JPH02255086A - 新規制限酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規な制限酵素及びその製造法に関するもので
ある。

［従来の技術］ 制限酵素とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）上のある特
定の塩基配列を認識し、この配列内または近傍の二本鎖
を切断するエンドヌクレアーゼである。

この酵素は、その酵素活性に高い基質特異性と再現性を
有しており、遺伝子の単離、塩基配列の解析やタンパク
質の構造解析を初め、遺伝物質の大量生産などの遺伝子
操作を行う上で不可欠である。

また、今後の遺伝病の解明や治療、遺伝子の人工変換等
に重大な産業的意義を有する試薬である。

制限酵素は種々の微生物より単離されており、その認識
する塩基配列、切断様式により、現在までに約１００種
類が知られている。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、既に発見された制限酵素は理論上考えられる種
類の酵素の半分はどでしかない。

したがって、本発明は従来知られていないまったく新し
い認識塩基配列を有する新規制限酵素及びその工業的生
産方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者等は有能な制限酵素の開発の目的で多数の制限
酵素生産菌の研究を行った結果、アグロバタテリウム属
に属する菌が、従来より知られていない認識塩基を認識
するまったく新しい制限酵素を生産することを突止め、
本発明を完成するに至った。

本発明の新規制限酵素Ａｇｅ　Ｉは次の酵素化学的諸性
質を有するものである。

ａ）作用及び基質特異性 制限酵素Ａｇｅ　Ｉは二本鎖デオキシリボ核酸中の↓ ↑ （式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジ
ン、Ｃはシチジンを示す） という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断する酵素で
ある。制限酵素Ａｇｅ　Ｉの認識部位の決定のため、大
腸菌ファージλＤＮＡ　、大腸菌ファージφＸ１７４Ｒ
ＦＤＮＡ　、大腸菌ファージＭ１３ｍｐ１８ＲＦＤＮＡ
、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの各ＤＮＡの切
断数を調べた。その結果、λＤＮＡのみ１０〜１５箇所
切断し、その他のＤＮＡは切断していなかった。これを
ファックスのデータ（Ｇｅｎｅ、　１９８０．１０．３
７１）に照らし合わせたところ、制限酵素Ａｇｅ　Ｉは
５’−ＡＣＣＧＧＴ一３′　または５’−ＡＴＧＣＡＴ
−３’　のいずれかの塩基配列を認識していると推定さ
れた。

そこで、５’−ＡＴＧＣＡＴ−３’　　という塩基配列
を認識切断する制限酵素ＥｃｏＴ２２　Ｉと大腸菌ファ
ージλＤＮＡを用い、制限酵素Ａｇｅ　Ｉとのダブルダ
イゼッションを行った。その結果、制限酵素ＡｇｅＩの
みで生成される切断片と異なり、制限酵素ＡｇｅＩは５
’−ＡＴＧＣＡＴ−３’　　という塩基配列を認識して
いないことが明らかになった。

切断点の決定は次の方法で行った。まず、制限酵素ＡＨ
Ｉで一箇所のみ切断される大腸菌プラスミドｐＢＲ３２
８ＤＮＡを制限酵素Ａｇｅ　Ｉで切断し、切断末端のリ
ン酸をアルカリフォスファターゼで除いた。次にポリヌ
クレオチドカイネース及び「γ３２Ｐ」アデノシン三リ
ン酸を用いて、・・ＤＮＡ断片の５′末端に放射性リン
酸を付加した。この放射性リン酸を付加したＤＮＡ断片
を制限酵素ＥＣＯＲＩで切断し、生成された２断片をポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分離・分取した。各々
のＤＮＡ断片をマクサム・ギルバート法によりその５′
末端からの塩基配列を調べた。これらの実験から制限酵
素ＡｇｅＩは ↓ ↑ という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断していると
判明した。

ｂ）酵素反応の至適条件及び酵素の安定性至適ｐＨ制限
酵素ＡｇｅＩの至適ｐＨは７．５であった。

安定ｐＨ１制限酵素Ａｇｅ　Ｉは４°Ｃ２４時間の処理
において、ｐＨ５，０〜８．０の間で安定であった。

至適温度：制限酵素Ａｇｅ　Ｉの至適温度は３０’Ｃで
あった。

安定温度・４５℃、５分間の加熱でも高い活性を示した
。

安定塩濃度・塩化ナトリウム濃度０〜１５０ｍＭで高い
活性を示した。

本発明の新規制限酵素の製造法は、アグロバクテリウム
属に属する制限酵素Ａｇｃ　Ｉ生産菌を栄養培地で培養
し、培養物より制限酵素Ａｇｅ　Ｉを採取することを特
徴とするものである。

本発明で使用する微生物はアグロバクテリウム属に属す
るＡｇｅ　Ｉ生産菌であればいずれでも良いが、例えば
海水中より分離された東京大学応用微生物研究所保存菌
アグロバクテリウム・ゲラチノバルムＩＡＭ１２６１７
　（Ａｇ＋ｏｂａｃｌｅ＋ｉｕｍ　ｇｅｌａｔｉｎｏｖ
ｏｒｕｍＩＡＭ１２６１７）である。培養法に制限はな
く、通常行われるアグロバクテリウム属細菌の培養法で
増殖可能であるものなら何でもよい。

例えば、炭素源及び窒素源としてペプトン、アミノ酸及
び酵母エキスなど、その他の炭素源としてグルコースな
どの糖類及び有機酸など、その他の窒素源として硫酸ア
ンモニウムや硝酸ナトリウムなどの無機塩類、そしてそ
の他の無機塩類として塩化ナトリウムや塩化マグネシウ
ム、リン酸カリウムなどを用いる。

本酵素の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に従った方
法で行える。すなわち、培養菌体は常法に従って集菌し
、超音波処理などの方法により菌体を破砕する。破砕の
後、遠心分離などの方法で無細胞抽出液を得る。この抽
出液をイオン交換クロマトグラフィー法、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィー法、ゲルろ過性、アフィニ
ティークロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー
法の組合わせにより精製を行い、制限酵素Ａｇｅ　Ｉを
得る。

Ａｇｅ　Ｉの活性測定を次の通り行った。ｌ０ｍＭト’
Ｊス塩酸（ｐＨ７，５）　、７ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール、７ｍＭ塩化マグネシウム、５０ＩＩＩＭ塩化
ナトリウム、１ｇｇλＤＮＡからなる反応系に、酵素を
加えて全量を５０μＣとし、３７℃で１時間反応させた
。反応液に１％ＳＤＳ　　（ドデシル硫酸ナトリウム）
、５０％グリセロール、０．１％ＢＩ’Ｂ　　（ブロモ
フェノールブルー）からなる酵素反応停止液を５μＣ加
えて反応を停止させた。反応液中の大腸菌ファージλＤ
ＮＡを０．５μｇ／ｍｅのエチジウムブロマイドを含ま
せた１％アガロースゲル電気泳動にて分離し、ＵＶ照射
でＤＮＡのバンドの数と量が変化しなくなった時を終点
とした。上記反応において１ｇｇλＤＮＡを完全に切断
する酵素活性を１単位とした。

［実施例］ アグロバクテリウム・ゲラチノバルムｌＡＭ１２６１７
は１．５％アガロースを含むスラント用調整海水培地（
表１）にて３０°０４８時間培養し、４℃でこれを保存
した。この保存菌を調整海水培地に１白金耳植え、振と
う培養法にて３０°Ｃ２４〜４８時間前培養を行った。

この前培養液を本培養培地の１／１０量添加し３０’０
２４時間振とう培養を行った。遠心分離で菌体を集め、
約２５ｇの湿菌体を得た。

表１　調整海水培地（ｐＨ７，５）　Ｉ　Ｑ中の組成ペ
プトン　　　　　　５、Ｏｇ 酵母エキス　　　　　１．０ｇ 海　　　水　　　　　　　７５０　ｍｌＬ得られた菌体
に緩衝液Ａ（］ＯｍＭ）’Ｊス塩酸、　ｐＨ７，５，７
ｍＭ　２−メルカプトエタノール）　２００ｍ１２を加
え、超音波で処理し、菌体を破砕した。遠心分離で無細
胞抽出液を得、１（ｌ　ＯｍＭとなるように塩化ナトリ
ウムを加え、１％ストレプトマイシンによる除核酸を行
った。この処理液を２５〜５５％（Ｗ／Ｖ）の硫酸アン
モニウム塩析画分を制限酵素画分として得た。この制限
酵素画分を緩衝液Ｂ　（１０ｍＭ）リス塩酸、　ｐＨ７
，５，７ｍＭ塩化マグネシウム、７ｍＭ　２メルカプト
エタノール、３％（Ｖ／Ｖ）グリセロール）　３０　ｍ
Ｑに溶解させ、同緩衝液３Ｑ、で一夜透析した。

この透析後の制限酵素画分を以下の各クロマトグラフィ
ー（ファルマシア社製）にて精製を行った。

まずこの透析液を緩衝液Ｂで平衡したＨｅｐａｒｉｎＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ　　（アフィニティーク
ロマトグラフィー）に吸着させた。０〜ＩＭ塩化ナトリ
ウムの直線的濃度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出させ、４５
０〜５００ｍＭ塩化ナトリウム濃度に制限酵素画分を得
た。この制限酵素画分を緩衝液Ｂに一夜透析した。

この制限酵素画分を緩衝液Ｂで平衡したＤＥＡＥＳｅｐ
ｈａ＋ｏｓｅ　Ｃ１，−ｆｉＢ　（イオン交換クロマト
グラフィー）に吸着させ、０〜１Ｍ塩化ナトリウムの直
線的濃度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出を行った。２００〜
２５０ｍＭ塩化ナトＩＪウム濃度に制限酵素画分を得た
。この制限酵素画分を緩衝液Ｂｌで一夜透析した。

この制限酵素画分を緩衝液Ｂで平衡したＭｏｎｏＱＦＰ
ＬＣ（イオン交換、ファースト・プロティン・リキッド
・クロマトグラフィー）に吸着させ、０〜６００ｍＭ塩
化ナトリウムの直線的濃度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出を
行った。１５０〜２００ｍＭ塩化ナトリウム濃度に制限
酵素画分を得た。

得られた制限酵素画分を５０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール
を含む緩衝液Ｂで一夜透析を行い、最終酵素標品とした
。ＭＯＩＩＯＱ画分において、非特異的なりＩＪＡ分解
酵素はほとんど見られなかった。

［発明の効果］ 上述した本発明により、まったく新しい認識塩基配列を
有する新規制限酵素Ａｇｅ　Ｉ及びその製造が可能とな
った。

特許出願人　　　日新製糖株式会社 代理人弁理士　　吉　　村　　　悟 手　　続　　補　　正　　書 事件の表示　　平成１年特許願第７７８１、発明の名称 新規制限酵素及びその製造法 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 東京都中央区日本橋小網町１４番１号 日新製糖株式会社 代表者森永為貴

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の酵素化学的諸性質を有する新規制限酵素Ａｇ
   ｅ I イ）作用及び基質特異性 二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 【遺伝子配列があります】 を認識し、かつこれを矢印の位置で切断す る。 （式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジ
   ン、Ｃはシチジンを示す） ロ）至適ｐＨ７．５ ハ）安定ｐＨ５．０〜８．０ ニ）至適温度３０℃ ホ）安定温度４５℃ 但し、５分間の加熱による。 へ）安定塩濃度０〜１５０ｍＭ 但し、塩化ナトリウムによる。
2. （２）アグロバクテリウム属に属する制限酵素Ａｇｅ
   I 生産菌を栄養培地で培養し、培養物より制限酵素Ａｇ
   ｅ I を採取することを特徴とする制限酵素Ａｇｅ I の
   製造法。
3. （３）アグロバクテリウム属に属する制限酵素Ａｇｅ
   I 生産菌が、アグロバクテリウム・ゲラチノバルム　Ｉ
   ＡＭ１２６１７である請求項第（２）項に記載の製造法
   。