DK145700B

DK145700B - Endonucleaser samt fremgangsmaade til fremstilling heraf

Info

Publication number: DK145700B
Application number: DK454976AA
Authority: DK
Inventors: T Shibata; T Ando
Original assignee: Rikagaku Kenkyusho
Priority date: 1975-10-08
Filing date: 1976-10-08
Publication date: 1983-01-31
Also published as: US4080261A; DK454976A; DK145700C; DE2645548C3; JPS5247980A; DE2645548B2; DE2645548A1; JPS5444756B2

Description

(19) DANMARK \jfj l»5liS5l

®/ (12) FREMUEGGELSESSKRIFT <n) 145700 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning rtr. 4549/76 (51) |nt.CI.3 C 12 M 9/22 (22) Indleveringsdag 8. okt. 1976 (24) Løbedag 8. okt. 1976 (41) Aim. tilgængelig 9· apr. 1977 (44) Fremlagt 51 · jan. 1983 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 8. ofcfc. 1975* 121671 /75, JP

(71) Ansøger RIKAGAKXJ KENKYUSHO, Wako-shi, JP.

(72) Opfinder Takehiko Shibata, JP: Tadahiko Ando, JP.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.

(54) Endonucleaser samt fremgangsmåde til fremstilling heraf.

Den foreliggende opfindelse angår endonucleaser betegnet Endonuclease R. Barn NI, Endonuclease R. Bam Nil og Endonuclease R.

Bam NIII, samt en fremgangsmåde til fremstilling heraf.

Enzymer (DNaser), som nedbryder deoxyxibonucleinsyre (DNA), forekommer i forskellige biologiske materialer og tager del i de vigtige livsprocesser, såsom metabolisme, nedbrydning, syntese og substitution af DNA.

ffl DNA-nedbrydende enzymer inddeles groft i exonucleaser og ^ endonucleaser i overensstemmelse med deres funktion, og den førsten nævnte type virker fra DNA-molekylets polynucleotidkædes terminale ende og frigiver successivt og spalter nucleotidet, medens den sidst-nævnte type danner DNA- eller oligonucleotidfragmenter ved at spalte ^ phosphodiesterbindinger i DNA-molekylet.

O

2 145700 I de senere år er der ved undersøgelse af endonucleaser gjort store fremskridt. Ved siden af talrige enzymer med biologisk vigtige funktioner er der blevet udvist særlig opmærksomhed overfor en speciel gruppe med særlige énzymatisk-kemiske egenskaber. Disse enzymer, såkaldte restriktionsnucleaser, udviser en høj specificitet overfor bestemte nucleotidsekvenser og er i deres virkning afhængig af naurlige eller kunstige strukturelle forandringer (modifikationer) i DNA'et. Restriktionsnucleaserne spiller en vigtig rolle ved undersøgelse af DNA-struktur og -funktion samt ved molekylær kloning af DNA-sekvenser af forskellig oprindelse.

Der kendes mikrobiologiske fremgangsmåder til fremstilling af nucleaser, f.eks. en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer fra Aspergillus oryzae-kulturer, hvilke enzymer ikke virker på dob-belt-strenget DNA men specifikt spalter enkelt-strenget DNA (jap. patent nr. 593.368), en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer fra Aspergillus oryzae-stammer, som fortrinsvis spalter purin-purin-bindinger (jap.patent nr. 621.205), en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer, som indfører et. begrænset antal enkelt-strengede brud i dobbelt-strenget DNA, som fremstilles fra bacteriophag-inficeret Escherichia coli(jap.patent nr. 764.919), en fremgangsmåde til fremstilling af et enzym, som hydrolyserer RNA til nucleosid-2,3-cyclisk phosphat, og som fremstilles fra Escherichia coli, der er inficeret eller induceret med bacteriophag (jap.pat.ans.nr. 78869/1972, jap. patent nr. 35577/1974), en fremgangsmåde til fremstilling af enzymer, som fortrinsvis spalter guanin-guanin-bindinger i DNA-molekylet, hvilke enzymer udvindes fra dyrkningsvæsken af en alkalophil Bacillus-art (jap.pat.ans.nr. 114131/1973, jap.patent nr. 64484/1975 og dansk fremlæggelsesskrift nr. 138.332), og en fremgangsmåde til fremstilling af et enzym, som specifikt fraspalter RNA-resten fra et DNA-RNA-hybrid, som fremstilles fra Bacillus subtilis-celler (jap.pat. ans.nr. 127.276/1974).

Det har nu vist sig, at der ud fra visse Bacillus-stammer kan isoleres nogle hidtil ukendte restriktionsnucleaser (endonucleaser R.). Endonucleaserne ifølge opfindelsen betegnes Endonuclease R. Barn NI, Endonuclease R. Bam NII og Endonuclease R. Bam NIII og er ejendommelige ved, at enzymerne er blevet vundet fra en cellefri ekstrakt af Bacillus subtilis IAM 1522 eller Bacillus amylolique-faciens ATCC 23.845.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af ovennævnte endonucleaser er ejendommelig ved, at Bacillus subtilis IAM 1522 eller Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23.845 dyrkes i et 3 145700 dyrkningsmedium, hvorpå cellerne isoleres og behandles til opnåelse af en cellefri ekstrakt derfra, som underkastes fraktionering og oprensning.

Tegningen i nærværende beskrivelse er et fotografi, som viser resultaterne af agarosegelelektroforese af DNA, som er behandlet med, enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse, hvilke enzymer er Endo. R. Bam NI, Endo. R. Bam NII og Endo. R. Bam NIII.

Tallene på tegningen har følgende betydninger.

1 — phag λ DNA behandlet med Endo. R. EcoRl (kontrol)

2 — ubehandlet phag λ DNA

3 — phag λ DNA behandlet med Endo. R. Bam NI“!

4 — λ · Η I behandlet med Endo. R. Bam NI

5 — ubehandlet phag φ105Ο·168 *DNA (kontrol)

6 — phag Φ105ΟΝ DNA behandlet med Endo. R. Bam NII + NIII

7 — phag φ105ϋ·Η DNA (som ikke kan kløves af Endo. R. Bam NII)

behandlet med Endo. R. Bam. NII+NIII

8 — phag φ105Ο·168 DNA behandlet Endo. R. Bam NII+ NIII

9 — phag λ DNA behandlet med Endo. R. Eco'Rl (kontrol)

10 — ubehandlet phag λ DNA

11,12 — phag λ DNA behandlet med Endo. R. Bam NII+ NIII

13 — phag λ DNA behandlet med Endo. R. Eco Ri (kontrol)

14 — ubehandlet λ dv 1 DNA

15 — λ dvl DNA behandlet med Endo. R. Bam NII+ NIII

16 — ubehandlet Col El DNA

17 — Col El DNA behandlet med Endo. R. Bam NII+ NIII

18 — ubehandlet SV40 DNA

19 — SV40 DNA behandlet med Endo. R. Bam NII+NIII

20 — phag λ DNA behandlet med Endo. R. Eco RI (kontrol)

21 — ubehandlet phag 3ΡΡΙΊ68 DNA

22 — phag SPPI-168 DNA behandlet med Endo. R. Bam NII+NIII

23 — phag λ DNA behandlet med Endo. R. Eco RI (kontrol).

4 145700

Bacillus subtilis-stammen, der anvendes ifølge opfindelsen, er deponeret uden restriktioner hos "The Institute of Applied Microbiology", Tokyo' Universitet (adresse: 1-1, Yayoi, Bunkyoku, Tokyo, Japan) som IAM 1522 (se "JPCC Catalogue of Culture, side 41, 1966), og er frit tilgængelig for en hvilken som helst tredie part på et hvilket som helst tidspunkt. Bacillus amyloliquefaciens-stammen er deponeret i "The American Type Culture Collection" (ATCC) (12301 Park-lawn Drive Rockville, Maryland 20852) som ATCC accessionsnummer 23.845 og er deponeret hos ATCC uden restriktioner, som tillader fuld offentlig adgang til kulturen. Stammen blev gjort tilgængelig for offentlig adgang den 8. september 1976.

De omtalte mikroorganismer kan dyrkes ved at følge en almindeligt anvendt dyrkningsmetode, f.eks. ved at pode en af de ovennævnte mikroorganismer i et dyrkningsmedium, som indeholder aminosyrer, et caseinnedbrydningsprodukt, glucose, phosphat, sulfat, etc., og dyrke den ved 30-37°C under beluftning og omrøring.

Et typisk dyrkningsmedium er vist nedenfor.

(1) Cl medium i 10 liter KH2P04 60 g K2HP04 140 g

Natriumcitr'at-2H20 10 g (NH4)2S04 20 g

Arginin 2 g

Casaminosyre 2 g

Glukose 50 g

MgS04 2 g

Tryptofan 0,25 g (2) Bacto-Penassay broth (Difco)

Mikroorganismens vækst måles ved at anbringe en del af dyrkningsmediet i en kuvette og ved anvendelse af lys med en bølgelængde på 660 my måle transmittansen.

5 145700

Cellerne opsamles fortrinsvis på det tidspunkt, hvor de befinder sig i den logaritmiske fase og ved begyndelsen af den stationære fase, og selve cellerne eller protoplasten, som er fremkommet ved behandling af cellerne med lysozym, knuses med ultralydbølger, og et cellefrit ekstrakt fremkommer ved centrifugalseparation. Det opnåede cellefrie ekstrakt kan behandles med streptomycinsulfat og udfældes med ammoniumsulfat, underkastes gelfiltreririg ved anvendelse af ultragel ACA 44 eller Sefadex G-100, underkastes ion-bytningschromatografi ved anvendelse af DEAE-cellulose, phospho-cellulose eller behandles med en kombination af disse metoder til isolering af de enkelte enzymer "Endo. R. Barn NI", 'Endo. R. Bam Nil" og'Endo. R. Bam NIII":

De enzymer, som er fremkommet på denne måde, har vist sig at have følgende fysisk-kemiske egenskaber: (1) Aktivitet og substratspecificitet.

DNA fra nedenstående phager blev fremstillet og anvendt som DNA-substrat ved enzymatiske reaktioner:

Formering i (modifikationsmønsterets DNA_ bærer) :_ a) Bakteriophager Φ 105 C,N. Bacillus subtilis (IAM 1522) φ 105 C.H. Bacillus subtilis (IAM 1521, ATCC 23.845)

også betegnet Bacillus amyloliquefaciens H

φ 105 C.168 Bacillus subtilis Marburg 168 (ATCC 6051) SPPI 168 Bacillus subtilis Marburg 168 (ATCC 6051) φ 29 ATCC 6051 eller IAM 1521 M 2 ATCC 6051 φ NR2 Bacillus megaterium 203

T7 Escherichia coli B

λ Escherichia coli K 12 λ HI Modifikationsmønster fra ATCC 23.845 b) Plasmidet ^ * } Escherichia coli

Col El c) Tumorvira

Ternocer Simian Virus 40 (SV 40)

Udtrykket "Endo. R." er en forkortelse for Endonuclease R.

6 145700

Efter den enzymatiske reaktion blev størrelsen af det spaltede DNA-substrat og antallet af spaltningssteder undersøgt ved anvendelse af agarosegelelektroforese, og den ved behandling med Endo. R.

Bam NI, Endo. R. Bam NII og Endo. R. Bam NIII opnåede elektroforese-figur er vist på den ledsagende tegning.

Tegningen er et fotografi, som viser en agarosegelelektro- : foresefigur for det substrat-DNA, som er behandlet med Endo. R. Barn NI, Endo. R. Bam NII og Endo. R. Bam NIII. Som det fremgår af tegningen blev substrat-DNA1ets DNA-molekyle spaltet af Endo. R. Bam NI, Endo.

R. Bam NII og Endo. R. Bam NIII·i fragmenter af en nærmere bestemt størrelse. Opsummering af disse forsøgsresultater, som anført i tabel 1, viser tydeligt, at de ovennævnte tre enzymer udviser substratspecificitet.

Tabel 1

Substrat-DNA Antal Spaltningssteder

Endo. R. Bam NI Endo. R. Bam Nil Endo. R. BamNTTT

Bacillus phag φ 105 C.N 000

Bacillus phag φ 105 C-168 0 9 ca. 7

Bacillus phag φ 105 C.H 0 0 ca. 7

Bacillus phag φ 29 0 0 0

Bacillus phag M2 0 0 0

Bacillus phag φ NR,, 0 -

Coli phag λ 4-5 ca. 15

Coli phag T7 0 ca..10-15

Bacillus phag SPPI 0 3 λ dv Ix) 1 2 (eller 3)

Col EIX^ 0 3 SV 40xx) 1 >4 x): λ dv I, Col El --- plasmid (indre cellefaktor for Escherichia coli) xx) : SV 40------------tumor virus (Simian Virus 40) 7 145700

Endo. R. Bam NI indvirkede ikke på φ 105 C.N, φ 105 C.II, φ 105 C-168, Φ 29, Mj, SPPI, T7, Col El men spaltede DNA af coli phag λ, og antallet af spaltningssteder var 5 pr. DNA-molekyle. Endo. R.

Barn NI spaltede også λ dv I og SV 40, hver i én stilling.

Endo. R. Bam NII indvirkede ikke på DNA af φ 105 C.N og φ 105 c*H men viste sig at spalte DNA af φ 105 C.168 ca. S stedar, og at spalte DNA af T7, λ, SPPI, λ dv I adskillige steder.

Og Endo. R. Bam NIII indvirkede ikke på DNA af φ 105 C.N men viste sig at spalte DNA af både φ 105 C.168 og φ 105 C.H 7 steder, og at spalte DNA af T7, λ, SPPI, λ dv I, Col El og SV 40 adskillige steder til dannelse af specifikke DNA-fragmenter.

(2) pH-optimum;

Alle, Endo. R. Barn NI, Endo. R. Barn NII og Endo. R. Bam NIII, viste sig at have deres pH-optimumsområde mellem pH 7,2 - 8,3.

(3) Brugstemperaturområde: 20° - 40°C, optimalt 35° - 37°C.

(4) Metode til måling af styrke;

Den enzymatiske aktivitet blev målt ved at tilsætte enzymprøven til 50 millimol tris-saltsyrepuffer (pH 7,5) , 5 millimol MgC^, 0,2 millimol EDTA, 5 millimol β-mercaptoethanol og 3,3 μ g/ml DNA til fremstilling 30 μ liter - 300 μ liter af en enzymreaktionsopløsning, og opløsningen blev behandlet ved 37°C i 50 minutter. Efter reaktionen blev spaltningen af reaktionsprodukternes DNA-substrat, da der ikke var iagttaget nogen dannelse af sur opløselig nucleotid, undersøgt ved elektroforese ved anvendelse af agarosegel eller ved anvendelse af en neutral sukrosegradientcentrifugalmetode.

(5) Inhibering, aktivering og stabilisering: 2+

Endo. R. Bam NI blev aktiveret af 0,3 - 10 millimol Mg og 2+ blev inhiberet af mere end 20 millimol Mg og af mere end 0,2 M NaCl, 2+

Endo. R. Bam NII blev aktiveret af 10 - 20 millimol Mg og blev inhiberet af mere end 0,2 M NaCl. Endo. R. Bam NI, Endo. R. Bam NII og Endo, R. Bam NIII blev tydeligt inhiberet af 5 millimol EDTA.

Ingen af Endo. R. Bam NI, Endo. Bam NII eller Endo. R.

Bam NIII krævede en co-faktor, såsom ATP og S-adenosylmethionin.

(6) Oprensningsmetode;

En metode til oprensning af enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse er vist i det følgende: 8 145700

Celle 4

Lysozymbehandling 4

Ultralydbølgebehandling 4·

Streptomycinbehandling 4

Ammoniumsulfatudfældning (40 vægtprocent til mættet opløsning) 4

Gelfiltrering (LKB AcA 44) 4-1-4

Lavmolekylvægt Højmolekylvægt

DEAE-cellulosechromatografi DEAE-cellulosechromatografi (0,05 til 0,1M NaCl) ' (0,05 til 0,1M (0,12 til 0,25M

NaCl) NaCl) .

- 4 ^

Endo. R. Barn NI Endo. R. Bam NII og III

I Ψ

Nativ DNA-cellulose- Nativ DNA-cellulosechro- chromatografi matografi (0,2 til 0,3M NaCl) (0,35MNaCl)

Endo. R. Barn NI Endo. R. Barn NII og III

(7) Molekylvægt:

Molekylvægten af enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse blev målt ved hjælp af gelfiltrering.

Molekylvægt af Endo. R. Barn NI: Ca. 10.000 til 100.000

Molekylvægt af Endo. R. Bam NII og III: Ca. 100.000

Som beskrevet ovenfor i detaljer genkender enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse DNA af specifikke organismer, såsom Bacillus-stammer og bacteriophager,og spalter bindingen i de for dem specifikke steder til dannelse af DNA-fragmenter af en nærmere angiven størrelse. Enzymerne ifølge den foreliggende opfindelse er nye enzymer, som spalter nucleinsyre, og som har en høj substrat 9 145700 specificitet, der ikke er kendt fra nogen hidtil offentlig tilgængelig litteratur, og ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles enzymerne på effektiv måde.

I det følgende vil fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse blive belyst ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1

Den ovennævnte Bacillus subtilis (IAM 1522) blev fordyrket 1 500 ml af et hjerne-hjerte-udtræksmedium ved 30°C i 13 - 15 timer under beluftning og omrøring, hvorefter denne fordyrkede. opløsning opslemmedes i 20 liter af et dyrkningsmedium, som havde følgende sammensætning: I^HPO^ 120 g Argininchlorid 4 g KH2PO4 280 g Glukose 100 g

Natriumcitrat 20 g MgSO^ 4 g

Ammoniumsulfat 40 g Tryptofan 0,5 g

Casaminsyre (vitaminfri) 4 g

Efter at have været dyrket ved 35°C i 4 - 6 timer under beluftning og omrøring, isoleredes de dyrkede celler i det tidlige, stationære fasetrin. Efter, at denne dyrkningsvæske var centrifugeret ved anvendelse af en kontinuerlig frysecentrifugalmetode, opnåedes ca. 32 g celler.

Cellerne opslemmedes i 1 liter PES-puffer (som indeholdt 0,12 M kaliumphosphatpuffer: pH 7,2, 5 millimol MgC^, 0,1 millimol EDTA, 171 g rørsukker), hvortil 0,3 g æggehvidelysozym tilsattes og fik lov at henstå ved 37°C i 30 - 60 minutter, og en kugleformet protoplast fremkom. Ca. 16 g af protoplasten isoleredes ved centrifugering, og efter nedfrysning ved .hjælp af flydende nitrogen eller en tør-is-acetoneblanding, blev.den opbevaret i et bad ved ekstra lav temperatur på -80°C.

4 g protoplast opslemmedes i 15 ml 50 millimol tris-salt-syrepuffer (pH 7,5), som indeholdt 0,1 millimol EDTA, 5 millimol MgC^, 2 millimol β-mercaptoethanol, protoplasten blev knust ved hjælp af ultralydbølgebehandling (20 KC, 30 sekunder, 3 gange), og den knuste 10 145700 masse blev behandlet ved at blive frysecentrifugeret ved 80.000 g i 60 minutter. Til den centrifugerede supernatantvæske blev eri strepto-mycinsulfatopløsning tilsat under omrøring til fremstilling af en 1% opløsning. Efter yderligere omrøring i 10 minutter blev supernatantvæ-sken skilt fra ved centrifugering ved lav temperatur (0 - 5°C). Til denne supernatantvæske tilsattes ammoniumsulfat over 30 minutter til fremstilling af en 40% mættet opløsning, som blev udsat for yderligere omrøring i 15 minutter. De dannede bundfald fjernedes ved centrifugering ved lav temperatur. Til den fremkomne supernatantvæske tilsattes ammoniumsulfat under omrøring over 30 minutter til fremstilling af en 60% mættet opløsning, som yderligere omrørtes i 15 minutter. Derpå blev de dannede bundfald isoleret i en kølecentrifuge, opslemmet og opløst i 30 ml tris-saltsyrepufferopløsning med pH 7,5 (D8) , som indeholdt 0,1 millimol EDTA, 2 millimol MgC^, 2 millimol β-mercaptoetha-nol. (Ammoniumsulfatfraktion).

Denne fraktion indeholdt de tre aktive DNA-nedbrydende enzymer, nemlig Endo. R. Barn NI, Endo. R. Bam NII og Endo. R. Bam NIII.

Eksempel 2 (Oprensningsmetode 1)

Efter, at ammoniumsulfatfraktionen var blevet dialyseret mod D8-bufferopløsningen, som er omtalt i Eksempel 1, blev den absorberet på en DEAE-cellulosekolonne (15 x 200 mm), som forud var blevet indstillet med D8-bufferopløsningen. Ved at eluere under en lineær koncentrationsgradient på 0 - 0,4 M natriumchlorid med den samme bufferopløsning, blev Endo. R. Barn NI elueret i en fraktionmed en natri-umchloridkoncentration på 0,5 - 0,1 M, og Endo. R. Bam NII og Endo.

R. Bam NIII blev elueret i 0,09 - 0,2 M fraktionen.

Eksempel 3 (Oprensningsmetode 2)

Efter, at ammoniumsulfatfraktionen, fremkommet i Eksempel 1, var blevet dialyseret mod D8-bufferopløsningen, absorberedes den på en phosphocellulose Pil-kolonne (15 x 200 mm), som forud var blevet indstillet med den samme bufferopløsning. Ved at eluere under en lineær koncentrationsgradient af natriumchlorid på 0 - 0,7 M med den samme bufferopløsning, blev Endo. R. Bam NI's aktive komponent elueret over et bredt område.

Og de Endo. R. Bam NIIrs og Endo. R. Bam NIII's aktive komponenter blev elueret i 0,3-0,5 M natriumchloridfraktionen.

11 145700

Eksempel 4 (Oprensningsmetode 3) Når airnnoniumsulfatfraktionen, fremkommet i Eksempel 1, blev underkastet en gelfiltrering, hvor der blev anvendt en ultragel ACA-44-kolonne (20 x 400 mm) og D8-bufferopløsning som eluerings-middel, blev de Endo. R. Bam NII og Endo. R. Bam NIII aktive rester elueret først, og efter at 1,5-2 gange kolonnevolumenet af eluerings-opløsningen var passeret, blev den Endo. R. Bam NI aktive rest elueret for sig selv (gelfiltreringseluatfraktion).

Eksempel 5 (Oprensningsmetode 4)

En kombineret metode af separations- og oprensningsmetoderne 1, 2 og 3, som er omtalt i henholdsvis Eksempel 2, 3 og 4, vil i det følgende blive omtalt.

Når ammoniumsulfattraktionen, fremkommet i Eksempel 1, først var blevet fraktioneret ved gelfiltreringsmetoden, som er beskrevet i Eksempel 4, kom Endo. R. Bam NII og Endo. R. Bam NIII tilsyne i væsken, som passerede igennem. Disse fraktioner blev separeret fra og koncentreret ved anvendelse af en DEAE-ce1lulosechromatografimetode, som er beskrevet i oprensningsmetode 1, og de fik yderligere lov til at blive absorberet og elueret ved phosphocellulosekolonnechromatogra-fi, som beskrevet i Eksempel 3 (oprensningsmetode 2).

Efter, at Endo. R. Bam NI fraktionen, som var blevet elueret efter den ovennævnte gelfiltreringsmetode, var blevet absorberet ved DEAE-cellulosekolonnechromatografi, der er beskrevet i· Eksempel 2 (oprensningsmetode 1), og elueret af natriumchloridkoncentrationsgra-dienten, blev Endo. R. .Bam NI derpå elueret i 0,06 - 0,90 M fraktionen.

Eksempel 6 (Oprensningsmetode 5)

Ved oprensning ifølge oprensningsmetode 1 af Endo. R. Bam NI fraktionen og af den Endo. R. Bam NII og NIII fraktion, som fremkommer ved oprensningsmetode 3, blev Endo. R. Bam NI indvundet fra Endo. R. Bam NI fraktionen, og Endo. R. Bam NII og NIII fra Endo.R.Bam NII og NIII fraktionen. Endo.R. Bam NI blev yderligere oprenset i overensstemmelse med oprensningsmetode 2 eller ved nativ DNA-cellulose-chromatografi.

12 145700

Den indvundne Endo. R. Baxri NII og III fraktion, som indeholdt en lille mængde Endo. R. Bam NI, blev oprenset til ren Endo. R. Bam NII og III i overensstemmelse med oprensningsmetode 1 ved at eliminere den indeholdte Endo. R. Bam NI. Den fremkomne Endo. R. Bam NII og III blev yderligere oprenset ved anvendelse af oprensningsmetode 2 eller ved nativ DNA-cellulosechromatografimetoden.