JP2653398B2 - ｔｆｄＡ−２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体及びｔｆｄＡ遺伝子を含有するプラスミドの同定及び単離法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はｔｆｄＡ−２，４−
Ｄ−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体並びにｔｆｄ
Ａ遺伝子を含有するプラスミドの同定及び単離法に関す
る。

【０００２】本発明は、遺伝子ｔｆｄＡ又は基本的にｔ
ｆｄＡと同等の遺伝子を、正確に特徴付けることのでき
る短いＤＮＡ断片上に含有する細菌株に関する。この新
しい微生物は、２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼの製造
に並びにこの酵素の２，４−Ｄ分解特性を種々の生物に
遺伝子工学的に転移させるための出発物質として特に好
適である（遺伝的に形質転換された植物ではこれにより
達成される２，４−Ｄ耐性を含む）。

【０００３】

【従来の技術】２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼは、
２，４−Ｄを分解する多数の生物中で、２，４−ジクロ
ルフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）の物質代謝の第一工程
を触媒する酵素である。２，４−Ｄ分解生物には、特
に、例えばアキネトバクタ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ア
ルトロバクタ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバ
クテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びプ
ソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のような土壌
細菌が含まれる［Ｇ．Ｒ．Ｂｅｌｌ、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．３：８２１（１９５７）；Ｊ．Ｍ．Ｂ
ｏｌｌａｇ及びその他、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃ
ｈｅｍ．、１６：８２６（１９６８）；Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ
及びその他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１４５：６８
１（１９８１）：Ｗ．Ｃ．Ｅｖａｎｓ及びその他、Ｐｒ
ｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
５７：４（１９５４）；Ｗ．Ｃ．Ｅｖａｎｃｅ及びその
他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１２２：５４３（１９７
１）；Ｒ．Ｐ．Ｆｉｓｈｅｒ及びその他、“Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．”、１３５：７９８（１９７８）；Ｔ．
Ｉ．Ｓｔｅｅｎｓｏｎ及びその他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．、１６：１４６（１９５７）；Ｊ．Ｍ．
Ｔｉｅｄｊｅ及びその他、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ
Ｃｈｅｍ．１７：１０８０（１９６９）；Ｊ．Ｅ．Ｔｙ
ｌｅｒ及びその他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、
２８：１８１（１９７４）；Ｊ．Ｍ．Ｔｉｅｄｊｅ及び
その他、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、１
７：１０２１（１９６９）参照］。これらの細菌は土壌
及び廃水を、農業で使われる殺そ剤及び除草剤で見られ
るようなハロゲン化芳香族化合物を除去して解毒する際
に著しく重要である。

【０００４】２，４−Ｄを分解する野生型細菌の群類で
は菌株アルカリゲネス・オイトロフス（Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ＪＭＰ１３４が最も良
く知られておりかつ最もその特性が明らかにされてい
る。この菌株は２，４−Ｄの分解に重要な遺伝子全部を
含有する大きさ約８０ｋｂのプラスミドｐＪＰ４を含有
する［Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ及びその他の前記文献］。最近、
プラスミドｐＪＰ４は単離されかつ特徴が解明された
［Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ及びその他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．、１６１：４６６（１９８５）］。

【０００５】ｔｆｄＢ、ｔｆｄＣ、ｔｆｄＤ、ｔｆｄＥ
及びｔｆｄＦとして表わされる２，４−Ｄ分解に関与す
る５個の遺伝子はトランスポゾン突然変異により局在化
されかつＥ．コリ（ｃｏｌｉ）中でクローン化された。
その際に、Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ及びその他［Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．、１６１：８５（１９８５）］の生化学的研
究により４個の遺伝子に酵素機能をもたらすことができ
た。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら従来は、
遺伝子ｔｆｄＡをプラスミドｐＪＰ４又はそのサブフラ
グメント上に局在化し、単離しかつその構造を解明する
ことに成功していない。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ところで本発明により、
初めてｔｆｄＡ−２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ遺伝
子突然変異体及びｔｆｄＡ遺伝子を含有するプラスミド
の同定及び単離法が得られた。これにより、遺伝子ｔｆ
ｄＡを単離し、クローン化しかつ特徴を明らかにするこ
とができた。それ故、この遺伝子を他の生物上に転移す
るために使用することが可能であり、その目的はｔｆｄ
Ａによりコード化された２，４−Ｄ−モノオキシゲナー
ゼを他の生物中で発現させるためである。その際に微生
物が該当し、しかしまた例えば植物のような高等生物も
該当する。

【０００８】ｔｆｄＡを他の微生物に転移することによ
って、これらの生物によって分解可能な物質の範囲を拡
大することができる。全体的な２，４−Ｄ分解の遺伝子
の転移及び発現は細菌に関しては既に記載されている
［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１４５：６８１（１９８
１）及びＡｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３４：９
２頁（１９８３）］。しかし単離したｔｆｄＡ遺伝子を
プソイドモナス又はアルカリゲネスのようなグラム陰性
菌中で発現させる研究はまだ行なわれなかった。このよ
うな研究は植物に関しても知られていなかった。数種の
植物による２，４−Ｄの代謝は報告されている［Ｗｅｅ
ｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ２４：５５７（１９７６）及びＺ．
Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：３９５（１
９８３）］。この物質は、低濃度でオーキシンに似た植
物ホルモンとして作用し、それ故細胞培養技術で使用
し、高濃度では植物の細胞並びに植物全体に対して生長
抑制物質として使用し、これが除草剤としてのその使用
の理由である。ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏ
ｔｉａｎａ Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）の一倍体細胞懸濁
液培養では２，４−Ｄの高まる濃度に合わせてこの合成
生長物質に対して、高められた代謝率に基づく耐性が達
成される［Ｍ．Ｈ．Ｚｅｎｋ、１９７４、Ｈａｐｌｏｉ
ｄｓ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎ Ｈａ
ｐｌｏｉｄｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓ．Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、３３９
頁、カナダ国、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｇｕｅｌｐｈ］。

【０００９】遺伝子ｔｆｄＡが２，４−Ｄの側鎖の脱離
を仲介するので、２，４−Ｄを失活化するその能力を細
菌から得られた遺伝子を用いて、このような遺伝子工学
操作が可能であるすべての植物に転移させることができ
るはずである。異種遺伝子を植物及びその子孫に転移す
る方法は今日まで既に数種の植物について実験され
［Ｍ．Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ、Ｌ．Ｈｅｒｒｅｒａ Ｅｓｔ
ｒｅｌｌａ、Ｍ．ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ、Ｊ．Ｓｃｈｅ
ｌｌ及びＰ．Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、１９８４、Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉ
ｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ
ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｇｅｎｙ．ＥＭＢＯ Ｊ．、
３：１６８１並びにＲ．Ｄ．Ｓｈｉｌｌｉｔｏ、Ｍ．
Ｗ．ｓａｕｌ、Ｊ．Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ、Ｍ．Ｍｕｅ
ｌｌｅｒ及びＪ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、１９８５、Ｈｉｇ
ｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ、Ｂｉｏ／ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：１０９９］、かつ近いうちに広
範な適用可能性を達成することになる。

【００１０】植物の遺伝的形質転換に対して大きな希望
を託すことになり、特に人間にとって重要な新種の有用
物質の開発に関してである［Ｊ．Ｌ．Ｍａｒｋ、１９８
５、Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｅｃ
ｏｍｅｓ ａ ｆｅｒｔｉｌｅ ｆｉｅｌｄ．Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２３０：１１４８］。遺伝子ｔｆｄＡにより、新
しい遺伝的に転移可能で生体内で選択可能な性質を、従
来は僅かな抗生物質−もしくは除草剤耐性に関してだけ
知られているような、生長抑制物質に対する耐性の形で
適用し得たであろう［Ｒ．Ｔ．Ｆｒａｌｅｙ及びその
他、１９８３、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ
ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
０：４８０３及びＮａｔｕｒｅ３１７：７４１（１９８
５）］。

【００１１】初めは本発明は、公知の突然変異法の適用
下に例えばアルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ１３４
のような２，４−Ｄを生長基質として使用し得る細菌株
から２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼの構造遺伝子が失
活化されている従来公知ではなかった突然変異体を製造
することであった。この突然変異体は試験管内でのＤＮ
Ａ組み換え、組み換えＤＮＡによる形質転換及びｔｆｄ
Ａ又はｔｆｄＡとほぼ同一の遺伝子を含有する組み換え
ＤＮＡを選択するための複合的なＤＮＡ転移という公知
方法の適用下に使用する。

【００１２】本発明の目的の１つは、遺伝子ｔｆｄＡ又
はｔｆｄＡと基本的に同等の遺伝子を含有するプラスミ
ド、並びにプロモータ領域を含めてこの遺伝子の一部を
含有するプラスミドを製造するためのｔｆｄＡ−２，４
−Ｄ−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体アルカリゲ
ネス・オイトロフスＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−２（ＤＳＭ
３８４２）及びＴｎ５−４（ＤＳＭ３８４３）である。

【００１３】本発明による２，４−Ｄ又は２，４−Ｄ類
縁化合物の代謝用の遺伝子を有する野生型細菌からのＤ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し、かつ生成した
ＤＮＡフラグメントをＤＮＡリガーゼを用いて、予め同
じ制限酵素によりその直線型に変換されているプラスミ
ドベクターと連結することにより新規のプラスミドを製
造することができる。

【００１４】このように生成した組み換えプラスミドで
は、前記のｔｆｄＡ含有プラスミドを、該プラスミドを
細菌株中に導入し、その菌株から直接ｔｆｄＡにより仲
介される能力に基づいてｔｆｄＡ含有クローンが選択さ
れ得ることにより同定することができる。

【００１５】そのような細菌株は、生体内での酵素的反
応において２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼにより形成
された生成物（その基質ではない）を炭素源及びエネル
ギー源として使用することができるという性質を有す
る。前記の性質を有する菌株の例は、すべての遺伝子が
２，４−ジクロルフェノールの分解に関して活性である
本発明によるｔｆｄＡ突然変異体、更にフェノールの分
解経路を有する菌株アルカリゲネス・オイトロフスＪＭ
Ｐ２２２、並びに４−クロルフェノールを利用すること
のできるプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓ
ｐ．Ｂ１３である。種々の置換基を有するフェノールを
分解することができかつ主にグラム陰性菌群に含まれる
他の一連の菌株をクローン化ｔｆｄＡ遺伝子の選択及び
同定のための宿主として生成することができる。

【００１６】クローン化ベクターとしては、Ｅ．コリ以
外の他の菌株中でも複製増殖する状態の広範な宿主域の
プラスミドを使用すると優れている。しかし、ＤＮＡは
ＤＮＡの一部が宿主細胞のゲノム中に組み込まれること
により更に増殖することのできるプラスミドも使用する
ことができる。

【００１７】前記の菌株の生きている細胞中にＤＮＡを
導入する方法として、１つには、方法が公知である場合
にはこれらの菌株の直接的な形質転換が好適である。例
えば、プソイドモナス菌及び類縁のグラム陰性菌の形質
転換法がある［Ａ．Ａ．Ｍｅｒｃｅｒ及びＪ．Ｓ．Ｌｏ
ｕｔｉｔ、１９７９、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａ
ｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１４０：３７−４２；Ａ．Ｍ．Ｃｈａｋｒａｂａｒ
ｔｙ、Ｊ．Ｒ．Ｍｙｌｒｏｉｅ、Ｄ．Ａ．Ｆｒｉｅｌｌ
ｏ及びＪ．Ｇ．Ｖａｃｃａ、１９７５、Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ−ｌｉｎｋｅｄ ｄｒｕｇ−
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ ＤＮＡ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２：３６４
７−３６５１］。これに対して、文献公知の方法により
Ｅ．コリ菌株の形質転換はすべてのグラム陰性菌に関し
て適用可能でありかつ極めて効果的であり、引続いてプ
ラスミドを該当する菌株中に接合により転移する。クロ
ーン化ＤＮＡの接合性転移には可動性プラスミドベクタ
ーを使用すると優れている。その際に、転移のために必
要な遺伝子は、所謂介助プラスミドあるいは特別にその
ために構成された運動性菌株から得られる。 直接好適
な生長基質上での選択により得られる前記の菌株か又は
前記の方法又は他の公知の試験系によりｔｆｄＡの発現
に関して同定されるＥ．コリのクローンから、ｔｆｄＡ
含有プラスミドを公知方法により明瞭に規定し得る化学
物質を単離し得る。

【００１８】とりわけ、ｔｆｄＡ菌株を生長試験により
直接選択するという利点は、すべてが相対的に経費のか
かる酵素試験をベースとする従来公知の方法に比べて、
ｔｆｄＡ含有プラスミドの同定を、殊に遺伝子銀行の製
造の際に、即ちゲノムＤＮＡのＤＮＡ断片の任意のクロ
ーン化の際に生じる非常に多数の種々のプラスミドでも
可能にするという点である。それ故、利点はこの方法を
広範に適用し得ることである。それというのもｔｆｄＡ
遺伝子のクローン化が、遺伝子ｔｆｄＡを良好に単離し
得るプラスミド上に有する野生型株に限定されるばかり
でなく、ほぼすべての野生型株からも、また該遺伝子を
入手し難いプラスミド又は染色体上に含有するものでも
可能だからである。

【００１９】例えばアルカリゲネス・オイトロフスＪＭ
Ｐ１３４から由来し、２，４−Ｄの分解用遺伝子を含有
するプラスミドｐＪＰ４を制限エンドヌクレアーゼＨｉ
ｎｄＩＩＩで切断し、生成したＤＮＡフラグメントを電
気泳動により分解し、かつそれぞれの単離したフラグメ
ントを、ＨｉｎｄＩＩＩで切断しかつ脱リン酸化したベ
クターｐＶＫ１０１と連結することにより組換えプラス
ミドが得られる。可動性Ｅ．コリＳ１７−１を該組み換
えＤＮＡで形質転換しかつプラスミド含有菌株をテトラ
サイクリン含有培地上で選択する。制限分析により同定
された組み換えプラスミドを含有する菌株からそのプラ
スミドＤＮＡを接合により前記のｔｆｄＡ突然変異体Ｊ
ＭＰ１３４：Ｔｎ５−２上に転移させ、かつクローン化
ｔｆｄＡ遺伝子の発現を２，４−Ｄ含有最少培地上での
野生型株の生長により検出する。このようにして、ｐＪ
Ｐ４から由来する２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
ト上に遺伝子ｔｆｄＡを含有するプラスミドｐＶＪＨ２
１を同定することができる。プラスミドの単離および引
続く制限分析によりクローン化フラグメントの同一性が
確認される。

【００２０】更に、前記プラスミドは、遺伝子ｔｆｄＡ
を含有する組み換えプラスミドからサブクローン化（Ｓ
ｕｂ−ｋｌｏｎｉｅｒｅｎ）により製造することができ
る。そのために、該プラスミドを制限エンドヌクレアー
ゼ１種又は数種で消化し、かつ生成した断片をＤＮＡリ
ガーゼを用いて、同じ制限エンドヌクレアーゼでその直
線形に変換されているベクタープラスミドと連結する。
生成したプラスミドからｔｆｄＡ含有分を前記のように
して選択することができる。

【００２１】例えば、ＳａｃＩにより生成したプラスミ
ドｐＶＪＨ２１のＤＮＡフラグメントをＳａｃＩで切断
したベクタープラスミドｐＧＳＳ３３と結合することに
よりプラスミドｐＧＪＳ３を製造することができる。若
干の新しく組み換えられたプラスミドから、完全なｔｆ
ｄＡ遺伝子を含有するものを、初めに組み換えプラスミ
ドＤＮＡを可動性菌株Ｅ．コリＳ１７−１中に形質転換
し、その後その菌株から接合によりｔｆｄＡ突然変異体
ＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−２中に転移することにより選択
することができる。２，４−Ｄ含有培地上での選択によ
り、制限分析により明らかにｐＶＪＨ２１からの２１ｋ
ｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに、それ故ｐＪＰ４に
由来する判別する３ｋｂのＳａｃＩ挿入断片を含有する
プラスミドが確認される。

【００２２】ｔｆｄＡ含有ＤＮＡ断片のサブクローン化
により、用途に応じて、使用されるプラスミドベクター
の種類という点で異なるような本発明によるプラスミド
を製造することもできる。

【００２３】例えば、ｐＧＪＳ３からの３ｋｂ Ｓａｃ
ＩフラグメントをベクターｐＫＴ２３１中に再クローン
化することができ、その際にプラスミドｐＫＪＳ３１及
びｐＫＪＳ３２が生成し、これらのｐＧＪＳ３に比べ
て、有利な制限地図及び多くのグラム陰性菌中に良好に
発現されるカナマイシン耐性によりｔｆｄＡの他の特徴
付けの利点を提供する。次に記載されているようなｐＫ
Ｔ２３１から誘導されたプラスミドによるｔｆｄＡ発現
の検出法として、Ｅ．コリＳ１７−１から菌株アルカリ
ゲネス・オイトロフスＪＭＰ２２２への接合転移が優れ
ており、引続いて生長基質としてのフェノキシ酢酸の利
用に関して試験する。このシステムは、ｔｆｄＡ突然変
異体に比べて、この受容菌株では接合転移が高い効率で
行なわれかつカナマイシン耐性によって他の選択可能な
マーカーを使えるという利点を提供する。

【００２４】サブクローン化により、ｔｆｄＡ含有ＤＮ
Ａフラグメントを発現ベクター中に組み込むこともで
き、該ベクター上でｔｆｄＡ遺伝子が異種プロモータに
より発現される。

【００２５】例えば、２．８ｋｂのＳａｃＩ／ＳａｃＩ
フラグメント、２．０ｋｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラ
グメント及び１．４ｋｂのＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメ
ントを発現ベクターｐＴ７−５及びｐＴ７−６中にファ
ージプロモータに直接組み込むことができ、このプロモ
ータにより遺伝子発現がプロモータ特異性ＲＮＡポリメ
ラーゼにより目的通りに開始される。新しく組換えられ
たプラスミドｐＴＪＳＳ′Ｏ３５、ｐＴＪＳ′Ｂ４３５
及びｐＴＪＳ′Ｘ５３５（これらの製造は例８、９及び
１０に記載されている）により発現されたｔｆｄＡ遺伝
子生成物は放射性メチオニンによる特異的標識及び引続
くゲル電気泳動により同定することができる。更に、こ
のシステムは、Ｅ．コリ菌株中で多量の２，４−Ｄ−モ
ノオキシゲナーゼを製造するのに使用することができ、
このことにより遺伝子生成物の精製及び引続く蛋白質化
学的及び酵素的特徴付けが野生型株からその単離に比べ
て簡便になり、それにより他の生物工学的な適用可能性
が初めて研究し得る。

【００２６】ｔｆｄＡ含有ＤＮＡフラグメントのＭ１３
ファージ型のファージベクター中でのサブクローン化に
より一本鎖ＤＮＡの製造が可能である。これはサンジャ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）法による塩基配列の測定に使用する
ことができ［Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ及
びＡ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ、１９７７。ＤＮＡ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３］、更に
オリゴヌクレオチドを用いて各塩基の所望の突然変異誘
発に使用することができ、遺伝子中の制限サイトの形成
及びアミノ酸配列の変化を可能にする１つの公知方法で
ある。遺伝子中への制限サイト導入はその使用可能性を
拡大する。それというのもそのことによって異種プロモ
ータを組み込むための制限サイト及び融合蛋白質を形成
するための遺伝子フラグメントを連結するための制限サ
イトが形成されるからであり、これは例えば原核遺伝子
を真核生物中で発現するのに必要である。

【００２７】ｐＫＪＳ３２からの２．８ｋｂのＳａｃＩ
／ＳａｌＩフラグメントのファージベクターＭ１３ｔｇ
１３０及びＭ１３ｔｇ１３１中へのサブクローン化（例
１６に記載されているように）は、遺伝子ｔｆｄＡを配
列決定に利用できるようにするための可能性を示す。組
換えファージＭＪＳＳ′０３０及びＭＪＳＳ′０３１の
二本鎖ＤＮＡの修飾により挿入断片ＤＮＡで更に変化さ
せることができる。

【００２８】更に、本発明によるプラスミドはｔｆｄＡ
含有プラスミドからの修飾により生成することができ
る。そのようなプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ１
種又は数種で処理することにより、場合によりエキソヌ
クレアーゼで処理しかつ引続いてＤＮＡ末端を環状分子
に再連結することにより、欠失した、即ち特定のＤＮＡ
断片だけ短かくなった、更に完全なｔｆｄＡ遺伝子を含
有し得るプラスミドが得られる。

【００２９】例えば、プラスミドｐＫＪＳ３１及びｐＫ
ＪＳ３２から一定のＤＮＡフラグメントを除去すること
により、その中に包含されている３ｋｂの挿入断片を一
方の側ではＸｂａＩ制限サイトまでかつ他方の側ではＳ
ａｌＩ制限サイトまで短縮することができ、その際にｔ
ｆｄＡの活性は失なわれない。このように生成した、例
４、５及び７に記載のプラスミドｐＫＪＳＢ３３０、ｐ
ＫＪＳ（Ｘ）６３０及びｐＫＪＳ３２ＲＨ△Ｓ′は、ｔ
ｆｄＡ遺伝子活性を発現することができる。このように
してこの遺伝子の位置を１．４ｋｂのＸｂａＩ／Ｓａｌ
Ｉフラグメントに制限することができる。

【００３０】例１６に記載されているように、組換えフ
ァージＭＪＳＳ′０３０及びＭＪＳＳ′０３１の二本鎖
形からエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて種々の長さの
ＤＮＡ断片を欠失することにより、その都度異なるクロ
ーン化ＤＮＡの領域が配列決定のための開始点の最も近
くに位置する一連のファージが生成される。２ｋｂのＢ
ａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントの配列をオーバーラッ
プして配列された部分領域から組合わせることができ
る。塩基配列の認識からｔｆｄＡを含有するＤＮＡの他
の性質、例えばコード領域の位置と長さ及び制限サイト
の位置を誘導することができ、このことはｔｆｄＡを更
に利用するのに極めて有用なはずである。ｔｆｄＡ含有
プラスミドからのＤＮＡフラグメントの欠失によりもし
くはＤＮＡフラグメントのサブクローン化により、ｔｆ
ｄＡ遺伝子の断片を含有する他の本発明のプラスミドも
得られる。例えば、ｐＫＪＳ３２からの１．５ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをｐＫＴ２３１中で
サブクローン化することによりプラスミドｐＫＪＥ△Ｂ
１３０が生じ、このプラスミドはｔｆｄＡの５′末端、
即ちプロモータとＮ末端をコードする配列とを含有し、
かつ酵素的に活性な遺伝子生成物を発現する能力をもは
や持っていない。遺伝子の断片を、同じ解読わく中のプ
ロモータを含めてコード付けＤＮＡの５′末端が他のコ
ード付けＤＮＡの３′末端と連結しておりかつそれ故そ
の都度のプロモータを認識する有機体中の所謂融合蛋白
質を発現させるプラスミドの構成に使用することができ
る。

【００３１】該プラスミドの他の修飾の可能性は、異種
ＤＮＡセグメントの挿入である。挿入は新しい機能ＤＮ
Ａ配列、例えば制限サイト、プロモータ、耐性遺伝子、
翻訳−及び転写終止シグナルの導入に適用することがで
きる。異種遺伝子配列の一部の挿入により融合蛋白質も
形成され得る。

【００３２】異種ＤＮＡの挿入の例は、オメガフラグメ
ントをｔｆｄＡのコード付け領域の真中に位置するプラ
スミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５のＢｇＩＩＩ制限サイト中に
挿入することである（例１１）。このフラグメントによ
りすべての解読わく中の翻訳終止コドン及び転写終止シ
グナルが選択可能な抗生物質耐性と一緒に組み込まれ
る。遺伝子生成物の特異的な放射性標識により並びに
２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼに関する生体内酵素試
験により（例１５）立証することができるように、組換
えプラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガにより、短縮さ
れたもはや酵素活性ではない蛋白質の発現がもたらされ
る。

【００３３】ｔｆｄＡ又はｔｆｄＡの部分を含有するク
ローン化フラグメントは相同ＤＮＡ配列の検出に、それ
故他の生体中のｔｆｄＡ遺伝子を見出すのに利用するこ
とができる。そのために、このフラグメントを本発明に
よるプラスミドから好適な制限酵素を用いて切断し、単
離しかつ文献公知の方法により、例えば放射性核種の組
み込みにより標識する。公知の雑種成形法により、ある
有機体の全ＤＮＡで又はそこから製造した遺伝子銀行に
おいて、ｔｆｄＡとの相同性を有するフラグメントを同
定することができる。このようにして、種々の生物の集
団下でも、ｔｆｄＡと相同の配列を含有するものを認識
することができる。この方法は、新しい２，４−Ｄ分解
生物を見つけ出したりかつ該生物中のｔｆｄＡ遺伝子を
検出するのに使用することができる。

【００３４】ｔｆｄＡ遺伝子は、好適であれば直接本発
明によるプラスミドを用いてあるいは公知の遺伝子工学
法を用いて変化させた後で他の生物に転移させることが
できる。転移により、ｔｆｄＡでコード付けされた２，
４−Ｄ−モノオキシゲナーゼを該生物中で発現させ、そ
れにより２，４−Ｄ又は２，４−Ｄ類似物質を分解し得
る性質を生物に付与するという目的を追求することがで
きる。

【００３５】例えば、広範な宿主域を有するｔｆｄＡプ
ラスミドを種々のグラム陰性菌中に例１４に記載したよ
うに接合転移することにより、２，４−Ｄ又は２，４−
Ｄ類似物質を相応するフェノールに変換する能力をこれ
らの細菌に付与することができる。その都度の菌株に固
有の分解能力と関連して、前記のことによりこの菌株に
より分解可能な化合物の範囲の拡大がもたらされる。例
えば、菌株アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ２２２
はフェノール代謝の遺伝子を有する。それ故、ｔｆｄＡ
の発現はその菌株にフェノキシ酢酸を生長基質として使
用する全く新しい可能性を介助する。菌株プソイドモナ
スＢ１３はフェノール並びに４−クロルフェノールを代
謝することができ、かつｔｆｄＡにより同様にフェノキ
シ酢酸及び４−クロルフェノキシ酢酸に基づく生長性を
獲得する。ｔｆｄＡを含有しかつ相応するフェノールを
変換し得る生物による４−クロル−２−メチルフェノキ
シ酢酸、２，４，５−トリクロルフェノキシ酢酸及び類
縁化合物のような種々の置換基を有するフェノキシ酢酸
の分解も同様に考えられる。それによって達成される生
物の分解能範囲の拡大により、従来自然界では実現され
なかった新しい性質の開示がいずれにせよなされなかっ
たとしても、それによって野生型株に比べて高い分解能
を有する菌株あるいは場合により毒性である基質又は分
解経路の生成物に対するより高い耐性を有するような菌
株が形成されるという点で定性的な改良がもたらされ得
る。特に、そのような菌株は、自然環境の中ではなく、
例えば工業廃水を浄化する浄化装置のような人工的なシ
ステム中のような条件下で有用なはずである。従来、ハ
ロゲン化芳香族化合物を微生物分解する分野で新規に形
成された菌株を用いて達成された成果の概要が最近公表
された［Ｄ．Ｇｈｏｓａｌ、Ｉ．−Ｓ．Ｙｏｕ、Ｄ．
Ｋ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、Ａ．Ｍ．Ｃｈａｋｒａｂａ
ｒｔｙ．１９８５。Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｅｇｒａｄ
ａｔｉｏｎ ｏｆｈａｌｏｇｅｎｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３５−１４２］。

【００３６】遺伝子ｔｆｄＡの他の使用可能性は、植物
へのその転移である。異種ＤＮＡにより植物を形質転換
する方法は文献公知でありかつ試験されている。従来
は、主に２つの方法が類別される：１つはアグロバクテ
リウム・ツメフアチェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのＴｉプラスミドの
機能を利用し、もう１つはエレクトロポレーション（Ｅ
ｌｅｋｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、ヒートショック（Ｈ
ｉｔｚｅｓｃｈｏｃｋ）、塩化カルシウム処理又はポリ
エチレングリコール処理のような物理的及び化学的手段
の適用下に植物のプロトプラストを形質転換することを
ベースとする。植物細胞を前記の一方か又は他方の方法
により形質転換するのは原則的に常に可能であるが、い
ずれにせよ各細胞又は細胞組織から植物全体を再生する
ことはできない。現在このことが単子葉植物の遺伝子工
学操作に関する主要な障害となっている。

【００３７】植物をｔｆｄＡで形質転換することの優れ
た目的は、遺伝子特性、即ち形質転換された植物中で
２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ活性の発現である。こ
れによって植物は、低濃度でオーキシン類縁植物ホルモ
ンとして作用しかつ高濃度で生長抑制物質として作用す
るフェノキシ酢酸誘導体を植物化学的に作用のないフェ
ノールに分解することができるはずである。従って、こ
の特性には、遺伝的に形質転換された植物の選択可能な
マーカーとしての意味がある。

【００３８】ｔｆｄＡのような原核遺伝子を植物細胞中
で発現し得るようにするために、この遺伝子を転写及び
翻訳に必要な植物特異的シグナル配列と連結しなければ
ならない。この連結が、これによって形質転換される植
物のゲノム中に遺伝子が偶然的に組み込まれることによ
り行なわれるという指摘が知られている。しかし原核遺
伝子は有利に試験管内で好適な植物特異性発現シグナル
と組み合わさる。例えば、一般的に適用可能な方法は、
構造遺伝子（これに属する植物のプロモータを含めて）
の５′末端を、植物蛋白のＮ末端アミノ酸と原核蛋白質
の主成分とから成りかつ基本特性において原核蛋白と同
じである融合蛋白質が形質転換された植物細胞中で合成
されるように原核遺伝子のコード付け配列と連結するこ
とである［Ｒ．Ｔ．Ｆｒａｌｅｙ及びその他、１９８
３。Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：４８０
３、Ｊ．Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ、及びＭ．Ｗ．Ｓａｕ
ｌ、１９８６。Ｄｉｒｅｃｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆ
ｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ．Ｉｎ Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗ
ｉｃｋ及びＮ．Ａ．Ｋａｐｌａｎ（ｅｄ）、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１１８：６６８］。
１つの類似方法は、転写されたｍ−ＲＮＡの翻訳されて
いない５′領域の一部を含めて植物プロモータを使用す
るだけでありかつ植物遺伝子のコード付け領域の５′末
端放棄する。植物中での発現では、原核遺伝子部分のＡ
ＴＧコドンが翻訳の開始点として有用である。同様にし
て、植物ウイルスの発現シグナルを使用することができ
る［Ｎ．Ｂｒｉｓｓｏｎ、及びＴ．Ｈｏｈｎ．１９８
６、Ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ；ｃａｕ
ｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ．Ｉｎ
Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ．Ｏ．Ｋａｐｌａｎ
（ｅｄ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ１１８：６５９］。植物中で原核遺伝子を発現する
ためのベクターは文献公知でありかつ一般的に自由に使
える。

【００３９】前記のベクタープラスミドを用いて、植物
中で発現可能な原核遺伝子からの遺伝子を形成するため
の前提条件は、遺伝子ｔｆｄＡに関して存在するように
塩基配列を認識することである。これが制限サイトの正
確な局在化を可能にし、かつこれによって種々のＤＮＡ
セグメントの塩基に整合する連結を可能にする。更に、
例えば新しい制限サイトの導入のように機能的に重要な
新しいＤＮＡ配列を展開するための目的に応じた突然変
異生成を初めて可能にする。

【００４０】以下、本発明を図面及び実施例に基づき詳
説する。実施例では当業界で一般に公知のかつ行なわれ
ている遺伝子工学の方法を使用した。遺伝子のクローン
化及び遺伝子構造の分析は、既にＥ．Ｌ．ヴインナッカ
ー［Ｅ．Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、ｇｅｎｅ ａｎｄ
Ｋｌｏｎｅ、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍ、１９８５］及びＲ．Ｗ．オールド（Ｏｌｄ）及
びＳ．Ｂ．プリムローズ（Ｐｒｉｍｒｏｓｅ）［Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔ
ｉｏｎ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌ．、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５］の教科書に記載
されている遺伝子工学の標準的方法により実施した。例
えば、Ｉ．Ｋ．セトロウ（Ｓｅｔｌｏｗ）及びＡ．ホレ
ンダ（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ）［Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍ
ｅｔｈｏｄｓ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．、
Ｎ．Ｙ．］では方法及び技術をそれぞれ最新の水準まで
もっていっている。特別な刊行物と共に、しばしば実験
ハンドブックの形の一般的な操作規定も利用した［Ｒ．
Ｗ．Ｄａｖｉｓ及びその他、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ ｍａｎｕａｌ
ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ及びその他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ及びその
他、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈｇｅｎｅ ｆｕ
ｓｉｏｎｓ、全部Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｕｒ Ｌａｂから、Ｎ．Ｙ．；Ａ．Ｐｕｅｈｌｅｒ ａ
ｎｄ Ｋ．Ｎ．Ｔｉｍｍｉｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ、Ｂｅｒｌｉｎ、１９８４；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ、
ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐ
ｐｒｏａｃｈ、ＪＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｗ
ａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９８５］。

【００４１】１９８６年８月２８日に、ドイツ微生物保
存機関（ＤＳＭ：ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ、西ドイツ
国、ゲッチンゲン在）に次の微生物が寄託された（寄託
番号）： Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ｐＴ７−５）
（ＤＳＭ３８２９） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４（ｐＴ７−６）
（ＤＳＭ３８３０） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＡ２２１（ｐＧＳＳ３３）
（ＤＳＭ３８３１） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２（ｐＴＪＳＳ′０
３５） （ＤＳＭ３８３２） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＶＫ１０１）
（ＤＳＭ３８３３） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＫ１５９２（ｐＫＴ２３
１） （ＤＳＭ３８３４） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＫＪＳ３１）
（ＤＳＭ３８３５） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＫＪＳ３２Ｒ
Ｈ△Ｓ′） （ＤＳＭ３８３６） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１（ｐＫＪＳ（Ｘ）
６３０） （ＤＳＭ３８３７） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＢＣ１０７（ｐＲＭＥ１）
（ＤＳＭ３８３８） Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ３８（ｐＧＴ１−２／ｐＴ
ＪＳ′Ｘ５３５）（ＤＳＭ３８３９） アルカリゲネス・オイトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ＪＭＰ１３４（ｐＪＰ４）
（ＤＳＭ３８４０） アルカリゲネス・オイトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ＪＭＰ２２２ （ＤＳＭ３８
４１） アルカリゲネス・オイトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−２
（ｐＪＰ４：Ｔｎ５−２） （ＤＳＭ３８４２） アルカリゲネス・オイトロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−４
（ｐＪＰ４：Ｔｎ５−４） （ＤＳＭ３８４３） 例 １：プラスミドｐＶＪＨ２１の製造 ａ） プラスミドｐＪＰ４及びｐＶＫ１０１の単離 アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ１３４をＰＹＦ培
地（ペプトン３ｇ／ｌ、酵母エキス３ｇ／ｌ、フラクト
ース２ｇ／ｌ）２５０ｍｌ中で３０℃１６時間培養す
る。遠心分離した細胞からプラスミドｐＪＰ４を単離す
る［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３５：２２７（１９７
８）からの方法により］。プラスミドｐＶＫ１０１
［Ｖ．Ｃ．Ｋｎａｕｆ及びその他、Ｐｌａｓｍｉｄ８：
４５（１９８２）］は、Ｅ．コリＨＢ１０１から一般に
公知のＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）及びその他
によるアルカリ性溶菌法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕ
ｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２］により単離する。

【００４２】ｂ） ｐＪＰ４から２１ｋｂ ＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントのクローニング ｐＪＰ４ ２０μｌ（５００ｎｇ）、ＴＡＳ緩衝液
（０．３３Ｍトリス−アセテート、０．６５Ｍ酢酸カリ
ウム、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、５ｍＭジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）、３０ｍＭスペルミジン、ｐＨ７．
９）２．５μｌ及び稀ＨｉｎｄＩＩＩ溶液２．５μｌ
（１単位）を３７℃で１２０分間恒温保持する。ｐＶＫ
１０１ ５０μｌ（１４μｇ）、ＴＡＳ緩衝液５．５μ
ｌ及び未稀釈のＨｉｎｄＩＩＩ溶液１μｌ（２０単位）
より成る他の反応混合物を３７℃で９０分間恒温保持
し、その後、子牛の腸内アルカリ性ホスファターゼ（Ｃ
ａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｃａｌｉｎｅ Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＤＩＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１μｌ（３０単位）を添加しかつ
更に６０分間恒温保持する。両方の反応混合物のそれぞ
れ９０μｌを０．７％ロウ・メルテイング・アガロース
・ゲル（Ｌｏｗ−Ｍｅｌｔｉｎｇ−Ａｇａｒｏｓｅ−Ｇ
ｅｌ）上で電気泳動により分離する。引続いてこのゲル
を臭化エチジウム溶液（５μｇ／ｍｌ）中１５分間で着
色しかつＵＶ３００ｎｍのＤＮＡバンドを可視化する。
ｐＶＫ１０１制限のそれぞれの２０ｋｂバンド及びｐＪ
Ｐ４制限の２番目に大きいバンド（２１ｋｂ）をゲルか
ら切断し、それら両方を合し、かつＤＮＡをＴ．マニア
チス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）及びその他の方法（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２）により
アガロースから単離する。エタノールで沈殿させたＤＮ
Ａを連結緩衝液（６６ｍＭトリス−ＨＣｌ、６．６ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ １ｍＭ ＡＴＰ、ｐ
Ｈ７．５）１０μｌ中に取り、稀Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
１μｌ（０．１単位）を加え、かつ１４℃で１６時間恒
温保持する（＝連結バッチ）。Ｅ．コリＳ１７−１［Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：７８４（１９８３）］の
コンピテント細胞をＴ．Ｊ．シルヘイビー（Ｓｉｌｈａ
ｖｙ）及びその他の方法（Ｅｘｐｅｒｍｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９８４）により製造する。このようにして得られたコ
ンピテント細胞０．２ｍｌを連結バッチ５μｌと混合
し、氷上に４０分間放置し、その後４２℃に３分間加熱
し（＝形質転換）引続いてＴ．マニアチス及びその他に
よるＬＢ培地（前記参照）２ｍｌで稀釈しかつ３０℃で
６０分間恒温保持する（＝表現型発現）。その後、テト
ラサイクリン１０μｌ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天プレ
ート上にそれぞれ０．２ｍｌを塗布する。プレートを３
７℃で１６時間培養する。数個のテトラサイクリン耐性
コロニーが認められる。

【００４３】ｃ） ｐＶＪＨ２１の同定 このようにして得られたテトラサイクリン耐性のコロニ
ーからアルカリ性溶菌法によりプラスミドＤＮＡの迅速
調製を、Ｔ．マニアチス及びその他により記載されてい
るように実施する。前記のアルカリ性ホスファターゼを
用いる処理法により、それぞれのテトラサイクリン耐性
クローンが所望の挿入断片を含有することが保証され
る。ＥｃｏＲＩによる制限酵素消化及び引続いてＴ．マ
ニアチス及びその他（前記参照）により０．７％アガロ
ースゲル中でＤＮＡフラグメントを電気泳動により分離
することにより組換えプラスミドが同定される。得られ
たＥｃｏＲＩフラグメントの大きさを、ｐＪＰ４及びｐ
ＶＫ１０１のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩに関して文
献から公知である大きさ［Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ、Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．１６１：４６６（１９８５）及びＶ．
Ｃ．Ｋｎａｕｆ及びその他、Ｐｌａｓｍｉｄ８：４５
（１９８２）］と比較することによりベクタープラスミ
ドｐＶＫ１０１中の挿入ＤＮＡ並びにその配列の正確な
同定が達成される。 ｄ） ｐＶＪＨ２１中のＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片の制限
地図 このようにして得られた、プラスミドｐＶＪＨ２１を含
有する菌株をテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含有す
るＬＢ培地４００ｍｌ中３７℃で１６時間培養する。遠
心分離した細胞から、プラスミドＤＮＡをＴ．マニアチ
ス及びその他（前記参照）のアルカリ性溶菌法により単
離する。単離したｐＶＪＨ２１のプラスミドＤＮＡをそ
れぞれ酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ並びに
次に挙げる数個の酵素の組合せ９個：ＥｃｏＲＩ／Ｂａ
ｍＨＩ(１)、ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ(２)、ＢａｍＨＩ／
ＳａｃＩ(３)、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ（４）、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ（５）、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓ
ａｃＩ（６）、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
Ｉ（７）、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ
（８）及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ
（９）を含有する種々のバッチで消化させる。ＤＮＡフ
ラグメントをＴ．マニアチス及びその他（前記参照）に
より０．７％アガロースゲル中で分離しかつフラグメン
トの大きさをＨｉｎｄＩＩＩで切断したラムダＤＮＡと
比較して確定する。このようにして得られたデータを用
いてプラスミドｐＪＰ４［Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ、Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｏｌ．１６１：４６６（１９８５）及びｐＶＫ１
０１［Ｖ．Ｃ．Ｋｎａｕｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｓｍｉ
ｄ８：４５（１９８２）］についてＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩに関して公知の大きさの比率と
一緒に制限地図を作成する。

【００４４】例 ２：プラスミドｐＧＪＳ３の製造 ａ） プラスミドｐＶＪＨ２１及びｐＧＳＳ３３の単離 例１で製造したプラスミドｐＶＪＨ２１を含有する組換
え菌株Ｅ．コリＳ１７−１及びベクタープラスミドｐＧ
ＳＳ３３を含有するＥ．コリＪＡ２２１［Ｇ．Ｓ．Ｓｈ
ａｒｐｅ Ｇｅｎｅ２９：９３（１９８４）］をテトラ
サイクリン２０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地各３００
ｍｌ中３７℃で１６時間培養する。遠心分離した細胞か
ら両方のプラスミドをＴ．マニアチス及びその他（前記
参照）のアルカリ性溶菌法により単離する。

【００４５】ｂ） ＳａｃＩフラグメントをｐＶＪＨ２
１からクローン化 ｐＶＪＨ２１ １０μｌ（μｇ）、ｐＧＳＳ３３ １０
μｌ（１μｇ）、ＴＡＳ緩衝液４μｌ、水１６μｌ及び
ＳａｃＩ ０．５μｌ（１０単位）より成る反応混合物
を３７℃で９０分間恒温保持する。引続いて、制限酵素
を６８℃に１５分間加熱することにより失活化する。Ｄ
ＮＡをＴ．マニアチス及びその他の方法（前記参照）に
よりエタノールで沈殿させ、かつ乾燥した沈殿を連結緩
衝液４０μｌ中に取る。Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ１μｌ
（１単位）の添加後、１４℃で１６時間恒温保持する。
Ｅ．コリＬＥ３９２［Ｎ．Ｂ．Ｍｕｒｒａｙ及びその
他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１５０：５３（１９
７７）］をＴ．Ｊ．シルヘイビー及びその他の方法（Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉ
ｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）によりＤＮＡ
の取り込みに対してコンピテントであるように処理し、
コンピテント細胞０．２ｍｌを連結バッチ５μｌと混合
し、氷上に４０分間放置し、かつ４２℃に３分間加熱す
ることにより形質転換する。ＬＢ培地２ｍｌで稀釈しか
つ３０℃で恒温保持した後で、５０μｌから２０μｌま
での部分量を、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを
含有するＬＢ−寒天プレート上に塗布する。プレートを
３７℃で１６時間恒温保持する。

【００４６】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたクロラムフェニコール耐性クロ
ーンを平行して２つのＬＢ−寒天プレート上に塗布し、
そのうちの一方はストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌを
含有し、他方はクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを
含有する。この試験でストレプトマイシン感受性が明ら
かであるクローンからプラスミドＤＮＡをＴ．マニアチ
ス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法（前記参照）によ
り単離する。単離したプラスミドをＳａｃＩで制限し、
ＤＮＡフラグメントを０．７％アガロースゲル上で電気
泳動により分離しかつＵＶ３００ｎｍで観察し得るバン
ドをラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ制限の公知
フラグメントと比較することによりベクターｐＶＫ１０
１中に含まれる挿入断片の大きさを確定する。プラスミ
ドｐＧＪＳ３はｐＧＳＳ３３と３ｋｂのＤＮＡフラグメ
ントとからの組み換えプラスミドである。プラスミドｐ
ＶＫ１０１はＳａｃＩの制限サイトを有していないの
で、明らかにクローン化ＤＮＡフラグメントはｐＪＰ４
の２１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントから由来す
る。

【００４７】例 ３：プラスミドｐＫＪＳ３１及びｐＫ
ＪＳ３２の製造 ａ） プラスミドｐＧＪＳ３及びｐＫＴ２３１の単離 例２により製造した、組換えプラスミドｐＧＪＳ３を含
有するＥ．コリＬＥ３９２菌株を、クロラムフェニコー
ル２０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地４００ｍｌ中、３
７℃で１６時間培養する。ベクタープラスミドｐＫＴ２
３１を含有するＥ．コリＳＫ１５９２［Ｍ．Ｂａｇｄａ
ｓａｒｉａｎ及びその他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃ
ｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ９６：４７（１９８２）］を、カナマイ
シン５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地４００ｍｌ中で
同じ条件下に培養する。遠心分離した細胞から両方のプ
ラスミドをＴ．マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌
法（前記参照）により単離する。

【００４８】ｂ） ｐＫＴ２３１中のｐＧＪＳ３からの
ＳａｃＩフラグメントの再クローン化 ｐＧＪＳ３ ４０μｌ（４００ｎｇ）、ｐＫＴ２３１
４μｌ（１００ｎｇ）、ＴＡＳ緩衝液６μｌ、水９μｌ
及び稀ＳａｃＩ溶液１μｌ（１単位）より成る反応混合
物を３７℃で１２０分間恒温保持する。引続いて反応混
合物を６８℃に１５分間加熱することにより、制限酵素
を失活化する。このバッチに水３９μｌ、１０倍濃縮し
た連結緩衝液１０μｌ及びＴ４−ＤＮＡリガーゼ１μｌ
（０．１単位）を加え、かつこの連結バッチを１４℃で
１６時間恒温保持する。Ｔ．Ｊ．シルヘイビー及びその
他の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎ
ｅｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）に
より製造したＥ．コリＬＥ３９２コンピテント細胞０．
２ｍｌを連結バッチ１０μｌと混合し、氷上で４０分間
放置し、４２℃で３分間加熱し、ＬＢ培地２ｍｌと混合
し、３７℃で６０分間恒温保持する。５０μｌ〜２００
μｌの部分量を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有す
るＬＢ−寒天−プレート上に塗布する。プレートを３７
℃で１６時間恒温保持する。

【００４９】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして獲られたカナマイシン耐性クローンを、
１つはストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌ、２つ目はク
ロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌ及び３つ目はカナマ
イシン５０μｇ／ｍｌを含有する３つの異なるＬＢ−寒
天プレート上に平行して塗布する。一般に、この試験で
ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールに感受性
だがカナマイシン耐性であることが明らかなクローンが
ベクターｐＫＴ２３１（カナマイシン耐性）とｐＧＪＳ
３からの３ｋｂのＳａｃフラグメントからの組み換えプ
ラスミドを含有する。このプラスミドＤＮＡをＴ．マニ
アチス及びその他の公知の迅速法（前記参照）により単
離し、ＤＮＡをＳａｃＩで制限しかつ引続いてフラグメ
ントを０．７％アガロースゲル中で電気泳動で分析する
ことにより、単離したＤＮＡの大きさを測定する。同じ
ようにＥｃｏＲＩを用いて行なった制限分析により、ベ
クタープラスミドに対する挿入断片の向きが異なってい
るプラスミドが同定される。プラスミドｐＫＪＳ３２で
は、挿入断片のＥｃｏＲＩ部位がベクター分のＥｃｏＲ
Ｉの直近に存在する、両方の可能性の形が該当する。こ
のプラスミドは０．９ｋｂ及び１．５ｋｂの２つのＥｃ
ｏＲＩフラグメントを生成する。プラスミドｐＫＪＳ３
１は挿入断片の反対向きの構造を有し、２．３ｋｂ及び
１３．５ｋｂの２つのＥｃｏＲＩフラグメントを供給す
る。

【００５０】 例 ４：プラスミドｐＫＪＳＢ３３０の製造 ａ） プラスミドｐＫＪＳ３１の単離 例３で得られた、新規の組み換えプラスミドｐＫＪＳ３
１を含有するＥ．コリＬＥ３９２のクローンを、カナマ
イシン５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地４００ｍｌ中
３７℃で１６時間培養し、かつ遠心分離した細胞から
Ｔ．マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌（前記参
照）によりプラスミドＤＮＡを単離する。

【００５１】ｂ） ｐＫＪＳ３１からより小さいＢａｍ
ＨＩフラグメントの欠失 ｐＫＪＳ３１ １０μｌ（５００ｎｇ）、水７μｌ、Ｔ
ＡＳ緩衝液２μｌ及び稀ＢａｍＨＩ溶液１μｌ（１単
位）より成る反応混合物を３７℃で６０分間恒温保持
し、引続いて酵素反応を６８℃に１５分間加熱すること
により停止する。この制限バッチに水５０μｌ、１０倍
に濃縮した連結緩衝液８μｌ及びＴ４−ＤＮＡ−リガー
ゼ２μｌ（２単位）を加えかつ１４℃で１６時間恒温保
持する。Ｔ．Ｊ．シルヘイビー及びその他の公知方法
（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈｇｅｎｅ ｆｕｓ
ｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）により製造
したＥ．コリＳ１７−１のコンピテント細胞０．２ｍｌ
を連結バッチ１０μｌと混合し、氷上で４０分間放置
し、４２℃に３分間加熱し、ＬＢ培地２ｍｌと混合しか
つ３７℃で６０分間恒温保持する。５０μｌ〜２００μ
ｌの部分量をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬ
Ｂ−寒天−プレート上に塗布する。このプレートを３７
℃で１６時間恒温保持する。

【００５２】ｃ） 小さくなったプラスミドの同定 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンか
ら、Ｔ．マニアチス及びその他の公知のアルカリ性溶菌
の迅速法（前記参照）により単離する。プラスミドをＢ
ｇｌＩＩで制限しかつＤＮＡフラグメントを０．７％ア
ガロースゲル中で電気泳動で分離することにより小さな
ＢａｍＨＩフラグメントがｐＫＪＳ３１から消失したプ
ラスミドが同定される。該プラスミドは唯一のＢｇｌＩ
Ｉ制限サイトを有し、それ故１３．２ｋｂのＢｇｌＩＩ
−フラグメントを供給する。それ故、元のプラスミドｐ
ＫＪＳ３１とは明らかに異なっておりかつｐＫＪＳＢ３
３０と表わされる。

【００５３】 例 ５：プラスミドｐＫＪＳ３２ＲＨ△Ｓ′の製造 ａ） プラスミドｐＫＪＳ３２及びｐＲＭＥ１の単離 例３で得られた、新規組み換えプラスミドｐＫＪＳ３２
を含有するＥ．コリＬＥ３９２のクローン並びにＥ．コ
リＳＢＣ１０７（ｐＲＭＥ１）を、カナマイシン５０μ
ｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地それぞれ４００ｍｌ中、３
７℃で１６時間培養する。遠心分離した細胞からプラス
ミドをＴ．マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌（前
記参照）により単離する。

【００５４】ｂ） ｐＫＪＳ３２からのＨｉｎｄＩＩＩ
／ＳａｌＩ−フラグメントの欠失及び引続くｐＲＭＥ１
からのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ−フラグメントの挿入 ｐＫＪＳ３２ １０μｌ（５００ｎｇ）、ｐＲＭＥ１
１０μｌ（１μｇ）、水１５μｌ、ＴＡＳ緩衝液４μ
ｌ、稀ＨｉｎｄＩＩＩ溶液０．５μｌ（１単位）及び稀
ＳａｌＩ溶液０．５μｌ（１単位）より成る反応混合物
を３７℃で１２０分間恒温保持しかつこの酵素反応を６
８℃に１５分間加熱することにより停止する。引続いて
この制限バッチ１０μｌに水２５μｌ、１０倍濃度の連
結緩衝液４μｌ及びＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ１μｌ（１
単位）を加えかつ１４℃で１６時間恒温保持する。Ｔ．
Ｊ．シルヘイビーの公知方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、１９８４）により受容性にしたＥ．コリＳ１７−１
の細胞を連結バッチ１０μｌと混合し、４０分間氷上に
放置し、４２℃に３分間加熱し、かつＬＢ培地２ｍｌと
６０分間混合した後で、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを
含有するＬＢ−寒天−プレートに塗布する。このプレー
トを３７℃で１６時間恒温保持する。

【００５５】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンか
ら、プラスミドＤＮＡを公知のＴ．マニアチス及びその
他のアルカリ性溶菌迅速法（前記参照）を用いて単離す
る。ＢａｍＨＩで制限しかつ得られたＤＮＡフラグメン
トを電気泳動により分離することにより、ｐＫＪＳ３２
から出発して小さなＤＮＡ断片がベクター部分上のカナ
マイシン耐性遺伝子の真中に位置するＨｉｎｄＩＩＩ制
限サイトと挿入断片上に位置するＳａｌＩ制限サイトと
の間で除去されていてかつカナマイシン耐性遺伝子のコ
ード領域の３′末端を有するｐＲＭＥ１からのＨｉｎｄ
ＩＩＩ／ＳａｌＩ−フラグメントにより代えられている
プラスミドが同定される。該プラスミドは長さ１３．３
及び２．０ｋｂの２つのＢａｍＨＩフラグメントを供給
し、それ故明らかに出発物質及び他の可能な連結副生成
物とは異なる。ｐＫＪＳ３２からの３．０ｋｂの挿入断
片の０．２ｋｂのＤＮＡ断片が除去されかつカナマイシ
ン耐性遺伝子の一部が同じ遺伝子的由来の他の遺伝子フ
ラグメントに代えられた構造を示す。このプラスミドが
ｐＫＪＳ３２ＲＨ△３′と表わされる。

【００５６】 例 ６：プラスミドｐＫＪＥ△Ｂ１３０の製造 ａ） プラスミドｐＫＴ２３１及びｐＫＪＳ３２の単離 ｐＫＴ２３１の単離については例３に、ｐＫＪＳ３２の
単離については例５に記載されている。

【００５７】ｂ） ｐＫＪＳ３２からの小さい方のＥｃ
ｏＲＩ／ＢａｍＨＩ−フラグメントをｐＫＴ２３１中で
クローン化 一方がｐＫＪＳ３２ １０μｌ（５００ｎｇ）、水５μ
ｌ、ＴＡＳ緩衝液２μｌ並びに酵素ＥｃｏＲＩ、Ｂａｍ
ＨＩ及びＰｓｔＩの稀溶液各１μｌ（１単位）より成
り、かつ他方がｐＫＴ２３１ １０μｌ（２５０ｎ
ｇ）、水６μｌ、ＴＡＳ緩衝液２μｌ並びに酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＢａｍＨＩの稀溶液各１μｌ（１単位）より成
る反応混合物２種を３７℃で１２０分間恒温保持し、反
応を停止させるために１５分間６８℃に加熱する。引続
いて、両方の制限バッチ各１０μｌを混合し、水５０μ
ｌ、１０倍濃度の連結緩衝液８μｌ及びＴ４−ＤＮＡ−
リガーゼ２μｌ（２単位）を加えかつ１４℃で１６時間
恒温保持する。Ｔ．Ｊ．シルヘイビー及びその他の文献
公知の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅ
ｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８
４）により製造したＥ．コリＬＥ３９２のコンピテント
細胞０．２ｍｌを連結バッチと混合し、氷上に４０分間
放置し、４２℃に３分間加熱し、ＬＢ培地２ｍｌと混合
し、かつ３７℃で６０分間恒温保持する。５０μｌ〜２
００μｌの部分量をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有
するＬＢ−寒天−プレート上に塗布する。プレートを３
７℃で１６時間恒温保持する。

【００５８】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンを、
一方はストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌを、他方はカ
ナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有する２つのＬＢ−寒天
−プレート上に平行に塗る。この試験でストレプトマイ
シン耐性であることが明らかであるクローンからプラス
ミドＤＮＡをＴ．マニアチス及びその他の迅速法（前記
参照）により単離する。そのＤＮＡをＸｈｏＩで制限し
かつ引続いてＤＮＡ断片を０．７％アガロースゲル中で
電気泳動で分離することにより、３．０ｋｂ及び９．７
ｋｂの２個のＸｈｏＩフラグメントを与える組み換えプ
ラスミドの同定を行なうことができる。同じプラスミド
を同時にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断する場合、電
気泳動分析により１．５ｋｂ及び１１．２ｋｂの２つの
断片が生じる。このようにして同定されたプラスミド
は、ｐＫＴ２３１のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ−フラグメ
ントとプラスミドｐＫＪＳ３２の挿入ＤＮＡに由来する
１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ−フラグメントと
より成る組み換え体である。これをｐＫＪＥ△Ｂ１３０
と表わす。

【００５９】 例 ７：プラスミドｐＫＪＳ（Ｘ）６３０の製造 ａ） プラスミドｐＫＪＳＢ３３０の単離 例４で得られた組み換えプラスミドｐＫＪＳＢ３３０を
含有するＥ．コリＳ１７−１のクローンをカナマイシン
５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地４００ｍｌ中、３７
℃で１６時間培養し、かつ遠心分離した細胞からプラス
ミドＤＮＡをＴ．マニアチス及びその他のアルカリ性溶
菌により（前記参照）単離する。

【００６０】ｂ） プラスミドｐＫＪＳＢ３３０からＢ
ａｍＨＩ／ＸｂａＩ−フラグメントの除去 ｐＫＪＳＢ３３０ ２０μｌ（１μｇ）、水１５μｌ、
ＴＡＳ緩衝液４μｌ、稀ＸｂａＩ溶液０．５μｌ（２単
位）及び稀ＢａｍＨＩ溶液０．５μｌ（２単位）より成
る反応混合物を３７℃で１２０分間恒温保持する。引続
いて、Ｔ．マニアチス及びその他（前記参照）により緩
衝させたファノール２０μｌを加え、混合し、クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２４：１）２０μｌの添
加後再度混合しかつ遠心分離する。上方の水相を取りか
つ−２０℃のエタノール１２０μｌと混合する。混合物
を−２０℃で３０分間保存し、その後で遠心分離する。
沈殿ＤＮＡを冷い７０％エタノールで洗い、真空乾燥し
かつクレノウ反応溶液［２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０Ｕ／ｍｌＤＮＡポリ
メラーゼＩ（＝クレノウ酵素）］２０μｌ中に取る。３
７℃で５分間予備恒温保持した後で、４種のすべてのデ
オキシヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ０．１２５ｍＭ、
ＣＴＰ０．１２５ｍＭ、ＧＴＰ０．１２５ｍＭ、ＴＴＰ
０．１２５ｍＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の溶液２μｌを
加え、更に５分間恒温保持する。その後、このバッチを
Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ２５Ｕ／ｍｌを含有する連結緩
衝液８０μｌと混合しかつ室温で６時間放置する。引続
いて１４℃で１６時間恒温保持する。Ｔ．Ｊ．シルヘイ
ビー及びその他の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、
１９８４）により製造したＥ．コリＳ１７−１のコンピ
テント細胞の懸濁液０．２ｍｌを連結バッチ１０μｌと
混合し、氷上で４０分間恒温保持後、熱処理（４２℃、
３分間）により形質転換し、ＬＢ培地２ｍｌを混合しか
つ３７℃で６０分間恒温保持する。細胞懸濁液から５０
〜２００μｌの部分量をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを
含有するＬＢ−寒天−プレート上に塗布する。プレート
を３７℃で１６時間恒温保持する。

【００６１】ｃ） 小型プラスミドの同定 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンから
プラスミドＤＮＡを公知のＴ．マニアチス及びその他の
アルカリ性溶菌迅速法（前記参照）により単離する。プ
ラスミドをＳｍａＩで制限しかつ次いでＤＮＡ断片を
０．７％アガロースゲル中で電気泳動により分離するこ
とにより、ｐＫＪＳＢ３３０の挿入断片上のＢａｍＨＩ
制限サイトとＸｂａＩ制限サイトとの間のＤＮＡ断片を
失っているプラスミドが同定される。このプラスミドは
制限分析において２．６ｋｂ及び９．９ｋｂのＳｍａＩ
フラグメント２種を生成し、これをｐＫＪＳ(Ｘ)６３０
と表わす。それ故、これは明らかに出発生成物ｐＫＪＳ
Ｂ３３０とは区別される。

【００６２】例 ８：プラスミドｐＴＪＳＳ′０３５及
びｐＴＪＳＳ′０３６の製造 ａ） プラスミドｐＴ７−５、ｐＴ７−６及びｐＫＪＳ
３２の単離 一方はプラスミドｐＴ７−５、他方はプラスミドｐＴ７
−６を含有するＥ．コリＨＭＳ１７４の２種の菌株をア
ンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加してＴ．マニアチス及
びその他（前記参照）によりＬＢ培地それぞれ４００ｍ
ｌ中、３７℃で１６時間培養する。遠心分離した細胞か
らプラスミドＤＮＡを公知のＴ．マニアチスのアルカリ
性溶菌法により単離する。ｐＫＪＳ３２の単離は例５に
記載されている。

【００６３】ｂ） ｐＫＪＳ３２からのＳａｃＩ／Ｓａ
ｌＩ−フラグメントをｐＴ７−５及びｐＴ７−６中でク
ローン化 ｐＫＪＳ３２ ２０μｌ（１μｇ）、水１５μｌ、ＴＡ
Ｓ緩衝液４μｌ及び酵素ＳａｃＩ及びＳａｌＩそれぞれ
０．５μｌ（２単位）より成る反応混合物（Ａ）を３７
℃で１２０分間恒温保持する。ｐＴ７−５ ２μｌ（１
μｇ）（Ｂ）か又はｐＴ７−６ ２μｌ（１μｇ）
（Ｃ）、水１５μｌ、ＴＡＳ緩衝液２μｌ及び酵素Ｓａ
ｃＩ及びＳａｌＩそれぞれ０．５μｌ（２単位）より成
る他の２種の反応混合物を同じ条件下で恒温保持する。
３つすべての反応を６８℃に１５分間加熱することによ
り停止する。制限バッチＡ（ｐＫＪＳ３２）各１３μｌ
を制限バッチＢ（ｐＴ７−５）７μｌもしくは制限バッ
チＣ（ｐＴ７−６）７μｌと混合する。両方の混合物に
それぞれ水０．５μｌ、１０倍濃度の連結緩衝液８μｌ
及びＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ２μｌ（２単位）を加え
る。両方の連結バッチを１４℃で１６時間恒温保持す
る。Ｔ．Ｊ．シルヘイビー及びその他の方法（Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ
ｓ．Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８４）により製造したＥ．コリＬＥ３
９２のコンピテント細胞それぞれ０．２ｍｌを連結バッ
チそれぞれ１０μｌと混合し、氷上で４０分間放置し、
４２℃に３分間加熱し、ＬＢ培地２ｍｌと混合しかつ３
７℃で６０分恒温保持する。５０〜２００μｌの部分量
を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天
−プレート上に塗る。このプレートを３７℃で１６時間
恒温保持する。

【００６４】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたアンピシリン耐性クローンか
ら、プラスミドＤＮＡをＴ．マニアチス及びその他の公
知のアルカリ性溶菌迅速法（前記参照）により単離す
る。プラスミドをＢａｌＩＩ及びＢａｍＨＩで制限しか
つＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重制限（ｄｏｐｐ
ｅｌｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｋｔｉｏｎ）しかつ引続いてフ
ラグメントを０．７％アガロースゲル中で電気泳動で分
離することにより、両方のベクタープラスミドｐＴ７−
５か又はｐＴ７−６の１つとｐＫＪＳ３２の小型Ｓａｃ
Ｉ／ＳａｌＩ−フラグメントより成るプラスミドが同定
される。該組み換えプラスミドは出発生成物としてのｐ
Ｔ７−５の場合には３．０ｋｂ及２．２ｋｂのＢｇｌＩ
Ｉフラグメント２個、５．２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメ
ント並びに３．２ｋｂ及び２．０ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−フラグメント２個を供給しかつこれをｐ
ＴＪＳＳ′０３５と表わす。出発生成物がｐＴ７−６の
場合には２．８ｋｂ及び２．２ｋｂのＢｇｌＩＩフラグ
メント２個、５．０ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント及び
３．０ｋｂ及び２．０ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−フラグメント２個が生じ、それをｐＴＪＳＳ′０３
６と表わす。それ故、該組み換えプラスミドは明らかに
それらの出発生成物ｐＫＪＳ３２、ｐＴ７−５もしくは
ｐＴ７−６とは異なっている。

【００６５】例 ９：プラスミドｐＴＪＳ′Ｂ４３５及
びｐＴＪＳ′Ｂ４３６の製造 ａ） プラスミドｐＴ７−５、ｐＴ７−６及びｐＫＪＳ
Ｂ３３０の単離 ｐＴ７−５及びｐＴ７−６の単離については既に例８
に、ｐＫＪＳＢ３３０の単離については例７に記載され
ている。

【００６６】ｂ） ｐＫＪＳＢ３３０からの小型Ｓａｌ
Ｉ／ＢａｍＨＩ−フラグメントをｐＴ７−５及びｐＴ７
−６中でクローン化 ｐＫＪＳＢ３３０ ４０μｌ（２μｇ）、ＴＡＳ緩衝液
５μｌ並びに酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩの稀溶液それ
ぞれ２．５μｌ（４単位）より成る反応混合物（Ａ）を
３７℃で１２０分間恒温保持する。ｐＴ７−５（Ｂ）２
μｌ（１μｇ）もしくはｐＴ７−６（Ｃ）２μｌ（１μ
ｇ）、水２０μｌ、ＴＡＳ緩衝液３μｌ並びに酵素Ｓａ
ｌ及びＢａｍＨＩの稀溶液それぞれ２．５μｌ（４単
位）より成る他の２種の反応混合物を同じ条件下に恒温
保持する。これらの反応を６８℃に１５分間加熱するこ
とにより停止する。制限バッチＡ（ｐＫＪＳＢ３３０）
全部をアガロースゲル［Ｔ．マニアチス及びその他（前
記参照）によりエチジウムブロミド０．５μｇ／ｍｌを
含有するＴ．マニアチス及びその他（前記参照）により
ＴＢＥ緩衝液中の０．７％アガロースゲル］中で電気泳
動で分離する。ＵＶ線（３００ｎｍ）で観察可能な両方
のＤＮＡバンドのうち小型の２．０ｋｂのバンドをＤＥ
ＡＥ膜溶離法によりゲルから次のようにして単離する：
好適な寸法のＤＥＡＥ膜片（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ｕ
ｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｓ ＆ ＳＮＡ−４５）を溶離
すべきバンドの下方の切欠き１〜２ｍｍ中に配置する。
該当するバンドが全く膜によって吸着されるまで電気泳
動を継続する。引続いて膜をゲルから取り出しかつＮＥ
Ｔ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１０ｍｌで
１０分間洗う。洗浄した膜をＨＮＥＴ緩衝液（１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０）１５０μｌ中６８℃で３０分間恒温保
持する。この溶液を除いて、膜を更に１０分間ＨＮＥＴ
緩衝液５０μｌで恒温保持する。合した溶離溶液（２０
０μｌ）を水２００μｌで稀釈し、次に（−２０℃）エ
タノール８００μｌと混合しかつ−２０℃で３０分間保
存する。沈殿したＤＮＡを遠心分離しかつこの沈殿を水
９０μｌ中に取る。Ｔ．マニアチス及びその他（前記参
照）により３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１０μｌの添加後、
冷いエタノール２００μｌで再び沈殿させ（−２０℃、
３０分間）、遠心分離し、沈殿を冷い７０％エタノール
で洗い、真空乾燥させかつ連結緩衝液８０μｌ中に取
る。そのうちの各４０μｌに制限バッチＢ（ｐＴ７−
５）３μｌ（１００ｎｇ）もしくは制限バッチＣ（ｐＴ
７−６）３μｌ（１００ｎｇ）及びＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼ２μｌ（１単位）を加えかつ１４℃で１６時間恒温
保持する。Ｔ．Ｊ．シルヘイビー及びその他の方法（Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉ
ｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）により製造し
たＥ．コリＬＥ３９２のコンピテント細胞０．２ｍｌを
連結バッチ１５μｌと混合し、氷上に４０分間放置し、
４２℃に３分間加熱し、ＬＢ培地２ｍｌと混合しかつ３
７℃で６０分恒温保持する。５０μｌ〜２００μｌの部
分量を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−
寒天−プレート上に塗る。このプレートを３７℃で１６
時間恒温保持する。

【００６７】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたアンピシリン耐性クローンから
ＤＮＡを公知であるＴ．マニアチス及びその他のアルカ
リ性溶菌迅速法（前記参照）により単離する。プラスミ
ドをＥｃｏＲＩで制限しかつ引続いてフラグメントを
０．７％アガロースゲル中で電気泳動で分離することに
より、ｐＫＪＳＢ３３０からの小型ＳａｌＩ／ＢａｍＨ
Ｉ−フラグメントを両方のベクタープラスミドの一方に
含有するプラスミドが同定される。出発生成物としての
ｐＴ７−５との組み換えプラスミドでは３．０ｋｂ及び
１．５ｋｂの２つのＥｃｏＲＩフラグメントが得られ、
かつこれをｐＴＪＳ′Ｂ４３５と表わし、出発生成物と
してのｐＴ７−６とのプラスミドでは２．８ｋｂ及び
１．５ｋｂの２つのＥｃｏＲＩフラグメントが生じ、こ
れをｐＴＪＳ′Ｂ４３６と表わす。

【００６８】例１０：プラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５及
びｐＴＪＳ′Ｘ５３６の製造 ａ） プラスミドｐＴ７−５、ｐＴ７−６及びｐＴＪＳ
Ｓ′０３５の単離 例８で製造したプラスミドｐＴＪＳＳ′０３５を含有す
るＥ．コリＬＥ３９２をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを
添加含有するＬＢ培地４００ｍｌ中３７℃で１６時間培
養する。遠心分離した細胞からプラスミドＤＮＡをＴ．
マニアチス及びその他（前記参照）により単離する。ｐ
Ｔ７−５及びｐＴ７−６の単離は例８に記載されてい
る。

【００６９】ｂ） ｐＴＪＳＳ′０３５からの小型Ｓａ
ｌＩ／ＸｂａＩ−フラグメントをｐＴ７−５及びｐＴ７
−６中でクローン化 ｐＴＪＳＳ′０３５ ６μｌ（３μｇ）、水１５μｌ、
ＴＡＳ緩衝液３μｌ並びに酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩ及び
ＢａｍＨＩの稀溶液それぞれ２μｌ（５単位）より成る
反応混合物（Ａ）を３７℃で１２０分間恒温保持する。
ｐＴ７−５（Ｂ）２μｌ（１μｇ）か又はｐＴ７−６
（Ｃ）２μｌ（１μｇ）、水２３μｌ、ＴＡＳ緩衝液３
μｌ並びに酵素ＸｂａＩ及びＳａｌＩの稀溶液各１μｌ
（２．５単位）より成る他の２種の反応混合物を同じよ
うに恒温保持する。反応を６８℃に１５分間加熱するこ
とに停止させる。２種の異なる連結バッチにおいて、制
限バッチＡ（ｐＴＪＳＳ′０３５）各５μｌ（５００μ
ｇ）を制限バッチＢ（ｐＴ７−５）１５μｌ又は制限バ
ッチＣ（ｐＴ７−６）１５ｍｌ、水５０μｌ、連結緩衝
液８μｌ及びＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ２μｌ（２単位）
と混合し、かつ１４℃で１６時間恒温保持する。Ｔ．
Ｊ．シルヘイビー及びその他の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌ
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８４）により製造したＥ．コリＬＥ３
９２のコンピテント細胞０．２ｍｌを連結バッチ１５μ
ｌと混合し、氷上に４０分間放置し、４２℃に３分間加
熱し、ＬＢ培地２ｍｌと混合しかつ３７℃で６０分恒温
保持する。部分量５０μｌ〜２００μｌをアンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天−プレート上に塗
る。このプレートを３７℃で１６時間恒温保持する。

【００７０】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたアンピシリン耐性クローンか
ら、プラスミドＤＮＡをＴ．マニアチス及びその他（前
記参照）により単離する。酵素ＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩ
による制限並びにＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩによる二重制
限により、ｐＴＪＳＳ′０３５からの１．４ｋｂの小型
ＳａｌＩ／ＸｂａＩ−フラグメントを両方のベクタープ
ラスミドｐＴ７−５もしくはｐＴ７−６中に含有するプ
ラスミドが同定される。出発生成物としてのｐＴ７−５
との組み換えプラスミドは３．０ｋｂ及び０．８ｋｂの
ＥｃｏＲＩフラグメント２個、２．４ｋｂ及び１．４ｋ
ｂのＳｍａＩフラグメント２個及び２．４ｋｂ、０．８
ｋｂ及び０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ−フラグメ
ント３個を生成し、それをｐＴＪＳ′Ｘ５３５と表わ
す。出発生成物としてのｐＴ７−６との組み換えプラス
ミドは２．８ｋｂ及び０．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメ
ント２個、２．２ｋｂ及び１．４ｋｂのＳｍａＩフラグ
メント２個並びに２．２ｋｂ、０．８ｋｂ及び０．６ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ−フラグメント３個を供給
し、これをｐＴＪＳ′Ｘ５３６と表わす。それ故、組み
換えプラスミドは明らかにその出発生成物とは異なって
いる。

【００７１】 例１１：プラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガの製造 ａ） プラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５及びｐＤＯＣ３７
の単離 一方が例１０で製造したプラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５
を、他方がプラスミドｐＤＯＣ３７を含有する菌株Ｅ．
コリＬＥ３９２ ２種をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを
添加含有するＬＢ培地各４００ｍｌ中、３７℃で１６時
間培養する。遠心分離した細胞からプラスミドをＴ．マ
ニアチス及びその他（前記参照）により単離する。プラ
スミドｐＤＯＣ３７はＥｃｏＲＩ制限サイト２個の間に
オメガフラグメントを含有する。ｐＤＯＣ３７の代りに
プラスミドｐＨＰ４５オメガ（Ｐｒｅｎｔｋｉ及びＫｒ
ｉｓｃｈ，１９８４、Ｇｅｎｅ，２９：１０３に記載）
を同じようにオメガフラグメント源として使用すること
ができる。

【００７２】ｂ） ｐＤＯＣ３７からのオメガフラグメ
ントをｐＴＪＳ′Ｘ５３５のＢｇｌＩＩサイト中にクロ
ーン化 一方がｐＴＪＳ′Ｘ５３５ ２μｌ（１μｇ）、水１４
μｌ、ＴＡＳ緩衝液２μｌ及びＢｇｌＩＩ ２μｌ（３
単位）より成りかつ他方がｐＤＯＣ３７ ２μｌ（２μ
ｇ）、水１４μｌ、ＴＡＳ緩衝液２μｌ及び稀ＢａｍＨ
Ｉ溶液２μｌ（４単位）より成る反応混合物２種を３７
℃で１２０分間恒温保持する。反応を、６８℃に１５分
間加熱することにより停止する。両方の制限バッチ各１
０μｌを合しかつそれに連結緩衝液８０μｌ及びＴ４−
ＤＮＡ−リガーゼ１μｌ（１単位）を加える。連結バッ
チを１４℃で１６時間恒温保持する。Ｔ．Ｊ．シルヘイ
ビー及びその他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８
４）により製造したＥ．コリＬＥ３９２のコンピテント
細胞０．２ｍｌを連結バッチ１０μｌと混合し、氷上に
４０分間放置し、４２℃に３分間加熱し、ＬＢ培地２ｍ
ｌと混合しかつ３７℃で６０分恒温保持する。５０〜２
００μｌの部分量を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び
スペクチノマイシン８０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒
天−プレート上に塗布する。このプレートを３７℃で１
６時間恒温保持する。スペクチノマイシンで選択するこ
とにより、すべての生長クローンがオメガフラグメント
を有するプラスミドを含有することが明らかである。そ
れというのもこのフラグメントがスペクチノマイシン耐
性発現遺伝子を含有するからである。

【００７３】ｃ） 組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたアンピシリン−及びスペクチノ
マイシン耐性クローンからプラスミドＤＮＡをＴ．マニ
アチス及びその他（前記参照）により単離する。Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで制限することにより組み換えプラスミドを同
定する。その際に、０．６ｋｂ、２．０ｋｂ及び３．２
ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント３種が生じ、これは
前回のＢｇｌＩＩサイトにオメガフラグメントを組み込
んだｐＴＪＳ′Ｘ５３５の誘導体である。ＢｇｌＩＩ−
及びＢａｍＨＩフラグメントの適合性重複末端の連結に
より、制限サイトＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩは連結サイ
トで失なわれる。この組み換えプラスミドをｐＴＪＳ′
Ｘ５３５オメガと表わす。

【００７４】例１２：ファージＭＪＳＳ′０３０及びＭ
ＪＳＳ′０３１の製造 ａ） プラスミドｐＫＪＳ３２並びに２本鎖形のファー
ジＭ１３ｔｇ１３０及びＭ１３ｔｇ１３１の単離 菌株Ｅ．コリＭ１０１［Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ及びその
他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３０９（１９
８１）］並びにベクターＭ１３ｔｇ１３０及びＭ１３ｔ
ｇ１３１［Ｍ．Ｐ．Ｋｉｅｎｙ及びその他、Ｇｅｎｅ２
６：９１（１９８３）］の二本鎖ＤＮＡはアマーシャム
・ブフラー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｕｃｈｌｅｒ Ｇｍ
ｂ Ｈ ＆ Ｃｏ．ＫＧ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ
在）から入手し得る。二本鎖ＤＮＡは次の方法で得られ
る：Ｔ．Ｊ．シルヘイビー及びその他（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ、１９８４）により製造したＥ．コリＪＭ
１０１のコンピテント細胞０．２ｍｌを文献公知の方法
によりＭ１３ベクターの一本鎖−又は二本鎖ＤＮＡで形
質転換し、溶融（４５℃）Ｈ−Ｔｏｐ−寒天（１０ｇ／
ｌトリプトン、８ｇ／ｌ ＮａＣｌ，８ｇ／ｌ寒天）３
ｍｌと混合し、Ｈ−寒天−プレート（１０ｇ／ｌトリプ
トン、８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１２ｇ／ｌ寒天）上に注
ぐ。冷却したプレートを３７℃で１６時間恒温保持す
る。ＴＹ培地（１６ｇ／ｌトリプトン，１０ｇ／ｌ酵母
エキス、５ｇ／ｌ ＮａＣｌ）２ｍｌにＴＹ培地中の
Ｅ．コリＪＭ１０１の一晩培養物（３７℃、１６時間）
２０μｌ及びＨ−寒天−プレートの各溶菌斑を接種す
る。３７℃で１６時間生長させた後で、ファージ感染細
胞をＥ．コリＪＭ１０１の新しい一晩培養物２ｍｌと一
緒にＴＹ培地４００ｍｌ中に移種し、３７℃で１６時間
培養する。遠心分離した細胞から二本鎖ＤＮＡをＴ．マ
ニアチス及びその他（前記参照）により単離する。プラ
スミドｐＫＪＳ３２の単離は例５に既に記載されてい
る。

【００７５】ｂ） ｐＫＪＳ３２からのＳａｃＩ／Ｓａ
ｌＩ−フラグメントをＭ１３ｔｇ１３０及びＭ１３ｔｇ
１３１中にクローン化 ｐＫＪＳ３２ ３０μｌ（１．５μｇ）、水２０μｌ、
ＴＡＳ緩衝液６μｌ及び酵素ＳａｃＩ及びＳａｌＩの稀
溶液それぞれ２μｌ（４単位）より成る反応混合物
（Ａ）を３７℃で１２０分間恒温保持する。Ｍ１３ｔｇ
１３０（Ｂ）又はＭ１３ｔｇ１３１（Ｃ）の二本鎖ＤＮ
Ａ１０μｌ（３００ｎｇ）、水２５μｌ、ＴＡＳ緩衝液
４μｌ並びに酵素ＳａｃＩ及びＳａｌＩの稀溶液各０．
５μｌ（１単位）より成る他の反応混合物２種を同じよ
うに恒温保持し、かつ反応を停止するために１５分間６
８℃に加熱する。全制限バッチＡをアガロースゲル［ア
ガロース０．７％、ＴＢＥ緩衝液中のエチジウムブロミ
ド０．５μｇ／ｍｌ、Ｔ．マニアチス及びその他（前記
参照）による］中で電気泳動により分離する。ＵＶ線で
観察されるＤＮＡバンドのうち２．８ｋｂの小型Ｓａｃ
Ｉ／ＳａｌＩ−バンドを例９で２．０ｋｂのバンドに関
して記載したようにゲルからＤＥＡＥ膜を用いて単離す
る。最後に、ＤＮＡを水８０μｌ中に取り、そのうちの
それぞれ４０μｌに制限バッチＢ（Ｍ１３ｔｇ１３０）
もしくはＣ（Ｍ１３ｔｇ１３１）２０μｌ及び水４０μ
ｌを加え、緩衝したフェノール／クロロホルム１００μ
ｌとＴ．マニアチス及びその他（前記参照）により混合
し、かつ遠心処理する。水性上相を取り、Ｔ．マニアチ
ス及びその他（前記参照）により３Ｍ酢酸ナトリウム溶
液１０μｌの添加後冷い（−２０℃）エタノールそれぞ
れ２００μｌと混合する。混合物を−２０℃で３０分間
放置し、引続いて遠心処理し、沈殿を冷い７０％エタノ
ールで洗い、真空乾燥しかつ連結緩衝液４０μｌ中に取
る。両方のバッチにＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ各１μｌ
（１単位）を加えかつ１４℃で１６時間恒温保持する。
Ｔ．Ｊ．シルヘイビー及びその他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ ｗｉｔｈｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８４）により製造したＥ．コリＪＭ１
０１のコンピテント細胞それぞれ０．２ｍｌを連結バッ
チ１０μｌと混合し、氷上で４０分間放置し、４２℃に
３分間加熱し、かつ溶融（４５℃）Ｈ−Ｔｏｐ−寒天そ
れぞれ３ｍｌと混合する。混合物にそれぞれＩＰＴＧ４
０μｌ（１００ｍＭ）及びＸ−Ｇａｌ４０μｌ（ジメチ
ルホルムアミド中２％）を加えかつＨ−寒天−プレート
上に注ぐ。冷却したプレートを３７℃で１６時間恒温保
持する。

【００７６】ｃ） 組み換えファージの同定 このようにして得られた溶菌斑のうち、青に着色してい
ないものが組み換えファージから由来する。更に同定す
るために、二本鎖−及び一本鎖ＤＮＡを無色の溶菌斑か
ら文献公知の方法（Ａｍｅｒｓｈａｍの“Ｍ１３ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋに総括されている）により単離する。二本鎖Ｄ
ＮＡをＢｇｌＩＩで制限しかつ引続いてＤＮＡフラグメ
ントを電気泳動で分離することにより、ｐＫＪＳ３２か
らの小型ＳａｃＩ／ＳａｌＩ−フラグメントを含有する
Ｍ１３ｔｇ１３０もしくはＭ１３ｔｇ１３１の誘導体が
同定される。ベクターとしてのＭ１３ｔｇ１３０との組
み換えファージは０．７ｋｂ、２．２ｋｂ及び７．１ｋ
ｂのＢｇｌＩＩフラグメント３個を示し、これをＭＪＳ
Ｓ′０３０と表わす。Ｍ１３ｔｇ１３１とのものは０．
６ｋｂ、０．７ｋｂ、２．２ｋｂ及び６．６ｋｂのＢｇ
ｌＩＩフラグメント４個を示し、これをＭＪＳＳ′０３
１と表わす。それらは、明らかにその出発生成物とは異
なっている。

【００７７】例１３：ｔｆｄＡ−突然変異体アルカリゲ
ネス・オイトロフスＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−２及びＪＭ
Ｐ１３４：Ｔｎ５−４の製造 ａ） アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ１３４のト
ランスポゾン突然変異誘発 ＰＹＥ培地（ペプトン３ｇ／ｌ、酵母エキス３ｇ／ｌ）
１０ｍｌにアルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ１３４
［Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ及びその他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１４５：６８１（１９８１）］の一晩培養物（１６
時間、３０℃）０．５ｍｌを接種しかつ３０℃で８時間
振盪させる。Ｔ．マニアチス及びその他（前記参照）に
よるＬＢ培地１０ｍｌは、プラスミドｐＳＶＰ２０２１
を含有するＥ．コリＳ１７−１［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ １：７８４（１９８３）］の一晩培養物０．１
ｍｌを接種し、かつ３７℃で５時間振盪する。引続い
て、両方の培養物について光度計で波長６００ｎｍで光
学密度を測定する。培養物をその光学密度に関連して比
１：１で混合しかつ混合物１．５ｍｌをＰＹＥ−寒天−
プレート［Ｒ．Ｈ．Ｄｏｎ及びその他、Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ．１４５：６８１（１９８１）］上に分散させ
る。プレートを３０℃で１６時間恒温保持する。引続い
て、細菌を滅菌０．７％ＮａＣｌ溶液１．５ｍｌでプレ
ートから洗浄しかつ細菌懸濁液を２工程で０．７％Ｎａ
Ｃｌ溶液を用いてその都度１：１０（０．１ｍｌ＋０．
９ｍｌ）に稀釈する。それぞれの稀釈液から部分量５０
μｌ、１００μｌ、２００μｌ及び４００μｌを付加的
にフラクトース２ｇ／ｌ及びカナマイシン３８０μｇ／
ｍｌを含有する最少寒天プレート（リン酸水素二カリウ
ム１．６ｇ／ｌ、硫酸二水素カリウム０．４ｇ／ｌ、硫
酸アンモニウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７Ｈ₂Ｏ
０．０５ｇ／ｌ、硫酸鉄（ＩＩ）・７Ｈ₂Ｏ ０．０１
ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ）上に塗る。プレートを３０℃
で３〜７日間恒温保持する。

【００７８】ｂ） トランスポゾン含有菌株による２，
４−Ｄ分解試験 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンは、
トランスポゾンＴｎ５をそのゲノム中に安定的に組み込
んだ菌株ＪＭＰ１３４の子孫である。これを一方は２，
４−ジクロルフェノキシ酢酸・ナトリウム塩（２，４−
Ｄ）１ｍＭを含有し、他方はフラクトース２ｇ／ｌ及び
カナマイシン３８０μｇ／ｍｌを含有する２つの最少寒
天プレート上に平行して塗布する。プレートを３０℃で
３日間恒温保持する。２，４−Ｄ分解を誘発する遺伝子
の１つにおいて突然変異を示す菌株は２，４−Ｄを生長
基質として使用することはできない（２，４−Ｄ陰
性）。それはトランスポゾン含有カナマイシン耐性クロ
ーン全体に対して０．１〜１％の頻度で現われる。

【００７９】 ｃ） ２，４−Ｄ陰性突然変異体の遺伝子欠失の同定 このようにして得られた２，４−Ｄ陰性突然変異体を、
一方は３−クロル安息香酸・ナトリウム塩（３−ＣＢ）
２ｍＭを含有し、他方はフラクトース２ｇ／ｌ及びカナ
マイシン３８０μｇ／ｍｌを含有する最少寒天プレート
２つに平行して塗布する。プレートを３０℃で３日間恒
温保持する。２，４−Ｄ分解の遺伝子ｔｆｄＣ、ｔｆｄ
Ｄ及びｔｆｄＥ中に突然変異を有する菌株ＪＭＰ１３４
の２，４−Ｄ陰性トランスポゾン突然変異体は、ドン
（Ｄｏｎ）及びその他［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６
１：８５（１９８５）］が示すことができたように３−
ＣＢを生長基質として使用することはできない（３−Ｃ
Ｂ−陰性）。これに対して遺伝子ｔｆｄＡ及びｔｆｄＢ
における突然変異体が唯一の炭素源としての３−ＣＢ上
で生長し得る（３−ＣＢ陽性）。それ故、この試験にお
いて更に３−ＣＢ陽性が明らかになるトランスポゾン突
然変異体を酵素試験により遺伝子ｔｆｄＡ又はｔｆｄＢ
における欠失について試験する。そのために菌株をピル
ビン酸ナトリウム／５ｍＭ及び３−ＣＢ １ｍＭを添加
含有する最少培地（前記のような、寒天を含まない）２
５０ｍｌ中３０℃で１６時間培養する。細胞を４℃の遠
心処理により採取し、冷い（４℃）最少培地（炭素源含
まず）１０ｍｌ中で３回洗い、再び遠心処理し、かつ最
後に４２０ｎｍで光学密度３０を有するような量の最少
培地中に懸濁させる。２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ
もしくは２，４−ジクロルフェノールヒドロキシラーゼ
の酵素試験に関して、細胞懸濁液１容量部を酵素で飽和
した最少培地９容量部と混合して、４２０ｎｍの光学密
度が３であるようにする。市販の酸素電極を用いて１０
分間にわたって基質添加せずに酸素吸収を追跡する。引
続いて、２，４−Ｄを最終濃度１ｍＭ又は２，４−ジク
ロルフェノールを最終濃度０．２ｍＭまで添加しかつ酸
素濃度の低下を２０分間にわたって追跡する。この試験
により、ｔｆｄＡ突然変異体をすべての他の突然変異型
並びに野生型菌株ＪＭＰ１３４から区別することができ
る。それは２，４−Ｄの添加後に酸素消費の上昇を示さ
ず、２，４−ジクロルフェノールの添加後に酸素吸収の
有意な上昇が起る。野生型菌株並びにｔｆｄＢ突然変異
体は基質として２，４−Ｄの添加後に高まった酸素消費
を示し、それ故完全な２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ
である。両方のトランスポゾン突然変異体ＪＭＰ１３
４：Ｔｎ５−２及びＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−４では検出
可能な２，４−ジクロルフェノールヒドロキシラーゼを
有するが、検出可能な２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ
を有していない２，４−Ｄ陰性で３−ＣＢ陽性突然変異
体２種が該当する。それ故ｔｆｄＡ突然変異体として同
定することができる。この整理の仕方は更に以下の実施
例に記載の実際によって確認される。

【００８０】例１４：クローン化されたｔｆｄＡ遺伝子
の、Ｅ．コリ以外の他のグラム陰性菌中での発現 ａ） ｔｆｄＡ含有プラスミドを接合転移するための供
与菌株の製造 ｐＶＫ１０１［Ｖ．Ｃ．Ｋｎａｕｆ及びその他、Ｐｌａ
ｓｍｉｄ ８：４５（１９８２）］、ｐＧＳＳ３３
［Ｇ．Ｓ．Ｓｈａｒｐｅ，Ｇｅｎｅ ２９：９３（１９
８４）］及びｐＫＴ２３１［Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａ
ｎ及びその他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ ９６：４７（１９８２）］のような広範な宿主域
を有する可動性ベクターをベースとして形成されたプラ
スミド（これらの製造は例１〜７に記載されている）
を、可動性菌株Ｅ．コリＳ１７−１［Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １：７８４（１９８３）］から例えばアル
カリゲネス・オイトロフス及びプソイドモナス・プチダ
のような他のグラム陰性菌への接合により転移させるこ
とができる。そのために、プラスミドがＥ．コリＳ１７
−１中でクローン化されていない場合には初めに形質転
換によりこの菌株中に導入しなければならない。このた
めに、該当するプラスミドを含有するＥ．コリＬＥ３９
２のクローンからプラスミドＤＮＡをＴ．マニアチス及
びその他（前記参照）により単離し、Ｔ，Ｊ．シルヘイ
ビー及びその他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９
８４）により製造したＥ．コリＬＥ３９２のコンピテン
ト細胞０．２ｍｌを単離したプラスミドＤＮＡ１μｌと
混合し、氷上に４０分間放置し、４２℃に３分間加熱
し、ＬＢ培地２ｍｌと混合し、３７℃で６０分間恒温保
持する。５０〜２００μｌの部分量を、選択に好適な抗
生物質を含有するＬＢ−寒天−プレート上に塗布する。
プレートを３７℃で１６時間恒温保持する。

【００８１】ｂ） 接合転移 このようにして得られた、例１〜７に記載のプラスミド
を含有する菌株Ｅ．コリＳ１７−１を選択するのに好適
な抗生物質を含有するＬＢ培地５ｍｌ中３７℃で１６時
間培養する。受容菌として、例１３で単離したｔｆｄＡ
突然変異体のいずれか１つ（Ａ）、ｐＪＰ４を含まない
菌株アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ２２２［Ｒ．
Ｈ．Ｄｏｎ及びその他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４
５：６８１（１９８１）］（Ｂ）又はプソイドモナスｓ
ｐｃ．Ｂ１３［Ｅ．Ｄｏｒｎ及びその他“Ａｒｃｈ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．９９：６１（１９７４）］（Ｃ）を
ＰＹＥ培地（ペプトン３ｇ／ｌ、酵母エキス３ｇ／ｌ）
５ｍｌ中、３０℃で１６時間培養する。供与菌株の細胞
を遠心分離しかつ２倍容量のＰＹＥ培地中に懸濁させ
る。供与細胞の懸濁液及び受容菌の培養物を同量部で混
合する。混合物１００μｌをＰＹＥ−寒天−プレートの
表面上に配置した膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
ＨＡ ０．４５μｍ）上にピペット装入する。引続い
て、プレートを３０℃で６時間恒温保持する。その後
で、細胞を０．７％ＮａＣｌ溶液１ｍｌでフィルターか
ら洗出し、かつ細胞懸濁液を７段階で０．７％ＮａＣｌ
溶液を用いてその都度１：１０（０．１ｍｌ＋０．９ｍ
ｌ）に稀釈する。各稀釈液のうち１００μｌを次の生長
基質を含有する最少寒天プレート上に塗布する：Ａ（ｔ
ｆｄＡ突然変異体）では２，４−Ｄ １ｍＭ、Ｂ（アル
カリゲネス・オイトロフスＪＭＰ２２２）ではフェノキ
シ酢酸−Ｎａ ４ｍＭあるいはＣ（プソイドモナスＢ１
３）では４−クロルフェノキシ酢酸−Ｎａ １ｍＭ。プ
レートをＡでは１４日間、Ｂ及びＣでは４日間３０℃で
恒温保持する。

【００８２】ｃ） 新規に形成した菌株の特性 完全ｔｆｄＡ遺伝子を含有する前記の群類からの、広範
な宿主域を有する可動性プラスミドにより、それぞれの
受容菌株への接合転移後に機能性の２，４−Ｄ−モノオ
キシゲナーゼを合成することができる。これはＡ（ｔｆ
ｄＡ突然変異体）の場合には突然変異の相補性、それ故
２，４−Ｄの利用に関して野生型特性の再現をもたら
し、つまり２，４−Ｄ最少寒天プレート上で２，４−Ｄ
陽性菌株が生じる。更に、ｔｆｄＡによりコード付けさ
れた２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼは、２，４−Ｄと
共に２，４−Ｄと化学的に類縁の化合物フェノキシ酢酸
及び４−クロルフェノキシ酢酸をも酵素的に変換するこ
とができ、その際に生成物としてフェノールもしくは４
−クロルフェノールが形成される。菌株アルカリゲネス
・オイトロフスＪＭＰ２２２はフェノールを完全代謝す
る遺伝子を有するので、Ｂの場合ｔｆｄＡ含有プラスミ
ドの接合転移後に、フェノキシ酢酸を生長基質として利
用するという新しい特性を有する菌株が生じる。同じよ
うに、それと一緒に準備した、フェノール及び４−クロ
ルフェノールの完全分解経路を有するｔｆｄＡ含有プラ
スミドのプソイドモナスＢ１３が基質フェノキシ酢酸及
び４−クロルフェノキシ酢酸上で生長することができる
（Ｃ）。特に、前記のような一定の基質の利用に関する
試験は、可動性広範な宿主域ベクター（Ｂｒｏａｄ−Ｈ
ｏｓｔ−Ｒａｎｇｅ−Ｖｅｋｔｏｒｅｎ）中でクローン
化されたＤＮＡフラグメント及びその小型誘導物（それ
らの製造は例１〜７に記載）によりｔｆｄＡ遺伝子の発
現を検出するのに好適である。その際に、プラスミドｐ
ＶＪＨ２１、ｐＧＪＳ３、ｐＫＪＳ３１、ｐＫＪＳ３
２、ｐＫＪＳＥ３３０、ｐＫＪＳ３２ＲＨ△Ｓ′及びｐ
ＫＪＳ（Ｘ）６３０はすべて完全なｔｆｄＡ遺伝子を含
有するが、プラスミドｐＫＪＥ△Ｂ１３０は機能性の遺
伝子生成をコードしないことが明らかである。

【００８３】例１５：Ｅ．コリ中のｔｆｄＡコード付け
２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼの富化 ａ） 高生産性Ｅ．コリ菌株の製造 Ｔａｂｏｒにより構成されたベクターｐＴ７−５及びｐ
Ｔ７−６をベースとして製造した組み換えプラスミド
（例８、９、１０及び１１に記載）は、ファージＴ７の
強力なプロモータに続いてクローン化ＤＮＡフラグメン
トを含有する。完全なｔｆｄＡ遺伝子をプロモータに対
して正しい向きで含有するこの群類からのプラスミド
は、プラスミドｐＧＰ１−２［Ｓ．Ｔａｂｏｒ及びその
他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１０７４（１９８５）］からの発現Ｔ７−ＲＮＡ
−ポリメラーゼの作用下にＥ．コリＫ３８中で多量の
２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼを生産し得る。プロモ
ータは特異的にＴ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼによっての
み認識され、かつこのポリメラーゼはプラスミドｐＧＰ
１−２上に感熱性ラムダリプレッサーの制御下に位置す
るので、遺伝子生成物の合成は熱により誘発される。更
に、リファンピシンの添加により、細菌性ＲＮＡポリメ
ラーゼを抑制することができる。高生産性菌株を製造す
るに当り、例８〜１１で得られたプラスミド含有菌株
Ｅ．コリＬＥ３９２からプラスミドＤＮＡをＴ．マニア
チス及びその他（前記参照）により単離する。プラスミ
ドｐＧＰ１−２を含有するＥ．コリＫ３８を、ｐＧＰ１
−２の選択のためにカナマイシン５０μｇ／ｍｌを加え
たＬＢ培地中、３０℃で１６時間培養する。生長した培
養物からコンピテント細胞をＴ．Ｊ．シルヘイビー及び
その他の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇ
ｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８
４）により製造する。コンピテント細胞０．２ｍｌを単
離したＤＮＡ１μｌと混合し、氷上に４０分間放置し、
３７℃に５分間加熱し、ＬＢ培地２ｍｌと混合しかつ３
０℃で６０分間恒温保持する。５０〜２００μｌの部分
量をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０
μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−寒天プレート上に塗布す
る。プレートを３０℃で１６時間恒温保持する。

【００８４】ｂ） 誘発された製造及びｔｆｄＡ遺伝子
生成物の放射性標識 このようにして得られたアンピシリン−及びカナマイシ
ン耐性クローンはプラスミドｐＧＰ１−２及び組み換え
ｐＴ７誘導体の１つを含有する。これを、アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加
含有するＬＢ培地１０ｍｌ中、３０℃で培養する。５９
０ｎｍで測定した光学密度０．５で培養物０．２ｍｌを
遠心分離する。細胞をＭ９培地５ｍｌ中でＴ．マニアチ
ス及びその他（前記参照）により洗浄し、再び遠心分離
し、最後に、チアミン２０μｇ／ｍｌ並びにメチオニン
及びシスティン以外のすべてのプロテイノゲン（ｐｒｏ
ｔｅｉｎｏｇｅｎ）アミノ酸（全部で１８）各０．０１
％を含有するＭ９培地１ｍｌ中に懸濁させる。細胞懸濁
液を３０℃で６０分間振盪し、次に温度を４２℃に高め
る。１５分後に、リファンピシン溶液（メタノール中２
０ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを添加しかつバッチを更に４２
℃で１０分間放置する。その後、温度を再び３０℃に低
下させ、２０分後にバッチはＬ−（³⁵Ｓ）メチオニン
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ｃｅｌｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｇ
ｒａｄｅ）１０μＣｉを加えかつ室温で５分間放置す。
引続いて、細胞を遠心分離し、担持緩衝液（トリス−Ｈ
Ｃｌ ６０ｍＭ、ｐＨ６．８、ラウリル硫酸ナトリウム
１％、２−メルカプトエタノール１％、グリセリン１０
％、ブロムフェノールブルー０．０１％）１２０μｌ中
に懸濁し、かつ９５℃に３分間加熱する。

【００８５】ｃ） 特異的に放射性標識したｔｆｄＡ遺
伝子生成物の同定 このようにして得られた試料を１２．５％−ポリアクリ
ルアミドゲル［Ｕ．Ｋ．Ｌｅａｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ
２２７：６８０（１９７０）］上に負荷しかつ全細菌
性蛋白質を前記の文献公知の方法により電気泳動により
分離する。電気泳動の終結後、ゲルをセルバ・ブラウ
（ＳＥＲＶＡ Ｂｌａｕ）Ｇ２．５ｇ、メタノール４５
４ｍｌ、酢酸９２ｍｌ及び水４５４ｍｌからの混合物中
で３０分間着色させ、引続いてメタノール５０ｍｌ、酢
酸７５ｍｌ及び水８７５ｍｌからの混合物中で２４時間
脱色する。ゲルを濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭ）上で
市販のゲル乾燥機を用いて乾燥させ、引続いてＴ．マニ
アチス及びその他（前記参照）によりＸ線フィルム（Ｋ
ｏｄａｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｅｘ ＡＸ）でオートラジオ
グラフィを実施しかつフィルムを現像する。オートラジ
オグラム上に個々の標識蛋白質が、ｐＧＰ１−２と共に
プラスミドｐＴＪＳＳ′０３５、ｐＴＪＳ′Ｂ４３５、
ｐＴＪＳ′Ｘ５３５又はｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガの１
つを含有する菌株で同定される。これらのすべての相同
プラスミドには、クローン化フラグメントがＴ７−ＲＮ
Ａ−ポリメラーゼによりＳａｌＩ末端に転写されること
が共通している。逆向きの挿入断片を有するプラスミド
（ｐＴＪＳＳ′０３６、ｐＴＪＳ′Ｂ４３５及びｐＴＪ
Ｓ′Ｘ５３５）では特異的に標識された蛋白質は見出さ
れない。公知の大きさの標準蛋白質との比較により、標
識蛋白質の分子量が決定される。その際に、ｐＴＪＳ
Ｓ′０３５、ｐＴＪＳ′Ｂ４３５及びｐＴＪＳ′Ｘ５３
５により発現された遺伝子生成物に関しては分子量３２
０００が明らかであり、ｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガによ
り発現された遺伝子生成物に関しては分子量２９０００
が明らかである。

【００８６】 ｄ） 誘導された製造と、酵素活性の検出 前記で得られた、ｐＧＰ１−２並びにプラスミドｐＴＪ
ＳＳ′０３５、ｐＴＪＳ′Ｂ４３５、ｐＴＪＳ′Ｘ５３
５又はｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガの１つを含有するＥ．
コリＫ３８の菌株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び
カナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地中、３
０℃で培養する。５９０ｎｍの光学密度１．０で温度を
４２℃に高めかつ培養物を２５分間振盪させる。その
後、リファンピシン溶液（メタノール中２０ｍｇ／ｍ
ｌ）１００μｌを添加しかつ培養物を３７℃で２時間振
盪する。Ｅ．コリ中の２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ
の酵素活性の検出は、アミー（Ａｍｙ）及びその他［Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１２３７
（１９８５）］により記載された放射性酵素試験法によ
り次のように変更して行なう：誘導された２０ｍｌ培養
物の細胞を遠心処理により採取し、ＥＭ培地１０ｍｌで
洗浄し、再度遠心分離し、最後にＥＭ培地１０ｍｌ中に
懸濁させる。この細胞懸濁液を２５０ｍｌ−ワールブル
ク（Ｗａｒｂｕｒｇ）フラスコ中で形質転換緩衝液１０
ｍｌと混合し、未標識の２，４−Ｄ ２００μｇ及び
２，４−ジクロルフェノキシ（２−¹⁴Ｃ）酢酸（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ、５５ｍ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）０．１μＣｉを
加えかつ閉じたフラスコ中２１℃で４時間振盪させる。
引続いて、β−フェニルエチルアミン０．５ｍｌをワー
ルブルクフラスコの中央の容器中にピペット装入しかつ
１Ｍ−硫酸２ｍｌを細胞懸濁液中に注入する。２１℃で
１時間振盪後、β−フェニルエチルアミンを計数液体
（Ｚａｅｈｌｆｌｕｅｓｓｉｇｋｅｉｔ，ｒｏｔｉｓｚ
ｉｎｔ ２２，Ｒｏｔｈ）５ｍｌ中に採取し、かつ試料
の放射能をシンチレーションカウンタ中で測定する。ｐ
ＧＰ１−２と共にプラスミドｐＴＪＳＳ′０３５、ｐＴ
ＪＳ′Ｂ４３５又はｐＴＪＳ′Ｘ５３５の１つを含有す
るＥ．コリＫ３８菌株はこの試験で高い酵素活性を示す
が、プラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガを含有するも
のは酵素活性を発現しない。

【００８７】例１６：Ｍ１３中でクローン化されたＤＮ
Ａの塩基配列の決定 ａ） ＭＪＳＳ′０３０及びＭＪＳＳ′０３１から欠失
ファージの製造 組み換えファージの２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ−フ
ラグメントをサンジャー（Ｓａｎｇｅｒ）法により配列
するために［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７４：５４６３（１９７７）］、初めに文献公
知の方法［Ｇ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｇｅｎｅ ２８：３
５１（１９８４）］による調節欠失により、その都度２
００〜３００の塩基の重複配列により塩基配列全体を確
定するのを可能にする一連の種々の短いファージを製造
する。そのために、例１２で製造したファージＭＪＳ
Ｓ′０３０もしくはＭＪＳＳ′０３１を含有するＥ．コ
リＪＭ１０１の菌株から、ファージベクターＭ１３ｔｇ
１３０及びＭ１３ｔｇ１３１に関して記載した方法によ
り二本鎖ＤＮＡを単離する。ファージＭＪＳＳ′０３０
の二本鎖ＤＮＡ １０μｇを酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ
で切断し、ファージＭＪＳＳ′０３１の二本鎖ＤＮＡ
１０μｇを酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで切断する。制
限バッチをフェノールで抽出しかつ切断ＤＮＡをエタノ
ールで沈殿させる。引続いて行なうＤＮＡのエキソヌク
レアーゼＩＩＩ及びＳ１ヌクレアーゼによる消化、突出
したＤＮＡ末端のクレノウ充填及び連結は次のように変
更してヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）により記載された
方法により行なう：Ｓ１ヌクレアーゼの代りにムング・
ビーン・ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用する。Ｔ．Ｊ．
シルヘイビー及びその他の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎｓ．Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９８４）により製造したＥ．コリＪＭ１
０１［Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ及びその他、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．９：３０９（１９８１）］の部分量の
コンピテント細胞０．２ｍｌにそれぞれ連結バッチ２０
μｌを加え、氷上に４０分間放置し、４２℃に３分間加
熱し、溶融（４５℃）Ｈ−Ｔｏｐ−寒天（例１２）それ
ぞれ３ｍｌと混合しかつＨ．寒天−プレート（例１２）
上に注ぐ。プレートを３７℃で１６時間恒温保持する。

【００８８】ｂ） 欠失ファージの同定 Ｅ．コリＪＭ１０１をＴＹ培地（例１２）２ｍｌ中、３
７℃で１６時間培養する。この培養物１ｍｌをＴＹ培地
１００ｍｌで稀釈しかつ稀釈した細胞懸濁液各２ｍｌを
前記で得られた溶菌斑で感染させる。培養物を３７℃で
５時間振盪させ、その後遠心処理する。遠心処理の上澄
みから一本鎖ＤＮＡをアマーシャム［Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ，Ｍ１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９８４］により記載され
た方法により取得する。遠心分離した細胞からは二本鎖
ＤＮＡをＴ．マニアチス及びその他（前記参照）により
単離する。ＭＪＳＳ′０３０から由来する短いファージ
の二本鎖ＤＮＡをＢｇｌＩＩで、ＭＪＳＳ′０３１から
由来するファージのそれをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消
化する。引続いてＴ．マニアチス及びその他（前記参
照）により２％アガロースゲル上で断片を電気泳動によ
り分離することによってそれぞれの欠失の大きさを決定
する。

【００８９】ｃ） 一本鎖ＤＮＡの配列決定 前記で得られた短いファージの一本鎖ＤＮＡ並びに例１
２で製造したＭＪＳＳ′０３０及びＭＪＳＳ′０３１の
一本鎖ＤＮＡについて塩基配列を文献公知のジデオキシ
ヌクレオチド配列決定法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３（１９７７）］に
より決定する。その際に、アマーシャムによる方法［Ｍ
１３ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１０９４］で行なう。ＤＮＡフラ
グメントを分離するに当り、増加する厚さ０．１〜０．
４ｍｍの長さ５５ｃｍのゲルを使用する。同定された短
いファージのＤＮＡ配列をコンピュータプログラム
［Ｃ．Ｑｕｅｅｎ及びその他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１２：５８１（１９８４）］により重複領域
で、Ｍ１３ｔｇ１３０もしくはＭ１３ｔｇ１３１中でク
ローン化した挿入断片のＢａｍＨＩ制限サイトとＳａｌ
Ｉ制限サイトとの間に全断片を包含するＤＮＡ配列に接
合する。このようにして得られた両方の相補性ＤＮＡ鎖
の比較により塩基配列が確認される。

【００９０】ｄ） 配列決定されたＤＮＡの特性 前記のコンピュータプログラムにより、直接塩基配列か
ら明らかであるＤＮＡのすべての性質が確定する。その
中で最も重要なものとして挙げることができる：制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位の位置、遺伝子の可能なコ
ード付け領域としての転写解読わくの位置と長さ、一定
の塩基の頻度とその分布、及び一定の機能的なＤＮＡ配
列の出現。ＤＮＡ配列の分析は、転写解読わくを示し、
その位置、長さ及び転写方向は例１４及び１５に記載し
たｔｆｄＡ遺伝子の性質と一致する。解読わくは塩基番
号７４８のＧＴＧ開始コドンで開始しかつＴＡＧ終止コ
ドンの前塩基番号１６０８で終止し、従って塩基８６１
個の長さを有し、これはｔｆｄＡでコードした蛋白質の
長さ（例１５）と一致する。オメガフラグメントのｐＴ
ＪＳ′Ｘ５３５中へのクローン化が示すように（例１
１）、配列決定されたフラグメントの唯一のＢｇｌＩＩ
制限サイト中への転換−及び翻訳終止シグナルの挿入は
この転写解読わくを計算上７６８個の塩基に短かくし、
これはプラスミド−ｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガ（例１
５）による、短縮されかつ酵素的に不活性な遺伝子生成
物の発現と一致する。

【００９１】次の塩基配列は、塩基２０５８個のＢａｍ
ＨＩ／ＳａｌＩフラグメントの塩基配列を示し、このフ
ラグメント上で遺伝子ｔｆｄＡは５′末端から３′末端
に転写される。矢印はｔｆｄＡのコード付領域の開始と
終止を表わす。

【００９２】

【化１】

【００９３】

【化２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＪＰ４からクローン化した２１ｋｂのＨｉｎ
ｄＩＩＩフラグメント（例１）及びこれから誘導された
サブフラグメント（例３〜７）の由来及び制限地図、並
びに広範な宿主域を有するプラスミドによるアルカリゲ
ネス・オイトロフスＪＭＰ２２２中でのフェノキシ酢酸
分解の発現（例１４）を示す。矢印はプラスミドｐＪＰ
４中のｔｆｄＡの正確な位置を表示する。

【図２】ｐＫＴ２３１から誘導された、ｔｆｄＡ又はｔ
ｆｄＡの一部を含有するプラスミド（例３〜７）を示
す。細線はベクタープラスミドから由来する部分を表わ
し、太線はｐＪＰ４から由来する挿入断片を表わす。

【図３】ｐＫＴ２３１から誘導された、ｔｆｄＡ又はｔ
ｆｄＡの一部を含有するプラスミド（例３〜７）を示
す。細線はベクタープラスミドから由来する部分を表わ
し、太線はｐＪＰ４から由来する挿入断片を表わす。

【図４】ｐＫＴ２３１から誘導された、ｔｆｄＡ又はｔ
ｆｄＡの一部を含有するプラスミド（例３〜７）を示
す。細線はベクタープラスミドから由来する部分を表わ
し、太線はｐＪＰ４から由来する挿入断片を表わす。

【図５】Ｔ７−プロモータプラスミドｐＴ７−５及びｐ
Ｔ７−６から誘導された、ｔｆｄＡ含有挿入フラグメン
トを有するプラスミド（例８〜１１）を示す。細線はベ
クタープラスミドから由来する部分を表わし、太線はｐ
ＪＰ４から由来する挿入断片を表わす。

【図６】Ｔ７−プロモータプラスミドｐＴ７−５及びｐ
Ｔ７−６から誘導された、ｔｆｄＡ含有挿入フラグメン
トを有するプラスミド（例８〜１１）を示す。細線はベ
クタープラスミドから由来する部分を表わし、太線はｐ
ＪＰ４から由来する挿入断片を表わす。

【図７】Ｔ７−プロモータプラスミドｐＴ７−５及びｐ
Ｔ７−６から誘導された、ｔｆｄＡ含有挿入フラグメン
トを有するプラスミド（例８〜１１）を示す。細線はベ
クタープラスミドから由来する部分を表わし、太線はｐ
ＪＰ４から由来する挿入断片を表わす。

【図８】はプラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５中へのオネガ
フラグメントの挿入を示す（例１１）。

【図９】ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラム
上の、特異的に放射性標識した蛋白質を示し、これらの
蛋白質はｔｆｄＡを含有するプラスミドからＴ７−プロ
モータにより高収率で発現される（例１５）。１：ｐＴ
ＪＳＳ′０３５、２：ｐＴＪＳ′Ｂ４３５、３：ｐＴＪ
Ｓ′Ｘ５３５、４：ｐＴＪＳＳ′０３６、５：ｐＴＪ
Ｓ′Ｂ４３６、６：ｐＴＪＳ′Ｘ５３６。ａは完全標識
した全細胞蛋白質を表わし、ｂはＴ７−プロモータの誘
導後に特異的に標識した蛋白質を表わす。

【図１０】プラスミドｐＴＪＳ′Ｘ５３５ΩからＴ７−
プロモータにより発現された短縮されたｔｆｄＡ遺伝子
生成物（２ｂ）をｐＴＪＳ′Ｘ５３５から発現された短
縮されていない蛋白質（３ｂ）及び挿入断片を含まない
ベクタープラスミドｐＴ７−５（１ｂ）と比較して示
す。ａは完全に標識した全細胞蛋白質を表わし、ｂはＴ
７−プロモータの誘導後に特異的に標識した蛋白質を表
わす。

【符号の説明】

Ａｐ アンピシリン耐性 Ｋｍ カナマイシン耐性 ｋｂ キロベース Ｍ 分子量マーカー ｋＤ キロダルトン

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チミス， ケネス エヌ. スイス国 ＣＨ−1292 シヤンブフイ アヴエニユー ド ラ フオルタイユ ６ア (72)発明者 ツエンク， マインハルト ハー. ドイツ連邦共和国 8000 ミユンヘン 60 プフアイフエストルシユトラーセ 17 (56)参考文献 Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，145（２) （1981），Ｐ．681−686

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｔｆｄＡ−２，４−Ｄ−モノオキシゲナ
   ーゼ遺伝子突然変異体アルカリゲネス・オイトロフスＪ
   ＭＰ１３４：Ｔｎ５−２（ＤＳＭ３８４２）。
2. 【請求項２】 ｔｆｄＡ−２，４−Ｄ−モノオキシゲナ
   ーゼ遺伝子突然変異体アルカリゲネス・オイトロフスＪ
   ＭＰ１３４：Ｔｎ５−４（ＤＳＭ３８４３）。
3. 【請求項３】 ｔｆｄＡ−突然変異体アルカリゲネス・
   オイトロフスＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−２又はＪＭＰ１３
   ４：Ｔｎ５−４を使用することを特徴とするｔｆｄＡ遺
   伝子を含有するプラスミドの同定及び単離法。