JPS5860986A - 新規制限酵素及びその製造法 - Google Patents
新規制限酵素及びその製造法Info
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- JPS5860986A JPS5860986A JP56157448A JP15744881A JPS5860986A JP S5860986 A JPS5860986 A JP S5860986A JP 56157448 A JP56157448 A JP 56157448A JP 15744881 A JP15744881 A JP 15744881A JP S5860986 A JPS5860986 A JP S5860986A
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- JP
- Japan
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- enzyme
- restricted enzyme
- bifidobacterium breve
- bbel
- restriction enzyme
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な制限酵素及びその製造方法に関す基もの
である。
である。
制限酵素は２本領デオキシリｌＩｍ酸（Ｄ Ｎ Ａ）の
中の特定の塩基配列を認識してこれを特定の・部位で切
断するエンドヌクレアーゼ型ＤＮＡ分解酵素である０こ
の酵素祉その特異な酵素作用に基づき特定の生物種のＤ
ＮＡを認識して特定の大きさのＤＮＡ断片に切断するこ
とができるから、ＤＮＡの構造と機能の解析、塩基配列
の決定、遺伝子の単離などの試薬として有用なだけでな
く、命後きわめて重要な産業的意義を持つ遺伝子の人工
的変換のための試１！Ｔｈして不可欠のものである。
中の特定の塩基配列を認識してこれを特定の・部位で切
断するエンドヌクレアーゼ型ＤＮＡ分解酵素である０こ
の酵素祉その特異な酵素作用に基づき特定の生物種のＤ
ＮＡを認識して特定の大きさのＤＮＡ断片に切断するこ
とができるから、ＤＮＡの構造と機能の解析、塩基配列
の決定、遺伝子の単離などの試薬として有用なだけでな
く、命後きわめて重要な産業的意義を持つ遺伝子の人工
的変換のための試１！Ｔｈして不可欠のものである。
本発明者らはこのように実用性に富む重要な生化学試薬
としての制限酵素を、微生物を利用して製造する方法に
つき研究を重ね、特に■非病原性であること、■培養が
容易で菌体を大量に取憎できること、■制限酵素生産量
が多く精製が容易であること、などを指標として腸内細
Ｍを中心に制限酵素生産菌の検索を行なってきた。その
結果、ビフィドバクテリウムに属する細−がきわめて安
定で取扱いや保存が容易な種々の制限酵素を産生ずるこ
とを見いだし、中でもビアイドバクテリウム・ブレーベ
にムする細菌が、これまでに知られてψない制限酵素を
産生ずることを見いだし、本発明を完成するに至った。
としての制限酵素を、微生物を利用して製造する方法に
つき研究を重ね、特に■非病原性であること、■培養が
容易で菌体を大量に取憎できること、■制限酵素生産量
が多く精製が容易であること、などを指標として腸内細
Ｍを中心に制限酵素生産菌の検索を行なってきた。その
結果、ビフィドバクテリウムに属する細−がきわめて安
定で取扱いや保存が容易な種々の制限酵素を産生ずるこ
とを見いだし、中でもビアイドバクテリウム・ブレーベ
にムする細菌が、これまでに知られてψない制限酵素を
産生ずることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、新規制限酵素Ｂｂｅｉ及びこれをビ
フィドバクテリウム・ブレーベを利用して製造する方法
を提供するものである。
フィドバクテリウム・ブレーベを利用して製造する方法
を提供するものである。
制限酵素Ｂ ｂｅ ｌｉｄ次のような理化学的性質を持
ち、作用及び基質特異性の点で新規な酵素と認められる
ものである。
ち、作用及び基質特異性の点で新規な酵素と認められる
ものである。
（１） 作用及び基質特異性
この酵素による種々の基質ＤＮＡの切断個所の数は第１
表のとおりである。
表のとおりである。
第 １ 表
また塩基配列
↑
をｇ鎗し、矢印で示したＣ−０間のホスホジエステル結
合を切断し、３′末端に４塩基の長さ０１本鎖を持つＤ
ＮＡを生成する。
合を切断し、３′末端に４塩基の長さ０１本鎖を持つＤ
ＮＡを生成する。
（２） 至適ｐＨニア、４付近（安定なｐＨ６，５〜
８．３）（Ｊ） 至適温度：３５〜３９℃ （４）阻害、活性化及び安定化 １〜１５ ｍＭ （Ｑ Ｍｇｌ＋４オンで活性化される
が、ＡＴＰ＋８−アデノシルメチオニンのようなコファ
クターを必要としな−０また塩化す）ＩＪつＪ等の塩は
阻害的に働く。
８．３）（Ｊ） 至適温度：３５〜３９℃ （４）阻害、活性化及び安定化 １〜１５ ｍＭ （Ｑ Ｍｇｌ＋４オンで活性化される
が、ＡＴＰ＋８−アデノシルメチオニンのようなコファ
クターを必要としな−０また塩化す）ＩＪつＪ等の塩は
阻害的に働く。
上述のようなａｍ酵素Ｂｂｅｌｔ本発明の方法により製
造するには、まずビアイドバクテリウム・ブレーベに属
するＢｂｅｌ生産菌、例えばビフィドバクテリウム・ブ
レーベＹＩＴ−４００６（ＩＩ工研薗寄第３９０６号）
を培養する。培養法にｉｉ特に制限はなく、ビフィドバ
クテリウム薗につき周知の培養法に従≠、用φる菌が増
殖可能な培地及び培養条件下に、通常は菌の増殖が定常
期初期に達するまで培養を行えばよ−。培養終了後は常
法により集菌し、得られた菌体をその４１ま、ある−は
リゾチーム処理した後、超音波波砕し次いで遠心分離す
るなどの方法で無細胞抽出液を得る。こノ抽出液をスト
レプトマイシン硫酸塩で処理し、更に硫酸アンモニウム
で分画した後、ホスホセルロース、ＤＥＡＲ−セルワー
スなどを用いるイオン交換りｐマド法、ヘパリンアガロ
ース、ＤＮＡ−セルロースなどを用いるアフィニティー
クロマト法、又はこれらの方法の組合せにより精製して
Ｂｂｅｌを得る。
造するには、まずビアイドバクテリウム・ブレーベに属
するＢｂｅｌ生産菌、例えばビフィドバクテリウム・ブ
レーベＹＩＴ−４００６（ＩＩ工研薗寄第３９０６号）
を培養する。培養法にｉｉ特に制限はなく、ビフィドバ
クテリウム薗につき周知の培養法に従≠、用φる菌が増
殖可能な培地及び培養条件下に、通常は菌の増殖が定常
期初期に達するまで培養を行えばよ−。培養終了後は常
法により集菌し、得られた菌体をその４１ま、ある−は
リゾチーム処理した後、超音波波砕し次いで遠心分離す
るなどの方法で無細胞抽出液を得る。こノ抽出液をスト
レプトマイシン硫酸塩で処理し、更に硫酸アンモニウム
で分画した後、ホスホセルロース、ＤＥＡＲ−セルワー
スなどを用いるイオン交換りｐマド法、ヘパリンアガロ
ース、ＤＮＡ−セルロースなどを用いるアフィニティー
クロマト法、又はこれらの方法の組合せにより精製して
Ｂｂｅｌを得る。
このように本発明は取扱い及び培養が容易なビフィドバ
クテリウム菌を用φて新規な制限酵素を提供することに
成功したもので、制限酵素を必要とする学術研究及び各
種産業に貢献するところ大なものである。
クテリウム菌を用φて新規な制限酵素を提供することに
成功したもので、制限酵素を必要とする学術研究及び各
種産業に貢献するところ大なものである。
以下実施例を示して本発明を説明する。なお実施例中で
示した「力価」−は次のような方法で測定した値である
。
示した「力価」−は次のような方法で測定した値である
。
力価測定法： ＩＯＤＩＭ）！Ｊスス−酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，４） 、８ｍＭ ＭｇＣｌ、、７ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、大腸菌プラスミドｐＢＲｓ２２ １μ
ｇを含む反応液に酵素を加えて５０μｔとし、３７℃で
１時間反応させた後、反応生成物をアガロースゲル電気
泳動法で分析７る。上記条件において１μｍ１０ｐＢＲ
３２２ＤＮＡを完全に断片化する酵素活性を１単位とす
る。
Ｈ７，４） 、８ｍＭ ＭｇＣｌ、、７ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、大腸菌プラスミドｐＢＲｓ２２ １μ
ｇを含む反応液に酵素を加えて５０μｔとし、３７℃で
１時間反応させた後、反応生成物をアガロースゲル電気
泳動法で分析７る。上記条件において１μｍ１０ｐＢＲ
３２２ＤＮＡを完全に断片化する酵素活性を１単位とす
る。
実１４Ｍ ！
ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ−４００６（微
工研菌寄第３９０６号）を巌酸ガ冬噴射法で嫌気性とし
髪下記の組成のＶＬＧ培地にＭ１楓し、３７℃で約１５
時間嫌気培養して前培養液を＃た。
工研菌寄第３９０６号）を巌酸ガ冬噴射法で嫌気性とし
髪下記の組成のＶＬＧ培地にＭ１楓し、３７℃で約１５
時間嫌気培養して前培養液を＃た。
ビーフェキストラクト ２ｇトリプディナー
ス １０ ｇイーストエキス
５ｇＫ冨ＨＰＯ番水溶液（濃度ａｏｇ／ｇ
７．５ｍ塩 溶 液※ ７．５
ｍ１０．１％レサズリン溶液 １１１ｊイオ
ン交換水 ９１４ ｄグルコース
１０ ｇｏ、０７％ヘミン溶液
１９６７３％システィン塩酸塩溶液 １０
１１１７８％Ｎ ａ 黛ＣＯａ水溶液 ５０
１１１７＊ 壌溶液組成 ＫＨ，Ｐｏ、 ３０ ｇ（ＮＨ，）Ｒ
８０，ｓ ｏ ｇ ＮａＣｌ ６Ｇ １Ｍｇ８０． 。
ス １０ ｇイーストエキス
５ｇＫ冨ＨＰＯ番水溶液（濃度ａｏｇ／ｇ
７．５ｍ塩 溶 液※ ７．５
ｍ１０．１％レサズリン溶液 １１１ｊイオ
ン交換水 ９１４ ｄグルコース
１０ ｇｏ、０７％ヘミン溶液
１９６７３％システィン塩酸塩溶液 １０
１１１７８％Ｎ ａ 黛ＣＯａ水溶液 ５０
１１１７＊ 壌溶液組成 ＫＨ，Ｐｏ、 ３０ ｇ（ＮＨ，）Ｒ
８０，ｓ ｏ ｇ ＮａＣｌ ６Ｇ １Ｍｇ８０． 。
７Ｈ，０３ｇ
ＣａＣｌ、−２Ｈ，０３ｇ
イオン交換水 １ｔ
これを同組成のＶＬＧ培地に、その１ ／ ２５０量接
種し、３７℃て約１５時間嫌気培養して定常期初期の培
養液を得た。この培養液から冷却遠心機を用いて集菌し
て得られた菌体的６０ｇを４倍量（Ｄ Ｏ，４Ｍ Ｎ
ａ Ｃ１及びｏｌｖｎＭ）ｘ＝ニルメチルスルニルフ
ルオライドを含む緩衝液Ａ（１゜ｍＭリン讃カリ緩衝液
＊ ｐ Ｈ７，Ｏ＃ ｙ ｍＭ ／ −メルカプトエ
タノール、１ｍＭ ’ＢＤＴＡ）に懸濁し、卵白リゾチ
ーム（ｔｏｏｘｇ／ｍ）を加え、氷水中で３０分間処理
して細胞壁を部分分解した後、超音波処理して菌体を破
砕し、超遠心分離し゛【＃細胞抽出液を得た。この後シ
下紀の処理をナベて０〜５℃で行なった。まず無細胞抽
出液にｌＯメストレプトマイシン硫酸塩を最終濃度が１
．２襲になるように攪拌しながら徐々に加え、更に３０
分間攪拌した後、遠心分離して沈殿を除いた。得られた
上澄液を硫酸アンモニウムで分画し、大部分の制限酵素
活性を含む４０〜６０％飽和画分を集め、これｔ／）＞
ｉｉめ食塩を含む上記緩衝浪人に溶解し、同じ緩衝液に
対して一夜透析した。透析画分を１あらかじめ０． Ｉ
Ｍ Ｎ ａ Ｃｌを含む緩衝浪人で平衡化したホスホ
セルロースカラム（ｐＨ。
種し、３７℃て約１５時間嫌気培養して定常期初期の培
養液を得た。この培養液から冷却遠心機を用いて集菌し
て得られた菌体的６０ｇを４倍量（Ｄ Ｏ，４Ｍ Ｎ
ａ Ｃ１及びｏｌｖｎＭ）ｘ＝ニルメチルスルニルフ
ルオライドを含む緩衝液Ａ（１゜ｍＭリン讃カリ緩衝液
＊ ｐ Ｈ７，Ｏ＃ ｙ ｍＭ ／ −メルカプトエ
タノール、１ｍＭ ’ＢＤＴＡ）に懸濁し、卵白リゾチ
ーム（ｔｏｏｘｇ／ｍ）を加え、氷水中で３０分間処理
して細胞壁を部分分解した後、超音波処理して菌体を破
砕し、超遠心分離し゛【＃細胞抽出液を得た。この後シ
下紀の処理をナベて０〜５℃で行なった。まず無細胞抽
出液にｌＯメストレプトマイシン硫酸塩を最終濃度が１
．２襲になるように攪拌しながら徐々に加え、更に３０
分間攪拌した後、遠心分離して沈殿を除いた。得られた
上澄液を硫酸アンモニウムで分画し、大部分の制限酵素
活性を含む４０〜６０％飽和画分を集め、これｔ／）＞
ｉｉめ食塩を含む上記緩衝浪人に溶解し、同じ緩衝液に
対して一夜透析した。透析画分を１あらかじめ０． Ｉ
Ｍ Ｎ ａ Ｃｌを含む緩衝浪人で平衡化したホスホ
セルロースカラム（ｐＨ。
ワットマン、ｔｓｘｓａａ）に吸着させ、洗浄後０．１
〜０．６ＭＮａＣ１の直線的濃度勾配を持つ緩−液入で
溶出させると、０．２９〜０．３４Ｍ ＮａＣ１−メル
カプトエタノール、ｔｔｎＭ ＢＤＴＡ）に対して一
夜透析し、透析画分を、あらかじめ緩衝液Ｂで平衡化し
たＤＥＡＢ −セルロースカラム（１）ｈ５２．’７７
トマン＊ １−ＯＸ ２００１）に吸着させ、緩衝液Ｂ
で洗浄後、ｏ〜ｏ、ｓＭ ＮａＣ１の直線的濃度勾配を
持つ緩衝液Ｂで溶出させると、０、２１〜０．２４５
Ｍ Ｎａ Ｃｌ濃度Ｏ１ｉ分に活性＃回収された・この
活性画分を集め、ＮａＣ１濃度を０．２５ＭＫ調整し、
コレをあらかじめ０．２５ＭＮａＣｌ を含む緩衝液
Ｂで平衡化したヘパリン−七７アロースＣＬ −ｓ Ｂ
カラム（ファーマシアｔ、ｏｘｓ、５ａａ） ＫｔＭ着
させ、洗浄後、０．２５〜０．７５ＭＮａＣ１の直線的
濃度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出８Ｊすると０．３３〜０
．４ ｉ Ｍ ＮａＣ１１ｌ［の−分に活性が溶出した
。この活性画分を集め一夜緩衝液ＢＫ対して透析し、透
析画分をあらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したＤＮＡ−セル
ロースカラム（ｔｏｘｓｍ）に吸着させ、洗浄後ｏ 〜
ｏ、 ｓ ＭＮａｅｌ の直線的濃度勾配をもつ緩衝液
Ｂで溶出させると、０．０７〜θ、１１ＭＮａＣｌ濃度
ノ画分Ｋ１１ｍ！酵素Ｂｂｅｌの強い活性が回収された
（収量約１万単位）。
〜０．６ＭＮａＣ１の直線的濃度勾配を持つ緩−液入で
溶出させると、０．２９〜０．３４Ｍ ＮａＣ１−メル
カプトエタノール、ｔｔｎＭ ＢＤＴＡ）に対して一
夜透析し、透析画分を、あらかじめ緩衝液Ｂで平衡化し
たＤＥＡＢ −セルロースカラム（１）ｈ５２．’７７
トマン＊ １−ＯＸ ２００１）に吸着させ、緩衝液Ｂ
で洗浄後、ｏ〜ｏ、ｓＭ ＮａＣ１の直線的濃度勾配を
持つ緩衝液Ｂで溶出させると、０、２１〜０．２４５
Ｍ Ｎａ Ｃｌ濃度Ｏ１ｉ分に活性＃回収された・この
活性画分を集め、ＮａＣ１濃度を０．２５ＭＫ調整し、
コレをあらかじめ０．２５ＭＮａＣｌ を含む緩衝液
Ｂで平衡化したヘパリン−七７アロースＣＬ −ｓ Ｂ
カラム（ファーマシアｔ、ｏｘｓ、５ａａ） ＫｔＭ着
させ、洗浄後、０．２５〜０．７５ＭＮａＣ１の直線的
濃度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出８Ｊすると０．３３〜０
．４ ｉ Ｍ ＮａＣ１１ｌ［の−分に活性が溶出した
。この活性画分を集め一夜緩衝液ＢＫ対して透析し、透
析画分をあらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したＤＮＡ−セル
ロースカラム（ｔｏｘｓｍ）に吸着させ、洗浄後ｏ 〜
ｏ、 ｓ ＭＮａｅｌ の直線的濃度勾配をもつ緩衝液
Ｂで溶出させると、０．０７〜θ、１１ＭＮａＣｌ濃度
ノ画分Ｋ１１ｍ！酵素Ｂｂｅｌの強い活性が回収された
（収量約１万単位）。
代理人 弁理士 板 井 −壜
Claims (1)
- （１）２本鎖デオキシリポ核酸中の塩基配列↑ を認識し且つこれを矢印の位置で特異的に切断し３′末
端に４塩基の長さの１本鎖を持つＤＮＡ断片を生成する
新規制限酵素Ｂｂｅ１０（２）２本鎖デオキシリボ核酸
中の塩基配列↑ を認識し且つこれを矢印の位置で特異的に切断し３′末
端に４塩基の長さの１本鎖を持つＤＮＡ断片を生成する
制限酵素Ｂｂｅ ｌ生産能を有するビフィドバクテリウ
ム・ブレーベを培養し、得られ先菌体の無細胞抽出液か
ら制限酵素Ｂｂｅｌを採取することを特徴とする制限酵
素Ｂｂｅｌの製造法０
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56157448A JPS5860986A (ja) | 1981-10-05 | 1981-10-05 | 新規制限酵素及びその製造法 |
| CA000412862A CA1194824A (en) | 1981-10-05 | 1982-10-05 | Restriction enzyme and a method for production thereof |
| EP82305295A EP0076696A3 (en) | 1981-10-05 | 1982-10-05 | A restriction enzyme and a method for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56157448A JPS5860986A (ja) | 1981-10-05 | 1981-10-05 | 新規制限酵素及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5860986A true JPS5860986A (ja) | 1983-04-11 |
| JPS6337626B2 JPS6337626B2 (ja) | 1988-07-26 |
Family
ID=15649874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56157448A Granted JPS5860986A (ja) | 1981-10-05 | 1981-10-05 | 新規制限酵素及びその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0076696A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5860986A (ja) |
| CA (1) | CA1194824A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6115690A (ja) * | 1984-06-29 | 1986-01-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 酵素固定樹脂組成物並びにその製造方法及び再生法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6163286A (ja) * | 1984-08-31 | 1986-04-01 | Takara Shuzo Co Ltd | 新規制限酵素及びその製造法 |
| JPS6178382A (ja) * | 1984-09-27 | 1986-04-21 | Takara Shuzo Co Ltd | 制限酵素の製造法 |
| JPS61115490A (ja) * | 1984-11-09 | 1986-06-03 | Takara Shuzo Co Ltd | 制限酵素の製造法 |
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| US5196328A (en) * | 1987-05-21 | 1993-03-23 | Institute For Cancer Research | Modified cloning vectors for restriction mapping, their preparation and use |
| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56140888A (en) * | 1980-04-02 | 1981-11-04 | Yakult Honsha Co Ltd | Preparation of limiting enzyme |
-
1981
- 1981-10-05 JP JP56157448A patent/JPS5860986A/ja active Granted
-
1982
- 1982-10-05 EP EP82305295A patent/EP0076696A3/en not_active Withdrawn
- 1982-10-05 CA CA000412862A patent/CA1194824A/en not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6115690A (ja) * | 1984-06-29 | 1986-01-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 酵素固定樹脂組成物並びにその製造方法及び再生法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6337626B2 (ja) | 1988-07-26 |
| CA1194824A (en) | 1985-10-08 |
| EP0076696A2 (en) | 1983-04-13 |
| EP0076696A3 (en) | 1983-06-01 |
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