JPS6357038B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は新規制限酵素及びその製造法に関し、
更に詳細にはミクロバクテリウム属の細菌の生産
する新規制限酵素Mfl及び製造法に関する。 従来の技術 制限酵素とはデオキシリボ核酸（DNA）上の
ある特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断する
エンド型ヌクレアーゼである。分子遺伝学や生化
学等の発達により、DNAが遺伝をつかさどる本
体であることが明らかになつて以来、制限酵素は
遺伝病解明のための利用や、遺伝子操作による遺
伝物質の大量生産への利用等現在広く用いられて
いる有用な酵素である。制限酵素は種々の微生物
より単離されており、その認識する塩基配列、切
断様式により現在までに約100種類が知られてい
る。 という塩基配列を認識し、矢印の印置で、切断す
る制限酵素として、キサントモナス・ホルシコラ
（Xanthomonas holcicola）ATCC13461が生産
するXhoがある。 発明が解決しようとする問題点 Xhoではその生産量が低いこと、またXho

【式】の混入があり除去が困難であ ることなど工業化には問題がある。またXhoは
認識塩基配列中のＡがメチル化されている場合も
上記と同様の位置で切断する。 本発明の目的は従来知られているXhoより基
質特異性の高い新規制限酵素及びその工業的生産
に適した製造法を提供することにある。 問題点を解決するための手段 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は下
記の理化学的性質を有する新規制限酵素Mflに
関する。 (イ) 作用及び基質特異性 二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する。
認識塩基配列中のＡがメチル化されている場合
は作用しない。 （式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔ
はチミジン、Ｃはシチジン、Puはアデノシン
またはグアノシン、Pyはチミジンまたはシチ
ジンを示す） (ロ) 至適PH 8.0〜8.5 (ハ) 安定PH 6.0〜9.5 (ニ) 至適温度 約45℃ (ホ) 分子量 100000±20000 また本発明の第２の発明は新規制限酵素Mfl
の製造法に関し、ミクロバクテリウム属に属する
制限酵素Mfl生産菌を栄養培地で培養し、培養
物より制限酵素Mflを採取することを特徴とす
る。 本発明で使用する微生物はミクロバクテリウム
属に属するMfl生産菌は全て使用できるが、一
例として東京大学応用微生物研究所保存菌ミクロ
バクテリウム・フラバム（Microbacterium
flavum）IAM1642がある。培養はジヤーフアー
メンターを用いた通常の培養方法で行い、培養終
了後、遠心分離にて培養液から菌体を取得する。 本酵素の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に
従つた方法で行なえる。すなわち、菌体を緩衝液
に懸濁後、超音波処理により破砕し、細胞内酵素
の抽出を行う。次に細胞残渣を超遠心分離により
除去後、抽出液を硫酸アンモニウムで塩析する。
沈澱物をリン酸カリウム緩衝液（PH7.5）に溶解
し、同緩衝液にて透析を行う。得られる透析内液
をホスホセルロース、DEAE−セルロースのイオ
ン交換クロマトグラフイー、ヘパリンセフアロー
スのアフイニテイクロマトグラフイーを用いた精
製法で本制限酵素を得る。 Mflの活性測定方法を示す。下記表１に示す
組成の反応液50μを予め37℃で予熱した後、本
酵素を加え酵素反応を進める。60分後に酵素反応
停止液（１％SDS、50％グリセロール、0.02％ブ
ロムフエノールブルー）を5μ添加して反応を
停止させる。 表 １ 10ｍＭ トリス−HCl、PH7.5 ７ｍＭ MgCl₂ ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール 0.01％ 牛血清アルブミン 1.0μｇ Dam^-λ−DNA（ニユーイングバイオラ
ボ製品） 反応液を１％アガローススラブゲルに重層し、
10V／cmの定電圧下で約１時間から２時間、電気
泳動を行う。電気泳動用緩衝液は90ｍＭトリス−
ほう酸緩衝液（PH8.3）2.5ｍＭ EDTAを用い
る。 ゲルに前もつて0.5μｇ／cmのエチジウムブロマ
イドを含まてておくことにより、UV照射で
DNAのバンドが検出可能である。DNAフラグメ
ントのバンドの数と量が変化しなくなつた時を終
点とする。 活性の定義は37℃で１時間に1μｇのDam^-λ−
DNAを完全に分解する酵素活性を１単位とする。 本発明により得られた制限酵素Mflは以下の
ような理化学的性質を持つている。 (1) 作用及び基質特異性 本酵素は二本鎖デオキシリブ核酸中の という塩基配列を認識切断する酵素で、公知の
制限酵素Xhoとアイソシゾマーである。ま
た、認識配列中のＡがメチル化されていると切
断できない。 本発明の制限酵素Mflの認識部位の決定は
Dam⁺λ−DNA（宝酒造製品）とDam^-λ−
DNAを基質に用いて行つた。その結果、本酵
素はDam^-λ−DNAを切断し15本以上のフラグ
メントを生成したが、Dam⁺λ−DNAは切断し
なかつたことからDam遺伝子により認識され
Ａがメチル化を受ける塩基配列5′−GATC−
3′が本酵素の認識部位内に存在することが示唆
された。そこで全塩基配列が既知である
λDNA上で5′−NGATCN−3′のＮを変え、そ
の位置をコンピユーターで検索し、得られたパ
ターンと本酵素による切断パターンを比較した
結果、本酵素による切断パターンは、
PuGATCPyのパターンと一致した。さらに
PuGATCPyを認識切断する既知制限酵素Xho
を−λ−DNAに作用させ、Mflのそれと
切断パターンを比較したところ同一パターンを
示しした。以上の結果から本酵素の認識する
DNA上のヌクレオチド配列は5′−PuGATCPy
−3′であると結論された。 本発明の制限酵素Mflの切断部位の決定に
は、Dam^-λ−DNAを、本酵素で切断したのち
得られるフラグメントの5′末端塩基を決定する
方法と、Mfl認識部位をもつオリゴヌクレオ
チドを合成し、これに本酵素を作用させ生成物
の鎖長から切断部位を決定する方法を用いた。 詳細は以下のとおりである。 すなわち、λ−DNAを本酵素標品で完全に
分解する、これをアルカリフオスフアターゼ
（宝酒造製品）で処理して、DNAフラグメント
の末端のリン酸を取り除く。その後、ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造製品）と〔γ−
³²P〕アデノシン三リン酸を用いてDNAフラグ
メントの末端に放射性リン酸を付加する。これ
をP1ヌクレアーゼ（ヤマサ製品）でモノヌク
レオチドにまで分解する。これをPEI−セルロ
ース薄層プレート（マシエレイ・ナゲル社製
品）を用いて分析した。この時検出された標識
された5′−モノヌクレオチドはグアノシンであ
つた。 一方、セルフコンプリメンタリーの構造をも
つ２種のオリゴヌクレオチドｄ
（CCGGATCCGG）とｄ（GCAGATCTGC）を
固相法により合成しポリヌクレオチドキナーゼ
と〔γ− ³²P〕アデノシン三リン酸を用いて
5′末端に放射性リン酸を付加する。各々のオリ
ゴヌクレオチドをアニーリングさせて二本鎖
DNAとした後、Mflで切断し、DEAE−セ
ルロース薄層プレート（マシエレイ・ナゲル社
製品）により分析した。この時、生成物として
鎖長三塩基（5′−CCGと5′−GCA）の標識され
たスポツトが検出された。 このことから本酵素は を認識し矢印の位置で切断していると結論され
た。 (2) 至適酵素活性条件 (i) 至適温度 Mflの至適温度は約45℃であつた。 (ii) 至適PH Mflの至適PHはPH8.0〜8.5の範囲にある。 (iii) 塩濃度 NaCl、KCl濃度について両者とも40ｍＭ
までは活性は維持されるが、それ以上の濃度
で阻害される。 (iv) MgCl₂濃度 MgCl₂濃度が７ｍＭ〜20ｍＭの存在下で酵
素反応が活性化される。 (v) 安定PH Mflの安定PHは6.0〜9.5である。 (3) 分子量 TSKgelG300SW〔東洋曹達(株)〕を用いたゲ
ル過法で100000±20000であつた。 実施例 以下、本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。 実施例 １ ミクロバクテリウム・フラバムIAM1642を下
記表２に示す組成の培地50lで26℃にて17時間通
気撹拌培養を行い、その後冷却遠心機を用いて菌
体を得る。培養液50から湿重量にして約300ｇ
の菌体が得られた。 表 ２ ポリペプトン 10ｇ イーストエキス 5ｇ NaCl 5ｇ グルコース 1ｇ 脱イオン水 1 PH 7.3 得られた300ｇの菌体を1400mlの抽出緩衝液
（20ｍＭトリス−HCl、PH7.5、10ｍM2−メルカ
プトエタノール）に懸濁し、超音波破砕機を用い
て破砕後、100000×ｇで１時間遠心分離を行い、
残渣を除去、抽出液を得た。 得られた抽出液に、硫酸アンモニウムを80％飽
和になるように加え、沈澱物を遠心分離にて集
め、緩衝液Ａ（10ｍＭリン酸カリウム緩衝液、PH
7.5、10ｍM2−メルカプトエタノール、５％グリ
セロール）に溶解後、同緩衝液Ａで一晩透析を行
つた。 次に透析内液を、予め緩衝液Ａで平衡化させて
おいたホスホセルロース（ワツトマンＰ−11）の
カラム（50×110mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗
浄後、０〜0.6Mの塩化カリウムの直線濃度勾配
を持つ緩衝液Ａで溶出させると、0.13〜0.26Mの
塩化カリウム濃度画分にMflの活性が検出でき
た。 次にこの活性画分を合わせ緩衝液Ａで一晩透析
後、透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておい
たDEAE−セルロース（ワツトマンDE52）のカ
ラム（20×120mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄
後、０〜0.5Mの塩化カリウムの直線濃度勾配を
持つ緩衝液Ａで溶出させると0.02〜0.10Mの塩化
カリウム濃度画分にMflの活性が検出できた。 次に、得られた活性画分を合わせ緩衝液Ｂ（20
ｍＭリン酸カリウム緩衝液、PH7.5、10ｍM2−メ
ルカプトエタノール、10％グリセロール）で一晩
透析後、透析内液を予め緩衝液Ｂで平衡化させて
おいたヘパリン−セフアロース（フアルマシア
CL6B）のカラム（７×140mm）に吸着させ、緩
衝液Ｂで洗浄液０〜0.6Mの塩化カリウムの直線
濃度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出させると、0.13〜
0.18Mの塩化カリウム濃度画分にMflの活性が
検出できた。 次に得られた活性画分を合わせ、50％グリセロ
ールを含む緩衝液Ａで透析を行い、２倍に濃縮
し、Mflの最終標品として得た。 この酵素標品には非特異的なDNA分解酵素及
びホスフアターゼは夾雑していなかつた。 以上述べた方法により300ｇの湿菌体より
190000単位の活性単位が得られ、22％の収量で比
活性は790倍に精製された。 発明の効果 以上詳細に説明したとおり、本発明により従来
知られていなかつた基質特異性を有する新規制限
酵素Mfl及びその工業的に有利な製造法が提供
された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有する制限酵素Mfl (イ) 作用及び基質特異性 二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する。
   認識塩基配列中のＡがメチル化されている場合
   は作用しない。 （式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔ
   はチミジン、Ｃはシチジン、Puはアデノシン
   またはグアノシン、Pyはチミジンまたはシチ
   ジンを示す） (ロ) 至適PH 8.0〜8.5 (ハ) 安定PH 6.0〜9.5 (ニ) 至適温度 約45℃ (ホ) 分子量 100000±20000 ２ ミクロバクテリウム属に属する制限酵素Mfl
   生産菌を栄養培地で培養し、培養物より制限酵
   素Mflを採取することを特徴とする制限酵素
   Mflの製造法。 ３ ミクロバクテリウム属に属する制限酵素Mfl
   生産菌がミクロバクテリウム・フラバム
   （IAM1642）である特許請求の範囲第２項記載の
   製造法。