JP2944094B2 - 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌 - Google Patents

細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細菌染色体上への遺伝子の組み込み方法
と、該方法によって得られる細菌に関する。
［従来の技術］ 細菌は、酵素やアミノ酸等有用な物質を種々生産する
ことが知られている。これらの物質は、多くの遺伝子や
代謝産物に制御を受けている複雑な生合成経路を経て合
成される。これら代謝産物の生産量は比較的少量であ
り、生産量増加のために代謝制御解除株の分離など様々
な方法が試みられてきた。近年特に環状プラスミドをベ
クターとして用い、目的とする遺伝子のコピー数を細菌
細胞質内で増幅し、遺伝子産物の増産や酵素活性の増加
による代謝産物の増産を図る方法が数多く報告されてい
る。しかしながら、これらの方法によって得られる細菌
細胞当りのコピー数は、ベクターの種類、挿入する遺伝
子の長さ、細胞内の生理学的条件に依り影響を受け変化
し易くまたベクターを菌体内に安定に保持するために培
地中に抗生物質を添加しなければならない例が多く見ら
れる。また染色体上に目的遺伝子を組み込み安定化させ
るためにインテグレーションベクターが構築され報告さ
れているが、コピー数の選択は困難である。
更に細菌の他の生物においてトランスポゾンをベクタ
ーとして用いた例がいくつか見られるが（US−Ａ−4670
388,EP−Ａ−0200708,EP−Ａ−0091723,Gene,42,185（1
986）,EMBO J.,４（４）891（1985）,Biotechnology,４
（５）,446（1986）、従来報告された方法において目的
遺伝子のコピー数を不必要に増幅することなく、必要と
されるコピー数だけ増幅し、かつ増幅した遺伝子を染色
体上に安定に維持させる方法については述べられていな
い。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、目的とする遺伝子を細菌染色体上に
組み込み、必要な数だけ増幅させ、かつこれらの遺伝子
のコピー数を安定に維持する方法を開発すること、及び
その方法によって目的物質を効率良く生産する微生物を
得ること、そしてそれによって目的物質の効率の良い生
産方法を見出すことにある。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は、上記問題点を解決するため研究の結
果、トランスポゾンを用いて目的とする遺伝子を細菌染
色体またはエピソーム上に組み込み、必要とするコピー
数だけ遺伝子を増幅した菌株を選択する方法、及び増幅
した遺伝子を安定に維持する方法を開発することに成功
した。そして本法を用いて蛋白質（β−ガラクトシダー
ゼ）をコードする遺伝子、またはアミノ酸（Ｌ−スレオ
ニン）生合成系遺伝子を染色体上に増幅させた細菌を分
離し、これらの細菌が培地中への抗生物質の添加無しに
導入された遺伝子を安定に保持し、かつ、蛋白質やアミ
ノ酸の高い生産性を有することを見出した。
本発明にいうトランスポゾンは、細菌DNAの任意の部
位に転移し得るものであればどのようなのでもよい。具
体的には、Tn3,Tn5,Tn7,Tn10,Tn903,TnHoHo,IS1,IS10,I
S50,Mud Iファージ及びMud IIファージ等が挙げられ
る。
このようなトランスポゾンのうち特にMudファージ（M
uファージの欠失体）類縁体（Mud IやMud II等）が本発
明においては最もましいものである。また目的の遺伝子
をより安定にDNA上に組み込むためには、用いるトラン
スポゾンが欠損トランスポゾン、すなわちそれ自身では
転移不可能なトランスポゾンを用いることが好ましい。
本発明においては、トランスポゼースを欠くトランスポ
ゾンが最も好ましいものであるが、トランスアクティン
グなトランスポゼースが通常の条件下で抑制または不活
性化されているトランスポゾンも用いることができる。
本発明にいう細菌は、上述のトランスポゾンが転移可
能なものであればどのようなものでもよく、次のような
細菌が例としてあげられる。
Enterobacteriaceae;Escherichia coli，Cirobacter
freundii，Erwinia herbicola，Erwinia chrysanthem
i，Salmonella typhimurium，Shigella sonnei，Entero
bacter cloacae，Serratia marcescens等。
Rhizobiaceae;Agrobacterium tumefaciens等。
Pseudomonas ;Pseudomonas putida等。
本発明にいう目的遺伝子とは、通常使用するトランス
ポゾン内に存在しない遺伝子、または用いる宿主細菌内
に存在しない遺伝子をいう。目的遺伝子には、動物、植
物、細菌由来遺伝子及び合成遺伝子で宿主細菌内で発現
可能なクローン化遺伝子、融合遺伝子及び遺伝子断片が
含まれる。目的遺伝子の具体例としては、ペプチド、蛋
白合成遺伝子や、アミノ酸生合成系遺伝子などがあげら
れる。これらの遺伝子を１個ないし複数個トランスポゾ
ン内に挿入することが可能である。
目的遺伝子をトランスポゾン内に挿入するためには通
常用いられる遺伝子工学の手法が適用できるが、トラン
スポゾンを含むプラスミドを用いる方法がより容易であ
る。プラスミド上のトランスポゾンは欠失や変異により
欠損トランスポゾンに変えうる。トランスポゾンを含む
プラスミドはこれを保有する細菌より単離され、トラン
スポゾン内部で転移に必須な領域以外を切断する適当な
制限酵素により切断される。この切断部位に同じ制限酵
素切断末端を持つ目的遺伝子を連結する。
あるいは切断されたプラスミド及び目的遺伝子断片の
それぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドを接続せしめて、次いで両者のライゲーション
反応を行なう。この際、npt遺伝子やlacZ遺伝子のよう
なレポーター遺伝子を同時に挿入すれば目的遺伝子の転
移の検出がより容易に行える。挿入される遺伝子の個数
は１ないし複数個で、１種類ないし複数種の遺伝子の導
入が可能である。
トランスポゾンとしてMuファージを用いる場合はMud
ファージを含むプラスミドを用いる方法がより容易であ
る。Mudファージを含むプラスミドを構築する方法は、M
uｃts及びMudファージをクロモゾール上に保有する菌株
を宿主として用い、本菌株を適当なプラスミドを用いて
形質転換する。形質転換株を適当な培地で培養後37℃〜
45℃にて熱処理を行い溶菌液を得る。本溶菌液を用い
て、rec+ 株を感染させ、用いたプラスミドの形質及びMu
dファージの形質を利用してMudファージが転移したプラ
スミドを保有する菌株を選択する。Muｃts及びMudファ
ージを含む菌株と例としては、PO II1734（Castilho et
al.,J.Bacteriol.,158,488（1984））,PO II1681（同
上）、MC4100（Muｃts）（MudIIPR13）,MC4100（Muｃt
s）（Mud II PR3）（P.Ratet et al.,Gene,63,41（198
8））等があげられる。用いるプラスミドは宿主菌内で
増幅可能なものであればどのようなものでもよい。プラ
スミドが抗生物質耐性遺伝子を保有していれば目的プラ
スミドの選択がより容易に行える。Mudファージを含む
プラスミドに目的遺伝子を挿入する方法は、前述のトラ
ンスポゾンを含むプラスミドの場合と同じ方法が適用さ
れる。
構築されたキメラトランスポゾンを宿主菌に導入する
方法は従来用いられているトランスフォーメーション、
トランスダクション、コンジュゲーション等の方法が用
いられる。キメラMudファージを用いる場合は、これを
含むプラスミドを用いてMuｃtsライソジェンを形質転換
し、形質転換株を適当な培地で培養後37℃〜45℃の熱処
理を行う。得られた溶菌液を目的の菌株に感染させれ
ば、Mudが染色体に組み込まれた（インテグレートし
た）菌株（Mudライソジェン）が得られる（ミニミュー
ダクション）。本ライソジェンは本発明の目的のために
は、同時にMuｃtsファージのライソジェンでないことが
好ましい。またこのとき得られるMuｃtsとMudのダブル
ライソジェンを用いて溶菌液を調製し、ミニミューダク
ションに用いればより効率よくMudライソジェンが得ら
れる。Muｃtsライソジェンの例としては、MC4100（Muｃ
ts）やJM109（Muｃts）（P.Ratet et al.,Gene,42,185
（1986））等があげられる。以上の方法でキメラMudフ
ァージを導入する際にキメラMudの増幅が起こり得る
が、下記の方法で増幅を行なう方がより効率よく行え
る。
上述のようにして細胞内に導入されたキメラトランス
ポゾンは、そのトランスポゼースの発現がリプレッサー
により抑制されているか欠損トランスポゾンである場
合、細胞内で安定に維持される。
キメラトランスポゾンは、さらに以下に述べる方法に
よって細胞内のDNA上で転移増幅させ、目的遺伝子の活
性を増幅することができる。すなわちトランスポゼース
の発現がリプレッサーにより抑制されている場合は、リ
プレッサーを不活性化することによりトランスポゼース
の発現を誘導し、トランスポゾンを転移増幅させること
ができる。リプレッサーの不活性化は例えば温度感受性
のリプレッサーを用いれば培養温度の変化によって不活
性化を行うことができる。欠損トランスポゾンすなわち
トランスポゼースを持たないトランスポゾンを用いた場
合は、トランスアクティングなトランスポゼース遺伝子
を保有するプラスミドやファージを菌体内に導入しトラ
ンスポゼースを発現相補すればよい。
キメラMudファージの場合は、それを保有する菌株を
Ａ又はＡかつＢ遺伝子（Muファージ由来）を保有するプ
ラスミドで形質転換するかMuファージを感染させれば、
Mudファージが転移増幅した菌株が得られる。
異った発現形質を有する複数種のキメラトランスポゾ
ンも上述の方法で同時に、または個別に導入、転移増幅
させ、同一菌体内のDNA上に同時に存在させることが可
能である。
これらトランスポゾンが転移増幅するDNAは、染色体
やエピソームなど菌体内で安定に維持されるDNAであれ
ばどのようなものでもよい。
キメラトランスポゾンの転移増幅後のコピー数は、挿
入した遺伝子の発現の程度によって選択できる。抗生物
質耐性遺伝子や発色反応を利用できる遺伝子（例えばla
cZ）などが組み込まれていればより容易に選択が行え
る。抗生物質耐性遺伝子の場合は、例えば種々の濃度の
抗生物質を含むプレートに増幅処理後の菌液をスプレッ
ドすることにより種々のコピー数のキメラトランスポゾ
ンが転移増幅した菌株が選択できる。lacZ遺伝子の場合
は、Ｘ−Gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド）をプレートに添加しておき
処理菌液をスプレッドすれば、コロニーの発色（青色）
の程度により増幅コピー数の多少を知ることができる。
キメラトランスポゾンの菌体内におけるコピー機は、通
常の方法例えばサザンアナリシスより測定できる。
増幅したキメラトランスポゾンを安定に維持するため
には、トランスポゼース遺伝子の発現を抑えるか、トラ
ンスポゼースを不活性化するかあるいはトランスポゼー
スが菌体内に存在しないようにすればよい。すなわち増
幅処理の際使用したプラスミドやファージを菌体内から
除去、あるいは熱処理を解除すればよい。プラスミドや
ファージの除去された菌株を得るためには特別の処理を
必要としない。このようにして得られた菌株のキメラト
ランスポゾンは安定に保持されるが、より安定に保持す
るためには、トランスポゼース遺伝子を持たないトラン
スポゾンを用いてキメラトランスポゾンを構築すること
が望ましい。キメラMudファージを用いた場合は、増幅
後宿主菌にDNAポリメラーゼＩ、５′−３′エキソヌク
レアーゼあるいはHU遺伝子欠損などの性質を付与すれば
より安定に維持される。
このようにして得られた目的遺伝子産物の生産能を有
する細菌を培養して目的物質を生成蓄積せしめる方法
は、従来実施されてきた方法で行われるが、従来のよう
に目的遺伝子の菌体内安定維持のため抗生物質等を培地
中に添加する必要が無い点が大きく異なる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必
要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有
する通常のものを使用できる。炭素源としては、グルコ
ース、シュークロース、ラクトース等及びこれらを含有
する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒
素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。培養は好気手条件下で培
地のpHおよび温度を適宜調整しつつ、実質的に目的産物
の生産蓄積が停止するまで行われる。アミノ酸や蛋白質
等の生産には、宿主菌として目的産物の生産性のより高
い株を選べばより高い生産性が得られる。
実施例１lac 遺伝子の増幅によるβ−ガラクトシダーゼ生産菌の
育種 （１）欠損トランスポゾンにクローン化されたβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を１コピー染色体上に有する菌株の
育種 Mud II1734（第１図参照）とMuｃts（Gastilho et a
l.,J.Bacteriol.,158,488（1984））をクロモゾーム上
に保有するE.coli PO II1734株（同上文献）を2mのL
B培地にて30℃で２時間培養したのち45℃、15分間の熱
処理を行い、更に37℃にて２時間培養を続け溶菌液を得
た。本溶菌液にクロロホルムを数滴加えよく混合後遠心
し、上澄をファージ溶液として用いた。
E.coli MC4100株（Casadaban,M.J.,J.Mol.Biol.,10
4,541（1976））をLB培地にて一晩培養後、最終濃度が
それぞれ1mM,2.5mMとなるようにCaCl2とMgSO4を添加し
た。本溶液20μと上記ファージ溶液50μを混合し15
分間室温で放置した後2mのLB培地を加え、30℃で２時
間培養を続けた。培養終了後菌液を20μg/mのカナマ
イシン（Km）と10mMのＸ−Galを含むLB培地にスプレッ
ドし、30℃で24時間培養し出現してくる白色コロニーを
釣り上げた。これらのコロニーの中からMu感受性菌を指
標菌とするレプリカ法でMuｃtsを保有しない菌株MC4100
（Mud II1734）を選択した。本菌株より染色体DNAを抽
出し、サザンアナリシスにより染色体上に１コピーのMu
d II1734が存在することを確認した（データ示さず）。
また本菌株はβ−ガラクトシダーゼを生産しないことか
ら、Mud II1734は染色体上でプロモータ下流に組み込ま
れていないと考えられた。
（２）プラスミド上へのMuファージ由来トランスポゼー
スA,B遺伝子のクローニング（Ａはトランスポゼースを
コードする遺伝子、Ｂはトランスポゼースと共存して転
移頻度を上昇させる蛋白をコードする遺伝子であるが便
宜上以下AB両者をトランスポゼース遺伝子と称する。） pBR322上にMud II1681（Castilho et al.,J.Bacterio
l.,158,488（1984））が転移したプラスミドよりE coR
I断片及びB gl II断片を除去したプラスミドpAB8155を
調製後、E coRI とE coR Vにて切断しトランスポゼース
A,B遺伝子を含む断片（8.3kb）をアガロースゲル電気泳
動により単離精製した。本DNA断片をS ma I及びE coR I
で切断したpUC19にT4 DNAリガーゼを用いて連結しpPR30
を得た（第２図参照）。
CaCl2処理（Mandel and Higa,J.Mol.Biol.,53,159（1
970））で得たMC4100（Mud II1734）のコンピテント細
胞をpPR30を用いて形質転換しトランスフォーマントMC4
100（Mud II1734）/pPR30を得た。MC4100（Mud II173
4）/pPR30をLB培地にて30℃で２時間培養後、20μg/m
のKm、25μg/mのアンピシリン（Amp）及び10μg/m
のＸ−Galを含むLBプレートにスプレッドした。30℃で4
8時間培養し出現してきたコロニーのうち各種濃淡のブ
ルーコロニーを釣り上げた。各コロニーを20μg/mのK
mを含むLBプレートでシングルコロニーに分離しpPR30を
脱落させるため同培地で数回植継いだ後、それぞれのク
ローンより染色体DNAを調製した。染色体DNAをE coR I
にて切断した後、ラジオアイソトープでラベルしたpCE1
134（第４図参照）をプローブとしてサザンアナリシス
を行った。その結果各クローンに数コピーのMud II1734
の転移が認められた。その一例（AM1株）を第３図のレ
ーンｆに示す。４本のバンドが２コピーのMud II1734に
相当している。
（３）転移したMud II1734の安定性 ２コピーのMud II1734を染色体上に持つAM1株を、Km
を含まないLB培地で170世代培養した後シングルコロニ
ーに分離した。このうち５コロニーより染色体DNAを調
製し、上記（２）と同様の方法でサザンアナリシスを行
った。その結果各クローンとも２コピーのMud II1734を
維持し、またハイブリダイゼーションのパターンに変化
が見られないことから（第３図、レーンａ−ｅ参照）転
移したMud II1734の安定性が示された。
（４）β−ガラクトシダーゼの生産 MC4100（Mud II1734）株及びAM1株をLB培地にて一夜
培養し、集菌、洗浄の後細胞を0.05Mのリン酸バッファ
ーに懸濁し超音波破砕機で細胞を破壊した。細胞破砕液
を遠心し（15000rpm,20分）、上澄を細胞抽出液として
β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。その結果MC4100
（Mud II1734）及びAM1にそれぞれ７×1011及び10nmole
/min/mg proteinの酵素活性が見出された。
実施例２ 遺伝子増幅によるＬ−スレオニン生産菌の育種とＬ−ス
レオニンの製造 （１）pCE1134の構築 E.coli PO II1734株（Castilho et al.J.Bacterio
l.,158,488（1984））をCaCl2法（Mandel M.and Higa
A.,J.Mol.Biol.,53,159（1970））にてコンピテント化
しpCE100（2.1kb,Cmr,第４図参照）を用いて形質転換し
た。処理菌液をクロラムフェニコール（Cm）25μg/m
含有LBプレート培地上にスプレッドし、30℃で24時間培
養後出現してきたコロニーを釣り上げトランスフォーマ
ントPO II1734/pCE100を得た。PO II1734/pCE100を3m
のLB培地で30℃にて２時間培養した後、45℃、15分間の
熱処理を行い更に37℃にて２時間培養を続けた。得られ
た溶菌液にクロロホルムを数滴加え、よく混合した後遠
心して（10000rpm,10分）上澄をファージ溶液Ｉとし
た。
E.coli M8820（Mu）株（Castilho et al.,J.Bacteri
ol.,158,488,1984））をLB培地で一晩培養したのち、Ca
Cl2及びMgSO4をそれぞれ1mM及び2.5mMとなるように添加
した。本菌液200μにファージ溶液Ｉを50μ加え、
室温にて15分放置した後2mのLB培地を加えて30℃で２
時間培養を行った。培養後菌液を20μg/mのKmと25μg
/mのCmを含むLBプレート培地にスプレッドし、30℃で
24時間培養後出現してくるコロニーを釣り上げた。20コ
ロニーよりミニプレップ法（Birnboim and Doly,Nuclei
c Acids Res.,７,1513（1979））にてプラスミドを抽出
し、適当な制限酵素を用いてリストリクションサイトを
決定し、すべてのプラスミドにMud II1734が転移してい
ることを確認した。この内の１つをpCE1134と名付けた
（第４図参照）。
（２）thrオペロンを含むMudファージ、MudAM9の構築 pCE1134をB amH I及びS al Iにて切断し、アガロース
電気泳動でMud遺伝子を含むDNAフラグメントを抽出し
た。一方、pAJ294（Miwa,K.et al.,Agric.Blol.Chem.,4
7,2329（1983））をB amH I及びS al Iで切断しthrオペ
ロンを含むDNAフラグメントをアガロースゲル電気泳動
で抽出した。両フラグメントをT4 DNAリガーゼを用いて
10℃で16時間連結反応させた後、E.coil thrB株（E.col
iジェネティックストックセンターより入手（CGSC＃507
6））を本ライゲーション溶液を用いて形質転換した。2
5μg/mのCm、20μg/mのKm、１μg/mのサイアミン
を含みＬ−スレオニンを含まない最小培地でトランスフ
ォーマントを選択し、ミニプレップ法でプラスミドを抽
出後種々の制限酵素で制限部位を解析し、npt遺伝子、t
hrオペロン及びMud両末端を含むプラスミドpAM9（第５
図）を保有するトランスフォーマントを選出した。
（３）MudAM9の染色体上への転移 E.coli JM109（Muｃts）株（Yanisch−Perron et a
l.,Gene,33,103−119（1985））をpAM9を用いてCaCl2処
理法にて形質転換し、トランスフォーマントをKm及びCm
をそれぞれ20μg/m及び25μg/m含むLBプレートにて
選択した。20クローンよりプラスミドを抽出し、それぞ
れpAM9であることを確認した。トランスフォーマントJM
109（Muｃts）/pAM9をLB培地にて30℃で２時間培養した
後、45℃、15分間の熱処理を加え更に37℃にて２時間培
養を続けた。得られた溶菌液に数滴のクロロホルムを加
えよく混合した後室温にて15分間放置し、続いて5000rp
m,10分の遠心で得られた上澄液をファージ溶液IIとし
た。JM109（Muｃts）をLB培地を用いて30℃にて一晩培
養した。本培養液にCaCl2とMgSO4を最終濃度がそれぞれ
1mM及び2.5mMとなるように添加した後、本溶液200μ
と50μのファージ溶液IIを混合し室温に15分間放置し
た。2mのLB培地を加え30℃で２時間培養後、Kmを20μ
g/m含むLB培地にスプレッドした。30℃にて24時間培
養の後出現したコロニーより100コロニーをピックアッ
プし、それ等のCm感受性を調べた。コロニーの95％がCm
感受性であり、JM109（Muｃts）（MudAM9）であるとを
認めた。
JM109（Muｃts）（MudAM9）をLB培地を用いて30℃に
て２時間培養し、45℃、15分間の熱処理を加えた。その
後37℃にて２時間培養を続け得られた溶菌液にクロロホ
ルム数滴を加えよく混合した。5000rpm、10分間の遠心
にて得られた上澄液をファージ溶液IIIとした。
E.coli AJ11332株（Shiio et al.,Agric.,Biol.,Che
m.,33,1152（1969））をLB培地を用いて一晩培養し、Ca
Cl2とMgSO4を最終濃度がそれぞれ1mM及び2.5mMとなるよ
うに添加した。本溶液200μに50μのファージ溶液I
IIを添加し、室温にて15分間放置した。2mのLB培地を
添加した後30℃にて２時間培養を続け、得られた培養液
を20μg/mのKmを含むLBプレートにスプレッドした。3
0℃にて24時間培養を続け、出現してきたコロニーより1
00コロニーをピックアップしそれ等のMuファージ感受性
及び45℃における溶菌性を調べた。その結果、85％のコ
ロニーが溶菌せずかつMu感受性であった。これらのうち
の１クローンをEL1001株とした。
（４）宿主染色体におけるMudAM9の増幅とコピー数の決
定 （ｉ） pPR30によるMudAM9の増幅 EL1001株をpPR30を用いて形質転換し、トランスフォ
ーマントを25μg/mのAmp及び200−400μg/mのKmか
つ／またはNmを含むLBプレートにスプレッドした。
（ii）Muｃts溶菌液を用いたMudAM9の増幅 JM109（Muｃts）をLB培地で30℃にて２時間培養し、4
5℃、15分間の熱処理を行った後更に37℃にて２時間培
養を続けた。得られた溶菌液にクロロホルム数滴を加え
混合した後、5000rpmで10分間遠心しファージ溶液を得
た。LB培地を用いて一晩培養したEL1001株の培養液にCa
Cl2とMgSO4を最終濃度がそれぞれ1mM及び2.5mMとなるよ
うに添加しした後、本溶液200μと50μの上記ファ
ージ溶液を混合し室温にて15分間放置した。2mのLB培
地を加えて30℃で２時間培養を続けた後200−400μg/m
のKmかつ／またはNmを含むLBプレートにスプレッドし
た。30℃で48時間培養後出現したコロニーをピックアッ
プし、（ｉ）の場合はpPR30の脱落したクローンを、（i
i）の場合はMuｃtsが溶原化いていないクローンを更に
選択した。染色体上のMudAM9のコピー数をサザンアナリ
シス法にて測定した。以下得られたクローンのうち特に
EL1002と1003について詳細に述べる。AJ11332、EL100
1、EL1002及びEL1003株より通常の方法で染色体DNAを調
製した。制限酵素E coR IでDNAを切断後、0.8％アガロ
ースを用いて電気泳動を行い続いてDNSをニトロセルロ
ースフィルター上にブロットした。pAM9のE coR Iフラ
グメントのうち4.3kbのフラグメントをラジオアイソト
ープでラベルしプローブとして用いハイブリダイゼーシ
ョンを行った。結果を第６図に示した。レーンA,B,C及
びＤはAJ11332,EL1001,EL1002及びEL1003にそれぞれ相
当する。
小文字「ａ」は元菌株由来のthrオペロンに相当し、
「ｂ」はカラムB,C及びＤに見られる非特異的なフラグ
メントに相当する。数字は染色体上に転移増幅したMudA
M9の数に相当する。本結果より、EL1001,EL1002及びEL1
003はそれぞれ少なくとも1,4及び10コピーのMudAM9を染
色体に保有することが示唆された。MuDAM9のコピー数と
それを保有する菌株の薬剤耐性度を表Ｉに示した。
（５）MudAM9保有菌株によるＬ−スレオニンの生産 上記のようにして得られた菌株をLBプレート上で30℃
にて24時間培養した後、20mの生産培地を入れたフラ
スコにシードし、30℃にて72時間振盪培養を行った。培
養ブロス中のＬ−スレオニン蓄積量はアミノ酸アナライ
ザーを用いて測定した。結果を表IIに、生産培地の組成
を以下に示す。
生産培地組成；グルコース;30g/，（NH4）2SO4;10g
/,KH2PO4;1g/,MgSO4・7H2O;1g/,FeSO4・7H2O;10m
g/,MnSO4・４−6H2O;10mg/,L−Met;0.1g/,L−Il
e;0.1g/;L−Pro;0.45g/,RNA;2g/,Thiamine−HCl;
1mg/,CaCO3;40g/,pH＝7.5 （６）MudAM9保有株におけるＬ−スレオニン生産性の安
定性 少なくとも４コピーのMudAM9を保有するEL1002株を抗
生物質を含まないLBプレート培地上で植え継ぎ、各植え
継ぎの後（５）で述べたのと同様の方法でＬ−スレオニ
ン生産性を調べた。結果を表IIIに示した。
（７）MudAM9保有株におけるＬ−スレオニン生合成系酵
素活性 MudAM9を保有する各種菌株を最小培地で培養し、P.T.
Bachi等の方法（Method in Enzymolozy,17,694（197
0））でアスパルトキナーゼ（AK I）活性を、同じくP.
T.Bach等の方法（Biochimi.,Biophys.,Acta.,128,450
（1966））でホモセリンデヒドロゲナーゼ（HDH I）活
性を測定した。結果を表IVに示した。
EL1002は抗生物質を含まないLBプレート上で植え継い
だ。
実施例３ 温度で誘導可能なトランスポゼース遺伝子を有するプラ
スミドを用いたMudファージの増幅 （１）温度誘導可能なトランスポゼース遺伝子を有する
プラスミドの構築 PO II1681株（Castilho et al.,J.Bacteriol.,158,48
8（1984））をCaCl2で処理でコンピテント化（Mandel a
nd Higa,J,Mol.,Biol.,53,159（1970））した後、プラ
スミドpEV11（第７図）を用いて形質転換し、20μg/m
のAmpと20μg/mのKmを含むLBプレートを用いてトラン
スフォーマントを選択した。トランスフォーマント、PO
II1681/pEV11を3mのLB培地を用いて30℃で２時間培
養した後、45℃、15分間の熱処理を行い続いて37℃で２
時間培養を続け、ファージ溶菌液を得た。クロロホルム
を数滴添加した後よく混合し、遠心して上澄液を得、フ
ァージ溶液とした。
E.coli M8820株（Castilho et al.,J.Bacteriol.,15
8,488（1984））をLB培地にて一晩培養し、CaCl2とMgSO
4を最終濃度がそれぞれ1mMおよび2.5mMとなるように添
加した。本溶液200μと上述のファージ溶液50μを
混合し、室温で15分放置した後LB培地を2m加えて30℃
で２時間培養を続けた。この菌液を20μg/mのKmと20
μg/mのAmpを含むLBプレートにスプレッドし、30℃で
24時間培養後、出現してきたコロニーのうち20コロニー
を釣り上げ、ミニプレップ法にてプラスミドを抽出し、
制限酵素を用いて制限部位を解析した。すべてのクロー
ンがMud II1681の転移したpEV11を持つことが確認さ
れ、このうちの１クローンをpMC1（第７図）とした。pM
C1をB gl IIとB amH Iで切断し、B amH Iで切断したpRC
100（実施例２参照）と連結しMC1060を形質転換した。
トランスフォーマントを25μg/mのCmと20μg/mのAm
pを含むLBプレートで選択し、30コロニーよりプラスミ
ドを抽出して解析した。これらのうちの一つをpMC23と
した（第７図）。
（２）pMC23を用いたMudファージの増幅 MudAM9が転移増幅した菌株、EL1001（実施例２参照）
をCaCl2法で処理しコンピテント化した後pMC23で形質転
換した。トランスフォーマントは25μg/mのCmと20μg
/mのAmpを含むLB培地で選択した。トランスフォーマ
ントEL1001/pMC23を25μg/mのCmと20μg/mのAmpを
含むLB培地で30℃にて２時間培養後、45℃、15分間の熱
処理を加えた。本菌液1mにLB培地を同量加え、30℃で
２時間培養を続けた後、400μg/mのKmとNmを含むLB培
地にスプレッドし30℃で培養した。48時間後出現してき
たコロニーのうち50コロニーを釣り上げCm感受性とＬ−
スレオニンの生産性を調べた。その結果60％が親株以上
のＬ−スレオニンを生産し、またそのうちの50％がCm感
受性であった。２クローンを選び染色体上のMudAM9のコ
ピー数をサザンハイブリダイゼーション法で測定した。
すなわち、染色体DNAをHind IIIで切断後アガロースゲ
ルを用いて泳動しナイロンメンブレン上にブロットし
た。thrオペロンを含むpAM9（実施例２参照）のS al I
−B amH I断片をスルフォネーションでラベルし（ケミ
プローブキットPBS Organics社使用）プローブとして使
用した。MudAM9のコピー数およびＬ−スレオニン蓄積量
の結果を表Ｖに示す。またサザンハイブリダイゼーショ
ンの結果を第８図に示した。
実施例４ 同一細胞染色体上における２種類のMudの転移増幅 （１）MC4100（Muｃts）（Mud II PR13）株よりMud II
PR13ライゼートの調製 MC4100（Muｃts）（Mud II PR13）株（Ｐ・Ratei et
al.,Gene,63,41（1988））をLB培地にて30℃で２時間培
養した後、45℃、15分間の熱処理を加え更に37℃で２時
間培養を続けた。本溶菌液に数滴のクロロホルムを添加
混合し、5000rpmで10分間遠心してその上澄液をファー
ジ溶液IVとした。
（２）Mud II PR13のEL1001およびEL1003株染色体上へ
の転移 EL1001株をLB培地で一晩培養した後、最終濃度がそれ
ぞれ1mMおよび2.5mMとなるようにCaCl2とMgSO4を添加し
た。本溶液200μと50μのファージ溶液IVを混合
し、15分間室温にて放置した後2mのLB培地を加えて30
℃で２時間培養を続けた。この菌液を25μg/mのCmと2
0μg/mのKmを含むLBプレートにスプレッドし、30℃培
養を続け出現してきたコロニーのうち50を釣り上げ45℃
における溶菌性とMuファージ感受性を調べた。その結果
80％のコロニーが溶菌せずかつMu感受性であった。この
うちの１クローンをEL1004とした。EL1003株も上述の方
法で処理した。その結果90％のコロニーが45℃で溶菌せ
ずかつMu感受性であった。クローンの一つをEL1005とし
た。
（３）EL1004およびEL1005株におけるMud II PR13の増
幅 実施例２で述べたのと同様の方法でEL1004株をJM109
（Muｃts）より調製したMuｃtsライゼートを用いて感染
させた。得られた菌液を20μg/mのKmと400μg/mのC
mを含むLB培地にスプレッドし、30℃で48時間培養して
出現してくるコロニーのうち50を釣り上げ45℃における
溶菌性とMu感受性を調べた。その結果84％のコロニーが
溶菌せずかつMu感受性であった。これらのうちの１クロ
ーンをEL1006とした。EL1005株も同様に処理し、その結
果82％のコロニーが45℃で溶菌せずかつMu感受性であっ
た。クローンの一つをEL1007とした。
染色体DNAをAJ11332,EL1004,EL1005,EL1006及びEL100
7より調製し、それぞれをE coR Iで切断した。Hind III
で切断したpRC100をプローブとしてサザンアナリシスを
行なった（ケミプローブキット使用）。ハイブリダイゼ
ーションの結果を第９図に示す。カラムＡのすべてのフ
ラグメントはプローブpRC100とAJ11332株のDNA間のハイ
ブダイゼーションによるものである。これらのパターン
は他の株でも同様に見られる。カラムC,D,FおよびＧに
おいてそれぞれ1,4,1および３本のMud II PR13に相当す
るフラグメントが見られる。
実施例５Erwinia chrysanthemi におけるMudの転移と増幅 （１）Mudライゼートの調製 Mud II1734やMudAM9のライゼート調製のために以下の
菌株を用いた。
PO II1734（Castilho et al.,J.Bacteriol.,158,488
（1984）） JM109（Muｃts）（MudAM9）（実施例２参照） それぞれのMudライゼートを実施例２で述べたのと同
様の方法で調製した。
（２）各MudのErwinia chrysanthemi染色体上への転移 Erwinia chrysanthemi384551（M.Chippaux,CNRS Mars
eille）を受容菌とし、上記２種のライゼートを用いてM
udの導入（ミニミューダクション）を実施例２と同様の
方法で行った。20μg/mのKmを含むLB培地上に出現し
たコロニーを釣り上げ45℃における溶菌性とMu感受性を
調べた。その結果Mud II1734を用いた場合は70％、MudA
M9を用いた場合は80％のコロニーが45℃で溶菌せずまた
Mu感受性であった。E.chrysanthemi384551（Mud II173
4）をEL3003,E.chrysanthemi384551（MudAM9）をEL304
とした。
（３）Mud II1734およびMudAM9の増幅 Muｃtsライゼートを用いてEL3003およびEL3004のMud
の増幅を実施例２と同様の方法を用いて行った。増幅株
の選択にはKmとNmをそれぞれ400μg/m含むLB培地を用
いた。プレート上に現れたコロニーよりそれぞれ50コロ
ニーを釣り上げ、45℃で溶菌せず、Mu感受性のコロニー
を選択した。EL3003由来の増幅株をEL3007,EL3004由来
の増幅株をEL3008とした。
（４）各菌株の染色体DNA上のMudのコピー数 各菌株より染色体DNAをE.coliの場合と同様の方法
（クリアードライゼート調製に用いるSarcosineをSDSに
変更した点だけ異なる）で調製した。各染色体DNAをE c
oR Iで切断し、下記のプローブを用いてサザンアナリシ
スを行った。サザンアナリシスにはケミプローブキット
を使用した。
Mud II1734用プローブ;Mud左端部分を含むDNA（pAM9のE
coR I−Hind III断片） MudAM9用プローブ：thrオペロンを含むDNA（pAM9のS al
I−B amH I断片） 結果を表IV、第10図および第11図に示した。
実施例６ 複数の遺伝子を保有するMudの増幅 （１）thrオペロンとasd遺伝子を有するMudAM11の構築 プラスミドpAD20（Haziza et al.,EMBO J.,３,379（1
982））をB amH Iにて切断し、アガロース電気泳動にて
asd遺伝子を含む1.7kbのDNAフラグメントを抽出した。
一方pAM9（実施例２参照）をB amH Iで切断し、上記asd
フラグメントと連結反応を行った（T4 DNAリガーゼで10
℃にて16時間反応）。Asd-株、JCP203（C.Printz,perso
nal communication）をコンピテント化し、上記ライケ
ーション溶液を用いて形質転換を行った。トランスフォ
ーマントを20μg/mのKmと25μg/mのCmを含むLBプレ
ートで選択し、プラスミドを抽出後制限酵素で切断解析
し、asdフラグメントを含むpAM9,pAM11（第12図），を
保有する菌株を選出した。
（２）染色体DNA上へのMudAM11の転移 プラスミドpAM11を用いてE.coli JM109（Muｃts）
（実施例２参照）を形質転換し、JM109（Muｃts）/pAM1
1を得た。本菌株をLB培地で30℃で２時間培養し、45
℃、15分間の熱処理を加えた後、更に37℃で２時間培養
を続け溶菌液を得た。クロロホルム数滴を添加しよく混
合した後、5000rpmで10分間遠心し上澄液をファージ溶
液II−AM11として得た。
LB培地を用いてJM109（Muｃts）を30℃で一晩培養
し、本菌液に最終濃度がそれぞれ1mMおよび2.5mMとなる
ようにCaCl2とMgSO4を添加した。本液200μとファー
ジ溶液II−AM11 50μを混合し室温に15分間放置した
後、2mのLB培地を添加して30℃で２時間培養した。本
菌液を20μg/mのKmを含むLBプレートにスプレッド
し、30℃で24時間培養後出現してきたコロニーより100
コロニーを釣り上げCm感受性を調べた。85％のコロニー
がCm感受性でありJM109（Muｃts）（MudAM11）であるこ
とを確認した。LB培地にてJM109（Muｃts）（MudAM11）
を30℃で２時間培養し、45℃、15分間の熱処理を加えた
後、更に37℃で２時間培養を続け溶菌液を得た。クロロ
ホルム数滴を添加しよく混合した後、5000rpmで10分間
遠心し上澄液をファージ溶液III−AM11として得た。
E.coli AJ11332（λ+,Pro-）（実施例２参照）をP1
ファージを用いて形質転換し、AJ11332（λ+,Pro+）を
得た。本株よりλ非溶原化株を選択し（C.Morel,私信）
EL1016（λ-,Pro+）株を得た。本菌株をLB培地で一晩培
養した後最終濃度がそれぞれ1mMおよび2.5mMとなるよう
にCaCl2とMgSO4を添加した。
本菌液200μとファージ溶液III−AM11 50μを混
合し室温で15分間放置した後、2mのLB培地を添加して
30℃で２時間培養を続けた。この菌液を20μg/mのKm
を含むLB培地にスプレッドし、30℃で２時間培養した後
出現してきたコロニーからMu感受性を示すコロニーを選
択しEL1012とした。
（３）MudAM11の増幅とコピー数の測定 Muｃtsライゼートを用いてEL1012染色体上のMudAM11
の増幅を実施例２と同様の方法を用いて行った。増幅株
の選択は250μg/m−1200μg/mのKmとNmをそれぞれ
含むLBプレートで行いこのうちの一株をEL1013とした。
染色体DNAをEL1016,EL1012およびEL1013より調製し、
S al IまたはE coR Iで切断した。アガロースゲルを用
いて電気泳動を行いサザンブロッティングを行った。２
種類のプローブDNAを用いてハイブリダイゼーションを
行った（ケミプローブキット使用）（第13−16図）。各
図においてレーンA,BおよびＣはそれぞれEL1016,EL1012
およびEL1013に相当する。小文字「ａ」は菌株由来のth
rオペロン（図13と14）とasd遺伝子（図15と16）に相当
し、数字は転移したMudAM11に対応するフラグメントで
ある。第13図はS al Iで切断した染色体DNAとnpt，thr
A，thrBおよびthrC′を含むDNAプローブ（pAM9のE coR
I−Hind IIIフラグメント）を用いたハイブリダイゼー
ションパターンである。数字を付したフラグメント２本
が1MudAM11に相当する。第14図はE coR Iで切断した染
色体DNAと上記プローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンパターンである。数字を付したフラグメント１本が1M
udAM11に相当する。第15図はS al Iで切断した染色体DN
Aとasdを含むDNAプローブ（pAM11のB amH I−B amH Iフ
ラグメント）を用いたハイブリダイゼーションパターン
である。数字のフラグメント１本が1MudAM11に相当す
る。第16図はE coR Iで切断した染色体DNAと上記asdフ
ラグメントを用いたハイブリダイゼーションパターンで
ある。数字のフラグメント１本が1MudAM11に相当する。
これらの結果よりEL1012とEL1013はそれぞれ少なくとも
１および５コピーのMudAM11を有することが示唆され
た。
（４）EL1012およびEL1013株の薬剤耐性度、Ｌ−スレオ
ニン生産性および酵素活性 表VIIに各菌株の抗生物質耐性度および感受性度を示
す。表VIIIには実施例２と同様にして測定したＬ−スレ
オニン生産性を示した。また表IXにはアスパルトカイネ
ース（AK I）活性およびアスパルテートセミアルデヒド
デヒドロゲナーゼ（ASD）活性（Hegeman,G.D.et al.,Me
thods in Enzymology,17,708（1970））を示した。
実施例７E.coli 由来aspA遺伝子の増幅とＬ−アスパルテートアン
モニアリアーゼの生産 （１）asp A遺伝子を有するMudAB9の構築 プラスミドpPR3（P.Ratet et al.,Gene,63,41（198
8））をP st Iで切断した後T4 DNAリガーゼを用いて再
度連結し、cat遺伝子がpPR3と逆向きに挿入されたプラ
スミドpPR3（第17図）を得た。プラスミドpGS94（Guest
et al.,J.Gen.Microbiol.,130,1271（1984））をC la
IおよびS al Iで切断しaspA遺伝子を含む3.4kbのDNAフ
ラグメントを得た。一方MubPC3を有するプラスミドpPC3
をS al IおよびC la Iで切断しMudPC3を含む5.3kbのDNA
断片を得た。上記２フラグメントをT4 DNAリガーゼを用
いて22℃で１時間連結反応を行った。本ライゲーション
溶液を用いてコンピテント化したMC1060（Casadaban et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,76,4530（1979））を形
質転換し、20μg/mのAmpと25μg/mのCmを含むLBプ
レートでトランスフォーマントを選択した。27クローン
のトランスフォーマントより更にKm感受性のクローンを
17選択した。これら17株のアスパルテートアンモニアリ
アーゼー（AspA）活性（Spencer et al.,J.Gen.Microbi
ol.,97,73（1976））を測定しコントロール株より高いA
spA活性を示す株を１株得た。本菌株よりプラスミドを
抽出し各種制限酵素で制限地図を解析した結果、aspA遺
伝子断片とMudを含むプラスミド、pAB9であることを確
認した（第17図）。
（２）MudAB9の染色体上への転移 JM109（Muｃts）株（実施例２参照）をpAB9を用いて
形質転換しJM109（Muｃts）/pAB9を得た。本株をLB培地
にて30℃で２時間培養した後、45℃、15分間の熱処理を
加え更に37℃で２時間培養を続けた。得られた溶菌液に
クロロホルム数滴を加えよく混合した後、5000rpmで10
分間遠心し、得られた上澄液をファージ溶液II−AB9と
した。
LB培地にて30℃で一晩培養したJM109（Muｃts）の培
養液に最終濃度がそれぞれ1mMおよび2.5mMとなるように
CaCl2とMgSO4を添加した。本液200μとファージ溶液I
I−AB9 50μを混合し室温に15分間放置した後2mのL
B培地を加えて30℃で２時間培養を続けた。培養液を25
μg/mのCmを含むLBプレートにスプレッドし、30℃で2
4時間培養した後出現してくるコロニーより100コロニー
を釣り上げた。これらのコロニーよりAmp感受性株を選
択しJM109（Muｃts）（MudAB9）とした。本株よりJM109
（Muｃts）/pAB9の場合と同様にしてファージ溶液を調
製しIII−AB9とした。
E.coli MC4100（Casadaban et al.,J.Mol.Biol.,10
4,541（1976））をLB培地で一晩培養した後、最終濃度
がそれぞれ1mMおよび2.5mMとなるようにCaCl2とMgSO4を
添加し、本溶液200μとファージ溶液III−AB9 50μ
を混合した。室温で15分間放置した後、2mのLB培地を
加えて30℃で２時間培養を続けた。培養液を25μg/m
のCmを含むLBプレートにスプレッドし、30℃で24時間培
養して出現したコロニーよりMu感受性株を選びEL1010と
した。
（３）MudAB9の増幅とコピー数 Muｃtsライゼートを用いてEL1010株のMudAB9を実施例
２と同様の方法で増幅させた。増幅株の選択には500μg
/mのCmを含むLBプレートを用いEL1011を選出した。MC
4100,EL1010およびEL1011より染色体DNAを調製しS al I
で切断後アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、続い
てナイロンメンブレンフィルターヘブロットしサザンア
ナリシスを行った。pGS94をプローブDNAとしケミプロー
ブキットを用いてハイブリダイゼーションを行った（第
18図）。第18図においてレーンA,BおよびＣはそれぞれM
C4100,EL1010およびEL1011に相当する。小文字「ａ」は
菌株由来のaspAフラグメントに相当し、数字を付したフ
ラグメントは転移したMudAB9に相当する。１フラグメン
トがMudAB9に相当する。この結果EL1010およびEL1011に
はそれぞれ少なくとも１および４コピーのMudAB9が存在
することが示唆された。
表Ｘに各菌株のMudAB9のコピー数、Cm耐性度、Cm感受
性度およびAsd活性を示した。
実施例８ １回の溶原化操作によるMudの複数転移 （１）MuｃStおよびMudライゼートによるAJ11332株の感
染 E.coli JM109（Muｃts）（MudAM9）株より実施例２と
同様の方法で溶菌液を調製しファージ溶液IIIを得た。L
B培地を用いてAJ11332（実施例２参照）を一晩培養しこ
の培養液に最終濃度がそれぞれ1mMおよび2.5mMとなるよ
うにCaC２とMgSO4を添加した。本液200μとファー
シ溶液III50μを混合し15分間放置した後、2mのLB
培地を添加して30℃で２時間培養を続けた。本溶液を25
0μg/mのKmとNmをそれぞれ含むLB培地にスプレッド
し、30℃で24時間培養した後出現してきたコロニー２個
を釣り上げた。両コロニーとも45℃で溶菌せず、Mu感受
性であった。これらのコロニーをEL1014およびEL1015と
した。
（２）MudAM9のコピー数とＬ−スレオニンの生産性 各菌株に含まれるMudAM9のコピー数をサザンアナリシ
ス法で測定した。両株より染色体DNAを調製しHind III
で切断した後ナイロンメンブレンフィルターヘブロット
した。thrオペロンを含むDNA断片（pAM9のS al I−B am
H I断片）をプローブとしケミプローブキットを用いて
サザンハイブリダイゼーションを行った。結果を第19図
に示す。図においてレーンA,BおよびＣはそれぞれAJ113
32,EL1014およびEL1015に相当する。小文字「ｏ」は菌
株由来のthrオペロンに相当し、数字はMudAM9に相当す
るフラグメントである。１フラグメントが1MudAM9に相
当する。Ｌ−スレオニンの生産性を実施例２と同様の方
法で測定した。結果を表XIに示した。この結果EL1014お
よびEL1015にはそれぞれ３および２コピーのMudAM9が含
まれることが示唆された。
実施例９ Mudファージの醗酵過程における位置安定性とコピー数
の安定性 EL1003株（λ+,Pro-）をP1ファージを用いた形質転換
によりPro+とし、続いてλファージの非溶原化株を選択
した（C.Morel,Personal communication）。本菌株をEL
1017（λ-,Pro+）とした。EL1017（EL1003株由来のMudA
M9を少なくとも10コピー含む）を用いて醗酵前と終了後
の菌株におけるMudファージの安定性を調べた。全容21
のミニジャーファーメンターに1.5の生産培地（実施
例２参照）を張り込み30℃で48時間醗酵を続けた。醗酵
終了後ブロスよりコロニーを単離しEL1017−a,−b,−ｃ
および−ｄとした。EL1016（実施例６参照）、EL1017お
よび４クローンより染色体DNAを調製し、Hind IIIで切
断後アガロースを用いて泳動しナイロンメンブレンフィ
ルターにブロットした。npt II,thr A，thrBおよびthr
C′を含むDNAフラグメント（pAM9のE coR I−Hind III
フラグメント）をプローブとしケミプローブキットを用
いてハイブリダイゼーションを行った（第20図）。レー
ンA,B,C,D,EおよびＦはそれぞれEL1016,EL1017,EL1017
−a,EL1017−b,EL1017−ｃおよびEL1017−ｄに相当す
る。小文字「ａ」は菌株由来のthrオペロンに相当し、
数字はMudAM9に相当する。１フラグメントが1MudAM9に
相当する。この結果よりEL1017およびそれから単離され
たクローンは同一のハイブリダイゼーションパターンを
有し転移増幅したMudAM9の位置およびコピー数の安定性
が示された。
以下の菌株はパスツール研究所（Collection Nnation
ale de Cultures de Microorganismes,Imstitut Pasteu
r,25 rue du Docteur−Roux,Paris（15th））に1988年
１月25日付にてブタペスト条約に基づき国際寄託され
た。
Escherichia coli K12 PO II1681受託番号 No.I−72
7 Escherichia coli K12 PO II1734受託番号 No.I−72
8 Escherichia coli K12 EL1001 受託番号 No.I729 Escherichia coli K12 EL1002 受託番号 No.I−730 Escherichia coli K12 EL1003 受託番号 No.I−731
【図面の簡単な説明】
添付の図面はそれぞれ下記を示す図または写真である。 第１図:Mud II1734の制限酵素地図 第２図:pBR322（Mud II1681）とpPR30の構築と制限酵素
地図 第３図:Mud II1734転移増幅株のハイブリダイゼーショ
ンパターンのＸ線写真 レーンａ−e:AM1株を170世代植え継ぎ後単離したクロー
ン レーンf:AM1株 ２本のフラグメントが1Mud II1734に相当する。 第４図:pCE1134の構築と制限酵素地図 第５図:pAM9の構築と制限酵素地図 第６図:AJ11332,EL1001,EL1002およびEL1003のハイブリ
ダイゼーションパターンのＸ線写真 レーンA:AJ11322,レーンB:EL1001,レーンC:EL1002,レー
ンD:EL1003 a:菌株由来のthrオペロン b:非特異的フラグメント 数字:MudAM9に相当するフラグメント;1本のフラグメン
トが1MudAM9に相当する。 第７図:pEV11,pMC1およびpMC23の構築 第８図:AJ11332,EL1008およびEL1009のサザンハイブリ
ダイゼーションパターンを示すＸ線写真 レーンA:AJ11332,レーンB:EL1008,レーンC:EL1009 o:菌株由来thrオペロン 数字:MudAM9に相当するフラグメント;1本のフラグメン
トが1MudAM9に相当する。 第９図:Mud II PR13転移株のサザンハイブリダイゼーシ
ョンパターン レーンA,B,C,D,E,FおよびＧはそれぞれAJ11332,EL1001,
EL1004,EL1006,EL1003,EL1005およびEL1007に相当す
る。 o:転移したMud II PR13のE coR I断片のうち共通のフラ
グメント 数字:Mud II PR13に相当するフラグメント;1フラグメン
トが1Mud II PR13に相当する レーンＡにおけるすべてのフラグメントはAJ11332とプ
ローブ;pRC100のハイブリダイゼーションによる。レー
ンＣ−Ｄにおいても同様のパターンが見られる。 第10図:Mud II1734転移株のハイブリダイゼーションパ
ターン レーンA,BおよびＣはそれぞれＥ．chrysanthemi384551,
EL3003およびEL3007に相当する。 数字はMud II1734に相当するフラグメントで１フラグメ
ントが1Mud II1734に相当する。 第11図:MudAM9転移株のハイブリダイゼーションパター
ン レーンA,BおよびＣはそれぞれＥ．chrysanthemi384551,
EL3004およびEL3008に相当する。 b:非特異的なフラグメント 数字:MudAM9に相当するフラグメント;1フラグメントが1
MudAM9に相当する。 第12図:pAM11の構築を示す図である。 第13図乃至第16図： MudAM11転移株のサザンハイブリダイゼーションパター
ン レーンA,BおよびＣはそれぞれEL1016,EL1012およびEL10
13に相当する。 a:菌株由来thrオペロン（第13図、第14図）およびasd遺
伝子（第15図、第16図）。 p:部分消化DNA由来のフラグメント 数字:MudAM11に相当するフラグメント;1フラグメントが
1MudAM11に相当（第14,15,16図）または２フラグメント
が1MudAM11に相当する（第13図）。 第17図:pAB9の構築を示す図である。 第18図:MudAB9転移株のハイブリダイゼーションパター
ン レーンA,BおよびＣはそれぞれMC4100,EL1010およびEL10
11に相当する。 a:菌株由来aspA遺伝子 数字:MudAB9に相当するフラグメント;1フラグメントが1
MudAB9に相当する。 第19図:MudAM9転移株のサザンハイブリダイゼーション
パターン レーンA,BおよびＣはそれぞれAJ11322,EL1014およびEL1
015に相当する。 o:菌株由来thrオペロン 数字:MudAM9に相当するフラグメント;1フラグメントが1
MudAM9に相当する。 第20図:MudAM9転移株のサザンハイブリダイゼーション
パターン a:菌株由来thrオペロン 数字:MudAM9に相当するフラグメント;1フラグメントが1
MudAM9に相当する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブルノー・ジヤリー フランス国、75017・パリ、ブルバー ド・ペレー、96 (72)発明者 滝波 弘一 フランス国、92290・シヤトネ・マラブ リ、リユー・キヤミー・ペルトン、16 (56)参考文献 Ｇｅｎｅ Ｖｏｌ．42（1986）ｐｐ. 185−192 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ ｌ．４（1986）ｐｐ．446−449 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．４（1985）ｐｐ．891−898 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，Ｖｏｌ．48（1984）ｐｐ．2233− 2237 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/90 C12P 21/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）トランスポゼース遺伝子が欠損して
    いるかその発現が抑制されているトランスポゾンを、ト
    ランスポゾンの上記トランスポゼースを相補することが
    できるプラスミド又はファージと共に、形質転換すべき
    宿主細菌に導入し、トランスポゾンは上記トランスポゼ
    ースが相補されたときにその転移増幅機能が回復されか
    つ下記目的遺伝子がトランスポゾンと共に転移されるよ
    うにして目的遺伝子が挿入されているものであり、およ
    び （ｂ）次いで、上記トランスポゼースと相補することが
    できるプラスミドまたはファージを上記宿主細菌にさら
    に導入し、それによってトランポゾンが上記細菌細胞内
    にて転移増幅される、 ことを少くとも含む細菌の製造方法。
  2. 【請求項２】トランスポゾンがバクテリオファージ中に
    挿入されている特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】トランスポゾンがプラスミド中に挿入され
    ている特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】トランスポゾンがTn3、Tn5、Tn7、Tn10,Tn
    903、IS1、IS10、IS50もしくはMuファージであるかまた
    はその誘導体である特許請求の範囲第１ないし３項に記
    載の方法。
  5. 【請求項５】トランスポゾンがMud IファージまたはMud
    IIファージである特許請求の範囲第１ないし４項に記
    載の方法。
  6. 【請求項６】トランスポゼースを相補することができる
    プラスミド又はファージがMuctsファージである特許請
    求の範囲第１ないし５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】トランスポゼースの相補をトランスポゼー
    ス発現の抑制により停止させることをさらに含む特許請
    求の範囲第１ないし５項に記載の方法。
  8. 【請求項８】トランスポゼース発現の抑制が温度環境の
    制御によりなされる特許請求の範囲第７項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】トランスポゼースの発現がリプレッサーに
    より調節されている特許請求の範囲第１ないし５項に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】宿主細菌が腸内細菌科またはリゾビウム
    属のいずれかに属する細菌である特許請求の範囲第１項
    ないし９項のいずれかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】宿主細菌がEscherichia属,Citrobacter
    属,Erwinia属,Salmonella属,Shigella属,Enterobacter
    属,Serratia属,Agrobacterium属またはPseudomonas属か
    ら選ばれる特許請求の範囲第１ないし９項のいずれかに
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】宿主細菌がEscherichia coliである特許
    請求の範囲第10または11項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】トランスポゾンの増幅数をトランスポゾ
    ン内のマーカー遺伝子の発現程度により測定することを
    含む特許請求の範囲第１ないし12項のいずれかに記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子で
    ある特許請求の範囲第13項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】マーカー遺伝子が発色マーカー遺伝子で
    ある特許請求の範囲第13項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】発色マーカー遺伝子がラクトースオペロ
    ンである特許請求の範囲第15項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】目的遺伝子がＬ−スレオニン生合成経路
    の１またはそれ以上の遺伝子がある特許請求の範囲第１
    ないし15項のいずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】目的遺伝子が宿主細菌の染色体上に複数
    コピー組み込まれている特許請求の範囲第１ないし17項
    のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】複数コピーが３以上である特許請求の範
    囲第18項に記載の方法。
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