JP3092817B2 - 制限酵素の製造方法 - Google Patents
制限酵素の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学用試薬として
有用な制限酵素の製造方法に関し、更に詳細にはアシデ
ィフィリウム属の細菌の生産する制限酵素の製造方法に
関する。
有用な制限酵素の製造方法に関し、更に詳細にはアシデ
ィフィリウム属の細菌の生産する制限酵素の製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】制限酵素とはデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）上のある特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断す
るエンド型ヌクレアーゼである。分子遺伝学や生化学等
の発達により、ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体であるこ
とが明らかになって以来、制限酵素は遺伝病解明のため
の利用や、遺伝子操作による遺伝物質の大量生産への利
用等現在広く用いられている有用な酵素である。制限酵
素は種々の微生物より単離されており、その認識する塩
基配列、切断様式により現在までに約１５０種類が知ら
れている。これまでに
Ａ）上のある特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断す
るエンド型ヌクレアーゼである。分子遺伝学や生化学等
の発達により、ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体であるこ
とが明らかになって以来、制限酵素は遺伝病解明のため
の利用や、遺伝子操作による遺伝物質の大量生産への利
用等現在広く用いられている有用な酵素である。制限酵
素は種々の微生物より単離されており、その認識する塩
基配列、切断様式により現在までに約１５０種類が知ら
れている。これまでに
【０００３】
【化２】
【０００４】（式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、
Ｔはチミジン、Ｃはシチジンを示す。）という塩基配列
を認識し、矢印の位置で切断する制限酵素（以下本酵素
と称する）として、エスシェリシア コリ ＲＦＬ４７
（Escherichia coli RFL４７）が生産するEco ４７III
が知られている〔フェブス レターズ（FEBS Letters）
１６１巻、Ｐ２１３〜２１６、１９８３年〕。
Ｔはチミジン、Ｃはシチジンを示す。）という塩基配列
を認識し、矢印の位置で切断する制限酵素（以下本酵素
と称する）として、エスシェリシア コリ ＲＦＬ４７
（Escherichia coli RFL４７）が生産するEco ４７III
が知られている〔フェブス レターズ（FEBS Letters）
１６１巻、Ｐ２１３〜２１６、１９８３年〕。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はEco ４
７III と同様の塩基配列の認識部位および切断部位を有
する制限酵素の工業的生産に適した製造方法を提供する
ことにある。
７III と同様の塩基配列の認識部位および切断部位を有
する制限酵素の工業的生産に適した製造方法を提供する
ことにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】概説すれば、本発明はア
シディフィリウム属に属し、下記ヌクレオチド配列を認
識し、式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産
能を有する細菌を培養し、得られた培養物より下記ヌク
レオチド配列を認識し、式中矢印の部位で特異的に切断
する制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製
造方法に関する。
シディフィリウム属に属し、下記ヌクレオチド配列を認
識し、式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産
能を有する細菌を培養し、得られた培養物より下記ヌク
レオチド配列を認識し、式中矢印の部位で特異的に切断
する制限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製
造方法に関する。
【０００７】
【化３】
【０００８】（式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、
Ｔはチミジン、Ｃはシチジンを示す。）
Ｔはチミジン、Ｃはシチジンを示す。）
【０００９】本発明者らはEco ４７III 同様の塩基配列
の認識部位および切断部位を有する制限酵素が新たにア
シディフィリウム属細菌によって生産されること、かつ
該細菌は該制限酵素以外の制限酵素を生成しないことか
ら精製を容易に行うことができることを見出し本発明を
完成した。
の認識部位および切断部位を有する制限酵素が新たにア
シディフィリウム属細菌によって生産されること、かつ
該細菌は該制限酵素以外の制限酵素を生成しないことか
ら精製を容易に行うことができることを見出し本発明を
完成した。
【００１０】以下本発明を詳細に説明する。本発明で使
用する微生物はアシディフィリウム属に属する本酵素生
産菌は全て使用できるが、例えばアシディフィリウム
オルガノフォルム（Acidiphilium organovorum）５１Ｈ
がある。本菌は、鉱山廃液中より分離された菌株で、そ
の菌学的性質は、以下の通りである。
用する微生物はアシディフィリウム属に属する本酵素生
産菌は全て使用できるが、例えばアシディフィリウム
オルガノフォルム（Acidiphilium organovorum）５１Ｈ
がある。本菌は、鉱山廃液中より分離された菌株で、そ
の菌学的性質は、以下の通りである。
【００１１】本菌は、好気性菌で、グラム陰性、胞子形
成能はない。本菌は、pH 3.0で生育し、pH 8.1では生育
しない。カタラーゼ活性（＋）、オキシダーゼ活性
（−）、ウレアーゼ活性（−）であり、馬尿酸は加水分
解される。0.25mM酢酸、２mM乳酸、４mMコハク酸で、生
育は完全に阻害される。炭素源として、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、イノシトール、グリセロール、Ｄ
−及びＬ−アラビノース、リボース、Ｄ−及びＬ−キシ
ロース、ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ラムノー
ス、ソルビトール、アドニトール、マニトール、Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−オルニシン、Ｌ−アルギ
ニン、及びＬ−グルタミン酸が利用されるが、メタノー
ルは利用されない。ＤＮＡのＧＣ含量は、67.2％であ
る。主要なイソプレノイドとして検出されるのは、ユビ
キノン−１０である。主な脂肪酸は、Ｃ18：2 である
が、ラウリン酸（Ｃ12：0 ）も検出される。
成能はない。本菌は、pH 3.0で生育し、pH 8.1では生育
しない。カタラーゼ活性（＋）、オキシダーゼ活性
（−）、ウレアーゼ活性（−）であり、馬尿酸は加水分
解される。0.25mM酢酸、２mM乳酸、４mMコハク酸で、生
育は完全に阻害される。炭素源として、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、イノシトール、グリセロール、Ｄ
−及びＬ−アラビノース、リボース、Ｄ−及びＬ−キシ
ロース、ガラクトース、Ｄ−フルクトース、ラムノー
ス、ソルビトール、アドニトール、マニトール、Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−オルニシン、Ｌ−アルギ
ニン、及びＬ−グルタミン酸が利用されるが、メタノー
ルは利用されない。ＤＮＡのＧＣ含量は、67.2％であ
る。主要なイソプレノイドとして検出されるのは、ユビ
キノン−１０である。主な脂肪酸は、Ｃ18：2 である
が、ラウリン酸（Ｃ12：0 ）も検出される。
【００１２】以上の性質により本菌株は、アシディフィ
リウム オルガノフォルムに属する菌株と要約される。
リウム オルガノフォルムに属する菌株と要約される。
【００１３】本菌株はAcidiphilium organovorum５１Ｈ
と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研
菌寄１２０２０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０２０）とし
て、寄託されている。
と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研
菌寄１２０２０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２０２０）とし
て、寄託されている。
【００１４】この菌の培養を行う場合には、培地組成と
しては使用微生物が資化でき、かつ本酵素を生産する炭
素源、窒素源および無機塩等を適宜組合わせて使用す
る。培地のpHは2.5 〜5.5 が好ましい。培養法としては
振盪培養、攪拌培養、通気培養を用いることができる
が、大量に培養するには通気攪拌培養が好ましい。培養
温度は酵素を生産する範囲で変更することができるが、
特に好ましくは２８℃〜３９℃である。培養時間は、培
養条件により異なり、本酵素の生産量が最高に達するま
で培養を行う。本酵素は主として菌体内に生産される。
しては使用微生物が資化でき、かつ本酵素を生産する炭
素源、窒素源および無機塩等を適宜組合わせて使用す
る。培地のpHは2.5 〜5.5 が好ましい。培養法としては
振盪培養、攪拌培養、通気培養を用いることができる
が、大量に培養するには通気攪拌培養が好ましい。培養
温度は酵素を生産する範囲で変更することができるが、
特に好ましくは２８℃〜３９℃である。培養時間は、培
養条件により異なり、本酵素の生産量が最高に達するま
で培養を行う。本酵素は主として菌体内に生産される。
【００１５】培養液からの菌体の分離はたとえば遠心分
離により行うことができる。本酵素の抽出、精製は一般
の制限酵素精製法に従った方法で行える。例えば、菌体
を緩衝液に懸濁後、超音波破砕機により破砕し、細胞内
酵素の抽出を行う。次に細胞残渣を超遠心分離により除
去後、抽出液をポリエチレンイミンにて除核酸後、硫酸
アンモニウムで塩析する。沈殿物をリン酸カリウム緩衝
液（pH7.5）に溶解し、同緩衝液にて透析を行う。得ら
れる透析内液をフォスフォセルロース、ＤＥＡＥ−セル
ロースのイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセフ
ァロースのアフィニティクロマトグラフィーを用いた精
製法で本制限酵素を得る。
離により行うことができる。本酵素の抽出、精製は一般
の制限酵素精製法に従った方法で行える。例えば、菌体
を緩衝液に懸濁後、超音波破砕機により破砕し、細胞内
酵素の抽出を行う。次に細胞残渣を超遠心分離により除
去後、抽出液をポリエチレンイミンにて除核酸後、硫酸
アンモニウムで塩析する。沈殿物をリン酸カリウム緩衝
液（pH7.5）に溶解し、同緩衝液にて透析を行う。得ら
れる透析内液をフォスフォセルロース、ＤＥＡＥ−セル
ロースのイオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセフ
ァロースのアフィニティクロマトグラフィーを用いた精
製法で本制限酵素を得る。
【００１６】次に本酵素の活性測定法を示す。下記表１
に示す組成の反応液５０μｌを予め３７℃で予熱した
後、本酵素を加え酵素反応を進める。６０分後に酵素反
応停止液（１％ＳＤＳ、５０％グリセロール、0.02％ブ
ロムフェノールブルー）を５μｌ添加して反応を停止さ
せる。
に示す組成の反応液５０μｌを予め３７℃で予熱した
後、本酵素を加え酵素反応を進める。６０分後に酵素反
応停止液（１％ＳＤＳ、５０％グリセロール、0.02％ブ
ロムフェノールブルー）を５μｌ添加して反応を停止さ
せる。
【００１７】
【００１８】反応液を１％アガローススラブゲルに重層
し、１０Ｖ／cmの定電圧下で約１時間から２時間、電気
泳動を行う。電気泳動用緩衝液は９０mMトリス−ほう酸
緩衝液（pH 8.3）2.5mM ＥＤＴＡを用いる。ゲルに前も
って0.5 μｇ／mlのエチジウムブロマイドを含ませてお
くことによりＵＶ照射でＤＮＡのバンドが検出可能であ
る。ＤＮＡフラグメントのバンドの数と量が変化しなく
なった時を終点とする。
し、１０Ｖ／cmの定電圧下で約１時間から２時間、電気
泳動を行う。電気泳動用緩衝液は９０mMトリス−ほう酸
緩衝液（pH 8.3）2.5mM ＥＤＴＡを用いる。ゲルに前も
って0.5 μｇ／mlのエチジウムブロマイドを含ませてお
くことによりＵＶ照射でＤＮＡのバンドが検出可能であ
る。ＤＮＡフラグメントのバンドの数と量が変化しなく
なった時を終点とする。
【００１９】活性の定義は３７℃で１時間に１μｇのλ
−ＤＮＡを完全に分解する酵素活性を１単位とする。
−ＤＮＡを完全に分解する酵素活性を１単位とする。
【００２０】本発明により得られた本酵素は以下のよう
な理化学的性質を持っている。
な理化学的性質を持っている。
【００２１】（１）作用および基質特異性 本酵素は、２本鎖デオキシリボ核酸中の
【００２２】
【化４】
【００２３】という塩基配列を認識し、矢印の位置で切
断する酵素で、公知の制限酵素Eco ４７III のアイソシ
ゾマーである。その根拠は、以下の通りである。
断する酵素で、公知の制限酵素Eco ４７III のアイソシ
ゾマーである。その根拠は、以下の通りである。
【００２４】本酵素は、λ−ＤＮＡ、Ｍ１３mp１８ＤＮ
Ａを各２カ所、pBR ３２２ＤＮＡを４カ所切断した。し
かし、φｘ１７４ＤＮＡ、ColE１ＤＮＡは切断しなかっ
た。さらに既知の制限酵素Eco ４７III をそれら基質に
作用させ、本酵素の切断数及び、それらの切断パターン
と比較したところ、同一の結果を示した。以上の結果か
ら、本酵素は、ＤＮＡ配列中の５’−ＡＧＣＧＣＴ−
３’を認識している事が示唆された。
Ａを各２カ所、pBR ３２２ＤＮＡを４カ所切断した。し
かし、φｘ１７４ＤＮＡ、ColE１ＤＮＡは切断しなかっ
た。さらに既知の制限酵素Eco ４７III をそれら基質に
作用させ、本酵素の切断数及び、それらの切断パターン
と比較したところ、同一の結果を示した。以上の結果か
ら、本酵素は、ＤＮＡ配列中の５’−ＡＧＣＧＣＴ−
３’を認識している事が示唆された。
【００２５】本酵素の切断部位の決定は以下の通り行っ
た。Sma Ｉサイトに、Hae IIリンカ−（５’−ＡＡＧＣ
ＧＣＴＴ−３’）を挿入したＭ１３mp１８一本鎖ＤＮＡ
と、５’末端塩基を放射性リン酸化したプライマー（Ｍ
１３プライマーＭ４：宝酒造製品）をアニール後、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片により、２本鎖を
合成し、その２本鎖ＤＮＡを本酵素により切断し、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、切断断片の鎖
長を測定する方法を用い行った。この時、生成物として
得られた鎖長は
た。Sma Ｉサイトに、Hae IIリンカ−（５’−ＡＡＧＣ
ＧＣＴＴ−３’）を挿入したＭ１３mp１８一本鎖ＤＮＡ
と、５’末端塩基を放射性リン酸化したプライマー（Ｍ
１３プライマーＭ４：宝酒造製品）をアニール後、大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー断片により、２本鎖を
合成し、その２本鎖ＤＮＡを本酵素により切断し、変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、切断断片の鎖
長を測定する方法を用い行った。この時、生成物として
得られた鎖長は
【００２６】
【化５】
【００２７】の矢印の所で切断されたスポットとして検
出され、またＴ４ＤＮＡポリメラーゼによるブランティ
ング処理を行っても、同じ所で切断されたスポットとし
て検出されたことより、本酵素は、
出され、またＴ４ＤＮＡポリメラーゼによるブランティ
ング処理を行っても、同じ所で切断されたスポットとし
て検出されたことより、本酵素は、
【００２８】
【化６】
【００２９】という塩基配列を認識し、矢印の位置で切
断する酵素で、公知の制限酵素Eco ４７III のアイソシ
ゾマーである。
断する酵素で、公知の制限酵素Eco ４７III のアイソシ
ゾマーである。
【００３０】（２）至適酵素活性条件 I ）至適温度 本酵素の至適温度は約４５℃であった。 II）至適pH 本酵素の至適pHは、pH 8.0〜9.0 の範囲にある。 III）至適NaCl濃度 本酵素の至適NaCl濃度は６０〜８０mMであった。 IV）MgCl2 濃度 本酵素のMgCl2 濃度が５mM〜１０mMの存在下で酵素反応
が活性化される。
が活性化される。
【００３１】（３）分子量 本酵素の分子量はゲル濾過法〔スーパーロース（ファル
マシア製品１２）〕による測定で約８２０００である。
マシア製品１２）〕による測定で約８２０００である。
【００３２】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００３３】実施例 １ ２００ｌ容のジャーファーメンターに下記表２に示す培
地１６０ｌを仕込み、常法により培地を滅菌した。上記
と同じ培地で３０℃で２４時間振盪培養したアシディフ
ィリウム オルガノフォルム５１Ｈ（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２０２０）の種培養液4.5 ｌを上記ジャーファーメンタ
ーに移植し、通気量２／３vvm 、攪拌数２５０rpm 、３
０℃で３９時間培養を行った。次いで冷却遠心機を用い
て菌体を得た。培養液１６０ｌから湿重量にして約２０
２ｇの菌体が得られた。
地１６０ｌを仕込み、常法により培地を滅菌した。上記
と同じ培地で３０℃で２４時間振盪培養したアシディフ
ィリウム オルガノフォルム５１Ｈ（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２０２０）の種培養液4.5 ｌを上記ジャーファーメンタ
ーに移植し、通気量２／３vvm 、攪拌数２５０rpm 、３
０℃で３９時間培養を行った。次いで冷却遠心機を用い
て菌体を得た。培養液１６０ｌから湿重量にして約２０
２ｇの菌体が得られた。
【００３４】
【００３５】得られた１００ｇの菌体を１０００mlの抽
出緩衝液（１０mMトリス−HCl 、pH7.5、１０mM ２−
メルカプトエタノール）に懸濁し、超音波破砕機を用い
て破砕後、１０００００×ｇで１時間遠心分離を行い、
残渣を除去、抽出液を得た。得られた抽出液に１０％ポ
リエチレンイミン溶液を終濃度１％になるように加え、
析出した沈殿物を遠心分離にて除去した。その上清に硫
酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、沈殿物
を遠心分離にて集め、緩衝液Ａ（１０mMリン酸カリウム
緩衝液、pH7.5、１０mM ２−メルカプトエタノール、
５％グリセロール）に溶解後、同緩衝液で一晩透析を行
った。次に透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておい
たフォスフォセルロース（ワットマン製品Ｐ１１）のカ
ラム（３０×１４０mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄
後、０〜1.0 Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩
衝液Ａで溶出させると0.2 〜0.5 Ｍの塩化カリウム濃度
画分に本酵素の活性が検出できた。次に得られた活性画
分を合わせ緩衝液Ａで透析後、透析内液を予め緩衝液Ａ
で平衡化させておいたＤＥＡＥ−セルロース（ワットマ
ン製品ＤＥ５２）のカラム（２０×６５mm）に吸着さ
せ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜0.5 Ｍのリン酸緩衝液の直
線濃度勾配にて溶出させると５０〜１００mMのリン酸緩
衝液の濃度画分に本酵素の活性が検出できた。次に得ら
れた活性画分を合わせ緩衝液Ａで一晩透析後、透析内液
を予め緩衝液Ａで平衡化させておいたヘパリンセファロ
ース（ファルマシア製品、ＣＬ６Ｂ）のカラム（１０×
１３０mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜0.5 Ｍ
の塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出さ
せると0.3 〜0.4 Ｍの塩化カリウム濃度画分に本酵素の
活性が検出できた。次に得られた活性画分を合わせ５０
％グリセロールを含む緩衝液Ａで透析を行い、２倍に濃
縮し、本酵素の最終標品として得た。この酵素標品には
非特異的なＤＮＡ分解酵素およびフォスファターゼは夾
雑していなかった。以上述べた方法により１００ｇの湿
菌体より５００００００単位の活性単位を得た。
出緩衝液（１０mMトリス−HCl 、pH7.5、１０mM ２−
メルカプトエタノール）に懸濁し、超音波破砕機を用い
て破砕後、１０００００×ｇで１時間遠心分離を行い、
残渣を除去、抽出液を得た。得られた抽出液に１０％ポ
リエチレンイミン溶液を終濃度１％になるように加え、
析出した沈殿物を遠心分離にて除去した。その上清に硫
酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、沈殿物
を遠心分離にて集め、緩衝液Ａ（１０mMリン酸カリウム
緩衝液、pH7.5、１０mM ２−メルカプトエタノール、
５％グリセロール）に溶解後、同緩衝液で一晩透析を行
った。次に透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておい
たフォスフォセルロース（ワットマン製品Ｐ１１）のカ
ラム（３０×１４０mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄
後、０〜1.0 Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩
衝液Ａで溶出させると0.2 〜0.5 Ｍの塩化カリウム濃度
画分に本酵素の活性が検出できた。次に得られた活性画
分を合わせ緩衝液Ａで透析後、透析内液を予め緩衝液Ａ
で平衡化させておいたＤＥＡＥ−セルロース（ワットマ
ン製品ＤＥ５２）のカラム（２０×６５mm）に吸着さ
せ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜0.5 Ｍのリン酸緩衝液の直
線濃度勾配にて溶出させると５０〜１００mMのリン酸緩
衝液の濃度画分に本酵素の活性が検出できた。次に得ら
れた活性画分を合わせ緩衝液Ａで一晩透析後、透析内液
を予め緩衝液Ａで平衡化させておいたヘパリンセファロ
ース（ファルマシア製品、ＣＬ６Ｂ）のカラム（１０×
１３０mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜0.5 Ｍ
の塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出さ
せると0.3 〜0.4 Ｍの塩化カリウム濃度画分に本酵素の
活性が検出できた。次に得られた活性画分を合わせ５０
％グリセロールを含む緩衝液Ａで透析を行い、２倍に濃
縮し、本酵素の最終標品として得た。この酵素標品には
非特異的なＤＮＡ分解酵素およびフォスファターゼは夾
雑していなかった。以上述べた方法により１００ｇの湿
菌体より５００００００単位の活性単位を得た。
【００３６】
【発明の効果】以上詳細に説明したとおり、本発明によ
りEco ４７III と同様の塩基配列の認識部位および切断
部位を有する制限酵素の工業的に有利な製造法が提供さ
れた。
りEco ４７III と同様の塩基配列の認識部位および切断
部位を有する制限酵素の工業的に有利な製造法が提供さ
れた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 浩之 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 君塚 房夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 アシディフィリウム属に属し、下記ヌク
レオチド配列を認識し、式中矢印の部位で特異的に切断
する制限酵素生産能を有する細菌を培養し、得られた培
養物より下記ヌクレオチド配列を認識し、式中矢印の部
位で特異的に切断する制限酵素を採取することを特徴と
する制限酵素の製造方法。 【化１】 （式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジ
ン、Ｃはシチジンを示す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03093489A JP3092817B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 制限酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03093489A JP3092817B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 制限酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04304886A JPH04304886A (ja) | 1992-10-28 |
| JP3092817B2 true JP3092817B2 (ja) | 2000-09-25 |
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ID=14083759
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03093489A Expired - Fee Related JP3092817B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | 制限酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3092817B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| AU5820200A (en) * | 1999-07-15 | 2001-02-05 | Bae-Lee, Myongsuk | Membrane separation process for purifying, concentrating and densifying enzyme solutions with polyols |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP03093489A patent/JP3092817B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04304886A (ja) | 1992-10-28 |
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