属する請求項１
に記載の制限酵素の生産菌。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2166164A JPH0669373B2 (ja) | 1990-06-25 | 1990-06-25 | 新規制限酵素 |
| EP91303882A EP0464990B1 (en) | 1990-06-25 | 1991-04-29 | New restriction enzyme |
| DE69113690T DE69113690T2 (de) | 1990-06-25 | 1991-04-29 | Restriktionsenzym. |
| US07/698,780 US5179016A (en) | 1990-06-25 | 1991-05-13 | Restriction enzyme sse 8387i |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2166164A JPH0669373B2 (ja) | 1990-06-25 | 1990-06-25 | 新規制限酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0458884A true JPH0458884A (ja) | 1992-02-25 |
| JPH0669373B2 JPH0669373B2 (ja) | 1994-09-07 |
Family
ID=15826266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2166164A Expired - Fee Related JPH0669373B2 (ja) | 1990-06-25 | 1990-06-25 | 新規制限酵素 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5179016A (ja) |
| EP (1) | EP0464990B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0669373B2 (ja) |
| DE (1) | DE69113690T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5391487A (en) * | 1993-08-13 | 1995-02-21 | Promega Corporation | Restriction endonuclease SgfI from Streptomyces griseoruber |
| JP3017019B2 (ja) * | 1994-07-28 | 2000-03-06 | 寳酒造株式会社 | 新規制限酵素 |
| US7713617B2 (en) * | 2004-05-10 | 2010-05-11 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Recording media for electrophotographic printing |
-
1990
- 1990-06-25 JP JP2166164A patent/JPH0669373B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-04-29 DE DE69113690T patent/DE69113690T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-04-29 EP EP91303882A patent/EP0464990B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-13 US US07/698,780 patent/US5179016A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0669373B2 (ja) | 1994-09-07 |
| EP0464990B1 (en) | 1995-10-11 |
| EP0464990A2 (en) | 1992-01-08 |
| DE69113690D1 (de) | 1995-11-16 |
| DE69113690T2 (de) | 1996-04-18 |
| EP0464990A3 (en) | 1992-04-15 |
| US5179016A (en) | 1993-01-12 |
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