JPS6178382A - 制限酵素の製造法 - Google Patents
制限酵素の製造法Info
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- JPS6178382A JPS6178382A JP59202199A JP20219984A JPS6178382A JP S6178382 A JPS6178382 A JP S6178382A JP 59202199 A JP59202199 A JP 59202199A JP 20219984 A JP20219984 A JP 20219984A JP S6178382 A JPS6178382 A JP S6178382A
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- enzyme
- restriction enzyme
- gluconobacter
- buffer
- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は制限酵素の製造法に関し、更に詳細にはグルコ
ノバクタ−属の細菌の生産する制限酵素の製造法に関す
る。
ノバクタ−属の細菌の生産する制限酵素の製造法に関す
る。
従来の技術
制限酵素とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）上のある特
定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌク
レアーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により、
ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体であることが明らかにな
って以来、制限酵素は遺伝病解明のための利用や、遺伝
子操作による遺伝物質の大量生産への利用゛＆現在広く
用いられている有用な酵素である。制限酵素は種々の微
生物より単離されており、その認識する塩基配列、切断
様式により現在までに約１００種類が知られている。
定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌク
レアーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により、
ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体であることが明らかにな
って以来、制限酵素は遺伝病解明のための利用や、遺伝
子操作による遺伝物質の大量生産への利用゛＆現在広く
用いられている有用な酵素である。制限酵素は種々の微
生物より単離されており、その認識する塩基配列、切断
様式により現在までに約１００種類が知られている。
これまでに
↑
（式中０はシチジン、Ｏはグアノシンを示すという塩基
配列を認識し、矢印の位置で切断する制限酵素（以下本
酵素と称する）として、ストレプトマイセス アクロモ
ゲネス（Ｓｔｒ ａｐｔ ｏｍｙｏ ｅ ｓａｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ） ＡＴＯＯ１２７６７が生産する５ａ
ｃｌお、及びストレプトマイセス スタンフォード（５
ｔｒ６ｐｔｏ ｍｙｏｅａ ５ｔａｎｆｏｒｄ ）の生
産するＳｓｔ ｌ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ、 １１巻、ｒ１３５頁、１９８３年）が知られて
いる。
配列を認識し、矢印の位置で切断する制限酵素（以下本
酵素と称する）として、ストレプトマイセス アクロモ
ゲネス（Ｓｔｒ ａｐｔ ｏｍｙｏ ｅ ｓａｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ） ＡＴＯＯ１２７６７が生産する５ａ
ｃｌお、及びストレプトマイセス スタンフォード（５
ｔｒ６ｐｔｏ ｍｙｏｅａ ５ｔａｎｆｏｒｄ ）の生
産するＳｓｔ ｌ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅｓ、 １１巻、ｒ１３５頁、１９８３年）が知られて
いる。
発明が解決しようとする問題点
５８ｅｌおよびＳｓｔ ｌではその生産量が低いこと、
またＳＢＯＩ またはＳｓｔ ｌの混入があり、除去
が困帷であることなど工業化には間頭がある。
またＳＢＯＩ またはＳｓｔ ｌの混入があり、除去
が困帷であることなど工業化には間頭がある。
を発明の目的はＳａｃ ｌおよびｓｓｔ ｌと同様の塩
基配列の認識部位および切断部位を有する制限酵素の工
業的生産に適した製造法を提供することにある。
基配列の認識部位および切断部位を有する制限酵素の工
業的生産に適した製造法を提供することにある。
問題点を解決するための手段
本発明を概説すれば、本発明はグルコノバクタ−属に属
し、下記ヌクレオチド配列の式中矢印の部位で特異的に
切断する制限酵素以外萌を有する細菌を培養し、得られ
た培養物より下記ヌクレオチド配列の式中矢印の部位で
特異的に切断する制限酵素を採取することを特徴とする
制限酵素の製造法に関する。
し、下記ヌクレオチド配列の式中矢印の部位で特異的に
切断する制限酵素以外萌を有する細菌を培養し、得られ
た培養物より下記ヌクレオチド配列の式中矢印の部位で
特異的に切断する制限酵素を採取することを特徴とする
制限酵素の製造法に関する。
↓
５’−００ＧＯＧＧ−３’
３’−ＧＧＯＧＯＯ−５’
↑
（式中０はシチジン、Ｇはグアノシンを示す）本発明者
らはＳａｃ ｌおよびＳｓｔ ｌと同様の塩基配列の認
識部位および切断部位を有する制限酵素が新たにグルコ
ノバクタ−礪細菌によって生産されること、かつ該細菌
は該制限酵素以外の制限酵素を生成しないことから精製
を容易に行なうことができることを見い出し本発明を完
成した。
らはＳａｃ ｌおよびＳｓｔ ｌと同様の塩基配列の認
識部位および切断部位を有する制限酵素が新たにグルコ
ノバクタ−礪細菌によって生産されること、かつ該細菌
は該制限酵素以外の制限酵素を生成しないことから精製
を容易に行なうことができることを見い出し本発明を完
成した。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明で使用する微生物はグルコノバクタ−属に属する
本酵素生産菌は全て使用できるが、たとえば財団法人発
酵研究所保存菌グルフッバクター アルビダス（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）工？０３２５
１およびグルコノバクタ−セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂ
ａｏｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ ）■ＦＯ３２６２がある
。
本酵素生産菌は全て使用できるが、たとえば財団法人発
酵研究所保存菌グルフッバクター アルビダス（Ｇｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｂｉｄｕｓ）工？０３２５
１およびグルコノバクタ−セリヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂ
ａｏｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ ）■ＦＯ３２６２がある
。
培養を行なう場合には、培地組成としては使用微生物が
資化でき、かつ本酵素を生産する炭素源、窒素源および
無機塩等を適宜組合わせて使用する。培地のｐＨは３．
５〜８，０が好ましい。
資化でき、かつ本酵素を生産する炭素源、窒素源および
無機塩等を適宜組合わせて使用する。培地のｐＨは３．
５〜８，０が好ましい。
培養法としては振盪培養、攪拌培養、通気培養を用いる
ことができるが、 量に培養するには通気攪拌培養が好
ましい。培養温度は酵素を生産する範囲内で変更するこ
とができるが、特に好ましくは２０″Ｃ〜３０゛Ｃであ
る。培養時間は、培養条件により異なり、本酵素の生産
量が最高に達するまで培養を行なう。
ことができるが、 量に培養するには通気攪拌培養が好
ましい。培養温度は酵素を生産する範囲内で変更するこ
とができるが、特に好ましくは２０″Ｃ〜３０゛Ｃであ
る。培養時間は、培養条件により異なり、本酵素の生産
量が最高に達するまで培養を行なう。
本酵素は主として菌体内に生産される。
培養液からの菌体の分離はたとえば遠心分離により行な
うことかできる。
うことかできる。
本酵素の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に従った方
法で行なえる。すなわち、菌体を緩衝液に斐濁後、超音
波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行なら。次に
細胞残渣を超遠心分離により除去後、抽出液を硫醸アン
モニウムで塩析する。沈殿物をリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，５）に溶解し、同綬衝液にて透析を行なう。
法で行なえる。すなわち、菌体を緩衝液に斐濁後、超音
波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行なら。次に
細胞残渣を超遠心分離により除去後、抽出液を硫醸アン
モニウムで塩析する。沈殿物をリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ７，５）に溶解し、同綬衝液にて透析を行なう。
得られる透析内液をＤＩ ＡＲ；−セルロースのイオン
交換クロマトグラフィー、アフィゲルブルーアガロース
、ヘパリンセファロースのアフイニテイクロマトグラフ
イーを用いた精製法で本制限酵素を得る。本酵素の活性
測定法を示す。下記表１に示す組成の反応液５０声ｔを
予め３７゛Ｃで予熱した後、本酵素を加え酵素反応を進
める。
交換クロマトグラフィー、アフィゲルブルーアガロース
、ヘパリンセファロースのアフイニテイクロマトグラフ
イーを用いた精製法で本制限酵素を得る。本酵素の活性
測定法を示す。下記表１に示す組成の反応液５０声ｔを
予め３７゛Ｃで予熱した後、本酵素を加え酵素反応を進
める。
６０分後に酵素反応停止液（１％ＢＤＢ、５０％グリセ
ロール、０．０２％ブロムフェノールブルー）を５ｐｔ
添加して反応を停＋ｈさせる。
ロール、０．０２％ブロムフェノールブルー）を５ｐｔ
添加して反応を停＋ｈさせる。
表 １
１０ｍＭ）リス−Ｈ０Ｉ、ｐＨ８，０
７ｍＭ ＭｇＯ１゜
７ ｍＭ ２−メルカプトエタノール０．０１％
牛血清アルブミン ｉ、ｏメ２ χ−ＤＮＡ （宝酒造製品）反応液を１
％アガローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／ａｍの定電
圧下で約１時間から２時間、電気泳動を行なう。電気泳
動用緩衝液は９０ｍＭトリス−は＞ｍ緩衝液（ｐＨ８，
３） ２．５１１１Ｍ ｇｎＴＡを用いる。
牛血清アルブミン ｉ、ｏメ２ χ−ＤＮＡ （宝酒造製品）反応液を１
％アガローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／ａｍの定電
圧下で約１時間から２時間、電気泳動を行なう。電気泳
動用緩衝液は９０ｍＭトリス−は＞ｍ緩衝液（ｐＨ８，
３） ２．５１１１Ｍ ｇｎＴＡを用いる。
ゲルに前もって０．５ 、ＩＩＦ ／ｍｌのエチジウム
ブロマイドを含ませておくことによりＵＶ照射でＤＮＡ
のバンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメントのバン
ドの数と歓が変化しなくなった時を終点とする。
ブロマイドを含ませておくことによりＵＶ照射でＤＮＡ
のバンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメントのバン
ドの数と歓が変化しなくなった時を終点とする。
活性の定義は３７°（］で１１時に１ｆｉ？のχ−ＤＮ
Ａを完全に分解する酵素活性を１単位とする。
Ａを完全に分解する酵素活性を１単位とする。
本発明により得られた本酵素は以下のような理化学的性
質を持っている。
質を持っている。
（１）作用および基質特異性
本酵素は二本鎖デオキシリポ薩酸中の
↓
↑
という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断する酵素で
、公知の制限酵素Ｓａｃ ｌおよびＳａｔ■とアイソシ
ゾマーである。
、公知の制限酵素Ｓａｃ ｌおよびＳａｔ■とアイソシ
ゾマーである。
本酵素の認識部位の決定はχ−ＤＮＡ％ｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ、 φＸ １７４ ＲＦＩ ＤＮＡ （以上宝
酒造製品）とアデノパイラス−２ＤＮＡ（ベセスダ リ
サーチ ラボラトリ−製品）を基質に用いて行なった。
ＮＡ、 φＸ １７４ ＲＦＩ ＤＮＡ （以上宝
酒造製品）とアデノパイラス−２ＤＮＡ（ベセスダ リ
サーチ ラボラトリ−製品）を基質に用いて行なった。
その結果、本酵素はχ−ＤＮＡを４カ所、φＸ１７４Ｒ
ＦよりＮＡを１カ所切断し、アデノパイラス−２ＤＮＡ
を２５力所以上切断した。しかしｐＢＲ３２２ＤＮＡに
は作用しなかった。さらに既知制限酵素Ｓ＆ｃ ｌをそ
れら基質に作用させ、本酵素のそれと切断パターンを比
較したところ同一のパターンを示した。以上の結果から
本酵素の認識するＤＮＡ上のヌクレオチド配列は５’−
００ＧＯＧＧ−３’であると結論された。
ＦよりＮＡを１カ所切断し、アデノパイラス−２ＤＮＡ
を２５力所以上切断した。しかしｐＢＲ３２２ＤＮＡに
は作用しなかった。さらに既知制限酵素Ｓ＆ｃ ｌをそ
れら基質に作用させ、本酵素のそれと切断パターンを比
較したところ同一のパターンを示した。以上の結果から
本酵素の認識するＤＮＡ上のヌクレオチド配列は５’−
００ＧＯＧＧ−３’であると結論された。
本発明の制限酵素の切断部位の決定には、アデノパイラ
ス−２ＤＮＡを、本酵素で切断したのち得られるフラグ
メントの５′末端塩基を決定する方法と、本酵素認識部
位をもつオリゴヌクレオチドを合成し、これに本酵素を
作用させ生成物の鎖長から切断部位を決定する方法を用
いた。
ス−２ＤＮＡを、本酵素で切断したのち得られるフラグ
メントの５′末端塩基を決定する方法と、本酵素認識部
位をもつオリゴヌクレオチドを合成し、これに本酵素を
作用させ生成物の鎖長から切断部位を決定する方法を用
いた。
詳細は以下のとおりである。
すなわち、γデフバイラス−２ＤＮＡを酵素標品で完全
に分解する。これをアルカリフォスファターゼ（宝酒造
製品）で処理して、ＤＮＡフラグメントの末端のリン酸
を取り除く。
に分解する。これをアルカリフォスファターゼ（宝酒造
製品）で処理して、ＤＮＡフラグメントの末端のリン酸
を取り除く。
その後、ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製品）と〔
γ−３２Ｐ〕アデノシン三リン酸を用いてＤＮＡフラグ
メントの末端に放射性リン酸を付加する。これをＰ１ヌ
クレアーゼ（ヤマサ製品）でモノヌクレオチドにまで分
解する。
γ−３２Ｐ〕アデノシン三リン酸を用いてＤＮＡフラグ
メントの末端に放射性リン酸を付加する。これをＰ１ヌ
クレアーゼ（ヤマサ製品）でモノヌクレオチドにまで分
解する。
これをＰＥｌ−セルロース薄層プレート（マシエレイ
ナゲル社製品）を用いて分析した。
ナゲル社製品）を用いて分析した。
この時検出された標誠された５′モノヌレオチドはグア
ノシンであった。
ノシンであった。
一万、セルフコンプリメンタリ−の構造をもつオリゴヌ
クレオチドｄ （ＧＡＯＯＧＯＧＯＴＯ）を、固相法に
より合成しポリヌクレオチドキナーゼと〔γ−１１ｐ〕
アデノシン三リン酸を用いて５１宋端に放射性リン酸を
付加する。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて二
本鎖ＤＮＡとした後、本酵素で切断し、Ｄｌｌｌ：ＡＪ
−セルロース薄層プレート（マシエレイ ナゲル社製品
）により分析した。この時、生成物として鎖長六塙基（
５’−ＧＡＯＯＧＯ）の標識されたスポットが検出され
た。
クレオチドｄ （ＧＡＯＯＧＯＧＯＴＯ）を、固相法に
より合成しポリヌクレオチドキナーゼと〔γ−１１ｐ〕
アデノシン三リン酸を用いて５１宋端に放射性リン酸を
付加する。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせて二
本鎖ＤＮＡとした後、本酵素で切断し、Ｄｌｌｌ：ＡＪ
−セルロース薄層プレート（マシエレイ ナゲル社製品
）により分析した。この時、生成物として鎖長六塙基（
５’−ＧＡＯＯＧＯ）の標識されたスポットが検出され
た。
このことから本酵素は
↓
↑
を認識し矢印の位置で切断していると結論された。
（２）至適酵素活性条件
■）至適温度
至適温度は約３７“Ｃであった。
■）至適ｐＨ
至適ｐＨは、ｐＨ８，０〜８．５の範囲にある。
冒）塩濃度
Ｎａ１ｌ、Ｋ０１１１！１度について両者とも２９ｍＭ
以上の濃度から阻害される。
以上の濃度から阻害される。
■）Ｍｇ０１ｓ濃度
ＭｇＯ１ｇ濃度が５ ｍＭ〜２０ ｍＭの存在下で酵素
反応が活性化される。
反応が活性化される。
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 １
２００１容のジャーファーメンタ−に下記表２に示す培
地１６０ｔを仕込み常法により培地を滅菌した。
地１６０ｔを仕込み常法により培地を滅菌した。
」１記と同じ培地で２６゛Ｃで３６時間振−培養したグ
ルコノバクタ−アルビダス エＦ０３２５１の種培養液
３ｔを上記ジャーファーメンタ−に移植し、通気社１ｖ
ｖｍ、攪拌数２５０ｒｐｍ、２６”Ｃで１８時間培養を
行なった。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養
液１６０ｔから４１１にして約６４０ｆの菌体が得られ
た。
ルコノバクタ−アルビダス エＦ０３２５１の種培養液
３ｔを上記ジャーファーメンタ−に移植し、通気社１ｖ
ｖｍ、攪拌数２５０ｒｐｍ、２６”Ｃで１８時間培養を
行なった。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養
液１６０ｔから４１１にして約６４０ｆの菌体が得られ
た。
表 ２
グルコース ５Ｆ
グリセロール １５ｍ１
イーストエキス ５ｆ’
ポリペプトン ５２
ＫＨ，Ｐｏ、 ０．５９
ＫＩＨＰＯ，０，５９
脱イオン水 １ｔ
ｐＨ６，５
得られた２００２の菌体を１０００ｍ／の抽出緩衝液（
２０ｍＭ ）リス−Ｈ（＋１ 、 ｐＨ７，５，１０ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、超音波破砕
機を用いて破砕後、１０００００Ｘｆで１時間遠心分離
を行ない、残渣を除去、抽出液を得た。
２０ｍＭ ）リス−Ｈ（＋１ 、 ｐＨ７，５，１０ｍ
Ｍ ２−メルカプトエタノール）に懸濁し、超音波破砕
機を用いて破砕後、１０００００Ｘｆで１時間遠心分離
を行ない、残渣を除去、抽出液を得た。
得られた抽出液に硫酸アンモニウムを８０％飽和になる
ように加え、沈殿物を遠心分離にて集め、緩衝液入（１
０ｍＭＱン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５，１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５％グリセロール）に溶解
後、同緩衝液Ａで一晩透析を行なった。
ように加え、沈殿物を遠心分離にて集め、緩衝液入（１
０ｍＭＱン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５，１０ｍＭ
２−メルカプトエタノール、５％グリセロール）に溶解
後、同緩衝液Ａで一晩透析を行なった。
次に透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておいりＤｌ
ＣＡＥ−セルロース（ワットマン製品Ｄｍ５２）のカラ
ム（６５Ｘ９５ｍ）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０
〜０．６Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液
Ａで溶出させると０．１５〜０．２３Ｍの塩化カリウム
濃度画分に本酵素の活性が検出できた。
ＣＡＥ−セルロース（ワットマン製品Ｄｍ５２）のカラ
ム（６５Ｘ９５ｍ）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０
〜０．６Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液
Ａで溶出させると０．１５〜０．２３Ｍの塩化カリウム
濃度画分に本酵素の活性が検出できた。
次に得られた活性画分を合わせ緩衝液Ａで−晩透析後、
透析内液をｆめ緩衝液Ａで平衡化させておいたアフィゲ
ルブルーアガロース（バイオラッド製品、１００〜２０
０ｍθａｈ ）のカラム（２５Ｘ１００ｍ）に吸着させ
、緩衝液Ａで洗浄後Ｏ〜１．０Ｍの塩化カリウムの直線
濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させると、０．４４〜０
．６６Ｍの塩化カリウム濃度画分に本酵素の活性が検出
できた。
透析内液をｆめ緩衝液Ａで平衡化させておいたアフィゲ
ルブルーアガロース（バイオラッド製品、１００〜２０
０ｍθａｈ ）のカラム（２５Ｘ１００ｍ）に吸着させ
、緩衝液Ａで洗浄後Ｏ〜１．０Ｍの塩化カリウムの直線
濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させると、０．４４〜０
．６６Ｍの塩化カリウム濃度画分に本酵素の活性が検出
できた。
次に得られた活性画分を合わせ、緩衝液Ｂ（２０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液、１）Ｈ７，５，１０ｍＭ２−メル
カプトエタノール、１０％グリセロール）で−晩透析後
、透析内液を予め緩衝液Ｂで平衡化させておいたヘパリ
ン−セファロース（ファルマシア製品、０Ｌ６Ｂ）のカ
ラム（１０×１３０■）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後
、０〜０．８Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩
衝液Ｂで溶出させると０．２０〜０．２６Ｍの塩化カリ
ウム濃度画分に本酵素の活性が検出できた。
ン酸カリウム緩衝液、１）Ｈ７，５，１０ｍＭ２−メル
カプトエタノール、１０％グリセロール）で−晩透析後
、透析内液を予め緩衝液Ｂで平衡化させておいたヘパリ
ン−セファロース（ファルマシア製品、０Ｌ６Ｂ）のカ
ラム（１０×１３０■）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後
、０〜０．８Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩
衝液Ｂで溶出させると０．２０〜０．２６Ｍの塩化カリ
ウム濃度画分に本酵素の活性が検出できた。
次に得られた活性画分を合わせ緩衝液Ｂで−晩透析後、
透析内液を予め緩衝液Ｂで平衡化させておいたヘパリン
−セファロース（ファルマシア製品、０Ｌ６Ｂ）のカラ
ム（５Ｘ５０■）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後、０．
５Ｍの塩化カリウム濃度を持つ緩衝液Ｂで溶出させ、本
酵素の最終標品として得た。
透析内液を予め緩衝液Ｂで平衡化させておいたヘパリン
−セファロース（ファルマシア製品、０Ｌ６Ｂ）のカラ
ム（５Ｘ５０■）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後、０．
５Ｍの塩化カリウム濃度を持つ緩衝液Ｂで溶出させ、本
酵素の最終標品として得た。
この酵素標品には非特異的なりＮＡ分解酵素およびホス
ファターゼは夾雑していなかった。
ファターゼは夾雑していなかった。
゛以上述べた方法により２００ｆの湿菌体より７５００
０単位の活性単位を得た。
０単位の活性単位を得た。
発明の効果
以上詳細に説明したとおり、本発明によりＳａｃ ｌお
よびＳｅｔ、 ｌと同様ｄ塩基配列の認識部位および切
断部位を有する制限酵素の工業的に有利な製造法が提供
された。
よびＳｅｔ、 ｌと同様ｄ塩基配列の認識部位および切
断部位を有する制限酵素の工業的に有利な製造法が提供
された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、グルコノバクター属に属し、下記ヌクレオチド配列
の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能を
有する細菌を培養し、得られた培養物より下記ヌクレオ
チド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素
を採取することを特徴とする制限酵素の製造法。 ５′−ＣＣＧＣＧＧ−３′ ３′−ＧＧＣＧＣＣ−５′ （式中Ｃはシチジン、Ｇはグアノシンを示す）
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59202199A JPS6178382A (ja) | 1984-09-27 | 1984-09-27 | 制限酵素の製造法 |
| DE19853530218 DE3530218A1 (de) | 1984-09-27 | 1985-08-23 | Verfahren zur herstellung einer restriktionsendonuklease |
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