JPH02242675A - 精製酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵素工学に関するものである。さらに詳しく
は、本発明は、ストレプトマイセス・クラプリゲルス（
Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕ
ｓ）から得られる酵素デアセトキシセファロスポリンＣ
シンターゼ（ＤＡＯＣ合成酵素、“エキスパンダーゼパ
とも称される）に関するものである。

酵素エキスパンターセはセファロスポリンＣの生合成経
路において、ペニシリンＮのワングエ牛スパンシジン（
環拡張）によりＤＡＯＣが生成される反応を触媒する。

ＤＡＯＣは次いで、酵素ヒドロキシラーゼの作用でデア
セチルセファロスポリンＣ（ＤＡＣ）に変換され、後者
は次いＳ１アセチルトランスフエラーゼの作用でセファ
ロスポリンＣに変換される。

セファロスポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏ
ｓｐｏｒｉｕｍ　ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）の細胞抽出液
から得られる２機能性酵素、エキスパンダーゼ／ヒドロ
キシラーゼが米国特許第４，７５３，８８１号に記載さ
れている。本発明のＳ、クラブリゲルス由来のエキスパ
ンダーゼ酵素はＣ，アクレモニウムから得られるそれと
は異なっており、特にＤＡＯＣをＤＡＣに変換するドロ
キシラーゼ活性を欠如している点で異なっている。

感染症治療においてセファロスポリン抗生物質は重要で
あることから、精製形のエキスパンダーゼを得ることが
できれば、これらの抗生物質の工業生産の開発研究が可
能となる。その上、酵素が利用可能となれば、修飾され
た基質に対する酵素の作用の研究により、構造の異なる
抗生物質を得ることができる。

本発明の精製デアセトキシセファロスポリンＣシンター
ゼはストレプトマイセス・クラプリゲルスから得られ、
ペニシリンＮを基質としてデアセトキシセファロスポリ
ンＣを与える。セファロスポリウム・アクレモニウム由
来の２機能性工牛スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素
とは異なり、本発明の精製酵素はＤＡＯＣをデアセチル
セファロスポリンＣ（ＤＡＣ）に変換するだめのヒドロ
キシラーゼ活性を持たない。しかしながら、Ｓ、クラブ
リゲルスから得られた酵素は部分的に精製された形で３
−エキソメチレンセフ１０スポリンＣのＤＡＣへの変換
を触媒する。

酵素はＳ、クラブリゲルスの細胞抽出物から単離され、
クロマトグラフィーで不活性な形で精製されている。こ
の酵素のアミン末端配列が決定され、エキスパンダーゼ
遺伝子の大腸菌（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ、　ｃｏｌ
　ｉ）へのクローニングに用いられた［Ｊ、Ｒ。

Ｍｉｌｌｅｒら、係属中の米国特許出願Ｎｏ、１９２，
２７３．１９８８年５月９日出願、日本特許出願平１−
１１４８８３、平成１年５月８日出願）。この酵素は組
換え体Ｅ、コリの培養物から大量に回収し、５段階のク
ロマト処理により見掛は上、均質な活性形に精製され得
る。組換え法で製造された酵素と天然の酵素との同一性
は既に示されている。

Ｓ、クラブリゲルスの細胞抽出物から得られる精製天然
酵素はフェニルメチルスルホニルΦフルオライドおよび
エタノールで部分的に安定化することができる。このよ
うにして安定化すると、酵素の半減期は２０時間から４
８時間に増大し、３段階のクロマト処理と以後のゲル電
気泳動的溶出によって精製することができる。

この酵素はタンパク質モノマーであって、ヌクレオチド
配列から導いた分子量は３４．６００ダルトンであり、
５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は３４．０００−３５，
０００である。酵素のアミノ末端残基は遊離状態にある
（ブロックされていない）。天然酵素のアミノ末端残基
の２２アミノ酸配列を常法に従って決定し、以下に示す
。

Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ　−１１ｅ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ
−Ｔｈｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ＩｎＧ　Ｉｎ
　−Ｇ　１ｙ−Ｌ　ｅｕ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ
　ｓｐ　−Ｇ　ｌｕ　−ｈｅ 組換え法で製造された酵素のアミン末端残基の２２アミ
ノ酸配列に関するデータは、第４番目のアミノ酸が異な
っていることを示している。組換え酵素における、第４
アミノ酸残基はイソロイシン（ｌｉｅ）であり、天然酵
素における第４アミノ酸は上記の如くスレオニン（Ｔ　
ｈｒ）である。その他の点ではこれらの配列は同一であ
る。この相違か複数のアイソザイムに関連しているのか
、または実験誤差に関連しているのかは、現時点では確
実でない。

精製酵素のアミノ酸組成を表１に示す。

（以下余白） 表　１　エキスパンダーゼのアミノ酸組成Ａｓｐ＋Ａｓ
ｎ　　　　　　　　　　２８Ｔｈｒ　　　　　　　　　
　　　２５’Ｓｅｔ　　　　　　　　　　　　２４’Ｇ
ｌｕ＋Ｇｌｎ　　　　　　　　　　３３Ｐｒｏ　　　　
　　　　　　　　１８ ｃｔｙ　　　　　　　　　　　２５ Ａｌａ　　　　　　　　　　　　２７ Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　６′′Ｖａｔ　　　　
　　　　　　　　２０ Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　５ １１ｅ　　　　　　　　　　　　１０ Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　２５ Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　１０ Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　２０ Ｈｉｓ　　　　　　　　８ Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　７ Ａｒｇ　　　　　　　　　　　２３ Ｔ　ｒｐ　　　　　　　　　　　　２　’ａ：加水分解
を０回に外挿して決定 ｂニジスティン酸として測定 Ｃ：チオグリコール酸の存在下に加水分解して測定精製
酵素は、５．３±０．２および６，１±０，２の２つの
別々の等電点を示した。

精製酵素は５０ａＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７）中
酵素濃度０．２〜１５ｍＵにおいて、ｌｏｏｍＭα−ケ
トグルタレート、５０μＭ第１鉄イオン、および５００
μＭ　　ＤＴＴの存在下に最適にシンターゼ活性を発現
し、１００μＭのペニシリンＮを反応時間１５分間、３
６℃でＤＡＯＣに変換する。

この酵素の基質特異性は狭い。酵素のシンターゼ活性（
ＨＰＬＣで検出可能な活性）は、上記のペニシリンＮの
ＤＡＯＣへの変換の至適条件下、インペニシリンＮ、ペ
ニシリンＧ、ペニシリンＶ１アンピシリンまたは６−ア
ミノペニシラン酸（こついては認められない。

酵素はその触媒活性の発現にα−ケトグルタレート、第
１鉄イオンおよび酸素を必要とする。ＤＡＯＣシンター
ゼ活性はジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって刺激さ
れる。ＡＴＰによる刺激は検出可能でない。

酵素活性の発現に必要な第１鉄イオンをマグネシウム、
マンガン、コバルト、カルシウム［１銅、ニッケル、亜
鉛、ナトリウムまたはカリウムイオンで置き換えること
はできなかった。ＤＴＴとアスコルビン酸の存在下では
、第１鉄イオンを第２鉄イオンに置き換えることができ
るが、酵素活性はやや低い。Ｚ　ｎ’＞　Ｃｏ″＞Ｎｉ
’の順番で阻害されることが示された。

酵素は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）およ
び１．ｌＯ−フェナンスロリンのＤＡＯＣシンターゼ活
性阻害作用に極めて感受性が高い。

酵素はある種のスルフヒドリル試薬、例えば、ｐ−ヒド
ロキシマーキュリ−ベンゾニー）（ｐ−ＨＭＢ）　、５
．５’−ジチオビス−２−二トロ安息香酸（ＤＴＮＢ）
およびＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）による阻害を極
めて受は易く、また、ヨード酢酸の阻害作用も僅かに受
けた。０．２ｍＭＤＴＮＢ中、４℃で０．５分間の完全
な不活化の後、反応混合物に２１ＭＤＴＴを加えると３
０分で酵素のシンターゼ活性は完全に回復した。

上記の金属キレートおよびスルフヒドリル試薬の酵素へ
の影響を表２に示す。

表　２　　ＤＡＯＣシンターゼに対する金属キレートお
よびスルフヒドリル試薬の影響１ なし Ｏ−フェナンスロリン ０．０２ ０．２ ＥＤＴＡ ０．０２ ０．２ −ＨＭＢ ０．１ １．０ ＤＴＮＢ ０．１ １、Ｏ ＮＥＭ ０．１ １．０ ヨード酢酸 ０．１ １．０ １：酵素反応は、０．０６ａＭ　Ｆｅ５０．および０゜
１μＭＤＴＴの存在下で行われた。酵素ペニシリンＮと
の反応開始前に、記載の阻害物質と１分間インキュベー
トした。

本発明の精製シンターゼによるペニシリンＮのＤＡＯＣ
への変換に関する６０分間の反応におけるＤＡＯＣ形成
／ペニシリンＮ消失のモル比は第５図に示すように０．
９０−０．９８の範囲に維持された。ペニシリンＮから
ＤＡＯＣへのへの変換は、該反応条件下、９４％完了し
た。

本発明の精製シンターゼはα−ケトグルタレート、第１
鉄イオンおよび酸素の存在下、３６°Ｃにおいて、５０
ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱバッファー（１）Ｈ７４）ま
たはＨＥＰＥＳバッファー［Ｎ−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸］（ｐＨ
７、０）のいずれかの存在下で、ペニシリンＮのＤＡＯ
Ｃへの変換を最も好適に触媒することが示された。

酵素の至適反応条件である５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファ
ー（ｐＨ７，０）中、３６°Ｃで天然酵素および組換え
酵素の動力学を調べた。ラインウェーパー−バーク法で
測定した場合、組換え法で産生されたＤＡＯＣシンター
ゼのペニシリンＮに対するＫＩｌｌは、２９μＭであり
、α−ケトゲルタールに対するそれは１８μＭであった
。同様にして測定したＦｅ”に対する酵素のＫａは８μ
Ｍであった。

組換えシンターゼのＶＩｌｌａＸはＤＡＯＣ形成０，４
３２　ｕ　ｍｏｌ／　ｌｌ１ｉｎ／　ｙｇタンパク質で
あった。

部分精製酵素（表３、ＭｏｎｏＱ溶出液）を、ＨＥＰＥ
ＳバッファーとＴｒｉｓ−ＨＣＱバッファーとを置き換
える外は同様の至適条件下で評価して得た、天然シンタ
ーゼの対応する動力学的定数は、Ｋａ＋（ペニシリンＮ
）−３５μＭＳＫＩ１１（α−ケトゲルタレ−１）−２
２μＭ、およびＫａ（Ｆｅ”）＝４　μＭであった。

上記のごとく、本発明の精製シンターゼはＤＡＯＣをＤ
ＡＣ（デアセチルセファロスポリンＣ）に変換するヒド
ロキシラーゼ活性を有さないが、３−エキソメチレンセ
ファロスポリンＣをＤＡＣに変換することはできる。従
って、本発明は、式で示される７β−（α−アミノアジ
パミド）−３−エキソメチレンセファム−４−カルボン
酸（３−エキソメチレンセフ１０スポリンＣ）をデアセ
チルセファロスポリンＣに変換する方法であって、３〜
エキソメチレンセフアロスボリア、Ｃとストレプトマイ
セス・クラプリゲルスから導かれたシンターゼとを、温
度約３０°Ｃから約４０°Ｃの範囲で、第１鉄イオン、
α−ケトグルタレートおよび酸素を含有するｐＨ約６．
８〜約７．６の水性媒質中で混合することからなる方法
を提供するものである。

この工程は所望のｐＨ域でＴｒｉｓ−ＨＣρバッファー
等の緩衝液中で行うことができる。混合物のｐＨは約７
．０〜約７．４の範囲に維持することが好ましい。工程
は精製酵素が最高の活性を発揮すると思われる約３６℃
の諷度で行うことが好ましい。

第１鉄イオンは約２０μＭから約１００μＭの濃度範囲
、α−ケトグルタレートは約２０μＭから約３００μＭ
の濃度範囲で存在することが好ましい。

酸素は実験室用の小さいビーカーまたはフラスコを用い
て小規模に行う場合には、大気中からも十分量、供給さ
れ得る。しかしながら、大規模反応の場合には、反応混
合物に酵素を吹き込むとよい。

バッチ式の大多数、の酵素反応の場合と同様、撹はんま
たは振盪により、反応酵素反応を充分に混合する。ある
いは、固定化シンターゼを用いてもよく、この場合には
３−エキソメチレンセファロスポリンＣ１第１鉄イオン
、α−ケトグルタレートを含有し、上記のごとく緩衝化
された水性媒質を、不溶性支持体に固定化した酵素と接
触させる。

そのような支持体は周知であり、例えば、交差結合した
ジビニルベンゼン樹脂またはポリアクリル−メタクリル
樹脂であり、また、種々のサイズおよび孔径のビーズ形
であってよい。固定化酵素を適当なカラムに充填し、３
−エキソメチレンセファロスポリンＣを含有する水性媒
質をカラムに通す。

酸素はカラムを上に通り抜けさせてもよく、あるいは他
の方法で供給してもよい、例えば、カラムに入れる水性
媒質に通すことができる。

一般に、工程には過剰量の精製シンターゼを用いる。酵
素活性の発現に必要なＦｅ”″、α−ケトグルタレート
および酸素の外に、還元剤等の他の因子、例えばジチオ
スレイトール、β−メルカプトエタノール、ジチオエリ
スレイトール、アスコルビン酸等も工程の収率または速
度に有利な影響を及ぼすかもしれない。

３−エキソメチレンセファロスポリンＣは酵素のＤＡＯ
Ｃシンターゼ活性の強力な阻害物質であり、また、酵素
の３−二手ソメチレンセファロスポリンＣヒドロ亭シラ
ーゼ活性はＤＡＯＣをＤＡＣに変換しない。従って、３
−エキソ−ヒドロキシラーゼ活性は酵素のまったく別個
の機能のように思われる。

本発明の精製エキスパンダーゼは、ストレプトマイセス
・クラプリゲルスの培養物から、本発明の精製法によっ
て得られる。Ｓ、クラブリゲルスはかなり長い間利用さ
れており、それを用いて多くの研究者がセファロスポリ
ンの生合成を研究してきた、例えば、ジエンセンら（Ｊ
　ｅｎｓｅｎ　Ｓ、　Ｅ、。

Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、３８，２６３．１９８５
）、ウォルフら（Ｗｏｌｆｅ、　Ｓ、、　　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　Ｖｏｌ、　２２６＋　　１３８６−１３９２
．１９８４）、および米国特許第４，５３６，４７６号
。Ｓ、クラブリゲルスはまた、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクンヨンから受託番号ＡＴＣＣ２７０６
４の下で人手可能である。

本発明工程によれば、まず、Ｓ、クラブリゲルスの細胞
抽出物を全細胞から調製する間に、ｐＨ７，５において
フェニルメチルスルホニル・フルオライドおよびエタノ
ール等のプロテアーゼ阻害物質により温度Ｏ℃から約４
°Ｃで安定化する。安定化された抽出物を遠心して細胞
不含の安定化粗抽出物を得る。この粗抽出物を温度約０
°Ｃから約４℃において１週間、弱陰イオン樹脂クロマ
トグラフィーにかけ、Ｋ（Ｊ！リニアーグラデイエンド
によりＤＡＯＣシンターゼをＤＡＯＣヒドロキシラーゼ
活性から充分に分離した単一の活性ピークとして溶離す
る。ＤＡＯＣシンターゼのピーク画分（フラクション）
を分取し、限外ろ過して濃縮し、得られた濃縮液をゲル
ろ過する。活性の単一ピークを１０％エタノール含有Ｔ
　ｒｉｇ　−ＨＣ１２（ｐＨ７５）バッファーで溶離す
る。活性の６０％を含有するピーク画分を分取し、強陰
イオン樹脂の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（
ＦＰＬＣ）にかけ、シンターゼをバッファー中ＫＣＣの
リニアーグラデイエンドで溶離する。単一の活性ピーク
が得られる。

最高の活性を有する画分から主要タンパク質（Ｍｒ＝３
４，０００）を、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いる電気溶
出によって殆ど均質にまで精製することができる。

精製工程は、１）弱陰イオン樹脂クロマトグラフィーに
よるＤＡＯＣヒドロキシラーゼ活性の分離、２）ゲルろ
過、および３）強陰イオン樹脂を用いたＦＰＬＣクロマ
トグラフィー、の３段階工程が考えられる。

該工程のステップは約°Ｃから約４°Ｃの間で行う。

まず、収穫したＳ、クラブリゲルスの全細胞から粗酵素
抽出物を調製する。細胞を１０容量％のエタノールを含
有するｌ　５　ＩＩＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣｇ（ＰＨ７
。

５）バッファー（以後、Ｅバッファーと称する）に細胞
ヲｆｌｌｊ４濁する。フェニルメチルスルホニル・フル
オライドまたはジイソプロピル・フルオロポスフェート
等のプロテアーゼ阻害物質の存在下、細胞を音波処理し
て破壊する。音波処理混合物を４０、０００　Ｘ９で約
３０分間遠心する。土浦を粗酵素抽出物として用いる。

工程の第１段階では、冷粗抽出物を、あらかじめＥバッ
ファーで平衡化した弱陰イオン樹脂クロマトグラフィー
にかける。用い得る弱陰イオン樹脂はＤ’ＡＥセルロー
ス（Ｗｈａｔｎａｎ、　Ｉｎｃ、　）として市販されて
いるジエチルアミンエチルセルロースなトノセルロース
誘導Ｌ　Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）メチルコ
アクリルアミドと陰イオンアクリル誘導体の第２級モノ
マーとの共重合体なとのアクリル系コポリマーを挙げる
ことができる。市販品を入手し得るＤＥＡＥ−トリスア
クリルＬＳ（Ｉ　ＢＦ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ　　
Ｉｎｃ、）は好適な陰イオン樹脂である。

冷粗抽出物をカラムに適用し、カラムをＥバッファーで
洗浄し、結合したタンパク質をＥバッファー中、塩化カ
リウム（０−０，３５Ｍ）リニアーグラデイエンドで溶
離する。ＤＡＯＣシンターゼはＤＡＯＣヒドロキシラー
ゼ活性のピークとは充分に離れた単一の活性なピークと
して溶出する（第１図参照）。

全シンターゼ活性の約６０％を含有するピーク画分を分
取し、限外ろ過して小容量に濃縮する。

工程の第２段階ではシンターゼ濃縮物をゲルろ過する。

使用前にゲルをＥバッファーで平衡化し、タンパク質を
Ｅバッファーでゲルから溶離する。

通常のろ過でシンターゼ活性は単一のピークとして得ら
れる。市販の交差結合した多糖類タイプのゲル、例えば
セファデックス、セファロースおよびスーパーロース（
ファルマシア、インコーボレイテソド）、並びにウルト
ラゲルＡ４４（ＩＢＦ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ＋　
　　Ｖｉｌｌｅｎｅｖｅ−１ａ−Ｇｉａｒｅｍｅｒｅ、
　　　Ｆｒａｎｃｅ）はこの工程に用いるのに適してい
る。

全シンターゼ活性の６０％を含有するゲルろ過のピーク
画分を分取し、使用前にＥバッファーで平衡化した強陰
イオン交換樹脂によるＦＰＬＣクロマトグラフィーにか
ける。好ましい樹脂はポリマー陰イオン交’ｆＡ　樹脂
ＭｏｎｏＱ（ファルマシア）である。結合したタンパク
質をＥバッファー中、塩化カリウム（０−０，５Ｍ）リ
ニアーグラデイエンドで溶離する。単一のシンターゼ活
性のピークが観察された。最高の活性を有する画分を用
い、以下に記載の精製酵素の特性決定を行った。

シンターゼ活性を含有する単一のピークから得た画分は
必要な時まで一７０°Ｃで保存することができる。

一般に本発明方法によれば純度８５％以上の酵素が得ら
れ、通常は、純度９０％から９５％が得られる。

既述のごとく、Ｓ、クラブリゲルス由来のシンターゼは
Ｊ　、　Ｒ，Ｍｉｌｌｅｒらによって組換え法で得られ
た（米国特許出前１９２．２７３．１９８９年５月９日
出願）。組換え法で産生されたシンターゼも精製され、
それが起源のものと同一であることが認められた。

本発明は、また、組換え法で産生されたシンターゼの回
収および精製法を提供するものである。

組換え法で産生された酵素の精製工程は固有の酵素の精
製に関して述べた上記の工程と同様である。しかしなが
ら、天然起源のものよりも、組換え酵素はより濃縮され
た形で、より豊富に産生されるので、そして、２つの生
成源によって生産されるタンパク質は異質であるので、
その工程は別個である。

組換え体大腸閑によって産生される酵素は細胞内の顆粒
内に濃縮されている。一般に、工程は以下のように行わ
れる。酵素の顆粒抽出物をあらかじめＥバッファーで平
衡化した弱陰イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー
にかけ、ＮａＣＱのリニアーグラデイエンドで溶離する
。単一の活性なピークを得、全酵素活性の約６０％を含
有する溶出画分を分取する。限外ろ過して分取した画分
の容量を減少する。濃縮物をゲルろ過し結合したタンパ
ク質をバッファーでゲルから溶離し、単一のピークを得
る。全酵素活性の約６０％を含有するピーク画分を分取
し、０．１ｅＭペニシリンＮを補充する。合した画分を
次いで、ｐＨ８のバッファーと一緒に強陰イオン交換樹
脂によるクロマトグラフィーにかけ（ＦＰＬＣ）、結合
したタンパク質をｐＨ８バツフアー中、Ｎ８０ｇリニア
ーグラデイエンドで溶離する。２個の活性ピークが分析
により認められる。主ピークからの約６０％の酵素活性
を含有する画分を分取し、限外ろ過して濃縮する。濃縮
物をゲルろ過し、結合したタンパク質を０．１ＭのＫＣ
Ｑを補充したバッファーで溶離すると、２個の部分的に
分離した活性ピークか得られる。主ピークからの約８０
％の酵素活性を含有する画分を分取し、０．０５ＭのＫ
Ｃｆ７を補充したｐＨ７のバッファーと共に強陰イオン
交換樹脂を用いるＦＰＬＣにかける。カラムをバッファ
ー（ｐＨ７）中ＫＣＱのりニア−グラデイエンドで溶離
する。

少なくとも２７５ｍＵ／１１２のシンターゼ活性を有す
る主活性ピークから得た画分を合し、使用に備えて一７
０°Ｃで保存する。

最初に、例えば５０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｇ　−ＨＣＱ（ｐ
Ｈ７５）バッファー等の緩衝化媒質中で細胞をホモジネ
ートすることにより大腸菌から、シンターゼ含有顆粒を
単離する。ＤＡＯＣシンターゼに富む顆粒は８．０００
　Ｘ９で約１分間分画遠心することにより分離すること
ができる。顆粒をバッファーに再懸濁し、５ｍＭＤＴＴ
およびＩＯ容量％グリセロール含有１５ＩＩ＋Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ８，０）中の５Ｍ尿素（以後、Ｕ
ＤＧバッファーと呼称）によって可溶化する。混合物を
４０．０００ｘ９で約１５分間遠心する。次いで、粗Ｄ
ＡＯＣシンターゼを含有する顆粒抽出液である上清を本
明細書記載の方法で精製する。

以下の工程は温度約Ｏ′Ｃから約４°Ｃで行う。使用に
先立ってバッファーからガスを完全に除去しておく。

まず、粗抽出物を天然起源の酵素の精製に用いるために
先に記載した弱陰イオン交換樹脂のどれかによってクロ
マトグラフする。好ましい樹脂はＤＥＡＥ−セファロー
ス（ファルマシアＩｎｃ、、　　Ｐｉｓｃａｔａ★ａｙ
、　Ｎ　Ｊ　）である。まず樹脂をＵＤＧバッファーで
平衡化したのち、樹脂に粗抽出物を充填し、樹脂をＵＤ
Ｇバッファーで洗浄する。結合したタンパク質をＫＣＱ
またはＮａＣｌ２の線状グラデイエンド、好ましくはＮ
ａＣｌ（０−０，３Ｍ）のリニアグラディエントで溶離
する。第３Ａ図に示すように、シンターゼは単一の活性
なピークとして観察される。全酵素活性の約６０％を含
有するピーク画分を分取し、限外ろ過して小容量に濃縮
する。

濃縮物をＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　　ＲｉｃｈＩＩｌｏｎｄ、ＣＡから人手可能なり１ｏ
−Ｇｅｌ　Ａｏ、５ｍのような好ましい適当なゲルでゲ
ルろ過する。使用前にゲルをυＤＧバッファーで平衡化
する。タンパク質をＵＤＧバッファーでゲルから溶離す
ると、第３Ｂ図に記載のごとく、活性な単一のピークが
得られる。

全酵素活性の約６０％を含有するピーク画分を再度分取
し、０．１ｍＭペニシリンＮを補充し、酵素を安定化す
る。このプールを強陰イオン交換樹脂によるＦＰＬＣク
ロマトグラフィーにかける。

強陰イオン交換樹脂としては、市販のＡｃｃｅｌ（Ｗａ
ｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）、ＱＡＥ　　５ｅｐ
ｈａｄｅｘ（ファルマシアｌ　ｎｃ、　）およびＭｏｎ
ｏＱ（ファルマシアＩｎｃ、）を用いることができる。

好ましい樹脂はＭｏｎｏ　Ｑである。使用前に樹脂をグ
リセロール不含ＵＤＧバッファー、ｐＨ８，０で平衡化
しておく。結合したタンパク質を平衡化バッファー中、
Ｎａ１Ｊ！（０−０，５Ｍ）リニアーグラデイエンドで
溶離する。

第３Ｃ図に示すように、クロマトグラフィーで２本（主
および副ピーク）の活性ピークが観察された。

主ピークからの約６０％の酵素活性を含有する画分を分
取し、限外ろ過して濃縮する。濃縮物を適当なゲルでゲ
ルろ過し、小容量に濃縮する。好ましいゲルは市販のＳ
　ｕｐｅｒｏｓｅ（ファルマシア［ｎｃ、　）である。

ゲルを使用前、グリセロール不含バッファーで平衡化し
ておき、結合したタンパク質をＯＩＭのＫＣｌ２を補充
したグリセロール不含バッファーで溶離する。第３Ｄ図
に示すように、２本の部分的に分離した活性ピークが観
察される。

次いで、主ピークから得た酵素活性の約８０％を含有す
る画分を分取し、安定化のためにＯ，１ｍＭペニシリン
Ｎを補充し、再度、Ｍｏｎｏ　Ｑ等の強陰イオン交換樹
脂でクロマトグラフ（ＦＰＬＣ）する。樹脂を上記の最
初のＦ　Ｐ　Ｌ　ＣにおけるＵＤＧバッファー（ｐＨ８
，０）ではなくグリセロール不含バッファー（ｐＨ７、
’Ｏ）で平衡化しておく。結合したタンパク質を平衡化
バッファー中のＫＣｌ（０゜０５０５−０（２リニアー
グラデイエンドにより溶離する。シンターゼ活性の主ピ
ークを示すクロマトグラム・プロットを第４図に示す。

工程を通して、酵素精製は５ＤＳ−ＰＡＧＥによって追
跡することができる。第４Ｂ図は、工程の様々な段階に
おける酵素試料を電気泳動にかけた後のゲルの写真の模
写図である。第４Ｂ図から分かるように、ＤＡＯＣシン
ターゼの単一のスポットに対応するレーンは基本的に他
のタンパク質を含有していない。

上記の組換えシンターゼの精製工程によって得られた活
性な形のＤＡＯＣシンターゼは、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル
のレーザー・デンジトメトリック・スキャンにより、純
度約９７％を示した。従って、上記の組換えシンターゼ
精製法は、本発明の好ましい工程である。

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、
これらの実施例は本発明を限定するものではない。

特に明記しない限り、ＤＡＯＣシンターゼの分析は、０
．２８　μｍｏｌペニシリンＮ％　０．３　μａｏｌａ
ケトグルタレート、０．０６μｍｏｌ　　Ｆｅ５０．．
０２５μｓｏｌアスコルビン酸塩、１μｍｏｌジチオス
レイトール、および５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｇ（ｐＨ
７，４バッファー中０．０００２〜０．０１５単位の酵
素を含有する反応混合物１ｍｌを用いて行った。

酵素反応はペニシリンＮの添加で開始し、温度３６℃で
１５分間行った。シンターゼ活性は、ドッツラフおよび
イｘ−［Ｄ　ｏｔｚｌａｆ、　Ｊ　、　Ｅ　、　ａｎｄ
　Ｙ　ｅｈ。

Ｗ、に、、（１９８７）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６
９．１６１１−１６１８］の示した、ＨＰＬＣにおける
２６０１量でのＤＡＯＣ形成のモニターリングによって
測定した。

実施例Ｉ　Ｓ、クラブリゲルスからのＤＡＯＣセファマ
イシンＣ産生ストレプトマイセス・クラプリゲルスＡＴ
ＣＣ２７０６４をホイ、トニーら［Ｗｈｉｔｎｅｙ、　
Ｊ　、　Ｇ　１、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅ
ｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　　Ｖｏ
ｌ、　ｌ、　ｐｐ、　２４７　２５１（１９７２）］記
載の条件下、５００好エーレンマイヤーフラスコ中で培
養した。２日間培養した後、細胞を遠心して収穫し、１
０％工、タ／−ルおよび１、ＯＭ　ＫＣＱを含有するｌ
　５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７，５）で洗浄し
た。次いで、細胞を塩不含バッファーで洗浄し、必要な
時まで一７０°Ｃで保存した。

Ｓ、クラブリゲルス細胞からのＤＡＯＣ／ンターゼの単
離および精製は温度約Ｏ′Ｃ〜約４°Ｃで行った。すべ
てのバッファーは、使用前に脱ガス処理された。

生細胞（湿重量３００ｓ＋）を、全容量６００村中に１
０％のエタノールを含有するｌ　５　ｒＡＭ　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）バッファー（以後、Ｅバッ
ファーと称する）に懸濁した。４℃またはそれ以下の温
度において、細胞を音波処理して破壊した。音波処理の
間にフェニルメチルスルホニル・７／ｌ、ｔライド（Ｐ
ＭＳ　Ｆ）（２ＱＩＭ）およびデオキシリボヌクレアー
ゼ（１μｇ／ｘｆｆ）／Ｍｇ５Ｏ，（１０ｓＭ）を懸濁
液に加えた。音波処理の後、破壊細胞懸７ＷＪ液を４０
．０ＯＯＸ９で約３０分間遠心し、上清を粗細胞抽出物
として用いた。

上清を、あらかじめＥバッファーで平衡化したＤＥＡＥ
−トリスアクリル（Ｔ　ｒｉｓａｃｒｙｌ）　Ｌ　Ｓカ
ラム２．６Ｘ５０ｃｍ）に適用した。カラムを２カラム
容量のＥバッファーで洗浄し、結合したタンパク質をＥ
バッファー中、塩化カリウム（０−０，３５Ｍ）リニア
ーグラデイエンドで溶離した。ＤＡＯＣシンターゼはＤ
ＡＯＣヒドロキシラーゼ活性のピークとは充分に離れた
単一の活性なピークとして溶出した（第１図参照）。

全シンターゼ活性の約６０％を含有するピーク画分を分
取し、８１５　Ｍｉｎｉｃｏｎコンセントレータ−（Ａ
ａｉｃｏｎ）で限外ろ過して５！σに濃縮した。

濃縮物を予めＥバッファーで平衡化しておいたＵｌｔｒ
ａｇｅｌ　Ａ　４４カラム（Ｉ　Ｘ　１０　ｃｍ）（Ｐ
　ｈａｒｍａｃｉａ。

？　ｎｃ、　＋　　Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ、　　Ｎ　
Ｊ　）に適用した。単一の活性ピークが得られた。

全シンターゼ活性の６０％を含有するピーク画分を分取
し、予めＥバッファーで平衡化しておいたＭｏｎｏ　Ｑ
カラム（１ｘ　１０ｃｍ）（ファルマシアＩｎｃ、、　
Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ、　　Ｎ　Ｊ　）に適用した。

結合したタンパク質をＥバッファー中、塩化カリウム（
００，５Ｍ）リニアーグラデイエンドで溶離した。単一
の活性ピークが得られた。最高のシンターゼ活性を有す
る画分を一７０℃で保存した。Ｍｏｎｏ　Ｑカラムの各
１．Ｏｘ９画分から得られた主要タンパク質（即ち、分
子量３４，０００）を、１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに
よる電気溶出によって精製した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果（第２図）、画分から得た
全タンパク質の約５０％が主タンパク質と考えられ、そ
れは電気泳動溶出の後、はぼ均質でることが分かる。し
かしながら、ゲル精製した夕ンパク實は、ＤＡＯＣシン
ターゼとしては不活性であった。第２図において、ライ
ン１および４はタンパク標準２．５μ９を含有している
。レーン２および３の“ゲル溶出液”は、固有のシンタ
ーゼ精製においてゲル溶出したＳ、クラブリゲルスクン
バク質を含有している。

上記のＳ、クラブリゲルス・シンターゼの３段階精製を
以下の表３に示す。

表　３　３．　　クラブリゲルスからのＤＡＯＣシンタ
ーゼの精製 工程　　　タンパク質１　活性２　比活性３　回収率（
ｘ９）　　　　（Ｕ　）　　　Ｕ　／　ｍ９）　　（％
）粗抽出液　　　７，１６６　　　２５．７７　０．０
０３６　　１００■、タンパク質含有量はＢ　ｒａｄｆ
ｏｒｄ、　Ｍ、　Ｍ、　（１９７９）、　　Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　７２．　２４８−２５４の方法
に従い、ウシ血清アルブミンを標準に用いて測定した。

２：酵素活性１単位（Ｕ）は本明細書記載の方法に従っ
てペニシリンＮから、１分間にＤＡＯＣ１μＭを産生ず
るのに必要なシンターゼの量と定義する。

３；比活性は単位／タンパク質ズ９である。

実施例２　組換えＤＡＯＣシンターゼの単離と鼎 以下の精製は温度約０°Ｃ〜約４°Ｃで行った。全バッ
ファーは、使用前に完全な脱ガス処理を施された。　Ｓ
、クラブリゲルスのＤＡＯＣンンターゼのコピーを含有
するエシェリキア・コリに１２株ＪＭ１０９を米国特許
出願Ｎｏ、１９２，２７３（１９８８年５月９日出願）
記載の振盪フラスコ培養の条件下、１０Ｑ発酵器中で培
養した。発酵混合物の温度が３０°Ｃから４２°Ｃに上
昇した６時間後にＥ、コリ細胞を遠心して収穫し、実施
例１記載のＳ、クラブリゲルス細胞について用いた方法
で洗浄した。

洗浄した細胞を５０　ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　−ＨＣＱ＜ｐ
Ｈ７５）バッファーに懸濁し、Ｇａｕｌｉｎホモジナー
ザーで破壊した。ＤＡＯＣシンターゼタンパク質に富む
顆粒を８．０００　Ｘｇで約１分間分画遠心して分離し
た。

顆粒を５１１■Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）および
１０％グリセロールの存在下、１５１ＭＴｒｉｓＨＣＲ
（ｐＨ８，０）中、５Ｍ尿素（以後、ＴＪＤＧバッファ
ーと呼称）によって可溶化し、混合物を４０゜０００　
Ｘｇで約１５分間遠心して顆粒抽出物（上清）を得た。

上清をＵＤＧバッファーで平衡化したＤＥＡＥ−セファ
０−ス（ファルマシアＩｎｃ１．　　Ｐｉｓｃａｔａｖ
ａｙ、　Ｎ　Ｊ　）カラム（１，６Ｘ２５ｃπ）に適用
した。

カラムを２カラム容量の同一バッファーで洗浄し、Ｎａ
ＣＱ（００，３Ｍ）のリニアグラディエントで溶離した
。第３Ａ図に示すように、シンターゼは単一の活性なピ
ークとして得られた。

全酵素活性の約６０％を含有する画分を分取し、８１５
　Ｍ　１ｎｉｃｏｎコンセントレータ−（Ａａ＋１ｃｏ
ｎ）で限外ろ過して２ｊｌ１２に濃縮した。濃縮物をあ
らかじめＵＤＧバッファーで平衡化しておいた、Ｂｉ。

Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎ
ｄ、　ＣＡから人手可能なり１ｏ−Ｇｅｌ　Ａｏ、５Ｉ
ｌカラム（１，６Ｘ９５ｃ貫）に適用した。結合したタ
ンパク質をＵＤＧバッファーでゲルから溶離すると、第
３Ｂ図に記載のごとく、活性な単一のピークが得られた
。クロマトグラフィー的に全酵素活性の約６０％を含有
するピーク画分を分取し、０．１ｍＭペニシリンＮを補
充し、あらかじめグリセロール不ｉバッファー（５Ｍ尿
素、Ｉ　５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ８，０）およ
びＤＴＴ）を用いて平衡化しておいたＭｏｎｏ　Ｑ（フ
ァルマシアＩ　ｎｃ、　）カラム（０，５Ｘ５ｃ次）に
適用した。結合したタンパク質を平衡化バッファー中、
ＮａＣ１２（００，５Ｍ）リニアーグラデイエンドで溶
離した。第３Ｃ図に示すように、クロマトグラフィーで
２本の活性ピークが得られた。

主ピークからの約６０％の酵素活性を含有する画分を分
取し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　−３Ｑ　（Ａ　ａｉｃｏｎ
）で容量０．５ｉｆｆに濃縮し、予めグリセロール不含
バッファーで平衡化したＳ　ｕｐｅｒｏｓｅ　（ファル
マシア１ｎｃ、　、　　Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ＋　　
Ｎ　Ｊ　）カラム（１，６Ｘ８５ｃｍ）に適用した。結
合したタンパク質をＱ、ＩＭＫｃＱ補充グリセロール不
含バッファーで溶離した。

第３Ｄ図に示すように、２本の部分的に分離したピーク
が観察された。

次いで、主ピークから得た酵素活性の約８０％を含有す
る画分を分取した。分取した画分にＯＩＩＩＩＭペニシ
リンＮを補充し、再度、０．０５ＭＫ　ＣＱ補充グリセ
ロール不含バッファー（ｐＨ７，０）［ＵＤＧバッファ
ー（ｐＨ８，０）ではなく］で平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ
カラム（０，５Ｘ　５ｃｘ’）に適用した。

結合したタンパク質を平衡化バッファー中のＫＣｆ２（
０，０５−０，２Ｍ）のリニアーグラデイエンドにより
溶離した。活性およびタンパク質の溶出パターンを第４
Ａ図に示す。少なくとも２７５ｍＵ／ＩＱのシンターゼ
活性を有する３画分を分取した。

分取した溶出液は５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析においてタンパ
ク質の主（ｍａｊｏｒ）および副（ｍｉｎｏｒ）バンド
として移動した（第４Ｂ図）。ゲルをレーザー・デンジ
トメトリック・スキャンにかけたところ、主タンパク質
の純度は９５％であることが分かった。

上記の組換え的に産生されたＤＡＯＣシンターゼの精製
を表４に示す。精製組換えＤＡＯＣシンターゼは活性形
である。

第４Ｂ図（組換え法で産生されたＤＡＯＣンンターゼの
５ＤＳ−ＰＡＧＥ）において、レーン２および８はタン
パク標準２．５μ９を含有している。

レーンｌは顆粒抽出物２０μｇ、レーン３〜７はＤＥＡ
ＥセファＣＩ−ス溶出液２０μ９、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ａ
ｏ、５ａ＋溶出液、Ｍｏｎｏ　Ｑ　　Ｉ溶出液、Ｓ　ｕ
ｐｅｒ。

５ｅ１２溶出液およびＭｏｎｏ　Ｑ　　１１溶出γ夜を
表す（表４参照）。

（以下余白） 衣−」２組換え体Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉからのＤＡＯＣシ
ンターゼの精製 タンパク質　活性　　比活性 （ｏ）　　　　（Ｕ　）　　（Ｕ　／　ｚｇ）ステップ 収率 （％） 顆粒抽出物 ２５．６６　　　０．０５５４ 以下の工程は同一出願人の出願にかかる特願平１１４８
８３の明細書に記載の方法と同様である。

Ａ、Ｅ、コリに１２　　ＲＲＩΔＭ１５／ｐＯＷ３８０
の培養 Ｅ、コリに１２　　ＲＲＩΔＭｌ　５／ｐＯＷ３８０の
凍結乾燥品はザ・ノーザン・レジオナル・リサーチ・ラ
ボラトリーズ（Ｎ　ＲＲＬ）（ベオリア、ｒＬ６１６０
４）から受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１３２６４のちとに
入手でき、これを下記のプロセスに、「培養物」として
直接使用する。

アンピシリン１００１１９／１１Ｑを含有するＴＹブロ
ス（１リットル当り、トリプトファン８９、ＮａＣ（２
５９および酵母抽出物５９）１リンドルにＥ、コリに１
２　　ＲＲＩΔＭｌ　５／ｐＯＷ８８０の培養物を接種
し、３７°Ｃで通気しながら１夜インキユベートした（
１５〜１８時間）。得られた培養をプラスミドｐＯＷ３
８０の供給源として使用した。

Ｂ、プラスミド０Ｗ３８０の単離 上記した先の出願の明細書記載の実施例ＩＡで作成した
培養を４°Ｃ１５２００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞
をペレット化した。生じた上清は棄てた。細胞ベレット
を、２５％スクロースおよび５０ｍＭ　　ＥＤＴＡから
なる溶液２８１りに再浮遊した。５０％グリセリンおよ
びＱ、２５ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８，０）に２０π９／
籾リゾチームを溶解した溶液約ｌＲ１２および０．５Ｍ
　　ＥＤＴＡ約１．５ｘ（１＜ｐＨ８、０）を細胞浮遊
液に添加し、混合した。

得られた混合物を氷上で１５分間インキュベートした。

リゾチームで処理した細胞に溶解液（１０％トリトン−
Ｘ１００　３ｘＱ、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，
０＞７５ｘ（ｌおよび水７Ｘｆｆから調製）３ＷＣを静
かに混合しながら添加した。得られた溶液を水上でさら
に１５分間インキュベートした。

４°ｃ１１７０００ｒｐｍで約４５分間の遠心ニヨり細
胞残層を溶液から除去した。〜３０ｘ（ｌの上清へＣ３
ＣＱ約２８．６９および５ｘｙ／ｘＱの臭化エチジウム
溶液〜ｌｚ＆を添加した。ついで容量を水で４０村に調
節し、溶液を超遠心用試験管へデカントした。試験管を
密閉し、４９５００　ｒＰｌで〜１８時間遠心した。紫
外線で観察して、生じたプラスミド・バンドヲ単離し、
塩飽和イソプロパツールで抽出して臭化エチジウムを除
き、ＴＥ緩衝液（１０１１Ｍトリス−ＨＣＱ（ｐＨ７，
５）および１ｍＭＥＤＴＡ）〜２０容量で透析し、透析
液を３回とり替えて行った。透析物を集め、ついでエタ
ノール２容量および３Ｍ酢酸ナトリウム溶液０．０５容
量を添加した。エタノール混合物を一２０°Ｃに冷却し
、−１０°Ｃ１ｌ　ＯＯ００ｒｐｍで３０分間の遠心に
よりプラスミドＤＮＡをベレット化した。得られたペレ
ットをＴＥ緩衝養液１ＩＣに再浮遊し、これを等容量の
フェノール：クロロホルム混合液（１１、ｖ／ｖ）で抽
出した。３Ｍ　　Ｎａ０ＡｃＯ，ｌ容量およびエタノー
ル２容量を添加することによって水層のＤＮＡを回収し
、これを−２０°Ｃで〜３０分間インキユヘートシ、ｌ
　５０００ｒｐｍテ２０分間遠心した。得られたＤＮＡ
ペレットをまず７０％のエタノール、ついで１００％の
エタノールで洗浄し乾燥した。

この方法によって得られたプラスミドｐＯＷ３８０　　
ＤＮＡの〜１．５ｘ９をＱ、１ｘＴＥ緩衝液１゜５ｊｌ
ｆｆに浮遊し、−２０’Ｃで貯蔵した。プラスミドｐＯ
Ｗ３８０の制限酵素部位および機能地図は特願平１１１
４８８３の明細書に添付した図面の第１図に記載されて
いる。

種々の方法および遺伝子配列供給源を使用して同一のプ
ラスミド組立てを達成することができる。

ＤＡＯＣＳ遺伝子を含んだコスミドｐＯＷ３７９の〜３
ｋｂ　　Ｂａａ＋Ｈ１制限酵素断片を、ＢａｍＨＩで消
化した複製型（ＲＦ）Ｍ１３ベクターとライゲーション
することによってファージｍ０Ｗ３８０を組立てた。ス
トレプトマイセス・クラプリゲルスのゲノムコスミド・
ライブラリーからコスミドｐＯＷ３７９クローンを得、
これをＳ、リブマニイのＩＰＮＳ遺伝子だけでなく、精
製したＳ、クラブリゲルス・エキスパンダーゼのアミノ
末端アミノ酸残基配列および種コドンー利用偏り（コド
ンユーゼージバイアス）に基づいて設計された「ゲスマ
ー（ｇｕｅｓｓ■ｅｒ）ＪＤＮＡプローブを使用するハ
イブリダイゼーションによって同定した。所望のファー
ジＭ１３クローンは「ゲスマー」プローブを使用するプ
ラークハイブリダイゼーション法により、または制限酵
素分析によって同定できる。しかしながら本発明では、
主としてプラスミドｐＯＷ３８０をＳ、クラブリゲルス
ＤＡＯＣ３遺伝子の供給源として使用し得るので、ｍ０
Ｗ３８０の組立ては極めて簡単である。Ｍ１３から導か
れたファージｍ０Ｗ３８０は、Ｓ、クラブリゲルス・エ
キスパンダーゼ暗号配列の５゛末端にＮｄｅｌ制限酵素
認識部位を作り出すため実施される部位特異的突然変異
の際の有用な中間体である。

先の出願記載の実施例１ｂで作成したプラスミドｐＯＷ
３８０ＤＮＡ約２５μ９の○、ｌ　ｘＴＥ緩衝液２５ａ
（ｌ浮遊液をｌＯＸ１０ＸＢａ緩衝液（ｌＯＭ　　Ｎａ
（１！、ｌ　ＯＯｎＭ　トリス−ＨＣＱ（ｐｆ−１７５
）および１００ＩＩＩＭ　　ＭｇＣ２ｔ）４０μり、ガ
ラス蒸留水３３５μＱおよび制限酵素ＢａｒＡＨｒ５μ
Ｑ（〜５０単位）に添加して混合する。特に記載しない
限り、制限酵素は二ニー・イングランド・バイオラブズ
［（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、３
２トザー・ロード（Ｔｏｚｅｒ　Ｒｏａｄ）、ビバリー
（Ｂ　ｅｖｅｒｌｙ）、ＭＡＯ１９１５］から入手した
。単位の定義はそれぞれの製造業者の単位の定義に対応
する。生じた反応物を３７℃で９０分間インキュベート
する。

ついでフェノールおよびクロロホルムで反応を抽出し、
ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＯＷ３８０　　ＤＮ
ＡをＮａｏＡｃおよびエタノールで沈澱させ、これをＨ
，０９Ｍｇに再浮遊させる。負荷緩衝液（２５％、ｖ／
ｖグリセリン、０．０５％ｗ／ｖブロムフェ／−ルブル
ーおよび０．０５％キシレンシア／−ル）約１μρをＤ
ＮＡ溶液へ添加し、ついで所望の〜３ｋｂ　　ＢａｍＨ
Ｉ制限酵素断片が他の消化生産物から明らかに分離され
るまで１％アガロースゲル上で電気泳動する。

ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（０，５μ９／ＪＩｅ
）で染色し、染色したゲルを長波長紫外線で照射するこ
とによって電気泳動されたＤＮＡを可視化した。断片の
位置を確かめたのち〜３ｋｂ断片の前でゲルに小切り込
みを作り、切り込みにシュライヒヤ−（Ｓ　ｃｈｌｅｉ
ｃｈｅｒ）およびシュエル（Ｓ　ｃｈｕｅｌｌ）［キー
ン（Ｋ　ｅｅｎｅ）、ＮＨσ３４３１コのＤＥＡＥ膜を
置いた。さらに電気泳動すると、ＤＮＡは非共有結合的
にＤＥＡＥ膜に結合した。所望の断片をＤＥＡＥ膜に結
合させたのち、膜を取り、低塩緩衝液（１００ｍＭ　Ｎ
ａＣ＜！、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ＩＩＩＭトリス
ーＨＣ１２（ｐＨ８））で洗浄した。つぎに膜を小試験
管に入れて、高塩緩衝液（ＬＭ　ＮａＣＱ、０、ＩＩＭ
　　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８））
に浸漬させ、６５°Ｃで１０分間インキュベートしてＤ
ＮＡをＤＥＡＥペーパーから遊離させた。

６５℃でインキュベーション後、インキュベーション緩
衝液を集め、膜を高塩緩衝液で洗浄した。所望のＤＮＡ
断片を採取する前に洗浄液とインキュベーション緩衝液
を分取した。

Ｎ　ａＣＱｊＲ度が０．２５Ｍとなるヨウニ高塩−ＤＮ
Ａ溶液の容量を調節し、ついで冷無水エタノール３容量
を溶液に添加した。得られた溶液を混合し、水上で１０
〜２０分間放置した。ついで溶液を１５０００　ｒｐｍ
で１５分間遠心した。もう−度沈澱させたのち、残りの
塩を除去し、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄
し、乾燥し、ＴＥ緩衝液２０μｇに再浮遊させて、所望
の制限酵素断片を構成した。〜３ｋｂの断片約０．６μ
９が得られた。

組立て Ｍ１３＋ｐ１９ＲＦ　　ＤＮＡ（二ニー・イングランド
・バイオラブズ（ＮＥＢ）から入手できる）約２５μ９
を、制限酵素ＢａＩＩＨＩｌμＩ２（〜２０単位）によ
りＢａｍＨＩ緩衝液１００μ＆中、３７°Ｃで９０分間
消化した。反応混合物をフェノール：クロロホルムで抽
出し、水層のＤＮＡをエタノール沈澱により濃縮した。

ＤＮＡペレットをＱ、ＩＸＴＥ緩衝液２０μｇに再浮遊
させて、所望のＢａｗＨＩ−消化Ｍ１３ｍｐ１９ベクタ
ー〜２μ２を構成した。

得られたベクターＤＮＡを一２０’Ｃで貯蔵した。

プラスミドｐＯＷ３８０の〜３ｋｂ　　ＢａｍＨＩ制限
酵素断片２μＱとＢａａ＋ＨＩ消化ベクターＭ１３ｍｐ
１９　１μＱを２０μＱの反応混合物［ＤＮＡ断片、１
０Ｘリガーゼ緩衝液（０，５Ｍトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ
７，５）および１００　ｓ＋Ｍ　ＭｇＣＱ＊　２　ｘＱ
ｚ　５　ａ＋ＭＡＴＰ２μｇ、６μ９／μｉ！Ｂ５Ａｌ
μＱ、ガラス蒸留水１２μＱおよびＴ４　　ＤＮＡリガ
ーゼ（ＮＥＢ月μｆｆ（１ワイス単位）を含有］中でラ
イゲーションする。反応を１５℃で〜１８時間インキュ
ベートする。ライゲーションしたＤＮＡはイ也のライゲ
ーション生産物とともに所望のファージ■○Ｗ３８０を
構成している。

コンピテントなＥ、コリＫ１２　　ＪＭ１０９（ｒエピ
キュリアン・コリ（Ｅ　ｐｉｃｕｒｅａｎ　Ｃｏｆ　１
）Ｊ（商標））をストラタジーン社［Ｓ　ｔｒａｔａ）
（ｅｎｅ、３７７０タンシー・ストリート（Ｔ　ａｎｓ
ｙ　Ｓ　ｔｒｅｅｔ）、サン・ジエゴ（Ｓ　ａｎ　Ｄ　
ｉｅｇｏ）、ＣＡ９２１２１］から購入し、ＤＮＡの容
量を２０Ｍｇとし、媒質の希釈や発現時間を必要としな
い以外は、実質上、製造業者の指示通り、ファージｌｌ
ｌ０Ｗ３８０を構成するライゲーション反応混合物で形
質転換した。形質転換後、対数増殖期にあるＥ、コリに
１２　　ＪＭ１０９を試験管１本当りに０．２５ｊｌ１
２ずつ含有する１３ＸＩＯＱｘ（の滅菌ガラス試験管へ
、細胞をそれぞれ〜１．１０．２０．４０および５０μ
！２ずつ試料として分配した。これらの試験管にトップ
アガ−（４５°Ｃで溶融維持させた０、８％寒天含有し
ブロス）３１Ｑずつを添加した。ついで細胞−ト、、ブ
アガー混合物を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ガル）４０μ９／　Ｉ
ＩＱおよび０、ＩＭ　イソプロピルチオ−βガラクトシ
ド（Ｉ　ＰＴＧ）を含有するＬ−寒天平板上に接種し、
平板を３７℃で１夜インキユベートした。［Ｍｌ　３法
に関する一層詳細な記述および説明については、Ｍｌ３
・クローニング／ジブオキ／・シーフェンシング・イン
ストラクション儂マニュアル（Ｍ　ｌ　３　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ／　Ｄ　１ｄｅｏｘｙ　Ｓ　ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　
Ｉ　ｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ）、ベセスダ
１ノサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓＸＢ　ＲＬ）、ライフ・チクノロシー
ズ・インコーホレーテッド（Ｌ　ｉｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、）、ゲイザースバーグ（Ｇ
　ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ２０８７７、参照］
。形質転換体をβ−ガラクトシダーゼ活性（無色のプラ
ーク表現型）の挿入失活および複製型（ＲＦ）ＤＮＡの
制限酵素分析によって同定する。スクリーニングの目的
のため、平板オーバーレイから初期対数増殖期のＥ、コ
ｌ）　Ｋ　１２ＪＭ１０９の１プラーク当り３１Ｑずつ
透明なプラークをパスツール・ピペットで充填する。培
養物を通気しなから３７°Ｃで６〜１８時間インキュベ
ートする。

インキュベー７：Ｉン後、培養１．５村ずつを１゜５ｆ
ｆ１２の工、ベンドルフ試験管でペレット化する。

新しく用意した試験管へ上清をデカントして、これをフ
ァージ接種物の供給源とするため４°Ｃで貯蔵する。下
記の例外を除き、実質上ｉ＜−ンボイムおよびドリーの
アルカリ性プラスミド調製法［ヌクレイツク・アシッド
・リサーチ（Ｎ　ｕｃ、　　Ａ　ｃｉｄＲｅｓ、　）、
７巻（６）、１５１３〜１５２３頁（１９７９年）コの
教示にしたがって、細胞ベレ・ノドから複製型ＤＮＡを
作成する。１液、■液および■液を１，５倍量使用して
スケ−ルア、、ブし、透明な細胞溶解液を等量のＣＨＣ
ｆ！３で一度抽出する。ついでインプロパツール０．４
容量を添加し、室温で２０分間インキュベートすること
によってＤＮＡを沈澱させる。遠心によってＤＮＡを採
取し、ついで０．３Ｍ　　Ｎａ０Ａｃからエタノールで
沈澱させる。ＲＦ　　ＤＮＡの制限パターン分析は、所
望の挿入体の存否を判断するだけでなく、Ｍ１３ベクタ
ーの多重（複数）クローニング部位（ＭＣ３）に対する
挿入配列の方向を判定するのにも使用し得る非対称型５
ｃａＩ制限酵素認識部位の存在によって容易となる。こ
の方法によって、Ｅ、コリＫ１２　　Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ９
／５ＯＷ３８０細胞を同定した。ついでこれらの細胞を
、以下に説明する部位特異的突然変位のためのファージ
ｍ０Ｗ３８０の供給源として使用した。

初期対数増殖期Ｅ、コ！ＪＫ１２　　ＪＭ１０９の培養
物１０＋Ｑにファージストック（実施例２Ｂで調製）〜
２００μｅを接種し、３７°Ｃで通気しなから〜１８時
間インキュベートした。培養物を遠心して、得られた上
清を新しく用意した試験管へ移して再び遠心した。上清
をもう一度新しい試験管へデカントした。２５％ポリエ
チレングリコール（分子量；３３５０）の３Ｍ　　Ｎａ
Ｃ（溶ｅ、ｔｘｃを上清に添加し、これを室温で１５分
間インキュベートした。得られた混合物を１１００００
ｒｐで３０分間遠心した。遠心によって得たペレ、ノド
は１本鎖ファージｍ０Ｗ３８０を含有しており、これを
ＴＥ緩衝養液００μｇに再浮遊した。溶液をまずＣＨＣ
Ｑ’ｓで、ついでＴＥ飽和フェノールで抽出した。

フェノールを水層と接触させて１５分間静置した。

ついで溶液をＴＥ飽和フェノール・ＣＨＣｆ２３（１１
、ｖ／　ｖ）混合液で２回、さらにＣＨＣＣ３だけで２
回抽出した。ついでＤＮＡを領３Ｍ　　Ｎａ０ＡＣから
沈澱させ、遠心によって採取し、得られたペレットをＱ
４ＸＴＥ緩衝液１００μＱに再浮遊した。この溶液は１
本鎖ファージｎ０Ｗ３８０ＤＮＡ〜５μＱを構成してい
た。

Ｄ、又然変異透介 突然変異の誘発（および引き続き所望のファージを検出
するためのハイブリダイゼーション）に使用した１本鎖
ＤＮＡ断片は、ＢＲＬ社から購入したＭ１３昔遍ブライ
マー（１５量体）以外は自動Ｅ）ＮＡ合成装置で合成し
た。突然変異誘発用断片は、（１）ＳＴＮＤＥ−Ａ：３
個の塩基を除いてファージｍ０Ｗ３８０のＤＡＯＣＳ暗
号配列と相同な４１ヌクレオチド長さの下記のＤＮＡ配
列：を有する１本鎖ＤＮＡ［その不対合部分（下線で示
す）はＤＡＯＣ５暗号配列のおよそ１位の位置で制限酵
素Ｎｄｅｌ認識配列を作り出すコ、および（２）ＳＴＮ
ＤＥ−Ｂ：単に５ＴＮＤＥ−Ａ断片の面断片（サブフラ
グメント）である下記のＤＮＡ配列：を有する１７ヌク
レオチド長さの１本鎖ＤＮＡのように設計されている。

５ＴＮＤＥ−Ａ約１００ピコモルの５゛末端を１ピコモ
ル／μｇ濃度の１本鎖ＤＮＡ、ＩＱＸリガーゼ緩衝液１
０μり、アゾ／シン三リン酸（ＡＴＰ）１０００ピコモ
ル、０、ＩＭ　ＤＴＴ１０μＱ１ガラス蒸留水６５μり
およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μＱ（ＩＯリチ
ャードソン単位）しべ−リンガ−・マンハイム・バイオ
ケミカルズ（Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ
　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、（ＢＭＢ）、７９４
１キヤツスルウエイ・ドライブ（Ｃａｓｔ　１ｅｖａｙ
Ｄｒｉｖｅ）、ｐ、　ｏ、ボックス５０８４１、インジ
アナポリス（Ｉ　ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インジア
ナ（Ｉｎｄｉａｎａ）、４６２５０）］を含何する反応
混合物でリン酸化（キナーゼ化）した。反応混合物を３
７°Ｃでインキュベートして３０分経過後、酵素ｌμＱ
を追加した。

ついで３７°Ｃでさらに３０分間インキュベートしたの
ち、６８°Ｃで５分間インキュベートして反応を終結し
た。これと同量の酵素を含有する類似の反応混合物４０
μｇで、Ｍ１３普遍ブライマー約４０ピコモルからなる
５“末端をキナーゼ化した。

１本鎖ファージｍ０Ｗ３８０　　ＤＮＡを、実質上、ア
デルマン（ＡｄｅｌＩｌａｎ）ら［ＤＮＡ、２巻（３）
、１８３〜１９３頁（１９８３年）］の教示にしたがい
下記のように突然変異した。１０×アニーリング緩衝液
８　μＲ（１０Ｃ）＋Ｍ　ｈ　’）　ス−ＨＣ（！（ｐ
Ｈ７，５）、１ａＭＥＤＴＡおよび５００ｍＭＮａＣの
、キナーゼ化した５ＴＮＤＥ−Ａ　　４μＱ（４ピコモ
ル）、キナーゼ化したＭ１３普遍配列決定ブライマー４
μｇ（４ピコモル）および水５０μｇに１本鎖ファージ
ｍ０Ｗ３８０　　ＤＮＡ〜５００ナノグラム（０，ＩＸ
ＴＥ緩衝液１５μｅ溶液）を添加し、混合物を８０°Ｃ
で２分間、５５°Ｃで５分間、最後に室温で５分間イン
キュベートすることによりアニーリング反応を実施した
。

１０Ｘクレノー・リガーゼ緩衝液２０μｆｆ（１００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、ｌｅＭＥＤＴＡ。

５００ｍＭ　　ＮａＣｌ２）、Ｏ，ＩＭ　ＤＴＴ２０μ
１２ＳｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰのそ
れぞれ６．２５１Ｍずツノ溶液２０１１（１，５ｍＭ　
　ＡＴＰ２０ｔｔ（１、水１２０μ（Ｊおよびタレ／−
酵素（ＢＭＢ）２．５μ！２（１２，５単位）からなる
混合物１２０μｅを、アニーリングしたＤＮＡ溶液に添
加して伸長反応を実施した。伸長反応混合物を室温で１
時間、３７°Ｃで４時間、最後に１４°Ｃで〜１８時間
インキュベートした。

伸長反応混合物をＣＨＣＱｓで一回抽出し、エタノール
およびＮａ０ＡｃでＤＮＡを沈澱させ、遠心により採取
した。ＤＮＡペレットを、ｌＸ５ＩＩ衝液（０，３Ｍ　
ＮａＣＲおよび３ｍＭ　Ｚｎ０Ａｃ）４００μＱに再浮
遊させた。このＤＮＡ溶液の半分は２０°Ｃで保存し、
残りの半分を分け、５本の１゜５ｘ＆試験管へ分配した
。１μａ当り２００　（３０ミニツト）単位に希釈した
Ｓ１ヌクレアーゼ（ＢＭＢ）１μＱをこれらの試験管４
本へ添加した。反応混合物を室温で、それぞれ５分、１
０分、１５分および２０分インキコベートした。まずｔ
ＲＮＡ５〜１０μ９を反応混合物に添加してキャリアー
として作用させ、ついでＴＥ飽和フェ／−ルーＣＨＣｆ
２゜混合物（１：１．Ｖ／Ｖ）で抽出することによって
反応を停止させた。Ｓｌで処理しなかった試料（陰性対
照）も同様に抽出した。水層に含まれるＤＮＡをエタノ
ール沈澱により濃縮し、遠心によって採取した。ＤＮＡ
ベレットをそれぞれ２０μｅの水に再浮遊させた。

ｓｌで処理して得られたＤＮＡ溶液各１０μＱを、実質
上、実施例２Ｂに記載した方法で、ただし各平板にＸ−
ガルまたはＩ　ＰＴＧのどちらかをも含ませず、Ｅ、コ
リに１２　　ＪＭ１０９の形質転換に使用した。以下記
載のように、放射能標識したオリゴヌクレオチド５ＴＮ
ＤＥ−Ｂをニトロセルロースフィルターにプロットした
ファージＤＮＡとハイブダイズさせることにより、所望
の突然変異体を同定した。

プラーク形成後、平板を４°Ｃで〜１時間インキュベー
トしてトップアガーを固化させた。陰性対照、１０分間
Ｓ１−処理系および２０分間Ｓｌ−処理系からそれぞれ
〜５０〜２００プラークを含んだ２枚ずつの平板細菌叢
の上方にニトロセルロースフィルターを置いた。フィル
ターと細菌叢表面の接触を〜１分間保ったのち、直ちに
ニトロセルロースフィルターを、０．１Ｎ　ＮａＯＨ−
１，５ＭＮａＣ＆で５分間、ついで０．５Ｍ）リス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７，０）　　３Ｍ　　Ｎａ（Ｊ！で５分間飽
和した３ＭＭＣｈｒフィルターペーパー［ワットマン・
ラブセールズ・インコーホレーテッド（Ｗａｔｉａｎ　
　Ｌ　ａｂ　−５ａｌｅｓ　Ｉ　ｎｃ、　）、Ｐ、Ｏ，
ボックス１３５９、ヒルスボｏ　（Ｈ１ｌｌｓｂｏｒｏ
）、オレイン（Ｏｒｅｇｏｎ）、９７１２３−１３５９
］を使用して処理した。ニトロセルロースフィルターを
空気乾燥し、ついで１空で８０°Ｃ５３０分間焼成した
。

ニトロセルロースフィルターを６ｘＳＳＣＹｌｊＭ（２
０ＸＳＳＣは３Ｍ　　ＮａＣｇおよび０．３Ｍクエン酸
Ｎａ）、１０×デンハート（Ｄ　ｅｎｈａｒｔ’　ｓ）
溶液（水１００ｄ当りポリビニルピロリドン０．２Ｌｉ
、ウシ血清アルブミン０．２９およびフイコール０．２
Ｌｉ）、０．１％ＮａＰＰ１．０．１％ＳＤＳおよび変
性Ｅ。

コリ染色体ＤＮＡｌ０μ９／奸からなる溶液で室温で約
５分間のプレハイブリダイゼーションに付した。ついで
６ＸＳＳＣ，ｌＱｘデンノ＼−ト溶液、０．１％ＮａＰ
Ｐ１および ”Ｐ−３ＴＮＤＥ−Ｂ　　１　ヒ＋モル１５．ｗ（２の
溶液中でフィルターをハイブリダイズした。”ｐ−５Ｔ
ＮＤＥ−８は、本実施例で先に記載した方法と実質上同
様に、ただし非放射性ＡＴＰの代わりにγ−”Ｐ−ＡＴ
Ｐ（二ニー・イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）（Ｎ　Ｅ　Ｎ）、５４９ア
ルバニー・ストリート（Ａｌｂａｎｙ　５ｔｒｅｅｔ）
、ボスト７　（Ｂ　ｏｓｔｏｎ）、ＭＡ、０２１１８、
カタログ＃ＮＥＧ−Ｏｏ２）〜７０ピコモルを使用して
５ＴＮＤＥ−Ｂ　　ｔｏｏピコモルの５°末端をリン酸
化することにより作成した。ハイブリダイゼーション後
、室温で過剰の６×ＳＳＣで１回当り５分間ずつ、つい
で５２°Ｃで過剰の６ＸＳＳＣで１回当り２０分間ずつ
それぞれ２回洗浄した。フィルターを空気乾燥し、クア
ンタ（Ｑ　ｕａｎｔａ）　Ｉ［［（商標）増感紙（デュ
ポン（ＤｕＰｏｎｔ）、インスッルメント・プロダクツ
（ｒ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｐ　ｒｏｄｕｃｔｓ）、バ
イオメジカル・デイビジョン（Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｃａｌ
　Ｄ　１ｖｉｓｉｏｎ）、ニュータウン（Ｎｅｗｔｏｗ
ｎ）、ＣＮ０６４７０）で−７０°Ｃで２時間オートラ
ジオグラフィーを行った。

フィルターへのファージＤＮＡの結合によって放射能標
識オリゴマーが結合するために、５ＴＮＤＥ−Ｂ配列と
相補的な配列を含んだ所望の突然変異体によりフィルム
が感光した。実質上実施例２Ｂ記載の方法によって作成
したＲＦＤＮＡの制限酵素分析により、正確な突然変異
体を同定し、ファージｍ０Ｗ３８１と命名した。

Ｅ、プラスミドｐＯＷ３８０の最終組立てファージｌｌ
ｌ０Ｗ３８１のＲＦ　　ＤＮＡはＥ、コリ発現プラスミ
ドｐＯＷ３８２の組立てに利用するＮｄｅ　Ｉ　−Ｂａ
ｇ＋ＨＩ制限酵素断片上にＤＡＯＣ３暗号配列を含んで
いるが、断片を単離するのに十分量のｍ０Ｗ３８１複製
型を蓄積することが困難な場合がある。Ｅ、コリ発現プ
ラスミドｐＯＷ３８２の組立てを容易にするため中間体
プラスミドｐ。

Ｗ２Ｂ５を組立てた。

実質上、実施例２Ｂ記載の方法によってファージｍｏｗ
３８１に感染させたＥ、コリＫ１２ＪＭ１０９から複製
型ＤＮＡを単離した。ファージｍ○Ｗ３８１　ＤＮＡの
ＲＦ　ＤＮＡ約１０μ９を、該ＤＮＡの１ＸＢａｉＨＩ
緩衝液溶液を含んだ反応混合物中で制限酵素ＢａｍＨＩ
（〜１０単位）により消化した。３７°Ｃで〜９０分間
インキュベーション後、反応混合物をアガロースゲル電
気泳動に掛け、実質上、先の出願の実施例２Ａにしたが
い〜３ｋｂＢａｏ＋ＨＩ断片を単離した。

ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＵＣ３ＤＮＡを実質
上実施例２Ｂにしたがい作成した（プラスミドｐＵＣｇ
ＤＮＡはＢＲＬから入手可能である）。

ファージｍＯＷ３ｇｌから単離した〜３　ｋｂ　　Ｂ　
ａａ＋Ｈ１断片ＤＮＡ５μＱ（〜１μｇ）とＢａａ＋Ｈ
Ｉで消化したプラスミドｐＵＣ８ＤＮＡ　　１μｇ（〜
１００ｎ９）とを、実質上、実施例２Ｂにしたがいライ
ゲーション（結合）した。ライゲーションしたＤＮＡは
池のライゲーション生産物と一緒に所望のプラスミドｐ
ＯＷ３８１を構成した。プラスミドｐＯＷ３８１は、Ｄ
ＡＯＣ３暗号配列のおよそ第１コドン位置にある付加し
たＮｄｅｆ制限酵素認識配列の存在を除けば、プラスミ
ドｐＯＷ３８０と同一の制限酵素部位地図を有する。

所望のプラスミドｐＯＷ３８１を構成しているライゲー
ション反応物を、コンピテントなＥ、コリに１２　　Ｒ
ＲＩΔＭ１５（ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５４４０）へ導入し
た。アンピシリン（１００μｇ／ｚＱ）、Ｘ−ガ／ｌ／
（４０μｇ／＊Ｒ）およびＩ　ＰＴＧ（０，１Ｍ）を含
有するＬ−寒天平板に形質転換混合物の一部を接種した
。平板を３７°Ｃで〜１８時間インキュベートした。白
色のコロニーカラーを示すアンピシリン耐性形質転換体
（プラスミドｐＵＣ８に暗号化されているβ−がラクト
シダーゼのα−断片の挿入による失活のため）を、その
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によってざらにスクリ
ーニングし、所望のプラスミドｐＯＷ３８１形質転換体
を同定した。ファージＭ１３に感染させたＥ、コリＫ１
２　　ＪＭ１０９細胞ベレットからＲＦ　　ＤＮＡを作
成した前記バーンボイムおよびドリーの方法に実質上し
たがい、３３１（培養からプラスミドＤＮＡを作成した
。以下の組立てに使用するため、先の出願の実施例１記
載の方法に実質上したかい、１個の形質転換体からプラ
スミドｐＯＷ３８１ＤＮＡを作成した。

プラスミドｐＯＷ３８２の組立て プラスミドｐＯＷ３８２は、ストレプトマイセス・タラ
ブリゲルス・エキスパンダーゼ（ＤＡＯＣ８）の暗号配
列を含んでいるプラスミドｐＯＷ３８１からの〜２．４
ｋｂ　ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素断片と、プラスミ
ドｐＣＺ　Ｒ３３６からの〜５．８ｋｂ　　Ｎｄｅｌ　
−ＢａｍＨＩ制限酵素断片とを互いにライゲージコンす
ることによって組み立てることができる。ｐＣＺ　Ｒ３
３６からの〜５．８　ｋｂ　Ｎｄｅ　ｌＢａ１Ｈ１制限
酵素断片は、λｐＬブひモーター關訳活性化配列、ｃ１
８５７リブレツサー、プラスミド複製の開始点、および
テトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を暗号化してい
るＤＮＡ配列を含んでいる。またプラスミドｐＣＺ　Ｒ
３６６はヒト成長ホルモンのための暗号配列を含んでい
る。

プラスミドｐＣＺ　Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ　ＮｄｅＩ
　−ＢａｍＨＩ制限酵素断片は先の出願の本実施例２人
に記載のように組立てることができる。先の出願の添付
図面第２図にプラスミドｐｃ　Ｚ　Ｒ３３６の制限酵素
部位および機能地図が示されている。

プラスミドｐＣＺＲ′３６６の〜５．８ｋｂ　Ｎｄｅｌ
ＢａａＨＩ制限酵素断片にあるＤＮＡの大部分は、プラ
スミドｐｃＺＲ１１１から〜５．７５ｋｂ　Ｘｂａｌ−
ＢａｍＨＩ制限酵素断片上に単離できる。先の出願の添
付図面第４図にプラスミドｐｃＺＲ１１１の制限酵素部
位および機能地図が示されている。

プラスミドｐｃＺＲ１１１は受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−
１８２４９のちとにＮＲＲＬから入手可能なＥコリＫＩ
２ＲＶ３０８／ｐｃＺＲ１ｌ　ｌから得ることができる
。プラスミドｐｃＺＲ１１１は１０μ９／ｘ（ｌテトラ
サイクリンに対する耐性を付与し、Ｃ１ａｌ制限酵素部
位を欠いている。

またプラスミドｐｃＺＲ１１１をＸｂａＩおよびＢａｍ
Ｈ［酵素で消化し、大きいＸｂａ　Ｉ　−Ｂ　ａ１１１
目断片モアガロースゲルから精製する。ホスホトリエス
テル法によって合成した２本鎖Ｘｂａｌ　−Ｎｄｅ］制
限酵素断片と、このプラスミドｐｃＺＲ１１１のＸｂａ
　Ｉ　−ＢａｍＨＩ制限酵素断片とを互いにライゲーシ
ョンしてプラスミドｐｃ　Ｚ　Ｒ３３６の〜５．８ｋｂ
　Ｎｄｅｌ　−Ｂａａ＋Ｈ［制限酵素断片を得る（先の
出願の第２図）。この２本鎖ＤＮＡ断片は下記の配列； ５’　−ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＴＡ
ＴＡＴＴＧＡＴＴｒＴＡＡＴＡＡＧＧＡＣＧＡＡＴＡＡ
ＴＣＡ−３゜を有する。

プラスミドｐＯＷ３８１ＤＮＡの約２５μｇ（０゜ＩＸ
ＴＥ緩衝液２５ｕＱ溶液）を１ＯＸＮｄｅｌ緩衝液（１
００ＩＩＩＭトリスＨＣρ（ｐＨ７，８）、７０ｍＭＭ
ｇＣ１２！、　ｌ　、　５　ｍＭ　Ｎ　ａＣの４μ（！
、　Ｈ２Ｏ６ｉｔＱと制限酵素Ｎｄｅｌ　　３μＱおよ
び制限酵素ＢａｍＨＩ３μｇへ添加し、混合した。得ら
れた反応混合物を３７°Ｃで２時間インキニーベートし
、引き続いてアガロースゲル電気泳動にかける。〜２．
４ｋｂＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ断片をアガロースゲルから
単離し、ライゲーションのために調製する。

Ｉ　　ＢａｍＨｉ制限酵素断片４μ（２（〜０，１μｇ
）とを実質上、実施例２に記載の方法によりライゲーシ
ョンした。ライゲーションしたＤＮＡは所望のプラスミ
ドｐＯＷ３８２を構成している。先の出願の添付図面第
３図にプラスミドｐＯＷ３８２の制限酵素部位および機
能地図を示す。製造業者の指示にしたがい、上記のライ
ゲーション反応物をコンピテントなＥ　コリＫ１２　　
ＪＭ１０９細胞（ストラタジーン社）へ導入した。形質
転換混合物をテトラサイクリン（１０μｇ／ｚ＆）を含
有するＴＹ寒天平板へ接種し、ラムダｐＬプロモーター
による転写を防止するため、平板を２５°Ｃ〜３０°Ｃ
でインキュベートした。所望の形質転換体をテトラサイ
タリン耐性表現型およびそのプラスミドＤＮＡの制限酵
素分析によって同定した。

プラスミドｐＣＺＲ３３６ＤＮＡの〜５．８ｋｂＮｄｅ
　ｒ　−ＢａｍＨＩ制限酵素断片約１μＩ２（〜０．５
μｇ）とｐＯＷ３８１から単離した〜２．４ｋｂＮｄｅ
回旋振とう機（２５Ｏｒｐｍ）中、Ｅ、コリＫ１２ＪＭ
１０９／ｐＯＷ３８２形質転換体をＬグロス（テトラサ
イクリン１０μｇ／ｒＱを含有）５００ｊｌＣ中で３０
°Ｃで１夜培養した。１夜培養物１０ｘ＆を２゜８リツ
トルフラスコで新たに調製したテトラサイクリン１０μ
９／ｘＱ含有培地９９０ｆｆ１２に加えることによって
１００倍に希釈し、前記と同一条件下で３０℃でさらに
１時間インキュベートした。ついで回旋振とう機の温度
を４２℃に上げ、さらに６．５時間インキュベートを続
けた。プラスミドｐＯＷ３８２のＤＡＯＣ３暗号配列を
発現させるため配置されたラムダｐ［、プロモーターの
ｃ１８５７温度感受性リプレッサーは４２℃で失活する
ため、宿主細胞内でのＤＡＯＣ３の発現は４２℃で起こ
る。誘導後、遠心によって細胞を回収し、Ｅ、コリ産生
ＤＡＯＣ８活性の好ましい供給源として使用した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｓ、クラブリゲルスから得た冷粗細胞抽出物
のＴ　ｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｌ　ｓカラムクロマトグラフ
ィーの溶出曲線、第２図は、第１図における活性画分を
Ｕ　Ｉｔｒａｇｅｌ　Ａ　４４およびＭｏｎｏ　Ｑカラ
ムクロマトグラフィーにかけて得た活性画分の５ＤＳＰ
ＡＧＥによる泳動パターンの複写図である。第３図は、
組換え法で製造された酵素の精製工程での精製状態を示
すグラフであり、ＡはＤＥＡＥＳ　ｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムクロマトグラフィーにおける溶出曲線、Ｂはへの活
性画分のＢｌｏ−Ｇｅ１　Ａｏ、５巾によるゲルろ過に
おける溶出曲線、ＣはＢの活性画分のＭｏｎｏ　Ｑカラ
ムによるＦＰＬＣクロマトグラフィーにおける溶出曲線
、Ｄ４まＣの活性画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０、次
いでＳ　ｕｐｅｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーにか
けて得た溶出曲線である。 第４図Ａは、第３図りにおける活性画分の精製状態を示
す、Ｍｏｎｏ　ＱカラムによるＦＰＬＣクロマトグラフ
ィーによる溶出曲線のグラフ、第４図Ｂは第４図Ａにお
ける溶出画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥでの泳動パターンの複
写図である。第５図は、精製シンターゼによるペニシリ
ンＮのＤＡＯＣへの変換反応におけるＤＡＯＣ形成／ペ
ニシリンＮ消失の経時変化を示すグラフである。 シゾーｖ”夕霧４’１ （ｍｕ／ｍｌ） ヘコ ム ■ ７ンｌヴ１１！′ （ｍｇ／ｍｌ） へ°ニジリンＮ　　ｉｒて１１ ＤＡＯＣ、＋ｌ　　（ｎｍｏｌ） 図面の浄書（内容に変更なし） 平成 ２年 ３月２０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量約３４，６００ダルトンのモノマーであり、
   ５．３±０．２および６．１±０．２の２つの等電点を
   有し、アミノ末端残基に式： 【遺伝子配列があります】 で示される２２アミノ酸のアミノ酸配列を有し、下記の
   アミノ酸組成： アミノ酸３４，６００ダルトン 当たりの残基数 Ａｓｐ＋Ａｓｎ２８ Ｔｈｒ２５＾ａ Ｓｅｒ２４＾ａ Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ３３ Ｐｒｏ１８ Ｇｌｙ２５ Ａｌａ２７ Ｃｙｓ６＾ｂ Ｖａｌ２０ Ｍｅｔ５ Ｉｌｅ１０ Ｌｅｕ２５ Ｔｙｒ１０ Ｐｈｅ２０ Ｈｉｓ８ Ｌｙｓ７ Ａｒｇ２３ Ｔｒｐ２＾ｃ ａ：加水分解を０回に外挿して決定 ｂ：システイン酸として測定 ｃ：チオグリコール酸の存在下に加水分解して測定を有
   し、活性の発現に第１鉄イオン、α−ケトグルタレート
   および酸素を必要とし、ジチオスレイトールの存在下で
   高められた活性を発現し、下記の動力学的パラメーター
   ： Ｋｍ（ペニシリンＮ）＝２９μＭ Ｋｍ（α−ケトグルタレート）＝１８μＭ Ｋａ（Ｆｅ＾＋＾＋）＝８μＭ を有し、デアセトキシセファロスポリンＣヒドロキシラ
   ーゼ活性を持たず、７β−（α−アミノアジパミド）−
   ３−エキソメチレンセファム−４−カルボン酸をデアセ
   チルセファロスポリンＣに変換することができる精製形
   のデアセトキシセファロスポリンＣシンターゼ。 ２、請求項１記載の酵素の製造方法であって、下記のス
   テップ（１）−（６）： （１）還元剤の存在下、ｐＨ７．５〜８．０に緩衝化さ
   れた、粗酵素の細胞抽出物を得、 （２）該抽出物を還元剤とバッファーの存在下、陰イオ
   ン交換樹脂によるクロマトグラフィーにかけ、該酵素を
   ０→約０．３ＭＮａＣｌまたはＫＣｌのリニアグラディ
   エントで溶離し、 （３）ステップ２のクロマトグラフィーで得た６０％の
   酵素活性を含有する画分を、該画分をバッファーと一緒
   にゲルでろ過することにより限外ろ過して濃縮し、 （４）６０％の酵素活性を含有する、ステップ（３）の
   ゲルろ過におけるろ液を還元剤の存在下、ｐＨ約８に緩
   衝化した強陰イオン交換樹脂でクロマトグラフし、該酵
   素を０→０．５ＭＮａＣｌのリニアグラディエントで溶
   離し、 （５）ステップ（４）のクロマトグラフィーで得た６０
   ％の酵素活性を含有する画分を、該画分を０．１ＭＫＣ
   ｌ含有バッファーと一緒にゲルでろ過することにより限
   外ろ過して濃縮し、さらに（６）８０％の酵素活性を含
   有するステップ（５）のゲルろ過のろ液を約０．０５Ｍ
   ＫＣｌの存在下、ｐＨ７に緩衝化した強陰イオン交換樹
   脂でクロマトグラフし、ｐＨ７の緩衝化０．０５→０．
   ２ＭＫＣｌリニアグラディエントで該精製酵素を溶離す
   ることからなり、（１）−（６）の各ステップを温度約
   ０℃〜約４℃で行うことからなる方法。 ３、ステップ（２）において、還元剤がジチオスレイト
   ール、ジチオエリスレイトールまたはβ−メルカプトエ
   タノールである請求項２記載の方法。 ４、ステップ（１）、（２）、（３）および（５）にお
   けるバッファーが５Ｍ尿素、１０％グリセロールおよび
   濃度５ｍＭの還元剤を含有する１５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
   ｌ（ｐＨ８）である請求項２記載の方法。 ５、ステップ（４）におけるバッファーが５Ｍ尿素およ
   び約５ｍＭの還元剤を含有する１５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
   ｌ（ｐＨ８）である請求項２記載の方法。 ６、ステップ（６）におけるバッファーが５Ｍ尿素およ
   び濃度約５ｍＭの還元剤を含有する１５ｍＭＴｒｉｓ−
   ＨＣｌ（ｐＨ７）である請求項２記載の方法。 ７、酸素の存在下、ストレプトマイセス・クラプリゲル
   スから導かれたデアセトキシセファロスポリンＣシンタ
   ーゼと、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される３−エキソメチレンセファロスポリンＣとを
   、第１鉄イオンとα−ケトグルタレートとを含有する水
   性媒質中、温度範囲約３０℃〜約４０℃、ｐＨ範囲約６
   ．８〜約７．６において接触させることからなるデアセ
   トキシセファロスポリンＣの製造方法。 ８、第２鉄イオンが約２０μＭ〜約１００μＭの濃度で
   存在する請求項７記載の方法。 ９、α−ケトグルタレートが約２０μＭ〜約３００μＭ
   の濃度で存在している請求項７記載の方法。