WO2020085511A1 - タンパク質の分泌生産法 - Google Patents

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吉彦 松田
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味の素株式会社
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    • C12Y207/13003—Histidine kinase (2.7.13.3)
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21089—Signal peptidase I (3.4.21.89)
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    • C12Y305/01044—Protein-glutamine glutaminase (3.5.1.44)
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    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
    • C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)

Definitions

  • the present invention relates to a method for secretory production of a heterologous protein.
  • a method for secreting and producing a heterologous protein for example, a method using a microorganism such as coryneform bacterium as an expression host is known.
  • a signal peptide also referred to as “signal sequence” can be used. That is, a heterologous protein can be efficiently secreted and produced by expressing a heterologous protein by fusing a signal peptide corresponding to the protein secretory pathway of the host to the N-terminus.
  • the general protein secretion pathway is a pathway called the Sec system that exists widely from prokaryotes to eukaryotes.
  • the Sec system In secretory production of a heterologous protein by a coryneform bacterium using the Sec system, for example, by inserting an amino acid sequence containing Gln-Glu-Thr or Ala-Glu-Thr between the signal peptide and the heterologous protein, the heterologous protein is inserted. Secretory production can be improved.
  • Non-patent document 1 a protein secretion pathway completely different from the Sec system has been found in the thylakoid membrane of chloroplasts of plant cells.
  • This novel secretory pathway is named as Tat system (Twin-Arginine Translocation system) because the arginine-arginine sequence is commonly present in the signal peptides of proteins secreted by it (Non-patent document 1).
  • Tat system Twin-Arginine Translocation system
  • the signal peptide is generally cleaved from the protein by signal peptidase at the C-terminus when the protein is secreted outside the cell.
  • signal peptidase in the secretory production of a protein, there may be a problem that the signal peptide is not cleaved and the protein accumulates in cells. In that case, it is known that protein secretion efficiency can be enhanced by highly expressing a signal peptidase such as LepB protein (Patent Documents 3 to 8 and Non-Patent Documents 3 to 7).
  • the protein is secreted outside the cell while retaining the partial sequence at the C-terminal side of the signal peptide because the signal peptide is cleaved inside the signal peptide rather than at the C-terminal.
  • the present inventors In the secretory production of a heterologous protein using a TorA signal peptide by a coryneform bacterium, the present inventors have not cleaved the TorA signal peptide at the correct position and left off 15 residues at the C-terminal side (mis-cleavage). Have been found to occur. It is an object of the present invention to develop a novel technique for reducing the uncut residue of TorA signal peptide and to provide an efficient method for secretory production of a heterologous protein using a TorA signal peptide by a coryneform bacterium.
  • the present inventors as a result of intensive studies to solve the above problems, by modifying the coryneform bacterium so that the activity of the LepB protein is increased, the heterologous protein utilizing the TorA signal peptide by the bacterium.
  • the present invention has been completed by finding that the truncation of the TorA signal peptide can be reduced during secretory production.
  • a method for producing a heterologous protein comprising: Culturing a coryneform bacterium having a genetic construct for secretory expression of a heterologous protein, and recovering the secreted and produced heterologous protein,
  • the coryneform bacterium has been modified so that the activity of the LepB protein is increased as compared to the unmodified strain
  • the gene construct comprises, in the 5 ′ to 3 ′ direction, a promoter sequence that functions in a coryneform bacterium, a nucleic acid sequence that encodes a TorA signal peptide, and a nucleic acid sequence that encodes a heterologous protein,
  • the method wherein the heterologous protein is expressed as a fusion protein with the TorA signal peptide.
  • LepB protein is the protein described in (a), (b), or (c) below:
  • A a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • B The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 contains an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, and / or addition of 1 to 10 amino acid residues, and has signal peptidase activity for the TorA signal peptide protein;
  • C A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having a signal peptidase activity against a TorA signal peptide.
  • TorA signal peptide is the peptide described in (a), (b), or (c) below: (A) a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46; (B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, which contains an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, and / or addition of 1 to 3 amino acid residues, and has a function as a Tat-dependent signal peptide.
  • the TorA signal peptide consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46.
  • the secreted and produced heterologous protein is a heterologous protein in which the TorA signal peptide is completely removed.
  • the coryneform bacterium is further modified to carry a phoS gene encoding a mutant PhoS protein.
  • the method, wherein the mutation is a mutation in the wild-type PhoS protein in which the amino acid residue corresponding to the tryptophan residue at position 302 of SEQ ID NO: 29 is replaced with an amino acid residue other than an aromatic amino acid and histidine.
  • the amino acid residue other than the aromatic amino acid and histidine is a lysine residue, alanine residue, valine residue, serine residue, cysteine residue, methionine residue, aspartic acid residue, or asparagine residue, Method.
  • coryneform bacterium is further modified so that expression of one or more genes selected from genes encoding Tat-based secretory apparatus is increased as compared to an unmodified strain.
  • the gene encoding the Tat-type secretory apparatus comprises a tatA gene, a tatB gene, a tatC gene and a tatE gene.
  • the coryneform bacterium is a bacterium of the genus Corynebacterium.
  • coryneform bacterium is Corynebacterium glutamicum.
  • coryneform bacterium is a modified strain derived from Corynebacterium glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) or a modified strain derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13869.
  • the coryneform bacterium is a coryneform bacterium in which the number of molecules of cell surface protein per cell is reduced as compared with the unmodified strain.
  • the figure which shows the structure of a vector The photograph which shows the result of SDS-PAGE when PTG (transglutaminase with a pro structure part) fused with TorA signal peptide was expressed in C. glutamicum YDK010 :: phoS (W302C) strain and its lepB gene expression-enhancing strain. The amino acid sequence in the figure is shown in SEQ ID NO: 54.
  • the amino acid sequence in the figure is shown in SEQ ID NO: 55. Photographs showing the results of SDS-PAGE when Bla ( ⁇ -lactamase) fused with a TorA signal peptide was expressed in the C. glutamicum YDK010 :: phoS (W302C) strain and its lepB gene expression-enhancing strain. The amino acid sequence in the figure is shown in SEQ ID NO: 56. The photograph which shows the result of SDS-PAGE when Trx (thioredoxin) which fused the TorA signal peptide was expressed in C.glutamicumYDK010 :: phoS (W302C) strain and its lepB gene expression enhancement strain. The amino acid sequence in the figure is shown in SEQ ID NO: 57.
  • the amino acid sequences in the figure are shown in SEQ ID NOs: 58 and 59.
  • the amino acid sequence in the figure is shown in SEQ ID NO: 54.
  • the method of the present invention is a method for producing a heterologous protein, which comprises culturing a coryneform bacterium having a gene construct for secretory expression of the heterologous protein, and recovering the secreted and produced heterologous protein.
  • Type bacterium has been modified to increase the activity of the LepB protein, and the TorA signal peptide is used for secretory production of a heterologous protein.
  • the “heterologous protein” secreted and produced by the method of the present invention refers to a completely truncated heterologous protein, unless otherwise specified.
  • the “completely cleaved heterologous protein” refers to a heterologous protein in which the TorA signal peptide has been completely removed, that is, has no TorA signal peptide.
  • Coryneform bacterium used in the method of the present invention is a coryneform bacterium having a gene construct for secretory expression of a heterologous protein, and having an activity of LepB protein. It is a coryneform bacterium modified to increase.
  • the coryneform bacterium used in the method of the present invention is also referred to as "the bacterium of the present invention” or "the coryneform bacterium of the present invention”.
  • the gene construct for secretory expression of a heterologous protein possessed by the bacterium of the present invention is also referred to as “gene construct used in the present invention”.
  • the bacterium of the present invention or the strain used for constructing the bacterium is also referred to as "host”.
  • Coryneform bacterium capable of secreting and producing a heterologous protein has a capability of secreting and producing a heterologous protein (specifically, a completely cleaved heterologous protein).
  • the coryneform bacterium of the present invention has the ability to secrete and produce a heterologous protein, at least depending on having a gene construct for secretory expression of the heterologous protein (gene construct used in the present invention).
  • the coryneform bacterium of the present invention is specifically heterologous by having a gene construct for secretory expression of a heterologous protein, or by having a gene construct for secretory expression of a heterologous protein in combination with other properties. It may have the ability to secrete a protein.
  • secretion of a protein means that the protein is transferred outside the bacterial cell (extracellular).
  • the outside of the bacterial cell (extracellular) include the medium and the surface layer of the bacterial cell. That is, the secreted protein molecule may be present in the medium, may be present in the cell surface layer, or may be present in both the medium and the cell surface layer, for example. That is, the term "secretion" of a protein is not limited to the case where all the molecules of the protein are finally completely free in the medium. For example, all the molecules of the protein are present on the cell surface. And the case where some molecules of the protein are present in the medium and the rest of the molecules are present on the cell surface.
  • the “ability to secrete and produce a heterologous protein” means that when the bacterium of the present invention is cultured in a medium, the heterologous protein is secreted into the medium and / or the cell surface layer, Alternatively, it refers to the ability to accumulate to the extent that it can be recovered from the cell surface.
  • the accumulated amount is, for example, 10 ⁇ g / L or more, more preferably 1 mg / L or more, particularly preferably 100 mg / L or more, further preferably 1 mg / L or more, as the accumulated amount in the medium.
  • the accumulated amount for example, as the accumulated amount on the bacterial cell surface, when the heterologous protein on the bacterial cell surface is recovered and suspended in the same amount of liquid as the medium, the concentration of the heterologous protein in the suspension is preferably The amount may be 10 ⁇ g / L or more, more preferably 1 mg / L or more, and particularly preferably 100 mg / L or more.
  • the “protein” secreted and produced in the present invention is a concept that also includes a mode called a peptide such as an oligopeptide or a polypeptide.
  • heterologous protein refers to a protein that is exogenous to a coryneform bacterium that expresses and secretes the protein.
  • the heterologous protein may be, for example, a protein derived from a microorganism, a protein derived from a plant, a protein derived from an animal, a protein derived from a virus, or an artificial protein. It may be a protein whose amino acid sequence has been designed.
  • the heterologous protein may in particular be a protein of human origin.
  • the heterologous protein may be a monomeric protein or a multimeric protein.
  • a multimeric protein refers to a protein that can exist as a multimer composed of two or more subunits.
  • each subunit may be linked by a covalent bond such as a disulfide bond, may be linked by a non-covalent bond such as a hydrogen bond or a hydrophobic interaction, or may be linked by a combination thereof. May be.
  • the multimer contains one or more intermolecular disulfide bonds.
  • a multimer may be a homomultimer consisting of a single type of subunit or a heteromultimer consisting of two or more types of subunits.
  • the multimeric protein is a heteromultimer, at least one subunit among the subunits forming the multimer may be a heterologous protein. That is, all subunits may be of different origin, or only some of the subunits may be of different origin.
  • the heterologous protein may be a naturally secreted protein or a naturally non-secreted protein, but is preferably a naturally secreted protein. Further, the heterologous protein may be a secretory protein that naturally depends on the Tat system, or may be a secretory protein that naturally depends on the Sec system. Specific examples of “heterologous protein” will be described later.
  • the heterologous protein produced may be only one type, or may be two or more types.
  • the heterologous protein is a heteromultimer, only one kind of subunit may be produced, or two or more kinds of subunits may be produced.
  • secreting and producing a heterologous protein means that secretory production of all of the subunits constituting the target heterologous protein, as well as secretory production of only a part of the subunits. Is also included.
  • Coryneform bacteria are aerobic gram-positive bacilli.
  • Examples of coryneform bacteria include bacteria of the genus Corynebacterium, bacteria of the genus Brevibacterium, and bacteria of the genus Microbacterium.
  • the advantage of using a coryneform bacterium is that compared to filamentous fungi, yeast, Bacillus genus bacteria, etc., which have been conventionally used for secretory production of heterologous proteins, the proteins originally secreted outside the cells are extremely small, and It can be expected to simplify or simplify the purification process when secreted and secreted, and it grows well in a simple medium containing sugar, ammonia, inorganic salts, etc., and is excellent in medium cost, culture method, and culture productivity. And so on.
  • coryneform bacterium include the following species. Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium crenatum Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) Brevibacterium album Brevibacterium
  • coryneform bacterium include the following strains. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium crenatum AS1.542 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020 Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
  • Corynebacterium genus bacteria were previously classified into the genus Brevibacterium, but bacteria currently integrated into the genus Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)) included.
  • Corynebacterium stationis also includes bacteria that were previously classified as Corynebacterium ammoniagenes, but were reclassified as Corynebacterium stationis by 16S rRNA nucleotide sequence analysis (Int. .Syst. Evol.Microbiol., 60, 874-879 (2010)).
  • strains can be subdivided from, for example, the American Type Culture Collection (Address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O.BoxBox 1549, Manassas, VA 20108, UnitedStates of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and the distribution number can be used for distribution (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is listed in the American Type Culture Collection catalog. In addition, these strains can be obtained, for example, from the depository in which each strain has been deposited.
  • C.glutamicum AJ12036 (FERM BP-734), which was isolated as a streptomycin (Sm) -resistant mutant from the wild strain C.glutamicum ATCC 13869, is a gene that controls the function of protein secretion compared to its parent strain (wild strain). It is predicted that there is a mutation in the protein, and the secretory production ability of the protein is extremely high, about 2 to 3 times as much as the accumulated amount under the optimal culture conditions, and it is suitable as a host bacterium (WO2002 / 081694).
  • the AJ12036 was developed on March 26, 1984 by the Institute of Microbial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (now the Incorporated Administrative Agency, Product Evaluation Technology Platform Organization, Patent Biological Deposit Center, ZIP code: 292-0818, address: Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. It was originally deposited as an international deposit in Kazusa Kama feet 2-5-8 room 120) and has been given the deposit number FERMBP-734.
  • Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERMBP-1539) is the Institute of Microbial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (now the Independent Administrative Agency Product Evaluation Technology Infrastructure Organization, Patent Biological Deposit Center, ZIP code: 292- 0818, address: 2-5-8, Kazusa, Kamasa, Kisarazu, Chiba, Japan, room 120), which was originally deposited as an international deposit, and is given the deposit number FERMBP-1539.
  • Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205) is the Institute of Microbial Science and Technology, Institute of Industrial Science and Technology (now the Independent Administrative Agency, Product Evaluation Technology Platform Organization, Patent Biological Deposit Center, Zip code: 292-) on December 24, 1988. 0818, address: 2-5-8, Kazusa, Kamasa, Kazusa, Chiba Prefecture, Japan, Room No. 120), which was originally deposited as an international deposit, and has been given the deposit number FERMBP-2205.
  • the above-mentioned coryneform bacterium may be used as a parent strain to select a strain having an increased protein secretory production capacity by using a mutation method or a gene recombination method and used as a host.
  • a mutation method or a gene recombination method for example, it is possible to select a strain having enhanced secretory productivity of a protein after being subjected to ultraviolet irradiation or treatment with a chemical mutagen such as N-methyl-N′-nitrosoguanidine.
  • a strain modified so as not to produce a cell surface protein from such a strain because the heterologous protein secreted in the medium or on the cell surface layer can be easily purified.
  • modification can be carried out by introducing a mutation into the coding region of the cell surface protein on the chromosome or its expression control region by a mutation method or a gene recombination method.
  • coryneform bacteria modified so as not to produce cell surface protein include C.glutamicum YJK010 strain (WO2002 / 081694), which is a defective strain of cell surface protein PS2 of C.glutamicum AJ12036 (FERMBP-734).
  • a coryneform bacterium having the ability to secrete and produce a heterologous protein can be obtained by introducing the gene construct used in the present invention into the coryneform bacterium as described above and holding it. That is, the bacterium of the present invention may be, for example, a modified strain derived from the coryneform bacterium as described above. Specifically, the bacterium of the present invention may be, for example, a modified strain derived from C. glutamicum AJ12036 (FERMBP-734) or a modified strain derived from C. glutamicum ATCC 13869. The modified strain derived from C. glutamicum AJ12036 (FERMBP-734) also corresponds to the modified strain derived from C. glutamicum ATCC 13869. The gene construct used in the present invention and the method for introducing it will be described later.
  • the bacterium of the present invention is modified so that the activity of LepB protein is increased.
  • the bacterium of the present invention is specifically modified so that the activity of the LepB protein is increased as compared with the unmodified strain. More specifically, the bacterium of the present invention may be modified so that expression of the lepB gene is increased.
  • the “remaining residual amount of TorA signal peptide” refers to the weight ratio of the secretory production amount of the mis-cleaved form of the heterologous protein to the total secretory production amount of the heterologous protein.
  • the “total secretory production of heterologous protein” refers to the total of the secretory production of completely cleaved heterologous protein and the secretory production of uncut residual protein.
  • the "truncated heterologous protein” refers to a heterologous protein in which the TorA signal peptide is partially removed, that is, the C-terminal partial sequence of the TorA signal peptide is retained.
  • the C-terminal side partial sequence of the TorA signal peptide include an amino acid sequence of 15 residues at the C-terminal side of the TorA signal peptide.
  • Specific examples of the C-terminal side partial sequence of the TorA signal peptide include the amino acid sequences at positions 25 to 39 of SEQ ID NO: 46.
  • the residual fraction of the TorA signal peptide in the method of the present invention may be, for example, 3% or less, 1% or less, 0.5% or less, 0.3% or less, 0.1% or less, or 0%.
  • the residual ratio of the TorA signal peptide in the method of the present invention is, for example, the residual residue of the TorA signal peptide when an unmodified strain (here, a strain that has not been modified to increase the activity of LepB protein) is used.
  • the rate may be 50% or less, 30% or less, 10% or less, 5% or less, 3% or less, 1% or less, or 0%.
  • a heterologous protein of the bacterium specifically, a completely cleaved heterologous protein
  • the ability can be improved, that is, the secretory production of a heterologous protein (specifically, a completely cleaved heterologous protein) utilizing the TorA signal peptide by the bacterium can be increased.
  • the bacterium of the present invention can be obtained by modifying a coryneform bacterium capable of secreting and producing a heterologous protein so that the activity of the LepB protein is increased.
  • the bacterium of the present invention can also be obtained by modifying a coryneform bacterium so that the activity of the LepB protein is increased, and then imparting the ability to secrete and produce a heterologous protein.
  • the modification for constructing the bacterium of the present invention can be performed in any order.
  • the strain used for the construction of the bacterium of the present invention secretes the heterologous protein if it is assumed to have a gene construct for secretory expression of the heterologous protein. It may or may not be produced. That is, the bacterium of the present invention may be, for example, one that has been modified to increase the activity of the LepB protein and has acquired the ability to secrete and produce a heterologous protein. Specifically, for example, the bacterium of the present invention is capable of secreting and producing a heterologous protein even if it has a gene construct for secretory expression of the heterologous protein before it is modified to increase the activity of the LepB protein. Alternatively, it may be obtained from a strain that could not be produced, and is capable of secreting and producing a heterologous protein by being modified so that the activity of the LepB protein is increased.
  • LepB protein is a signal peptidase.
  • Signal peptidase refers to a protein (enzyme) having an activity of catalyzing the processing of a signal peptide. The same activity is also referred to as “signal peptidase activity”.
  • Signal peptidase activity “Processing of a signal peptide” refers to a reaction of removing the entire signal peptide from a protein having the signal peptide.
  • the LepB protein has at least a signal peptidase activity for the TorA signal peptide, that is, an activity that catalyzes the processing of the TorA signal peptide.
  • the lepB gene and LepB protein include those of various organisms such as coryneform bacteria and bacteria of the Enterobacteriaceae family.
  • the nucleotide sequences of lepB genes of various organisms and the amino acid sequences of LepB proteins encoded by them can be obtained from public databases such as NCBI (National Center for Biotechnology Information).
  • the nucleotide sequence of the lepB gene of C. glutamicum ATCC 13869 and the amino acid sequence of the LepB protein encoded by the gene are shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively. That is, the lepB gene may be, for example, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the LepB protein may be, for example, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the expression “having an (amino acid or base) sequence” means “including the (amino acid or base) sequence”, and also includes “consisting of the (amino acid or base) sequence” unless otherwise specified. To do.
  • the lepB gene may be a variant of the lepB gene exemplified above (for example, the gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1) as long as the original function is maintained.
  • the LepB protein may be a variant of the above-exemplified LepB protein (for example, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) as long as the original function is maintained.
  • a variant in which such original function is maintained may be referred to as a "conservative variant".
  • the term “lepB gene” is not limited to the lepB gene exemplified above, but includes conservative variants thereof.
  • LepB protein is not limited to the above-exemplified LepB proteins, but includes conservative variants thereof. Examples of conservative variants include the homologues of the lepB gene and the LepB protein exemplified above, and artificial variants.
  • the original function is maintained means that the gene or protein variant has a function (eg, activity or property) corresponding to the function (eg, activity or property) of the original gene or protein. That is, “the original function is maintained” means that in the lepB gene, a gene variant encodes a protein in which the original function is maintained. Further, “the original function is maintained” means that in the LepB protein, the protein variant has a signal peptidase activity for the TorA signal peptide.
  • the signal peptidase activity can be measured, for example, by incubating an enzyme with a substrate (that is, a protein having a signal peptide) and measuring the enzyme-dependent processing of the signal peptide.
  • a substrate that is, a protein having a signal peptide
  • the processing of the signal peptide can be measured using, for example, the molecular weight of the substrate after incubation or the N-terminal amino acid sequence as an index.
  • a homolog of lepB gene or homolog of LepB protein can be easily obtained from a public database by, for example, BLAST search or FASTA search using the nucleotide sequence of lepB gene exemplified above or the amino acid sequence of LepB protein exemplified above as a query sequence. You can Further, the homologue of the lepB gene can be obtained, for example, by PCR using a chromosome of a coryneform bacterium as a template and an oligonucleotide prepared based on the known nucleotide sequence of the lepB gene as a primer.
  • the lepB gene has one or several amino acids at one or several positions in the amino acid sequence of the LepB protein exemplified above (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2). It may be a gene encoding a protein having a substituted, deleted, inserted, and / or added amino acid sequence.
  • the above-mentioned "1 or several” varies depending on the position of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein and the kind of the amino acid residue. Specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 It means ⁇ 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, further preferably 1 to 5, and particularly preferably 1 to 3.
  • substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or several amino acids are conservative mutations in which the function of the protein is normally maintained.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • a conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and a Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • Gln and Asn in the case of a basic amino acid
  • Lys, Arg, His in the case of an acidic amino acid
  • Asp and Glu in the case of an amino acid having a hydroxyl group.
  • substitution considered as a conservative substitution, specifically, substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln substitution, Cys to Ser or Ala substitution, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg substitution, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp substitution Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg substitution, Met to Ile, Leu, Val or Phe substitution, Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu substitution, Ser to Thr or Ala Substitution, Thr to Ser or Ala, Trp to Phe or Tyr, Tyr to His,
  • the lepB gene is, as long as the original function is maintained, 80% or more, preferably 90% or more, with respect to the entire amino acid sequence of the above-described LepB protein (for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2), It may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence having an identity of more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the lepB gene is a complementary sequence of the above-exemplified nucleotide sequence of the lepB gene (for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1) or a probe and a stringent that can be prepared from the complementary sequence, as long as the original function is maintained. It may be a DNA that hybridizes under various conditions.
  • the “stringent conditions” are conditions under which so-called specific hybrid is formed and non-specific hybrid is not formed.
  • DNAs having high identity for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more DNA having identity Conditions under which DNAs that hybridize with each other and are less identical than those with each other do not hybridize, or conditions for washing in ordinary Southern hybridization are 60 ° C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C, 0.1 ⁇ Conditions for washing once, preferably 2-3 times at a salt concentration and temperature corresponding to SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS can be mentioned.
  • the above-mentioned probe may be, for example, a part of a complementary sequence of a gene.
  • a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on the base sequence of a known gene as a primer and a DNA fragment containing these base sequences as a template.
  • a DNA fragment having a length of about 300 bp can be used.
  • the washing conditions for hybridization include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the lepB gene may have a nucleotide sequence in which an arbitrary codon is replaced with an equivalent codon in the nucleotide sequence of the lepB gene or the conservative variant thereof exemplified above.
  • the lepB gene may be modified to have optimal codons depending on the codon usage of the host used.
  • genes and proteins can be applied correspondingly to PhoRS proteins, cell surface proteins, Tat-based secretory apparatus, arbitrary proteins such as heterologous proteins secreted and produced in the present invention, and genes encoding them. .
  • the bacterium of the present invention may have desired properties as long as it can secrete and produce a heterologous protein.
  • the bacterium of the present invention may have a reduced cell surface protein activity (WO2013 / 065869, WO2013 / 065772, WO2013 / 118544, WO2013 / 062029).
  • the bacterium of the present invention may be modified so that the activity of the penicillin-binding protein is reduced (WO2013 / 065869).
  • the bacterium of the present invention may be modified so that the expression of a gene encoding a metallopeptidase is increased (WO2013 / 065772).
  • the bacterium of the present invention may be modified to have a mutant ribosomal protein S1 gene (mutant rpsA gene) (WO2013 / 118544). Further, the bacterium of the present invention may be modified so as to have a mutant phoS gene (WO2016 / 171224). In addition, the bacterium of the present invention may be modified so that the activity of RegX3 protein is reduced (WO2018 / 074578). Moreover, the bacterium of the present invention may be modified so that the activity of the HrrSA system is reduced (WO2018 / 074579). Further, the bacterium of the present invention may be modified so that the activity of the Tat secretion apparatus is increased. These properties or modifications can be used alone or in appropriate combination.
  • mutant phoS gene The bacterium of the present invention may be modified to retain the mutant phoS gene. “Holding a mutant phoS gene” is also referred to as “having a mutant phoS gene” or “having a mutation in the phoS gene”. In addition, “having a mutant phoS gene” is also referred to as “having a mutant PhoS protein” or “having a mutation in the PhoS protein”.
  • the phoS gene is a gene encoding a PhoS protein that is a sensor kinase of the PhoRS system.
  • the PhoRS system is one of the two-component regulatory systems that elicits a response to phosphate deficiency in the environment.
  • the PhoRS system consists of a sensor kinase PhoS encoded by the phoS gene and a response regulator PhoR encoded by the phoR gene.
  • a PhoS protein having a “specific mutation” is also called a “mutant PhoS protein”, and a gene encoding it is also called a “mutant phoS gene”.
  • the “mutant phoS gene” is a phoS gene having a “specific mutation”.
  • a PhoS protein having no “specific mutation” is also referred to as a “wild-type PhoS protein”, and a gene encoding the PhoS protein is also referred to as a “wild-type phoS gene”.
  • the “wild type phoS gene” is a phoS gene having no “specific mutation”.
  • wild type used herein is a description for convenience of distinction from the "mutant type”, and is not limited to a naturally obtained one as long as it does not have a "specific mutation”. The “specific mutation” will be described later.
  • the wild-type phoS gene includes, for example, the phoS gene of coryneform bacteria.
  • Specific examples of the phoS gene of coryneform bacterium include C. glutamicum YDK010 strain, C. glutamicum ATCC13032 strain, C. glutamicum ATCC14067 strain, C. callunae, C. crenatum, and C. efficiens phoS gene.
  • SEQ ID NO: 28 The nucleotide sequence of the phoS gene of the C. glutamicum YDK010 strain is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the amino acid sequences of wild-type PhoS proteins encoded by these phoS genes are shown in SEQ ID NOs: 29 to 34, respectively.
  • the wild-type phoS gene may be a variant of the above-mentioned wild-type phoS gene as long as it has no "specific mutation” and the original function is maintained.
  • the wild-type PhoS protein may be a variant of the above-exemplified wild-type PhoS protein as long as it has no “specific mutation” and the original function is maintained. That is, the term “wild-type phoS gene” is not limited to the above-exemplified wild-type phoS gene, but includes conservative variants thereof that do not have a “specific mutation”. Similarly, the term “wild-type PhoS protein” is not limited to the above-exemplified wild-type PhoS protein, but includes conservative variants thereof that do not have a “specific mutation”.
  • the wild-type PhoS protein and wild-type phoS gene variants the above-mentioned descriptions regarding the conservative variants of LepB protein and lepB gene can be applied.
  • the wild-type phoS gene does not have a “specific mutation”, and as long as the original function is maintained, one or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence are It may be a gene encoding a protein having a substituted, deleted, inserted, and / or added amino acid sequence.
  • the wild-type phoS gene does not have a "specific mutation", and as long as the original function is maintained, with respect to the entire amino acid sequence, 80% or more, preferably 90% or more, It may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence having an identity of more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the original function is maintained means that in the wild-type PhoS protein, a variant of the protein has a function as the PhoS protein (for example, a protein consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 34). Function).
  • “maintaining the original function” may mean that in the wild-type PhoS protein, the protein variant has a function as a sensor kinase of the PhoRS system. That is, the “function as a PhoS protein” may specifically be a function as a sensor kinase of the PhoRS system.
  • the “function of the PhoRS system as a sensor kinase” may be specifically a function of coupling with the response regulator PhoR protein to elicit a response to phosphate deficiency in the environment. More specifically, the "function of the PhoRS system as a sensor kinase” is a function of activating the PhoR protein by sensing phosphate deficiency in the environment, being autophosphorylated, and transphosphorylation. Good.
  • Whether a variant of the PhoS protein functions as a sensor kinase of the PhoRS system can be determined by, for example, introducing a gene encoding the variant into a phoS gene-deficient strain of coryneform bacterium and complementing the responsiveness to phosphate deficiency. It can be confirmed by confirming whether or not it is done. Complementation of responsiveness to phosphate deficiency can be detected, for example, as an improvement in growth under phosphate deficiency conditions or as induction of expression of a gene whose expression is known to be induced under phosphate deficiency conditions ( J. Bacteriol., 188, 724-732 (2006)).
  • phoS gene-deficient strain of coryneform bacterium for example, phoS gene-deficient strain of C. glutamicum YDK010 strain and phoS gene-deficient strain of C. glutamicum ATCC13032 strain can be used.
  • histidine residues that are autophosphorylated are conserved. That is, the conservative mutation preferably occurs at amino acid residues other than histidine residues that are autophosphorylated.
  • "Histidine residue that is autophosphorylated” refers to the histidine residue at position 276 of the wild-type PhoS protein.
  • the wild-type PhoS protein preferably has, for example, a conserved sequence of the wild-type PhoS proteins exemplified above. That is, the conservative mutation preferably occurs at an amino acid residue that is not conserved in the above-exemplified wild-type PhoS protein.
  • the mutant PhoS protein has a “specific mutation” in the amino acid sequence of the wild-type PhoS protein as described above.
  • the mutant PhoS protein may be the same as the wild-type PhoS protein and the conservative variant thereof exemplified above except that it has a “specific mutation”.
  • the mutant PhoS protein may be a protein having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 34, except that it has the “specific mutation”.
  • the mutant PhoS protein has one or several amino acid substitutions, deletions, insertions in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 34, except that it has a “specific mutation”. And / or a protein having an amino acid sequence containing additions.
  • the mutant PhoS protein has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 29 to 34, except that it has a “specific mutation”. May be a protein having an amino acid sequence having an identity of 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the mutant PhoS protein is a variant of the wild-type PhoS protein exemplified above, which has a “specific mutation” and further includes a conservative mutation at a position other than the “specific mutation”.
  • the mutant PhoS protein has a “specific mutation” in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 34, and one or several additional positions other than the “specific mutation”.
  • the protein may have an amino acid sequence containing amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions of.
  • the mutant phoS gene is not particularly limited as long as it encodes the mutant PhoS protein as described above.
  • the “specific mutation” is not particularly limited as long as the amino acid sequence of the wild-type PhoS protein is changed as described above and it is effective for secretory production of a heterologous protein.
  • the "specific mutation” is preferably a mutation that improves the secretory production of a heterologous protein.
  • the phrase "improving the secretory production of a heterologous protein” means that a coryneform bacterium modified to have a mutant phoS gene (modified strain) can secrete and produce a larger amount of a heterologous protein than an unmodified strain.
  • the "non-modified strain” refers to a control strain having no mutation in the phoS gene, that is, a control strain having no mutant phoS gene, and may be, for example, a wild strain or a parent strain.
  • the term "secretes and produces a larger amount of a heterologous protein than the non-modified strain” is not particularly limited as long as the secretory production amount of the heterologous protein is increased as compared with the non-modified strain.
  • the accumulated amount in the surface layer is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, still more preferably 1.3 times or more, further preferably 2 times or more, particularly preferably 5 times that of the unmodified strain.
  • the above-mentioned amount of the heterologous protein may be secreted and produced.
  • “secreting and producing a larger amount of a heterologous protein than the non-modified strain” means that the heterologous protein cannot be detected when the culture supernatant of the non-modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB. However, it may be that the heterologous protein can be detected when the culture supernatant of the unconcentrated modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB.
  • the phrase "improving the secretory production amount of a heterologous protein” does not need to improve the secretory production amount of any heterologous protein, and it is sufficient if the secretory production amount of a heterologous protein set as a target of secretory production is improved.
  • the phrase “improving the secretory production amount of the heterologous protein” may specifically mean, for example, improving the secretory production amount of the heterologous protein described in Examples.
  • Whether a certain mutation is a mutation that improves the secretory production of a heterologous protein is determined by, for example, preparing a strain modified to have a gene encoding a PhoS protein having the mutation based on a strain belonging to a coryneform bacterium. , Quantify the amount of heterologous protein secreted and produced when the modified strain is cultured in a medium, and compare it with the amount of heterologous protein secreted and produced when the strain before modification (non-modified strain) is cultured in the medium This can be confirmed.
  • substitution of amino acid residue is preferable. That is, the “specific mutation” is preferably a substitution of any amino acid residue of the wild-type PhoS protein with another amino acid residue.
  • the amino acid residue in which substitution is caused by the “specific mutation” may be one residue, or may be a combination of two residues or more.
  • the amino acid residue in which substitution is caused by the "specific mutation” may be preferably an amino acid residue other than a histidine residue that is autophosphorylated.
  • the amino acid residue in which the substitution is caused by the “specific mutation” may more preferably be an amino acid residue in the HisKA domain other than the histidine residue that is autophosphorylated.
  • “Histidine residue that is autophosphorylated” refers to the histidine residue at position 276 of the wild-type PhoS protein.
  • the “HisKA domain” refers to a region consisting of amino acid residues 266 to 330 of the wild-type PhoS protein.
  • the amino acid residue in which the substitution is caused by the “specific mutation” may be particularly preferably the tryptophan residue at position 302 (W302) of the wild-type PhoS protein.
  • the amino acid residues after substitution include K (Lys), R (Arg), H (His), A (Ala), V (Val), L (Leu), I (Ile) and G ( Gly), S (Ser), T (Thr), P (Pro), F (Phe), W (Trp), Y (Tyr), C (Cys), M (Met), D (Asp), E ( Among Glu), N (Asn), and Q (Gln), those other than the original amino acid residue can be mentioned.
  • the amino acid residue after substitution for example, one that can improve the secretory production of a heterologous protein can be selected.
  • amino acid residue after replacement examples include amino acid residues other than aromatic amino acids and histidine.
  • amino acid residue other than aromatic amino acid and histidine specifically includes K (Lys), R (Arg), A (Ala), V (Val), L (Leu), I (Ile), and G. (Gly), S (Ser), T (Thr), P (Pro), C (Cys), M (Met), D (Asp), E (Glu), N (Asn), Q (Gln).
  • amino acid residue other than aromatic amino acid and histidine K (Lys), A (Ala), V (Val), S (Ser), C (Cys), M (Met), Examples include D (Asp) and N (Asn).
  • the “specific mutation” in the phoS gene means a mutation in the nucleotide sequence that causes the above-mentioned “specific mutation” in the encoded PhoS protein.
  • amino acid residue at X position of wild-type PhoS protein means an amino acid residue corresponding to the amino acid residue at X position of SEQ ID NO: 29.
  • W302 means an amino acid residue corresponding to the tryptophan residue at position 302 of SEQ ID NO: 29.
  • the positions of the above-mentioned amino acid residues indicate relative positions, and their absolute positions may be changed due to deletion, insertion, addition of amino acids or the like.
  • the original amino acid residue at the X position is Is the X-1th or X + 1th amino acid residue counted from the N-terminus, respectively, and is regarded as the "X-position amino acid residue of the wild-type PhoS protein".
  • W302 means the positions 302, 302, 302, 321, 275, and 286, respectively. Refers to tryptophan residues.
  • the histidine residue at position 276 of the wild-type PhoS protein (a histidine residue that is autophosphorylated)” means positions 276 and 276, respectively. Position, 276, 295, 249, and 260 positions of histidine residues.
  • the region consisting of the amino acid residues at positions 266 to 330 of the wild-type PhoS protein (HisKA domain) means 266 to 330, respectively. Position 266-330 position, 266-330 position, 285-349 position, 239-303 position, and 250-314 position.
  • W302 here is usually a tryptophan residue, but it does not have to be a tryptophan residue. That is, when the wild-type PhoS protein has an amino acid sequence other than the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 34, “W302” may not be a tryptophan residue. Therefore, for example, “mutation in which W302 is replaced with a cysteine residue” is not limited to mutation in which the tryptophan residue is replaced with a cysteine residue when “W302” is a tryptophan residue, and is not limited to “W302”.
  • amino acid sequence of an arbitrary PhoS protein which amino acid residue is the “amino acid residue corresponding to the amino acid residue at the X position in SEQ ID NO: 29” is determined by the amino acid sequence of the arbitrary PhoS protein and SEQ ID NO: 29. It can be determined by performing alignment with the amino acid sequence. The alignment can be performed by using, for example, known gene analysis software. Specific software includes DNASIS manufactured by Hitachi Solutions and GENETYX manufactured by Genetics (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1), 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198 (2), 327-37.1987).
  • the mutant phoS gene can be obtained, for example, by modifying the wild-type phoS gene so that the encoded PhoS protein has the above-mentioned “specific mutation”.
  • the wild-type phoS gene to be modified can be obtained, for example, by cloning from an organism having the wild-type phoS gene or by chemical synthesis.
  • the mutant phoS gene can also be obtained without intervention of the wild-type phoS gene.
  • the mutant phoS gene may be directly obtained by chemical synthesis.
  • the obtained mutant phoS gene may be further modified before use.
  • the gene can be modified by known methods.
  • a site-directed mutagenesis method can be used to introduce a target mutation into a target site of DNA.
  • a site-directed mutation method a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth . In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • Modifying a coryneform bacterium to have a mutant phoS gene can be achieved by introducing the mutant phoS gene into a coryneform bacterium. Further, the modification of the coryneform bacterium to have the mutant phoS gene can also be achieved by introducing the above-mentioned "specific mutation" into the phoS gene on the chromosome of the coryneform bacterium. Mutagenesis to a gene on a chromosome can be achieved by natural mutation, mutagen treatment, or a genetic engineering technique.
  • the method for introducing the mutant phoS gene into coryneform bacteria is not particularly limited.
  • the mutant phoS gene may be retained so that it can be expressed under the control of a promoter that functions in coryneform bacteria.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous-derived promoter.
  • the promoter may be a promoter specific to the phoS gene or a promoter of another gene.
  • the mutant phoS gene may be present on a vector that autonomously propagates extrachromosomally such as a plasmid, or may be integrated on the chromosome.
  • the bacterium of the present invention may have only one copy of the mutant phoS gene, or may have two or more copies.
  • the bacterium of the present invention may have only one kind of mutant phoS gene, or may have two or more kinds of mutant phoS gene.
  • the introduction of the mutant phoS gene can be carried out, for example, in the same manner as the introduction of the gene in the method of increasing the expression of the gene described below and the introduction of the gene construct used in the present invention.
  • the bacterium of the present invention may or may not have the wild-type phoS gene, but it is preferable not to have it.
  • Coryneform bacteria that do not have the wild-type phoS gene can be obtained by disrupting the wild-type phoS gene on the chromosome.
  • the wild-type phoS gene can be disrupted by a known method. Specifically, for example, the wild-type phoS gene can be destroyed by deleting part or all of the promoter region and / or coding region of the wild-type phoS gene.
  • the PhoS protein functions by coupling with the response regulator PhoR protein, that is, it induces a response to phosphate deficiency in the environment. Therefore, the bacterium of the present invention has the phoR gene so that the mutant PhoS protein can function.
  • the phoR gene is a gene encoding the PhoR protein that is a response regulator of the PhoRS system. “Having a phoR gene” is also referred to as “having a PhoR protein”. Usually, it suffices that the PhoR protein originally possessed by the bacterium of the present invention functions by coupling with the mutant PhoS protein.
  • an appropriate phoR gene may be introduced in addition to or in place of the phoR gene originally possessed by the bacterium of the present invention.
  • the introduced phoR gene is not particularly limited as long as it encodes a PhoR protein that functions in association with the mutant PhoS protein.
  • the phoR gene includes, for example, the phoR gene of coryneform bacteria.
  • Specific examples of the phoR gene of coryneform bacteria include the C. glutamicum YDK010 strain, C. glutamicum ATCC13032 strain, C. glutamicum ATCC14067 strain, C. callunae, C. crenatum, and C. efficiens phoR gene.
  • the nucleotide sequence of the phoR gene and the amino acid sequence of the PhoR protein of C. glutamicum ATCC13032 strain are shown in SEQ ID NOs: 35 and 36, respectively.
  • the phoR gene may be a variant of the phoR gene exemplified above as long as the original function is maintained.
  • the PhoR protein may be a variant of the PhoR protein exemplified above as long as the original function is maintained. That is, the term “phoR gene” is intended to include conservative variants thereof in addition to the phoR gene exemplified above.
  • the term “PhoR protein” is intended to include the PhoR protein exemplified above and conservative variants thereof. With regard to the variants of PhoR protein and phoR gene, the above-mentioned descriptions regarding the conservative variants of LepB protein and lepB gene can be applied.
  • an amino acid in which one or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, and / or added as long as the original function is maintained. It may be a gene encoding a protein having a sequence. Further, for example, the phoR gene, as long as the original function is maintained, with respect to the entire amino acid sequence, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, Particularly preferably, it may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence having 99% or higher identity.
  • the original function is maintained means that in the PhoR protein, a protein variant has a function as the PhoR protein (for example, a function of the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36). Can be.
  • the original function is maintained may mean that in the PhoR protein, a protein variant has a function as a response regulator of the PhoRS system. That is, the “function as a PhoR protein” may specifically be a function as a response regulator of the PhoRS system.
  • the “function of the PhoRS system as a response regulator” may specifically be a function of coupling with a sensor kinase PhoS protein to elicit a response to phosphate deficiency in the environment.
  • the “function of the PhoRS system as a response regulator” is activated by the transfer of a phosphate group from the PhoS protein that is autophosphorylated by sensing phosphate deficiency in the environment. It may have a function of controlling the expression of a gene that responds to phosphate deficiency.
  • Whether a variant of the PhoR protein functions as a response regulator of the PhoRS system is determined by, for example, introducing a gene encoding the variant into a phoR gene-deficient strain of a coryneform bacterium and complementing the responsiveness to phosphate deficiency. It can be confirmed by confirming whether or not it is done. Complementation of responsiveness to phosphate deficiency can be detected, for example, as an improvement in growth under phosphate deficiency conditions or as induction of expression of a gene whose expression is known to be induced under phosphate deficiency conditions ( J. Bacteriol., 188, 724-732 (2006)).
  • the phoR gene-deficient strain of coryneform bacterium for example, the phoR gene-deficient strain of C. glutamicum YDK010 strain and the phoR gene-deficient strain of C. glutamicum ATCC13032 strain can be used.
  • the bacterium of the present invention may have a reduced activity of cell surface protein. Specifically, the bacterium of the present invention may have a reduced activity of cell surface protein as compared with an unmodified strain. "Reducing the activity of the cell surface protein” may particularly mean that the number of molecules of the cell surface protein per cell is decreased. The cell surface protein and the gene encoding it will be described below.
  • Cell surface proteins are proteins that make up the cell surface (S layer) of bacteria and archaea.
  • Examples of cell surface proteins of coryneform bacteria include C. glutamicum PS1 and PS2 (CspB) (Table 1-502548), and C. stationis SlpA (CspA) (JP-A-10-108675). Among these, it is preferable to reduce the activity of PS2 protein.
  • the nucleotide sequence of the cspB gene of C. glutamicum ATCC13869 and the amino acid sequence of the PS2 protein (CspB protein) encoded by the gene are shown in SEQ ID NOs: 37 and 38, respectively.
  • CspB homologs have been reported for 28 strains of C. glutamicum (J Biotechnol., 112, 177-193 (2004)).
  • GenBank accession numbers of the NCBI database of C. glutamicum and cspB gene homologs of these 28 strains are exemplified below (the GenBank accession numbers in parentheses).
  • C. glutamicum ATCC13058 (AY524990) C. glutamicum ATCC13744 (AY524991)
  • glutamicum ATCC14017 AY524993
  • glutamicum ATCC14020 AY525009
  • glutamicum ATCC14067 AY524994
  • glutamicum ATCC14068 (AY525010) C. glutamicum ATCC14747 (AY525011) C. glutamicum ATCC14751 (AY524995) C. glutamicum ATCC14752 (AY524996) C. glutamicum ATCC14915 (AY524997) C. glutamicum ATCC15243 (AY524998) C. glutamicum ATCC15354 (AY524999) C. glutamicum ATCC17965 (AY525000) C. glutamicum ATCC17966 (AY525001) C. glutamicum ATCC19223 (AY525002) C. glutamicum ATCC19240 (AY525012) C. glutamicum ATCC21341 (AY525003) C. glutamicum ATCC21645 (AY525004) C.
  • glutamicum ATCC31808 (AY525013) C. glutamicum ATCC31830 (AY525007) C. glutamicum ATCC31832 (AY525008) C. glutamicum LP-6 (AY525014) C. glutamicum DSM20137 (AY525015) C. glutamicum DSM20598 (AY525016) C. glutamicum DSM46307 (AY525017) C. glutamicum 22220 (AY525005) C. glutamicum 22243 (AY525006)
  • the gene encoding the cell surface protein is not limited to the above as long as the original function is maintained. It may be a variant of the gene encoding the exemplified cell surface protein. Similarly, the cell surface protein may be a variant of the cell surface protein exemplified above as long as the original function is maintained. That is, for example, the term “cspB gene” includes the above-exemplified cspB gene and conservative variants thereof.
  • CspB protein is intended to include the CspB protein exemplified above and conservative variants thereof.
  • the above description regarding the conservative variant of the LepB protein and lepB gene can be applied.
  • the gene encoding the cell surface protein as long as the original function is maintained, 1 or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence are substituted, deleted, inserted, and / or Alternatively, it may be a gene encoding a protein having an added amino acid sequence.
  • the gene encoding the cell surface protein as long as the original function is maintained, with respect to the entire amino acid sequence, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably May be a gene encoding a protein having an amino acid sequence with 97% or more, and particularly preferably 99% or more identity.
  • “the original function is maintained” means that in the cell surface protein, for example, when the activity is decreased in a coryneform bacterium, the secretory production amount of the heterologous protein is increased as compared with the unmodified strain. It may have the property of causing.
  • the property of increasing secretory production of a heterologous protein when the activity is reduced in coryneform bacteria compared to the non-modified strain means that the amount is higher than that of the non-modified strain when the activity is reduced in coryneform bacteria.
  • the ability to secrete and produce the heterologous protein of the coryneform bacterium refers to a control strain in which the activity of cell surface protein is not reduced, and may be, for example, a wild strain or a parent strain.
  • the term "secretes and produces a larger amount of a heterologous protein than the non-modified strain” is not particularly limited as long as the secretory production amount of the heterologous protein is increased as compared with the non-modified strain.
  • the amount of heterologous protein accumulated in the surface layer is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, further preferably 1.3 times or more, and particularly preferably 2 times or more that of the non-modified strain. It may be secretory production.
  • “secreting and producing a larger amount of a heterologous protein than the non-modified strain” means that the heterologous protein cannot be detected when the culture supernatant of the non-modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB. However, it may be that the heterologous protein can be detected when the culture supernatant of the unconcentrated modified strain is subjected to SDS-PAGE and stained with CBB.
  • a protein has the property of increasing the secretory production amount of a heterologous protein when its activity is reduced in a coryneform bacterium as compared with that of an unmodified strain depends on the activity of the protein based on the strain belonging to the coryneform bacterium.
  • a strain modified so as to reduce the amount of heterologous protein secreted and produced when the modified strain is cultured in the medium is quantified, and the strain before modification (non-modified strain) is secreted when cultured in the medium. This can be confirmed by comparison with the amount of heterologous protein produced.
  • the activity of the cell surface protein is reduced means that when the coryneform bacterium is modified so that the activity of the cell surface protein is reduced, and in the coryneform bacterium, The case where the activity is decreased is included.
  • the "case where the activity of the cell surface protein is originally reduced in the coryneform bacterium” includes the case where the coryneform bacterium originally does not have the cell surface protein. That is, as the coryneform bacterium in which the activity of the cell surface protein is reduced, for example, a coryneform bacterium originally having no cell surface protein can be mentioned.
  • Examples of "when the coryneform bacterium originally does not have a cell surface protein” include a case where the coryneform bacterium originally does not have a gene encoding a cell surface protein.
  • the coryneform bacterium originally does not have a cell surface protein means that the coryneform bacterium has one or more selected from cell surface proteins found in other strains of the species to which the coryneform bacterium belongs. It may be that the protein is not originally contained.
  • C.glutamicum does not originally have a cell surface protein
  • the C.glutamicum strain is one or more proteins selected from cell surface proteins found in other C.glutamicum strains, that is, For example, it may not have PS1 and / or PS2 (CspB) originally.
  • An example of a coryneform bacterium originally having no cell surface protein is C. glutamicum ATCC 13032 which originally has no cspB gene.
  • the bacterium of the present invention has a Tat system (Tat system secretory apparatus) which is a protein secretion system.
  • the bacterium of the present invention may inherently have a Tat secretion apparatus.
  • the bacterium of the present invention may be modified so that the activity of the Tat secretion apparatus is increased.
  • the bacterium of the present invention may be modified so that the activity of the Tat secretion apparatus is increased as compared with the unmodified strain.
  • the activity of the Tat-based secretory apparatus can be increased, for example, by increasing the expression of one or more genes selected from the genes encoding the Tat-based secretory apparatus.
  • the bacterium of the present invention may be modified, more specifically, so that the expression of one or more genes selected from the genes encoding the Tat secretion apparatus is increased.
  • a method for increasing the expression of the gene encoding the Tat secretory apparatus is described in Japanese Patent No. 4730302.
  • a heterologous protein specifically, a completely truncated heterologous protein
  • the ability can be improved, that is, the secretory production of a heterologous protein (specifically, a completely cleaved heterologous protein) utilizing the TorA signal peptide by the bacterium can be increased.
  • the genes encoding the Tat secretory apparatus include the tatA gene, tatB gene, tatC gene, and tatE gene.
  • the gene encoding the Tat secretory apparatus include the C. glutamicum tatA gene, tatB gene, and tatC gene.
  • the tatA gene, tatB gene, and tatC gene of C. glutamicum ATCC 13032 are respectively the sequences of positions 1571065 to 1571382 in the genome sequence registered as GenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI: 58036263) in the NCBI database. It corresponds to the complementary sequence, the sequence at positions 1167110 to 1167580, and the sequence complementary to the sequences at positions 1569929 to 1570873.
  • the TatA protein, TatB protein, and TatC protein of C are respectively the sequences of positions 1571065 to 1571382 in the genome sequence registered as GenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI: 58036263) in the NCBI database. It corresponds to the complementary sequence, the sequence at positions 1167110 to 1167580
  • locus_tag "NCgl1077”
  • the nucleotide sequences of the tatA gene, tatB gene, and tatC gene of C. glutamicum ATCC 13032 and the amino acid sequences of the TatA protein, TatB protein, and TatC protein are shown in SEQ ID NOs: 39 to 44.
  • E. coli coli tatA gene tatB gene, tatC gene, and tatE gene.
  • E.coli K-12 MG1655 tatA gene, tatB gene, tatC gene, and tatE gene are 4019968- It corresponds to the sequence at the 4020237 position, the sequence at the 4020241 to 4020756 position, the sequence at the 4020759 to 4021535 position, and the sequence at the 658170 to 658373 position.
  • the gene encoding the Tat secretory apparatus may be a variant of the gene encoding the Tat secretory apparatus exemplified above as long as the original function is maintained.
  • the Tat-based secretory apparatus may be a variant of the Tat-based secretory apparatus exemplified above as long as the original function is maintained. That is, for example, the terms "tatA gene”, “tatB gene”, “tatC gene”, and “tatE gene”, respectively, in addition to the tatA gene, tatB gene, tatC gene, and tatE gene exemplified above, Conservative variants shall be included.
  • TatA protein “TatB protein”, “TatC protein”, and “TatE protein” respectively refer to the TatA protein, TatB protein, TatC protein, and TatE protein exemplified above, as well as the preservation thereof. Variants are intended to be included.
  • the above-mentioned description regarding the conservative variant of the LepB protein and lepB gene can be applied.
  • the gene encoding the Tat secretory apparatus has one or several amino acids at one or several positions in the above amino acid sequence substituted, deleted, inserted, and It may be a gene encoding a protein having an added amino acid sequence.
  • the gene encoding the Tat secretion apparatus as long as the original function is maintained, with respect to the entire amino acid sequence, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further It may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence having an identity of preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the original function is maintained means that in the Tat-based secretory apparatus, the function of secreting a protein having a Tat-dependent signal peptide such as TorA signal peptide added to the N-terminus to the outside of the cell. May have.
  • the increase in the activity of the Tat system secretory apparatus can be confirmed, for example, by confirming that the secretory production amount of the protein in which the Tat system dependent signal peptide such as TorA signal peptide is added to the N-terminus is increased.
  • the secretory production amount of the protein in which the Tat-dependent signal peptide is added to the N-terminus may be increased by, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more that of the non-modified strain.
  • “Increase in protein activity” means that the activity of the protein is increased as compared to the unmodified strain. “Increased activity of a protein” specifically means that the activity of the same protein per cell is increased relative to an unmodified strain.
  • the term “non-modified strain” means a control strain that has not been modified to reduce the activity of the target protein. Non-modified strains include wild strains and parent strains. Specific examples of the non-modified strain include reference strains (type strains) of each bacterial species. Specific examples of the non-modified strain also include the strains exemplified in the explanation of coryneform bacteria.
  • the activity of the protein may be increased relative to the reference strain (ie the reference strain of the species to which the bacterium of the invention belongs).
  • the activity of the protein may be increased as compared to the C. glutamicum ATCC 13869 strain.
  • the activity of the protein may be increased as compared to the C. glutamicum ATCC 13032 strain.
  • the activity of the protein may be increased as compared to C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734).
  • the activity of the protein may be increased as compared to the C. glutamicum YDK010 strain.
  • “the activity of the protein is increased” is also referred to as "the activity of the protein is enhanced”.
  • the "activity of a protein is increased” means that the number of molecules of the same protein per cell is increased and / or the number of molecules of the same protein per molecule is higher than that of an unmodified strain. It may mean increased functionality. That is, the term “activity” in the case of “increasing the activity of a protein” means not only the catalytic activity of a protein but the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of a gene encoding the protein. May be.
  • the “number of molecules of a protein per cell” may mean an average value of the number of molecules of the same protein per cell.
  • increasing the activity of the protein means not only increasing the activity of the protein in the strain originally having the activity of the target protein, but also increasing the activity of the protein in the strain in which the activity of the target protein originally does not exist. It also includes imparting activity. Further, as long as the activity of the protein is increased as a result, the activity of the target protein originally possessed by the host may be reduced or eliminated, and then the activity of the suitable target protein may be imparted.
  • the degree of increase in protein activity is not particularly limited as long as the protein activity is increased as compared with the non-modified strain.
  • the activity of the protein may be increased by, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more that of the unmodified strain.
  • the protein when the non-modified strain does not have the activity of the target protein, the protein may be produced by introducing a gene encoding the protein, for example, the activity of the protein is measured. It may be produced to the extent possible.
  • Modification such that the activity of the protein is increased can be achieved by, for example, increasing the expression of a gene encoding the protein.
  • the phrase "the expression of a gene is increased” means that the expression of the gene is increased as compared with an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • “Increasing the expression of a gene” specifically means that the expression level of the same gene per cell is increased as compared with the unmodified strain.
  • the "expression amount of a gene per cell” may mean the average value of the expression amount of the same gene per cell.
  • Increasing the expression of a gene means, more specifically, an increase in the transcription amount (mRNA amount) of the gene and / or an increase in the translation amount (protein amount) of the gene.
  • the expression of a gene increases is also called “the expression of a gene is enhanced.”
  • the expression of the gene may be increased by, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more that of the unmodified strain.
  • increasing the expression of the gene means not only increasing the expression amount of the gene in the strain in which the target gene is originally expressed, but in the strain in which the target gene is not originally expressed, Expression of the same gene is also included. That is, “the expression of a gene is increased” may mean, for example, introducing the same gene into a strain that does not carry the target gene and expressing the same gene.
  • Increase in gene expression can be achieved, for example, by increasing the copy number of the gene.
  • Increase of gene copy number can be achieved by introducing the gene into the host chromosome.
  • the gene can be introduced into the chromosome, for example, by utilizing homologous recombination (Miller, JJ.H. Experiments in-Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • homologous recombination for example, the Red-driven integration method (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
  • the gene can be introduced into the chromosome of the host by transforming the host with recombinant DNA containing the target gene and causing homologous recombination with the target site on the chromosome of the host.
  • the structure of the recombinant DNA used for homologous recombination is not particularly limited as long as homologous recombination occurs in a desired manner.
  • a linear DNA containing a target gene which has a homologous nucleotide sequence upstream and downstream of the target site on the chromosome at both ends of the gene, is used to transform the host to obtain the upstream of the target site.
  • the target site can be replaced with the gene by causing homologous recombination in each of the gene and the downstream.
  • the recombinant DNA used for homologous recombination may be equipped with a marker gene for selecting transformants. Only one copy of the gene may be introduced, or two copies or more may be introduced. For example, multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination targeting a nucleotide sequence having multiple copies on the chromosome.
  • Sequences in which multiple copies are present on the chromosome include repetitive DNA sequences and inverted repeats present at both ends of transposons.
  • homologous recombination may be carried out by targeting an appropriate sequence on the chromosome such as a gene unnecessary for production of the target substance.
  • the gene can also be introduced randomly into the chromosome using a transposon or Mini-Mu (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985, US5,882,888, EP805867B1). It should be noted that such a method of modifying a chromosome using homologous recombination is not limited to the introduction of a target gene, and can be used for any modification of a chromosome such as modification of an expression regulatory sequence.
  • an increase in the copy number of a gene can be achieved by introducing a vector containing the gene into a host.
  • a vector containing the gene for example, it is possible to increase the copy number of the gene by linking a DNA fragment containing the target gene to a vector that functions in the host to construct an expression vector of the gene and transforming the host with the expression vector.
  • the DNA fragment containing the target gene can be obtained by, for example, PCR using genomic DNA of a microorganism having the target gene as a template.
  • a vector capable of autonomous replication in the cells of the host can be used.
  • the vector is preferably a multicopy vector.
  • the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene.
  • the vector may include a promoter or terminator for expressing the inserted gene.
  • the vector may be, for example, a bacterial plasmid-derived vector, a yeast plasmid-derived vector, a bacteriophage-derived vector, a cosmid, or a phagemid.
  • a vector capable of autonomous replication in a coryneform bacterium specifically, for example, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol.
  • plasmid having an improved drug resistance gene pCRY30 (JP-A-3-210184); pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, and pCRY3KX (JP-A-2-72876, US Pat. No. 5,185,262).
  • PCRY2 and pCRY3 JP-A-1-91686; pAJ655, pAJ611, and pAJ1844 (JP-A-58-192900); pCG1 (JP-A-57-134500); pCG2 (JP-A-58-35197); pCG4 and pCG11 (JP-A-57-183799); pVK7 (JP-A-10-215883); pVK9 (US2006-0141588); pVC7 (JP-A-9-070291); pVS7 (WO2013 / 069634).
  • the gene When introducing a gene, it is sufficient that the gene is retained in the host so that it can be expressed. Specifically, the gene may be retained so that it is expressed under the control of a promoter that functions in the host.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the “promoter that functions in the host” refers to a promoter having promoter activity in the host.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous-derived promoter.
  • the promoter may be a promoter specific to the gene to be introduced or a promoter of another gene. As the promoter, for example, a stronger promoter as described below may be used.
  • a transcription terminator can be placed downstream of the gene.
  • the terminator is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the terminator may be a host-derived terminator or a heterologous-derived terminator.
  • the terminator may be a unique terminator of the gene to be introduced or a terminator of another gene.
  • the vectors, promoters, and terminators that can be used in various microorganisms are described in detail in, for example, “Basic Microbiology Course 8, Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan, 1987”, and it is possible to use them.
  • each gene when introducing two or more genes, it is sufficient that each gene is retained in the host so that it can be expressed.
  • all of the genes may be carried on a single expression vector, or all of them may be carried on the chromosome.
  • each gene may be separately retained on a plurality of expression vectors, or may be separately retained on a single or a plurality of expression vectors and on a chromosome.
  • the operon may be constructed by introducing two or more genes.
  • the gene to be introduced is not particularly limited as long as it encodes a protein that functions in the host.
  • the gene to be introduced may be a host-derived gene or a heterologous-derived gene.
  • the gene to be introduced can be obtained by PCR using, for example, a primer designed on the basis of the nucleotide sequence of the gene and using as a template a genomic DNA of an organism having the gene or a plasmid carrying the gene.
  • the gene to be introduced may be wholly synthesized based on the nucleotide sequence of the gene (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
  • the obtained gene can be used as it is or after being modified appropriately. That is, the variant can be obtained by modifying the gene.
  • the gene can be modified by a known method.
  • a site-directed mutagenesis method can be used to introduce a target mutation into a target site of DNA.
  • the coding region of a gene can be modified such that the encoded protein contains amino acid residue substitutions, deletions, insertions, and / or additions at specific sites.
  • a site-directed mutation method a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth . In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • the gene variant may be totally synthesized.
  • each subunit constituting the complex may be derived from one type of organism or two or more different types of organisms as long as the complex has the function of the target protein. That is, for example, genes derived from the same organism, which code for a plurality of subunits, may be introduced into the host, or genes derived from different organisms may be introduced into the host.
  • an increase in gene expression can be achieved by improving the transcription efficiency of the gene.
  • the increase in gene expression can be achieved by improving the translation efficiency of the gene.
  • the transcription efficiency and translation efficiency of a gene can be improved by, for example, modifying the expression control sequence.
  • “Expression control sequence” is a generic term for sites that influence the expression of genes. Expression control sequences include, for example, a promoter, a Shine-Dalgarno (SD) sequence (also called a ribosome binding site (RBS)), and a spacer region between the RBS and the start codon.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • the expression control sequence can be determined using a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX. Modification of these expression control sequences can be carried out by, for example, a method using a temperature sensitive vector or a Red driven integration method (WO2005 / 010175).
  • the improvement of gene transcription efficiency can be achieved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a stronger promoter.
  • strong promoter is meant a promoter in which transcription of a gene is improved over the naturally occurring wild-type promoter.
  • stronger promoters include artificially modified P54-6 promoter (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)), acetic acid in coryneform bacteria.
  • the activity of the promoter can be enhanced by bringing the -35 and -10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO00 / 18935).
  • highly active promoters include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Federation Federation Patent application 2006134574). Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al.'S paper (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).
  • the translation efficiency of a gene can be improved, for example, by replacing the Shine-Dalgarno (SD) sequence (also called ribosome binding site (RBS)) of the gene on the chromosome with a stronger SD sequence.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • strong SD sequence is meant an SD sequence in which translation of mRNA is improved over the naturally occurring native SD sequence.
  • An example of a stronger SD sequence is the RBS of gene 10 derived from phage T7 (Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235).
  • substitution or insertion or deletion of several nucleotides in the spacer region between the RBS and the start codon, especially in the sequence immediately upstream of the start codon (5'-UTR), may improve mRNA stability and translation efficiency. It is known to have a great influence, and the translation efficiency of a gene can also be improved by modifying these.
  • Improve the translation efficiency of a gene can also be achieved by modifying the codon, for example.
  • the translation efficiency of a gene can be improved by replacing the rare codon present in the gene with a synonymous codon used more frequently. That is, the introduced gene may be modified to have an optimal codon according to the codon usage of the host to be used.
  • the codon substitution can be performed by, for example, a site-directed mutagenesis method. Alternatively, a gene fragment in which the codon is replaced may be totally synthesized.
  • the frequency of codon usage in various organisms can be found in the "codon usage database" (http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)) Is disclosed in.
  • the increase in gene expression can also be achieved by amplifying a regulator that increases gene expression, or by deleting or weakening a regulator that decreases gene expression.
  • Modification such that the activity of the protein is increased can also be achieved by, for example, enhancing the specific activity of the protein.
  • the protein with enhanced specific activity can be obtained by searching various organisms, for example.
  • a highly active form may be obtained by introducing a mutation into a conventional protein.
  • the introduced mutation may be, for example, a substitution, deletion, insertion, and / or addition of one or several amino acids at one or several positions of the protein.
  • the mutation can be introduced, for example, by the site-specific mutation method as described above.
  • the mutation may be introduced by, for example, mutation treatment.
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, ultraviolet irradiation, and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methane sulfonate (EMS), and methyl methane sulfonate (MMS). ) Etc. treatment with a mutagen.
  • DNA may be directly treated with hydroxylamine in vitro to induce random mutation.
  • the enhancement of the specific activity may be used alone, or may be used in any combination with the above-mentioned method for enhancing the expression of a gene.
  • the transformation method is not particularly limited, and conventionally known methods can be used.
  • a method of increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with calcium chloride as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol.Biol. 1970, 53, 159-162) and methods for preparing competent cells from cells in the growth stage and introducing DNA (Duncan, C. H., Wilson, G., as reported for Bacillus subtilis). A. and Young, F. E .., 1977. Gene 1: 153-167) can be used.
  • cells of DNA recipient cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, are made into protoplasts or spheroplasts that readily incorporate the recombinant DNA, and the recombinant DNA is transformed into the DNA recipient.
  • How to introduce (Chang, S. and Sho, N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA75: 1929-1933) can also be applied.
  • the electric pulse method Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791 as reported for coryneform bacteria can be used.
  • the increase in protein activity can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the fact that the activity of the protein has increased can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has increased.
  • the increase in the expression of the gene can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has increased or by confirming that the amount of the protein expressed from the gene has increased.
  • Confirmation that the transcription amount of a gene has increased can be performed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • a non-modified strain such as a wild strain or a parent strain.
  • methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, microarray, RNA-seq, etc. (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of mRNA (for example, the number of molecules per cell) may be increased by, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more that of an unmodified strain.
  • the increase in the amount of protein can be confirmed by western blotting using an antibody (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Third Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of protein (eg, number of molecules per cell) may be increased, eg, 1.5 fold or more, 2 fold or more, or 3 fold or more that of the unmodified strain.
  • the above-mentioned method for increasing the activity of a protein can be used for enhancing the activity of any protein or enhancing the expression of any gene.
  • Method for reducing protein activity A method for reducing protein activity will be described below. The method for reducing the activity of the protein described below can also be used for destroying the wild-type PhoS protein.
  • non-modified strain means a control strain that has not been modified to reduce the activity of the target protein.
  • Non-modified strains include wild strains and parent strains. Specific examples of the non-modified strain include reference strains (type strains) of each bacterial species. Specific examples of the non-modified strain also include the strains exemplified in the explanation of coryneform bacteria.
  • the activity of the protein may be reduced as compared to the reference strain (ie the reference strain of the species to which the bacterium of the present invention belongs).
  • the activity of the protein may be reduced compared to C. glutamicum ATCC 13032.
  • the activity of the protein may be reduced compared to C. glutamicum ATCC 13869.
  • the activity of the protein may be decreased as compared to C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734).
  • the activity of the protein may be decreased as compared with the C. glutamicum YDK010 strain.
  • “the activity of the protein is decreased” includes the case where the activity of the protein is completely lost.
  • the activity of the protein is reduced means that the number of molecules of the protein per cell is reduced and / or the number of molecules of the protein per cell is lower than that of an unmodified strain. It may mean that the function is deteriorated. That is, the term “activity” in the case of “decreasing the activity of a protein” means not only the catalytic activity of a protein but also the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of a gene encoding the protein. May be.
  • the “number of molecules of a protein per cell” may mean an average value of the number of molecules of the same protein per cell.
  • the number of molecules of the protein per cell is reduced includes the case where the protein is not present at all.
  • the function per molecule of the protein is reduced also includes the case where the function per molecule of the protein is completely lost.
  • the degree of decrease in the protein activity is not particularly limited as long as the protein activity is decreased as compared with the unmodified strain.
  • the activity of the protein may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of that of an unmodified strain.
  • Modification such that the activity of the protein is reduced can be achieved by, for example, reducing the expression of a gene encoding the protein.
  • reduced gene expression is meant that the expression of the gene is reduced as compared to the unmodified strain.
  • Reduced expression of a gene specifically means that the expression level of the same gene per cell is reduced as compared with an unmodified strain.
  • the "expression amount of a gene per cell” may mean the average value of the expression amount of the same gene per cell.
  • reduced expression of a gene means, more specifically, a decreased transcription amount (mRNA amount) of a gene, and / or a decreased translation amount (protein amount) of a gene.
  • Gene expression of a gene includes the case where the gene is not expressed at all. Note that “reduction of gene expression” is also referred to as “weakening of gene expression”. Gene expression may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of the unmodified strain.
  • the decrease in gene expression may be due to, for example, a decrease in transcription efficiency, a decrease in translation efficiency, or a combination thereof.
  • the reduction of gene expression can be achieved, for example, by modifying the expression control sequence of the gene.
  • "Expression control sequence” is a generic term for a site that affects gene expression, such as a promoter, a Shine-Dalgarno (SD) sequence (also called a ribosome binding site (RBS)), a spacer region between an RBS and a start codon. Is.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • the expression control sequence can be determined using, for example, a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX.
  • the expression control sequence is preferably modified by 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more.
  • the reduction of gene transcription efficiency can be achieved, for example, by replacing the promoter of the gene on the chromosome with a weaker promoter.
  • weaker promoter is meant a promoter in which transcription of a gene is weaker than the naturally occurring wild-type promoter.
  • weaker promoters include inducible promoters. That is, an inducible promoter may function as a weaker promoter under non-inducing conditions (eg, in the absence of inducer). Further, part or all of the expression control sequence may be deleted (deleted).
  • reduction of gene expression can also be achieved by, for example, manipulating factors involved in expression control.
  • Factors involved in expression control include low molecules (inducers, inhibitors, etc.), proteins (transcription factors, etc.), nucleic acids (siRNA, etc.), etc. involved in transcription and translation control.
  • the reduction of gene expression can also be achieved by, for example, introducing a mutation into the coding region of the gene that reduces the gene expression.
  • the expression of a gene can be reduced by replacing a codon in the coding region of the gene with a synonymous codon used less frequently in the host.
  • gene expression itself may be reduced by gene disruption as described below.
  • Modification such that the activity of the protein is reduced can be achieved by, for example, destroying a gene encoding the protein.
  • Gene disrupted means that the gene is modified so that it does not produce a normally functioning protein.
  • Does not produce a protein that functions normally means that the gene is not produced at all, or that the gene produces a protein with reduced or disappeared function (eg, activity or property) per molecule. Is included.
  • Destruction of a gene can be achieved by, for example, deleting (deleting) a gene on the chromosome.
  • “Deletion of a gene” refers to a deletion of a part or all of the coding region of a gene.
  • the entire gene may be deleted, including the sequences before and after the coding region of the gene on the chromosome.
  • the sequences before and after the coding region of the gene may include, for example, a gene expression regulatory sequence.
  • the region to be deleted may be an N-terminal region (a region encoding the N-terminal side of the protein), an internal region, a C-terminal region (a region encoding the C-terminal side of the protein), etc. It may be any area.
  • the region to be deleted is, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more of the entire coding region of the gene. Alternatively, it may be a region having a length of 95% or more. Further, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match. Reading frame mismatches can result in frameshifts downstream of the deleted region.
  • gene disruption can be performed, for example, by introducing an amino acid substitution (missense mutation) into the coding region of the gene on the chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or adding or deleting one or two bases ( It can also be achieved by introducing (frameshift mutation) (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Science, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological , 20833-20839 (1991)).
  • gene disruption can be achieved, for example, by inserting another base sequence into the coding region of the gene on the chromosome.
  • the insertion site may be in any region of the gene, but a longer nucleotide sequence to be inserted can surely inactivate the gene.
  • the other base sequence is not particularly limited as long as it reduces or eliminates the activity of the encoded protein, and examples thereof include a marker gene such as an antibiotic resistance gene and a gene useful for producing a target substance.
  • Gene disruption may be carried out in particular so that the amino acid sequence of the encoded protein is deleted (deleted).
  • the modification that reduces the activity of the protein may be carried out, for example, by deleting the amino acid sequence of the protein (a part or the whole region of the amino acid sequence). This can be achieved by modifying the gene so as to encode a protein in which a partial or entire region) is deleted.
  • the term “deletion of amino acid sequence of protein” refers to deletion of part or all of the amino acid sequence of protein.
  • the term “deletion of amino acid sequence of protein” means that the original amino acid sequence does not exist in the protein, and also includes the case where the original amino acid sequence is changed to another amino acid sequence.
  • a region in which another amino acid sequence is changed by frame shift may be regarded as a deleted region.
  • deletion of the amino acid sequence of a protein typically shortens the total length of the protein, it is possible that the total length of the protein may be unchanged or extended.
  • the region encoded by the deleted region can be deleted in the amino acid sequence of the encoded protein.
  • the region encoded by the region downstream from the introduction site can be deleted in the amino acid sequence of the encoded protein.
  • a frame shift in the coding region of a gene can delete the region encoded by the frame shift site.
  • Modifying a gene on a chromosome as described above includes, for example, preparing a disrupted gene modified so as not to produce a normally functioning protein, and transforming a host with recombinant DNA containing the disrupted gene. Then, homologous recombination is caused between the disrupted gene and the wild-type gene on the chromosome to replace the wild-type gene on the chromosome with the disrupted gene. At that time, if the recombinant DNA contains a marker gene according to the traits such as auxotrophy of the host, the operation is easy.
  • the disruptive gene a gene in which a part or all of the coding region of the gene is deleted, a gene in which a missense mutation is introduced, a gene in which a nonsense mutation is introduced, a gene in which a frameshift mutation is introduced, a transposon or a marker gene, etc.
  • the gene in which the insertion sequence of The protein encoded by the disruption-type gene has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein even if it is produced, and its function is reduced or lost.
  • the structure of the recombinant DNA used for homologous recombination is not particularly limited as long as homologous recombination occurs in a desired manner.
  • a host is transformed with a linear DNA containing a disruption-type gene, and the linear DNA having the upstream and downstream sequences of the wild-type gene on the chromosome at both ends is transformed into the upstream and downstream of the wild-type gene.
  • the wild-type gene can be replaced with the disrupted gene by causing homologous recombination.
  • Gene disruption by gene replacement using such homologous recombination has already been established, and a method called “Red-driven integration” (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645 (2000)), Red driven integration method and ⁇ phage-derived excision system (Cho, E.
  • the modification that reduces the activity of the protein may be carried out, for example, by a mutation treatment.
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, ultraviolet irradiation, and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methane sulfonate (EMS), and methyl methane sulfonate (MMS). ) Etc. treatment with a mutagen.
  • the decrease in protein activity can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the decrease in protein activity can also be confirmed by confirming the decrease in expression of the gene encoding the protein.
  • the decrease in the expression of the gene can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has decreased or by confirming that the amount of the protein expressed from the gene has decreased.
  • Confirmation that the transcription amount of a gene has decreased can be performed by comparing the amount of mRNA transcribed from the gene with an unmodified strain.
  • Examples of the method for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, microarray, RNA-Seq, etc. (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of mRNA may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of the unmodified strain.
  • Confirmation that the amount of protein has decreased can be performed by performing SDS-PAGE and confirming the intensity of the separated protein band.
  • the decrease in the amount of protein can be confirmed by Western blotting using an antibody (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Laboratory Manual / Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001).
  • the amount of protein (eg, number of molecules per cell) may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% of the unmodified strain.
  • the fact that a gene has been destroyed can be confirmed by determining the base sequence of part or all of the gene, the restriction enzyme map, the full length, etc., depending on the method used for the destruction.
  • the above-mentioned method of reducing the activity of a protein can be used to reduce the activity of any protein or the expression of any gene.
  • a secretory protein is generally translated as a preprotein (also referred to as prepeptide) or a preproprotein (also referred to as prepropeptide), and then , Is known to become a mature protein by processing.
  • a secretory protein is generally translated as a preprotein or preproprotein, and then a signal peptide that is a premoiety is cleaved by a protease (generally called a signal peptidase) to be converted into a mature protein or a proprotein.
  • the proprotein is further cleaved at the pro portion by a protease to become a mature protein. Therefore, in the method of the present invention, a signal peptide is used for secretory production of a heterologous protein.
  • the secretory protein preprotein and preproprotein may be collectively referred to as "secretory protein precursor".
  • the gene construct used in the present invention comprises, in the 5 ′ to 3 ′ direction, a promoter sequence that functions in a coryneform bacterium, a nucleic acid sequence that encodes a TorA signal peptide, and a nucleic acid sequence that encodes a heterologous protein.
  • the nucleic acid sequence encoding the TorA signal peptide may be linked downstream of the promoter sequence so that the TorA signal peptide is expressed under the control of the promoter.
  • the nucleic acid sequence encoding the heterologous protein may be linked downstream of the nucleic acid sequence encoding the TorA signal peptide so that the heterologous protein is expressed as a fusion protein with the signal peptide.
  • the fusion protein is also referred to as “fusion protein of the present invention”.
  • a heterologous protein in which the TorA signal peptide is completely removed is secreted and produced. That is, the finally obtained heterologous protein does not have the TorA signal peptide. Therefore, "heterologous protein is expressed as a fusion protein with the TorA signal peptide” means that the heterologous protein constitutes a fusion protein with the TorA signal peptide at the time of expression, and the finally obtained heterologous protein is It does not mean that it constitutes a fusion protein with the TorA signal peptide.
  • the nucleic acid sequence may be read as “gene”.
  • a nucleic acid sequence encoding a heterologous protein is also referred to as a “gene encoding a heterologous protein” or a “heterologous protein gene”.
  • the nucleic acid sequence includes DNA.
  • the gene construct used in the present invention has a control sequence (operator, SD sequence, terminator, etc.) effective for expressing the fusion protein of the present invention in a coryneform bacterium at an appropriate position so that they can function. May have.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it is a promoter that functions in coryneform bacteria.
  • the promoter may be a promoter derived from coryneform bacteria (for example, derived from a host) or a promoter derived from a different species.
  • the promoter may be the native promoter of the heterologous protein gene or the promoter of another gene.
  • the “promoter that functions in coryneform bacteria” refers to a promoter that has a promoter activity in coryneform bacteria.
  • heterologous promoter examples include E. coli-derived promoters such as tac promoter, lac promoter, trp promoter, and araBAD promoter. Among them, strong promoters such as tac promoter and inducible promoters such as araBAD promoter are preferable.
  • promoters derived from coryneform bacteria include gene promoters of PS1, PS2 (also called CspB) and SlpA (also called CspA), which are cell surface proteins, and promoters of various amino acid biosynthesis genes.
  • Specific examples of the promoter of various amino acid biosynthesis genes include, for example, glutamate dehydrogenase gene of glutamate biosynthesis system, glutamine synthetase gene of glutamine synthesis system, aspartokinase gene of lysine biosynthesis system, threonine biosynthesis.
  • Homoserine dehydrogenase gene isoleucine and valine biosynthesis acetohydroxy acid synthase gene, leucine biosynthesis 2-isopropylmalate synthase gene, proline and arginine biosynthesis glutamate kinase gene, histidine biosynthesis Phosphoribosyl-ATP Pyrophosphorylase gene, such as tryptophan, tyrosine and phenylalanine.
  • Aromatic amino acid biosynthesis system Deoxyarabinoheptulonate phosphate (DAHP) synthase gene, such as inosinate and guanylate Examples include promoters of phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) amide transferase gene, inosinate dehydrogenase gene, and guanylate synthase gene in a nucleic acid biosynthesis system.
  • DAHP Deoxyarabinoheptulonate phosphate
  • promoters that function in coryneform bacteria include the stronger promoters that can be used in coryneform bacteria as described above.
  • various reporter genes may be used to obtain and use a highly active form of a conventional promoter.
  • the promoter activity can be increased by bringing the -35 and -10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO00 / 18935).
  • Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al.'S paper (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)).
  • TorA signal peptide is a Tat system-dependent signal peptide.
  • Tat system-dependent signal peptide refers to a signal peptide recognized by the Tat system.
  • the “Tat system-dependent signal peptide” may specifically be a peptide in which the protein is secreted by the Tat system secretory apparatus when linked to the N-terminus of the protein of interest.
  • the Tat system-dependent signal peptide has a twin arginine motif. Examples of the twin arginine motif include R-R-X-#-# (#: hydrophobic residue) (SEQ ID NO: 45).
  • the TorA signal peptide includes a signal peptide of the TorA protein (trimethylamine-N-oxidoreductase) of bacteria of the Enterobacteriaceae family such as E. coli.
  • the amino acid sequence of the E. coli TorA signal peptide is "MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA (SEQ ID NO: 46)".
  • the TorA signal peptide may be a variant of the TorA signal peptide exemplified above as long as it has a twin arginine motif and the original function is maintained.
  • the TorA signal peptide and the variant of the gene encoding the same the above description regarding the conservative variants of the LepB protein and lepB gene can be applied.
  • the TorA signal peptide has an amino acid sequence in which one or several amino acids at one or several positions are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence of the TorA signal peptide exemplified above. It may be a peptide.
  • TorA signal peptide is specifically, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, further preferably 1 to 3, particularly preferably 1 Means ⁇ 2
  • TorA signal peptide with respect to the entire amino acid sequence of the TorA signal peptide exemplified above, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably It may be a peptide having an amino acid sequence having 99% or higher identity.
  • the term “TorA signal peptide” is intended to include the peptide set forth in SEQ ID NO: 46 and conservative variants thereof.
  • Whether a certain peptide has a function as a Tat system-dependent signal peptide is, for example, to confirm that the secretory production amount of a protein in which the peptide is added to the N-terminus is increased by enhancing the Tat system secretory apparatus, It can be confirmed by confirming that the secretory production amount of the protein in which the peptide is added to the N-terminus is reduced by the lack of Tat-type secretory apparatus.
  • the nucleic acid sequence encoding the TorA signal peptide is not particularly limited as long as it encodes the TorA signal peptide as described above.
  • heterologous protein secreted and produced by the method of the present invention examples include physiologically active proteins, receptor proteins, antigen proteins used as vaccines, enzymes, and other arbitrary proteins.
  • Examples of the enzyme include transglutaminase, protein glutaminase, isomaltdextranase, protease, endopeptidase, exopeptidase, aminopeptidase, carboxypeptidase, collagenase, chitinase and the like.
  • transglutaminase examples include Streptoverticillium mobaraense IFO 13819 (WO01 / 23591), Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852, Streptoverticillium Griseocarneum IFO 12776, Streptomyces lydicus (Actinomycetes), such as mycobacterial fungi (96), Omycetes, and the like, such as Omycetes, such as 96, Omycetes, and Oomycetes.
  • Examples of transglutaminase examples include transglutaminase.
  • protein glutaminase include protein glutaminase of Chryseobacterium proteolyticum (WO2005 / 103278).
  • isomaltdextranase examples include, for example, Arthrobacter globiformis isomaltdextranase (WO2005 / 103278).
  • bioactive proteins include growth factors (growth factors), hormones, cytokines, and antibody-related molecules.
  • growth factor examples include epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), and transforming growth factor.
  • TGF Transforming growth factor
  • Nerve growth factor NGF
  • Brain-derived neurotrophic factor BDNF
  • Vascular endothelial growth factor VEGF
  • G-CSF Granulocyte Colony stimulating factor
  • GM-CSF Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor
  • PDGF Platelet-derived growth factor
  • Erythropoietin Erythropoietin
  • EPO thrombopoietin
  • TPO acidic fibroblast growth factor
  • aFGF or FGF1 Basic fibroblast growth factor
  • bFGF or FGF2 Basic fibroblast growth factor
  • keratinocyte growth factor Keratinocyte growth factor
  • Hepatocyte growth factor Hepatocyte growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • hormones for example, insulin, glucagon, somatostatin (somatostatin), human growth hormone (human growth hormone; hGH), parathyroid hormone (parathyroid hormone; PTH), calcitonin (calcitonin), exenatide (exenatide) Can be mentioned.
  • cytokines include interleukins, interferons, and tumor necrosis factor (Tumor Necrosis Factor; TNF).
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • growth factors growth factors
  • hormones and cytokines
  • the physiologically active protein may belong to any one group selected from growth factors (growth factors), hormones, and cytokines, and may belong to a plurality of groups selected from them. Good.
  • the bioactive protein may be the whole protein or a part thereof.
  • the protein include a portion having a physiological activity.
  • Specific examples of the physiologically active moiety include the physiologically active peptide Teriparatide consisting of the N-terminal 34 amino acid residues of the mature form of parathyroid hormone (PTH).
  • the antibody-related molecule refers to a protein containing a molecular species consisting of a single domain selected from domains constituting a complete antibody or a combination of two or more domains. Domains that make up a complete antibody include the heavy chain domains VH, CH1, CH2, and CH3, and the light chain domains VL and CL.
  • the antibody-related molecule may be a monomeric protein or a multimeric protein as long as it includes the above-mentioned molecular species. When the antibody-related molecule is a multimeric protein, it may be a homomultimer composed of a single type of subunit, or a heteromultimer composed of two or more types of subunits. Good.
  • the antibody-related molecule include complete antibody, Fab, F (ab ′), F (ab ′) 2 , Fc, a dimer composed of a heavy chain (H chain) and a light chain (L chain). , Fc fusion protein, heavy chain (H chain), light chain (L chain), single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2 , disulfide bond Fv (sdFv), Diabody, VHH fragment (Nanobody (registered trademark)) Is mentioned.
  • Specific examples of the antibody-related molecule include trastuzumab (Trastuzumab), adalimumab (Adalimumab), and nivolumab (Nivolumab).
  • the receptor protein is not particularly limited, and may be, for example, a receptor protein for a physiologically active protein or other physiologically active substance. Examples of other physiologically active substances include neurotransmitters such as dopamine.
  • the receptor protein may also be an orphan receptor for which the corresponding ligand is unknown.
  • the antigen protein used as a vaccine is not particularly limited as long as it can elicit an immune response, and may be appropriately selected depending on the intended target of the immune response.
  • LFABP Liver-type fatty acid-binding protein
  • fluorescent protein include Green Fluorescent Protein (GFP).
  • immunoglobulin-binding proteins include Protein A, Protein G, Protein L.
  • albumin include human serum albumin.
  • Extracellular proteins include fibronectin, vitronectin, collagen, osteopontin, laminin, and their partial sequences.
  • Laminin is a protein having a heterotrimeric structure consisting of an ⁇ chain, a ⁇ chain, and a ⁇ chain.
  • laminin include mammalian laminin. Examples of mammals include humans, monkeys, primates such as chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, rabbits, horses, cows, sheep, goats, pigs, dogs, cats, and other various mammals. To be Mammals include in particular humans.
  • the laminin subunit chains include five types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 5), three types of ⁇ chains ( ⁇ 1 to ⁇ 3), and three types of ⁇ chains ( ⁇ 1). To ⁇ 3) are included.
  • Laminin constitutes various isoforms by the combination of these subunit chains.
  • Specific examples of the laminin include, for example, laminin 111, laminin 121, laminin 211, laminin 213, laminin 221, laminin 311, laminin 321, laminin 332, laminin 411, laminin 421, laminin 423, laminin 511, laminin 521, laminin. 523 is mentioned.
  • laminin E8 which is an E8 fragment of laminin can be mentioned.
  • Laminin E8 specifically has a heterotrimeric structure consisting of an ⁇ chain E8 fragment ( ⁇ chain E8), a ⁇ chain E8 fragment ( ⁇ chain E8), and a ⁇ chain E8 fragment ( ⁇ chain E8). It is a protein that has.
  • the subunit chains of laminin E8 ie, ⁇ chain E8, ⁇ chain E8, and ⁇ chain E8) are also collectively referred to as “E8 subunit chain”. Examples of the E8 subunit chain include the E8 fragment of the laminin subunit chain exemplified above.
  • Laminin E8 constitutes various isoforms by the combination of these E8 subunit chains.
  • laminin E8 examples include laminin 111E8, laminin 121E8, laminin 211E8, laminin 221E8, laminin 332E8, laminin 421E8, laminin 411E8, laminin 511E8, and laminin 521E8.
  • heterologous proteins such as these proteins can be used as they are or after being appropriately modified.
  • the gene encoding the heterologous protein can be modified, eg, depending on the host used and / or to obtain the desired activity.
  • a gene encoding a heterologous protein may be modified so that the amino acid sequence of the encoded heterologous protein contains one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, and / or additions.
  • the above description regarding the variants of the LepB protein and lepB gene can be applied correspondingly to the heterologous protein secreted and produced by the method of the present invention and the gene encoding the same.
  • the protein specified in the biological species of origin is not limited to the protein itself found in the biological species, but includes proteins having the amino acid sequence of the protein found in the biological species and variants thereof.
  • the variants may or may not be found in the species of interest. That is, for example, "human-derived protein” is not limited to the protein itself found in humans, but includes proteins having the amino acid sequence of the protein found in humans and variants thereof.
  • the gene encoding the heterologous protein may be one in which any codon is replaced with a codon equivalent thereto.
  • a gene encoding a heterologous protein may be modified to have an optimal codon depending on the codon usage of the host used.
  • the N-terminal region of the heterologous protein finally obtained by the method of the present invention may or may not be the same as the natural protein as long as the TorA signal peptide is completely removed. Good.
  • the N-terminal region of the finally obtained heterologous protein may have an extra addition or deletion of one or several amino acids as compared with the naturally occurring protein.
  • the above-mentioned "1 or several" varies depending on the total length and structure of the heterologous protein of interest, but specifically, it is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. It means one, particularly preferably one to three.
  • the heterologous protein secreted and produced may be a protein to which a pro-structure portion is added (proprotein). If the heterologous protein secreted and produced is a proprotein, the finally obtained heterologous protein may or may not be a proprotein. That is, the proprotein may be cleaved at the prostructure to become a mature protein. Cleavage can be performed with, for example, a protease. When using a protease, it is generally preferable that the proprotein be cleaved at almost the same position as the natural protein, from the viewpoint of the activity of the finally obtained protein, and the proprotein should be cleaved at exactly the same position as the natural protein. More preferably, a mature protein identical to the natural one is obtained.
  • proteases that cleave the proprotein at positions that result in the same protein as the naturally occurring mature protein are most preferred.
  • the N-terminal region of the finally obtained heterologous protein may not be identical to the naturally occurring protein.
  • a protein having an N-terminal longer or shorter by one to several amino acids than a naturally occurring protein may have more appropriate activity.
  • Proteases that can be used in the present invention include those that are commercially available such as Dispase (manufactured by Boehringer Mannheim), as well as those obtained from a culture solution of a microorganism, such as a culture solution of actinomycetes. Such a protease may be used in an unpurified state, or may be used after being purified to an appropriate purity if necessary.
  • the method for introducing the gene construct used in the present invention into coryneform bacteria is not particularly limited.
  • “Introduction of the gene construct used in the present invention” refers to allowing the host to retain the gene construct.
  • the “introduction of the gene construct used in the present invention” is not limited to the case where the previously constructed gene construct is introduced into the host all at once, and at least a heterologous protein gene is introduced into the host, and the gene construct is introduced in the host. Is also included.
  • the gene construct used in the present invention may be present on a vector that autonomously propagates extrachromosomally such as a plasmid, or may be integrated on the chromosome.
  • the introduction of the gene construct used in the present invention can be performed, for example, in the same manner as the introduction of the gene in the above-described method for increasing the expression of the gene.
  • introduction of the genetic construct used in the present invention, increase of activity of LepB protein, and other modifications can be performed in any order.
  • the gene construct used in the present invention can be introduced into a host using, for example, a vector containing the gene construct.
  • the gene construct used in the present invention can be ligated to a vector to construct an expression vector of the gene construct, and the host can be transformed with the expression vector to introduce the gene construct into the host.
  • the expression vector of the gene construct used in the present invention can also be obtained by linking the nucleotide sequence encoding the fusion protein of the present invention downstream of the promoter. Can be built.
  • the vector is not particularly limited as long as it is capable of autonomous replication in coryneform bacteria.
  • the vectors that can be used in coryneform bacteria are as described above.
  • the gene construct used in the present invention can be introduced into the host chromosome by using a transposon such as an artificial transposon.
  • a transposon such as an artificial transposon.
  • the gene construct used in the present invention is introduced into the chromosome by homologous recombination or its own transposition ability.
  • the gene construct used in the present invention can be introduced into the host chromosome by an introduction method utilizing homologous recombination. Examples of the introduction method utilizing homologous recombination include a method using a linear DNA, a plasmid containing a temperature-sensitive origin of replication, a plasmid capable of conjugative transfer, or a suicide vector having no origin of replication that functions in the host. Can be mentioned.
  • At least a heterologous protein gene may be introduced on the chromosome to construct the gene construct used in the present invention on the chromosome.
  • some or all of the components of the gene construct used in the present invention other than the heterologous protein gene may be originally present on the chromosome of the host.
  • the promoter sequence originally present on the host chromosome is used as it is, and only the gene connected downstream of the promoter sequence is replaced with the nucleic acid sequence encoding the TorA signal peptide and the target heterologous protein gene.
  • the gene construct used in the present invention can be constructed on the chromosome, and the bacterium of the present invention can be constructed.
  • the introduction of a heterologous protein gene or the like into a part of the chromosome of the gene construct used in the present invention can be performed in the same manner as the introduction of the gene construct used in the present invention into the chromosome.
  • the gene construct and its constituents (promoter sequence, nucleic acid sequence encoding TorA signal peptide, nucleic acid sequence encoding heterologous protein, etc.) used in the present invention can be obtained by, for example, cloning.
  • a heterologous protein gene is obtained by cloning from an organism having a heterologous protein of interest, and modifications such as introduction of a base sequence encoding a TorA signal peptide and introduction of a promoter sequence are carried out and used in the present invention. Can be obtained.
  • the gene construct and its constituents used in the present invention can also be obtained by chemical synthesis (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)). The obtained gene construct and its constituent elements can be used as they are or after being appropriately modified.
  • the gene construct for secretory expression of each protein may be retained in the bacterium of the present invention so that the secretory expression of the target heterologous protein can be achieved.
  • all of the gene constructs for secretory expression of each protein may be held on a single expression vector, or all may be held on the chromosome.
  • the gene construct for secretory expression of each protein may be separately held on a plurality of expression vectors, or may be separately held on a single or a plurality of expression vectors and on a chromosome. “When expressing two or more kinds of proteins” means, for example, a case where two or more kinds of heterologous proteins are secreted and produced, or a case where a heteromultimeric protein is secreted and produced.
  • the method for introducing the gene construct used in the present invention into a coryneform bacterium is not particularly limited, and a commonly used method such as the protoplast method (Gene, 39, 281-286 (1985)), the electroporation method (Bio / Technology, 7, 1067-1070 (1989)), the electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791), etc. can be used.
  • the bacterium of the present invention can be cultivated according to the methods and conditions usually used.
  • the bacterium of the present invention can be cultured in an ordinary medium containing a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic ion. If necessary, organic micronutrients such as vitamins and amino acids can be added to obtain higher growth.
  • the carbon source carbohydrates such as glucose and sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols, etc. can be used.
  • the nitrogen source ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt, etc. can be used.
  • the inorganic ion calcium ion, magnesium ion, phosphate ion, potassium ion, iron ion and the like are appropriately used as necessary.
  • the culture is carried out under an aerobic condition in an appropriate range of pH 5.0 to 8.5 and 15 ° C to 37 ° C, and the culture is performed for about 1 to 7 days.
  • the culture conditions for L-amino acid production of coryneform bacteria and the conditions described in the method for secretory production of proteins using signal peptides can be used (see WO01 / 23591, WO2005 / 103278).
  • a promoter inducer may be added to the medium for culturing.
  • the produced heterologous protein is secreted outside the microbial cell, for example, a protein that is generally lethal when accumulated in a large amount in the microbial cell of a microorganism such as transglutaminase also has a lethal effect. Can be continuously produced without receiving.
  • the protein secreted into the medium by the method of the present invention can be separated and purified from the medium after culture according to the method well known to those skilled in the art. For example, after removing cells by centrifugation, salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, medium and high pressure liquid chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobicity. It can be separated and purified by a known appropriate method such as chromatography or a combination thereof. In some cases, the culture or culture supernatant may be used as it is.
  • the protein secreted in the cell surface layer by the method of the present invention is the same as that secreted into the medium after being solubilized by a method well known to those skilled in the art, for example, by increasing the salt concentration, using a surfactant, etc. Can be separated and purified.
  • the protein secreted in the cell surface may be used as, for example, an immobilized enzyme without being solubilized.
  • the secreted production of the target heterologous protein can be confirmed by performing SDS-PAGE using the culture supernatant and / or the fraction containing the cell surface layer as a sample and confirming the molecular weight of the separated protein band.
  • the secretory production of the target heterologous protein can be confirmed by Western blotting using an antibody using the culture supernatant and / or the fraction containing the cell surface as a sample (Molecular cloning (Cold Spring Laboratory Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)).
  • the secretory production of the target heterologous protein can be confirmed by detecting the N-terminal amino acid sequence of the target protein using a protein sequencer.
  • the secretory production of the target heterologous protein can be confirmed by determining the mass of the target protein using a mass spectrometer.
  • the secretory production of the heterologous protein of interest means that the culture supernatant and / or the fraction containing the cell surface layer is It can be confirmed as a sample by measuring the enzymatic activity or physiological activity of the target heterologous protein.
  • Example 1 Construction of vector for amplifying C. glutamicum ATCC13869-derived signal peptidase gene (lepB)
  • the genomic sequence of C. glutamicum ATCC13869 strain and the nucleotide sequence of lepB gene encoding Type I signal peptidase (LepB) have already been determined.
  • GenBank Accession No. AP017557, NCBI locus_tag CGBL_0119390 The nucleotide sequence of the lepB gene derived from the C. glutamicum ATCC13869 strain is shown in ⁇ SEQ ID NO: 01>, and the amino acid sequence of the LepB protein is shown in ⁇ SEQ ID NO: 02>.
  • This PCR fragment was digested with restriction enzymes KpnI and XbaI and inserted into the KpnI-XbaI site of the pPK5 vector described in WO2016 / 171224 by a ligation reaction to construct a vector pPK5lepB for amplifying lepB gene.
  • the vector pPK6lepB for tatABC secretory apparatus gene and lepB gene amplification was built.
  • the pPK5 vector is a vector obtained by modifying the NaeI restriction enzyme site in the pPK4 vector described in JP-A-9-322774
  • the pPK6 vector is a vector for TatABC secretion apparatus amplification in which the tatABC gene is mounted on the pPK5 vector (Fig. 1). Panels A and C).
  • Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • the loading order of the expression cassette of the lepB gene and the target protein can be regulated (Fig. 1 panels B and D).
  • Example 2 Evaluation of lepB gene amplification effect on secretory expression of transglutaminase (PTG) with a pro structure using a TorA signal sequence
  • Secretion expression YDK010 :: phoS (W302C) / pPK6_T_PTG strain described in WO2016 / 171224 was added to MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin (glucose 120 g, magnesium sulfate heptahydrate 3 g, ammonium sulfate 30 g, phosphorus Potassium dihydrogen acid 1.5 g, iron sulfate heptahydrate 0.03 g, manganese sulfate pentahydrate 0.03 g, thiamine hydrochloride 0.45 mg, biotin 0.45 mg, DL-methionine 0.15 g, soy hydrochloric acid hydroly
  • pPK6_T_PTG is a vector for secretory expression of transglutaminase (PTG) with a pro-structure part constructed from the tatABC gene amplification vector pPK6, and a promoter derived from the cspB gene of C. glutamicum ATCC13869 strain, downstream of the promoter.
  • the YDK010 :: phoS (W302C) strain is a PhoS (W302C) mutation in the phoS gene on the chromosome of YDK010 strain (WO2002 / 081694), which is a defective strain of the cell surface protein CspB of C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734). Is a strain introduced with (WO2016 / 171224). After completion of the culture, 1.0 ⁇ l of the culture supernatant obtained by centrifuging the culture solution was subjected to reducing SDS-PAGE using MULTIGEL (R) II mini 15/20 (Cosmo Bio), and then SYPRO (R) Orange.
  • the plasmids pPK6lepB (K) _T_PTG and pPK6lepB (A) _T_PTG were constructed (FIG. 1, panel D).
  • the plasmid names (K) and (A) represent the restriction enzyme sites (KpnI site and ApaI site) of the pPK6lepB vector into which the PTG expression cassette was inserted.
  • the In-Fusion (R) HD Cloning Kit (Takara Bio) was used for the infusion reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the vendor. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected genes were inserted. Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • Each of the obtained transformants was cultured in an MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C. for 72 hours. After culturing, 1.0 ⁇ l of the culture supernatant obtained by centrifuging each culture was subjected to reducing SDS-PAGE using MULTIGEL (R) II mini 15/20 (Cosmo Bio), and then SYPRO (R). Staining was performed with Orange (Thermo Fisher Scientific).
  • Example 3 Evaluation of lepB gene amplification effect in secretory expression of protein glutaminase (PPG) with a pro-structured portion using TorA signal sequence
  • PPG protein glutaminase
  • TorA signal sequence a pro-structured portion using TorA signal sequence
  • pPK6_T_PPG is a vector for secretory expression of protein glutaminase (PPG) with a pro-structure part constructed from the tatABC gene amplification vector pPK6, and a promoter derived from the cspB gene of C. glutamicum ATCC13869 strain, downstream of the promoter.
  • PPG protein glutaminase
  • Plasmids pPK6lepB (K) _T_PPG and pPK6lepB (A) _T_PPG were constructed (Panel D in Figure 1).
  • the plasmid names (K) and (A) represent the restriction enzyme sites (KpnI site and ApaI site) of the pPK6lepB vector into which the PPG expression cassette was inserted.
  • the In-Fusion (R) HD Cloning Kit (Takara Bio) was used for the infusion reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the vendor. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected genes were inserted. Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • Each of the obtained transformants was cultured in an MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, 2.5 ⁇ l of the culture supernatant obtained by centrifuging each culture was subjected to reducing SDS-PAGE using MULTIGEL (R) II mini 15/20 (Cosmo Bio), and then SYPRO (R). Staining was performed with Orange (Thermo Fisher Scientific).
  • Example 4 Evaluation of lepB gene amplification effect on ⁇ -lactamase (Bla) secretion expression using TorA signal sequence
  • Bla a co-expression plasmid for TEM-
  • the amino acid sequence of the TEM-type class A broad-spectrum ⁇ -lactamase TEM-116, which is a type of ⁇ -lactamase (hereinafter referred to as Bla) is already known.
  • the amino acid sequence of 263 residues at positions 24-286 excluding the N-terminal signal sequence is shown in ⁇ SEQ ID NO: 11>.
  • the nucleotide sequence encoding Bla of SEQ ID NO: 11 was designed.
  • the designed nucleotide sequence is shown in ⁇ SEQ ID NO: 12>.
  • pPK6_T_Bla which is a Bla secretory expression plasmid using the TorA signal sequence (FIG. 1, panel C).
  • pPK6_T_Bla a Bla secretory expression plasmid using the TorA signal sequence (FIG. 1, panel C).
  • Plasmids pPK6lepB (K) _T_Bla and pPK6lepB (A) _T_Bla were constructed (Panel D in Figure 1).
  • the plasmid names (K) and (A) represent the restriction enzyme sites (KpnI site and ApaI site) of the pPK6lepB vector into which the Bla expression cassette was inserted.
  • the In-Fusion (R) HD Cloning Kit (Takara Bio) was used for the infusion reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the vendor. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected genes were inserted. Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • Each of the obtained transformants was cultured in an MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C. for 72 hours. After culturing, 5.0 ⁇ l of the culture supernatant obtained by centrifuging each culture was subjected to reducing SDS-PAGE using NuPAGE (R) 4-12% Bis-Tirs Gel (Thermo Fisher Scientific). Staining was performed with SYPRO (R) Ruby (Thermo Fisher Scientific).
  • Trx thioredoxin
  • the DNA encoding the 39 amino acid residues of the signal peptide of the TorA protein (UniProtAccession number: P33225) derived from E.coli downstream of the promoter of the cspB gene derived from C.glutamicum ATCC13869 strain and ⁇ SEQ ID NO: 16> was ligated, the KpnI site was added to the 5'-side, and the ApaI site was added to the 3'-side, and the expression cassette of the fusion protein of the TorA signal peptide and Trx was totally synthesized.
  • TrP secretory expression plasmid pPK6_T_Trx (FIG. 1, panel C).
  • the Trx gene expression cassette as designed was constructed. Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • Trx Secretion Expression Vector Using the Trx secretory expression vector pPK6_T_Trx constructed in Example 5 (1) as a template, ⁇ SEQ ID NO: 05> and ⁇ SEQ ID NO: 17> primers, or ⁇ Using the primers of SEQ ID NO: 07> and ⁇ SEQ ID NO: 18>, a DNA fragment of about 1.1 kbp containing the expression cassette of cspB promoter-TorA signal sequence-Trx was amplified by PCR.
  • the plasmids pPK6lepB (K) _T_Trx and pPK6lepB (A) _T_Trx were constructed (panel D of FIG. 1).
  • the plasmid names (K) and (A) represent the restriction enzyme sites (KpnI site and ApaI site) of the pPK6lepB vector into which the Trx expression cassette was inserted.
  • the In-Fusion (R) HD Cloning Kit (Takara Bio) was used for the infusion reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the vendor. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected genes were inserted. Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • Tr2016 secretion expression plasmids pPK6lepB (K) _T_Trx and pPK6lepB (A) _T_Trx constructed in Example 5 (3) were used to WO2016 / 171224.
  • YDK010 was transformed to obtain the YDK010 :: phoS (W302C) / pPK6lepB (K) _T_Trx strain and the YDK010 :: phoS (W302C) / pPK6lepB (A) _T_Trx strain.
  • Each of the obtained transformants was cultured in an MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C. for 72 hours.
  • Trx secretion production using the TorA signal sequence under the non-amplification condition of the lepB gene, a residual residue of the C-terminal 15 residues of the TorA signal peptide remains, but by amplification of the lepB gene, the TorA signal peptide It was found that processing can be promoted and the production efficiency of Trx having the correct N-terminal amino acid sequence can be significantly improved.
  • Example 6 Evaluation of lepB gene amplification effect on secretory expression of Liver-type fatty acid-binding protein (LFABP) using TorA signal sequence
  • LFABP Liver-type fatty acid-binding protein
  • DNA encoding the 39 amino acid residues of the signal peptide of the E. coli-derived TorA protein (UniProtAccession number: P33225) downstream of the promoter of the cspB gene derived from C. glutamicum ATCC13869 strain and described in ⁇ SEQ ID NO: 20> was ligated, and a KpnI site was added to the 5'-side and an ApaI site was added to the 3'-side, and an expression cassette of a fusion protein of the TorA signal peptide and LFABP was totally synthesized.
  • the totally synthesized DNA fragment was inserted into the KpnI-ApaI site of the pPK6 vector described in WO2016 / 171224 to construct a secretory expression plasmid of LFABP, pPK6_T_LFABP (FIG. 1, panel C).
  • a secretory expression plasmid of LFABP LFABP
  • pPK6_T_LFABP LFABP gene expression cassette as designed was constructed.
  • Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • the amino acid sequence (GMLGPSLLTP; SEQ ID NO: 47) showing that the C-terminal 15 residues of the TorA signal sequence remains at the N-terminal of LFABP in the high-molecular side band ), And the N-terminal sequence (APDSDWDRLA; SEQ ID NO: 52) of the mature protein of C. glutamicum-derived resuscitation-promoting factor Rpf1 (GenBank Accession No. AP017557, NCBI locus_tag CGBL_0109030) is detected, and the high molecular weight band is mainly It was confirmed to be a mixed band of these two proteins (FIG. 6, panel B).
  • the primers of ⁇ SEQ ID NO: 05> and ⁇ SEQ ID NO: 21> are designed with the restriction enzyme KpnI recognition sequence
  • the primers of ⁇ SEQ ID NO: 07> and ⁇ SEQ ID NO: 22> are designed with the restriction enzyme ApaI recognition sequence.
  • PrimeSTAR (R) HS DNA Polymerase (Takara Bio) was used for PCR, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • Plasmids pPK6lepB (K) _T_LFABP and pPK6lepB (A) _T_FABP were constructed (Panel D in Figure 1).
  • the plasmid names (K) and (A) represent the restriction enzyme sites (KpnI site and ApaI site) of the pPK6lepB vector into which the LFABP expression cassette was inserted.
  • the In-Fusion (R) HD Cloning Kit (Takara Bio) was used for the infusion reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the vendor. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected genes were inserted. Nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • YDK010 was transformed to obtain the YDK010 :: phoS (W302C) / pPK6lepB (K) _T_LFABP strain and the YDK010 :: phoS (W302C) / pPK6lepB (A) _T_LFABP strain.
  • Each of the obtained transformants was cultured in an MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C. for 72 hours. After culturing, 5.0 ⁇ l of the culture supernatant obtained by centrifuging each culture was subjected to reducing SDS-PAGE using NuPAGE (R) 4-12% Bis-Tirs Gel (Thermo Fisher Scientific).
  • the N-terminal amino acid sequence of LFABP (MSFSGKYQLQ; SEQ ID NO: 53) was confirmed in the low molecular weight band. That is, in LFABP secretory production using a TorA signal sequence, under the non-amplification condition of lepB gene, a residual residue of the C-terminal 15 residues of the TorA signal peptide remains, but by amplification of the lepB gene of the TorA signal peptide It was found that processing can be promoted and the production efficiency of LFABP having the correct N-terminal amino acid sequence can be significantly improved.
  • Example 7 Evaluation of lepB gene amplification effect on secretory expression of transglutaminase (PTG) with pro-structure part using SlpA signal sequence
  • PTG transglutaminase
  • the recognition sequences for the restriction enzyme KpnI are designed in the primers of ⁇ SEQ ID NO: 23> and ⁇ SEQ ID NO: 24>, respectively.
  • PrimeSTAR (R) HS DNA Polymerase (Takara Bio) was used for PCR, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • This DNA fragment was inserted into the KpnI site of the pPK5 vector described in WO2016 / 171224 by an infusion reaction to construct pPK5_S_PTG which is a PTG secretory expression vector using the SlpA signal sequence (FIG. 1, panel A).
  • In-Fusion (R) HD Cloning Kit (Takara Bio) was used for the infusion reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer.
  • nucleotide sequence of the inserted fragment As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected gene had been inserted.
  • the nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • the ⁇ SEQ ID NO: 23> and ⁇ SEQ ID NO: 25> primers are designed with a restriction enzyme KpnI recognition sequence
  • the ⁇ SEQ ID NO: 26> and ⁇ SEQ ID NO: 27> primers are designed with a restriction enzyme ApaI recognition sequence.
  • PrimeSTAR (R) HS DNA Polymerase (Takara Bio) was used for PCR, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer. These DNA fragments were inserted into the KpnI site or the ApaI site of the pPK5lepB vector constructed in Example 1 by an infusion reaction to obtain the lepB gene and pPK5lepB which is a co-expression vector for PTG secretion using the SlpA signal sequence.
  • (K) _S_PTG and pPK5lepB (A) _S_PTG were constructed (panel B in Figure 1).
  • the plasmid names (K) and (A) represent the restriction enzyme sites (KpnI site and ApaI site) of the pPK5lepB vector into which the PTG expression cassette was inserted.
  • In-Fusion (R) HD Cloning Kit (Takara Bio) was used for the infusion reaction, and the reaction conditions followed the protocol recommended by the manufacturer. As a result of determining the nucleotide sequence of the inserted fragment, it was confirmed that the expected genes were inserted.
  • the nucleotide sequence was determined using BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) and 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • Each of the obtained transformants was cultured in an MMTG liquid medium containing 25 mg / l kanamycin at 30 ° C. for 72 hours. After completion of the culture, 5.0 ⁇ l of the culture supernatant obtained by centrifuging each culture was subjected to reducing SDS-PAGE using MULTIGEL (R) II mini 15/20 (Cosmo Bio), and then SYPRO (R). Staining was performed with Orange (Thermo Fisher Scientific).
  • a heterologous protein can be efficiently secreted and produced.
  • SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence of lepB gene of C. glutamicum ATCC 13869
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of LepB protein of C. glutamicum ATCC 13869
  • SEQ ID NOS: 3 to 10 primer
  • SEQ ID NO: 11 amino acid sequence of ⁇ -lactamase TEM-116
  • SEQ ID NO: 12 nucleotide sequence encoding ⁇ -lactamase TEM-116
  • SEQ ID NOs: 13 to 14 primer SEQ ID NO: 15: amino acid sequence of modified TrxA protein of E. coli
  • SEQ ID NO: 16 modified TrxA protein of E.
  • SEQ ID NO: 32 amino acid sequence of PhoS protein of C. callunae
  • SEQ ID NO: 33 amino acid sequence of PhoS protein of crenatum
  • SEQ ID NO: 34 C. efficiens PhoS protein amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 35 nucleotide sequence of phoR gene of C. glutamicum ATCC 13032
  • SEQ ID NO: 36 amino acid sequence of PhoR protein of C. glutamicum ATCC 13032
  • Nucleotide sequence SEQ ID NO: 38 Amino acid sequence of CspB protein of C.
  • SEQ ID NO: 45 amino acid sequence of twin arginine motif
  • SEQ ID NO: 46 amino acid sequence of TorA signal peptide
  • SEQ ID NOs: 47 to 53 N-terminal amino acid sequence
  • SEQ ID NOs: 54 to 59 N-terminal amino acid sequence of protein containing signal peptide

Abstract

TorAシグナルペプチドの切れ残りを低減する新規な技術を開発し、コリネ型細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した効率的な異種タンパク質の分泌生産法を提供する。TorAシグナルペプチドを利用して異種タンパク質を分泌生産する能力を有し、且つ、LepBタンパク質の活性が増大するように改変されたコリネ型細菌を培養することにより、異種タンパク質を分泌生産する。

Description

タンパク質の分泌生産法
　本発明は、異種タンパク質の分泌生産法に関するものである。
　異種タンパク質の分泌生産法としては、例えば、コリネ型細菌等の微生物を発現宿主とする方法が知られている。異種タンパク質の効率的な分泌生産のためには、例えば、シグナルペプチド（「シグナル配列」ともいう）を利用することができる。すなわち、宿主が有するタンパク質分泌経路に対応するシグナルペプチドをＮ末端に融合して異種タンパク質を発現することにより、異種タンパク質を効率的に分泌生産することができる。
　一般的なタンパク質分泌経路は、原核生物から真核生物まで広く存在するSec系と呼ばれる経路である。Sec系を用いたコリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産においては、例えば、シグナルペプチドと異種タンパク質との間にGln-Glu-ThrまたはAla-Glu-Thrを含むアミノ酸配列を挿入することで異種タンパク質の分泌生産を向上させることができる。
　一方、近年、Sec系とは全く異なるタンパク質分泌経路が植物細胞の葉緑体のチラコイド膜において見出された（非特許文献１）。この新規な分泌経路は、それにより分泌されるタンパク質のシグナルペプチドにアルギニン－アルギニンの配列が共通して存在していることから（非特許文献１）、Tat系（Twin-Arginine Translocation system）と名付けられた。Sec系ではタンパク質が高次構造を形成する前の状態で分泌されるのに対し、Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌されることが知られている（非特許文献２）。コリネ型細菌においても、TorAシグナルペプチド等のTat系依存シグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌生産の報告がある（特許文献１、２等）。
　シグナルペプチドは、一般に、タンパク質が細胞外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによってＣ末端で切断されタンパク質から除去される。一方、タンパク質の分泌生産において、シグナルペプチドが切断されずにタンパク質が細胞内に蓄積するという問題が生じる場合がある。その場合、LepBタンパク質等のシグナルペプチダーゼを高発現することによりタンパク質の分泌効率を高めることができることが知られている（特許文献３～８、非特許文献３～７）。
　しかしながら、シグナルペプチドがＣ末端ではなくその内部で切断されることにより、シグナルペプチドのＣ末端側部分配列を保持したままタンパク質が細胞外に分泌される現象は知られていなかった。
WO2013/118544 特許第4730302号 EP444759 EP974654 WO2004/007740 DE102004035543 KR101077783 CN104611317
EMBO J., 14, 2715-2722(1995) J. Biol. Chem., 25;273(52), 34868-74(1998) Biochem Biophys Res Commun. 1999 255(2):444-50. Biotechnol Bioeng. 2005 91(5):616-21. J Microbiol Biotechnol. 2007 Aug;17(8):1316-23. J Biol Chem. 2011 Dec 23;286(51):43601-10. J Appl Microbiol. 2016 Sep;121(3):704-12.
　本発明者らは、コリネ型細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質の分泌生産の際に、TorAシグナルペプチドが正しい位置で切断されずにＣ末端側１５残基の切れ残り（mis-cleavage）が生じることを見出した。本発明は、TorAシグナルペプチドの切れ残りを低減する新規な技術を開発し、コリネ型細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した効率的な異種タンパク質の分泌生産法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、LepBタンパク質の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することにより、同細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質の分泌生産の際にTorAシグナルペプチドの切れ残りを低減できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のとおり例示できる。
［１］
　異種タンパク質の製造方法であって、
　異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および
　分泌生産された異種タンパク質を回収することを含み、
　前記コリネ型細菌が、LepBタンパク質の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
　前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
　前記異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
［２］
　前記LepBタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
［３］
　lepB遺伝子の発現を上昇させることにより、前記LepBタンパク質の活性が増大した、前記方法。
［４］
　前記lepB遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、前記方法。
［５］
　前記TorAシグナルペプチドが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のペプチドである、前記方法：
（ａ）配列番号４６に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号４６に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド；
（ｃ）配列番号４６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド。
［６］
　前記TorAシグナルペプチドが、配列番号４６に示すアミノ酸配列からなる、前記方法。
［７］
　前記分泌生産された異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドが完全に除去された異種タンパク質である、前記方法。
［８］
　前記コリネ型細菌が、さらに、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されている、前記方法。
［９］
　前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号２９の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、前記方法。
［１０］
　前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、前記方法。
［１１］
　前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２９～３４のいずれかに示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２９～３４のいずれかに示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２９～３４のいずれかに示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質。
［１２］
　前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇するように改変されている、前記方法。
［１３］
　前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、前記方法。
［１４］
　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、前記方法。
［１５］
　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
［１６］
　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869に由来する改変株である、前記方法。
［１７］
　前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が非改変株と比較して低下しているコリネ型細菌である、前記方法。
ベクターの構造を示す図。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのlepB遺伝子発現増強株でTorAシグナルペプチドを融合したPTG（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。図中のアミノ酸配列を配列番号５４に示す。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのlepB遺伝子発現増強株でTorAシグナルペプチドを融合したPPG（プロ構造部付きプロテイングルタミナーゼ）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。図中のアミノ酸配列を配列番号５５に示す。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのlepB遺伝子発現増強株でTorAシグナルペプチドを融合したBla（β－ラクタマーゼ）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。図中のアミノ酸配列を配列番号５６に示す。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのlepB遺伝子発現増強株でTorAシグナルペプチドを融合したTrx（チオレドキシン）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。図中のアミノ酸配列を配列番号５７に示す。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのlepB遺伝子発現増強株でTorAシグナルペプチドを融合したLFABP（Liver-type fatty acid-binding protein）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。図中のアミノ酸配列を配列番号５８と５９に示す。 C. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株およびそのlepB遺伝子発現増強株でSlpAシグナルペプチドを融合したPTG（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。図中のアミノ酸配列を配列番号５４に示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の方法は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、前記コリネ型細菌がLepBタンパク質の活性が増大するように改変されており、TorAシグナルペプチドが異種タンパク質の分泌生産に利用される、方法である。
　本発明の方法においては、TorAシグナルペプチドの切れ残りを低減し、以て完全切断型（completely-cleaved form）の異種タンパク質を分泌生産することができる。すなわち、本発明の方法において分泌生産される「異種タンパク質」とは、特記しない限り、完全切断型の異種タンパク質をいう。「完全切断型の異種タンパク質」とは、TorAシグナルペプチドが完全に除去された、すなわちTorAシグナルペプチドを全く保持していない、異種タンパク質をいう。
＜１＞本発明の方法に用いられるコリネ型細菌
　本発明の方法に用いられるコリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌であって、且つ、LepBタンパク質の活性が増大するように改変されたコリネ型細菌である。なお、本発明の方法に用いられるコリネ型細菌を「本発明の細菌」または「本発明のコリネ型細菌」ともいう。また、本発明の細菌が有する異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を「本発明に用いられる遺伝子構築物」ともいう。また、本発明の細菌またはそれを構築するために用いられる株を「宿主」ともいう。
＜１－１＞異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌
　本発明のコリネ型細菌は、異種タンパク質（具体的には、完全切断型の異種タンパク質）を分泌生産する能力を有する。本発明のコリネ型細菌は、少なくとも異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物（本発明に用いられる遺伝子構築物）を有することに依拠して、異種タンパク質を分泌生産する能力を有する。本発明のコリネ型細菌は、具体的には、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有することにより、または異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有することと他の性質との組み合わせにより、異種タンパク質を分泌生産する能力を有していてよい。
　本発明において、タンパク質が「分泌」されるとは、タンパク質が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいう。細菌菌体外（細胞外）としては、培地中や菌体表層が挙げられる。すなわち、分泌されたタンパク質分子は、例えば、培地中に存在していてもよく、菌体表層に存在していてもよく、培地中と菌体表層の両方に存在していてもよい。すなわち、タンパク質が「分泌」されることには、最終的にそのタンパク質の全分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合に限られず、例えば、そのタンパク質の全分子が菌体表層に存在している場合や、そのタンパク質の一部の分子が培地中に存在し、残りの分子が菌体表層に存在している場合も包含される。
　すなわち、本発明において、「異種タンパク質を分泌生産する能力」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中および／または菌体表層に異種タンパク質を分泌し、培地中および／または菌体表層から回収できる程度に蓄積する能力をいう。蓄積量は、例えば、培地中での蓄積量として、好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上、さらに好ましくは1 g/L以上であってよい。また、蓄積量は、例えば、菌体表層での蓄積量として、菌体表層の異種タンパク質を回収し培地と同量の液体に懸濁した場合に懸濁液中での異種タンパク質濃度が好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上となるような量であってよい。なお、本発明において分泌生産される「タンパク質」とは、オリゴペプチドやポリペプチド等のペプチドと呼ばれる態様をも包含する概念である。
　本発明において、「異種タンパク質」（heterologous protein）とは、同タンパク質を発現および分泌させるコリネ型細菌にとって外来性（exogenous）であるタンパク質をいう。異種タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。異種タンパク質は、特に、ヒト由来のタンパク質であってもよい。異種タンパク質は、単量体タンパク質（monomeric protein）であってもよく、多量体タンパク質（multimeric protein）であってもよい。多量体タンパク質とは、２またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体においては、１またはそれ以上の分子間ジスルフィド結合が含まれるのが好ましい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも１つのサブユニットが異種タンパク質であればよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。異種タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。また、異種タンパク質は、天然でTat系依存の分泌性タンパク質であってもよく、天然でSec系依存の分泌性タンパク質であってもよい。「異種タンパク質」の具体例は後述する。
　生産される異種タンパク質は、１種類のみであってもよく、２またはそれ以上の種類であってもよい。また、異種タンパク質がヘテロ多量体である場合には、１種類のサブユニットのみが生産されてもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットが生産されてもよい。すなわち、「異種タンパク質を分泌生産する」ことには、目的の異種タンパク質を構成するサブユニットの内、全てのサブユニットを分泌生産する場合に加えて、一部のサブユニットのみを分泌生産する場合も包含される。
　コリネ型細菌は、好気性のグラム陽性桿菌である。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属細菌等が挙げられる。コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来異種タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。
　コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
　コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
　なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
　これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
　とりわけ、野生株C. glutamicum ATCC 13869よりストレプトマイシン（Sm）耐性変異株として分離したC. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) は、その親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能を司る遺伝子に変異が存在することが予測され、タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２～３倍と極めて高く、宿主菌として好適である（WO2002/081694）。AJ12036は、昭和59年3月26日に工業技術院　微生物工業技術研究所（現、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。
　また、Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) は、昭和62年3月13日に工業技術院　微生物工業技術研究所（現、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-1539が付与されている。また、Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205) は、昭和63年12月24日に工業技術院　微生物工業技術研究所（現、独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-2205が付与されている。
　また、上述したようなコリネ型細菌を親株として、突然変異法や遺伝子組換え法を利用してタンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜し、宿主として利用してもよい。例えば、紫外線照射またはN-メチル-N'-ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することができる。
　さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中または菌体表層に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異法または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質のコード領域またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2の欠損株であるC. glutamicum YDK010株（WO2002/081694）が挙げられる。
　異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌は、上述したようなコリネ型細菌に、本発明に用いられる遺伝子構築物を導入し保持させることにより得ることができる。すなわち、本発明の細菌は、例えば、上述したようなコリネ型細菌に由来する改変株であってよい。本発明の細菌は、具体的には、例えば、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株またはC. glutamicum ATCC 13869に由来する改変株であってもよい。なお、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株は、C. glutamicum ATCC 13869に由来する改変株にも該当する。本発明に用いられる遺伝子構築物やその導入法については後述する。
＜１－２＞LepBタンパク質の活性増大
　本発明の細菌は、LepBタンパク質の活性が増大するように改変されている。本発明の細菌は、具体的には、LepBタンパク質の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている。本発明の細菌は、より具体的には、lepB遺伝子の発現が増大するように改変されていてよい。LepBタンパク質の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することにより、同細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質の分泌生産におけるTorAシグナルペプチドの切れ残りを低減することができる。TorAシグナルペプチドの切れ残りの低減としては、TorAシグナルペプチドの切れ残り率の低下が挙げられる。「TorAシグナルペプチドの切れ残り率」とは、異種タンパク質の総分泌生産量に対する切れ残り型（mis-cleaved form）の異種タンパク質の分泌生産量の重量比をいう。「異種タンパク質の総分泌生産量」とは、完全切断型の異種タンパク質の分泌生産量と切れ残り型の異種タンパク質の分泌生産量との合計をいう。「切れ残り型の異種タンパク質」とは、TorAシグナルペプチドが部分的に除去された、すなわち、TorAシグナルペプチドのＣ末端側部分配列を保持する、異種タンパク質をいう。TorAシグナルペプチドのＣ末端側部分配列としては、TorAシグナルペプチドのＣ末端側１５残基のアミノ酸配列が挙げられる。TorAシグナルペプチドのＣ末端側部分配列として、具体的には、配列番号４６の２５～３９位のアミノ酸配列が挙げられる。本発明の方法におけるTorAシグナルペプチドの切れ残り率は、例えば、３％以下、１％以下、０．５％以下、０．３％以下、０．１％以下、または０％であってよい。また、本発明の方法におけるTorAシグナルペプチドの切れ残り率は、例えば、非改変株（ここではLepBタンパク質の活性が増大するように改変されていない株）を用いた場合のTorAシグナルペプチドの切れ残り率の、５０％以下、３０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、１％以下、または０％であってよい。また、LepBタンパク質の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することにより、TorAシグナルペプチドを利用する際の同細菌の異種タンパク質（具体的には、完全切断型の異種タンパク質）を分泌生産する能力を向上させることができる、すなわち、同細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質（具体的には、完全切断型の異種タンパク質）の分泌生産を増大させることができる、と期待される。
　本発明の細菌は、異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌を、LepBタンパク質の活性が増大するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、LepBタンパク質の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変した後に、異種タンパク質を分泌生産する能力を付与することによっても得ることができる。本発明において、本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。なお、本発明の細菌の構築に用いられる、LepBタンパク質の活性が増大するように改変される前の株は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有すると仮定した場合に、異種タンパク質を分泌生産することができてもよく、できなくてもよい。すなわち、本発明の細菌は、例えば、LepBタンパク質の活性が増大するように改変されたことにより異種タンパク質を分泌生産する能力を獲得したものであってもよい。具体的には、例えば、本発明の細菌は、LepBタンパク質の活性が増大するように改変される前には異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していても異種タンパク質を分泌生産することができなかった株から得られたものであって、LepBタンパク質の活性が増大するように改変されることにより異種タンパク質を分泌生産できるようになったものであってもよい。
　以下、LepBタンパク質およびそれをコードするlepB遺伝子について説明する。LepBタンパク質は、シグナルペプチダーゼである。「シグナルペプチダーゼ」とは、シグナルペプチドのプロセッシングを触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう。同活性を、「シグナルペプチダーゼ活性」ともいう。「シグナルペプチドのプロセッシング」とは、シグナルペプチドを有するタンパク質から同シグナルペプチド全体を除去する反応をいう。LepBタンパク質は、少なくとも、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有する、すなわち、TorAシグナルペプチドのプロセッシングを触媒する活性を有する。
　lepB遺伝子およびLepBタンパク質としては、コリネ型細菌や腸内細菌科の細菌等の各種生物のものが挙げられる。各種生物が有するlepB遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるLepBタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公開データベースから取得できる。C. glutamicum ATCC 13869のlepB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするLepBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。すなわち、lepB遺伝子は、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、LepBタンパク質は、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
　lepB遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したlepB遺伝子（例えば配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、LepBタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したLepBタンパク質（例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。本発明において、「lepB遺伝子」という用語は、上記例示したlepB遺伝子に限られず、その保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「LepBタンパク質」という用語は、上記例示したLepBタンパク質に限られず、その保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したlepB遺伝子やLepBタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
　「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば活性や性質）に対応する機能（例えば活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、lepB遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、LepBタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有することをいう。
　シグナルペプチダーゼ活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、シグナルペプチドを有するタンパク質）とインキュベートし、酵素依存的なシグナルペプチドのプロセッシングを測定することにより、測定できる。シグナルペプチドのプロセッシングは、例えば、インキュベート後の基質の分子量またはＮ末端アミノ酸配列を指標として、測定できる。
　以下、保存的バリアントについて例示する。
　lepB遺伝子のホモログまたはLepBタンパク質のホモログは、例えば、上記例示したlepB遺伝子の塩基配列または上記例示したLepBタンパク質のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、lepB遺伝子のホモログは、例えば、コリネ型細菌の染色体を鋳型にして、これら公知のlepB遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
　lepB遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したLepBタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　また、lepB遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したLepBタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列）全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　また、lepB遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したlepB遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１に示す塩基配列）の相補配列又は同相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いDNA同士、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。
　上記プローブは、例えば、遺伝子の相補配列の一部であってよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。プローブとしては、例えば、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
　また、lepB遺伝子は、上記例示したlepB遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換した塩基配列を有するものであってもよい。例えば、lepB遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
　なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味する。また、塩基配列間の「同一性」とは、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味する。
　なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、PhoRSタンパク質、細胞表層タンパク質、Tat系分泌装置、本発明において分泌生産される異種タンパク質等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
＜１－３＞その他の性質
　本発明の細菌は、異種タンパク質を分泌生産できる限り、所望の性質を有していてよい。例えば、本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下していてよい（WO2013/065869、WO2013/065772、WO2013/118544、WO2013/062029）。また、本発明の細菌は、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい（WO2013/065869）。また、本発明の細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変されていてよい（WO2013/065772）。また、本発明の細菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子（変異型rpsA遺伝子）を有するように改変されていてよい（WO2013/118544）。また、本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を有するように改変されていてよい（WO2016/171224）。また、本発明の細菌は、RegX3タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい（WO2018/074578）。また、本発明の細菌は、HrrSAシステムの活性が低下するように改変されていてよい（WO2018/074579）。また、本発明の細菌は、Tat系分泌装置の活性が増大するように改変されていてよい。これらの性質または改変は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、利用することができる。
＜１－３－１＞変異型phoS遺伝子の導入
　本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されていてよい。「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型phoS遺伝子を有する」または「phoS遺伝子に変異を有する」ともいう。また、「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型PhoSタンパク質を有する」または「PhoSタンパク質に変異を有する」ともいう。
　以下、phoS遺伝子およびPhoSタンパク質について説明する。phoS遺伝子は、PhoRSシステムのセンサーキナーゼであるPhoSタンパク質をコードする遺伝子である。PhoRSシステムは、二成分制御系の１つであり、環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する。PhoRSシステムは、phoS遺伝子にコードされるセンサーキナーゼPhoSと、phoR遺伝子にコードされるレスポンスレギュレーターPhoRとからなる。
　本発明において、「特定の変異」を有するPhoSタンパク質を「変異型PhoSタンパク質」、それをコードする遺伝子を「変異型phoS遺伝子」ともいう。「変異型phoS遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有するphoS遺伝子である。また、本発明において、「特定の変異」を有さないPhoSタンパク質を「野生型PhoSタンパク質」、それをコードする遺伝子を「野生型phoS遺伝子」ともいう。「野生型phoS遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有さないphoS遺伝子である。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。「特定の変異」については後述する。
　野生型phoS遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のphoS遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のphoS遺伝子として、具体的には、例えば、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. glutamicum ATCC14067株、C. callunae、C. crenatum、およびC. efficiensのphoS遺伝子が挙げられる。C. glutamicum YDK010株のphoS遺伝子の塩基配列を、配列番号２８に示す。また、これらのphoS遺伝子がコードする野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２９～３４に示す。
　野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型phoS遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、野生型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型PhoSタンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、「野生型phoS遺伝子」という用語は、上記例示した野生型phoS遺伝子に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。同様に、「野生型PhoSタンパク質」という用語は、上記例示した野生型PhoSタンパク質に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。野生型PhoSタンパク質および野生型phoS遺伝子のバリアントについては、上述したLepBタンパク質およびlepB遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
　なお、「元の機能が維持されている」とは、野生型PhoSタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoSタンパク質としての機能（例えば、配列番号２９～３４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の機能）を有することであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、野生型PhoSタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有することであってもよい。すなわち、「PhoSタンパク質としての機能」とは、具体的には、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能であってよい。「PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能」とは、具体的には、レスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質と共役して環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する機能であってよい。「PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能」とは、より具体的には、環境中のリン酸欠乏を感知して自己リン酸化され、リン酸基転移によりPhoRタンパク質を活性化させる機能であってもよい。
　PhoSタンパク質のバリアントがPhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するか否かは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をコリネ型細菌のphoS遺伝子の欠損株に導入し、リン酸欠乏に対する応答性が相補されるか否かを確認することにより、確認できる。リン酸欠乏に対する応答性の相補は、例えば、リン酸欠乏条件での生育の向上として、またはリン酸欠乏条件で発現が誘導されることが知られている遺伝子の発現の誘導として、検出できる（J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)）。コリネ型細菌のphoS遺伝子の欠損株としては、例えば、C. glutamicum YDK010株のphoS遺伝子欠損株や、C. glutamicum ATCC13032株のphoS遺伝子欠損株を用いることができる。
　野生型PhoSタンパク質においては、自己リン酸化されるヒスチジン残基が保存されているのが好ましい。すなわち、保存的変異は、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基において生じるのが好ましい。「自己リン酸化されるヒスチジン残基」とは、野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基を指す。また、野生型PhoSタンパク質は、例えば、上記例示した野生型PhoSタンパク質の保存配列を有するのが好ましい。すなわち、保存的変異は、例えば、上記例示した野生型PhoSタンパク質において保存されていないアミノ酸残基において生じるのが好ましい。
　変異型PhoSタンパク質は、上述したような野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。
　すなわち、言い換えると、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、上記例示した野生型PhoSタンパク質やその保存的バリアントと同一であってよい。具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２９～３４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２９～３４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２９～３４に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　また、言い換えると、変異型PhoSタンパク質は、上記例示した野生型PhoSタンパク質において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、配列番号２９～３４に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
　変異型phoS遺伝子は、上記のような変異型PhoSタンパク質をコードする限り、特に制限されない。
　以下、変異型PhoSタンパク質が有する「特定の変異」について説明する。
　「特定の変異」は、上述したような野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列が変化するものであって、且つ、異種タンパク質の分泌生産に有効なものであれば特に制限されない。
　「特定の変異」は、異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるのが好ましい。「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、変異型phoS遺伝子を有するよう改変されたコリネ型細菌（改変株）が、非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産できることをいう。「非改変株」とは、phoS遺伝子に変異を有さない対照株、すなわち変異型phoS遺伝子を有さない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株の、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは２倍以上、特に好ましくは５倍以上の量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。なお、「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、あらゆる異種タンパク質の分泌生産量が向上する必要はなく、分泌生産のターゲットとして設定した異種タンパク質の分泌生産量が向上すれば足りる。「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、具体的には、例えば、実施例に記載の異種タンパク質の分泌生産量を向上させることを意味してもよい。
　ある変異が異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるかどうかは、例えば、コリネ型細菌に属する菌株を基に当該変異を有するPhoSタンパク質をコードする遺伝子を有するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
　アミノ酸配列の変化としては、アミノ酸残基の置換が好ましい。すなわち、「特定の変異」は、野生型PhoSタンパク質のいずれかのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されるものであるのが好ましい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、１残基であってもよく、２残基またはそれ以上の組み合わせであってもよい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、好ましくは、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であってよい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、より好ましくは、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外の、ＨｉｓＫＡドメインのアミノ酸残基であってよい。「自己リン酸化されるヒスチジン残基」とは、野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基を指す。「ＨｉｓＫＡドメイン」とは、野生型PhoSタンパク質の２６６～３３０位のアミノ酸残基からなる領域を指す。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、特に好ましくは、野生型PhoSタンパク質の３０２位のトリプトファン残基（Ｗ３０２）であってよい。
　上記変異において、置換後のアミノ酸残基としては、K（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。置換後のアミノ酸残基としては、例えば、異種タンパク質の分泌生産量が向上するものを選択することができる。
　Ｗ３０２が置換される場合、置換後のアミノ酸残基としては、芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、より具体的には、K（Lys）、A（Ala）、V（Val）、S（Ser）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、N（Asn）が挙げられる。
　なお、phoS遺伝子における「特定の変異」とは、コードするPhoSタンパク質に上記のような「特定の変異」を生じさせる塩基配列上の変異を意味する。
　本発明において、「野生型PhoSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、配列番号２９のＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。例えば、「Ｗ３０２」とは、配列番号２９の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基を意味する。上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその絶対的な位置は前後することがある。例えば、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなる野生型PhoSタンパク質において、Ｘ位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した、または挿入された場合、元のＸ位のアミノ酸残基は、それぞれ、Ｎ末端から数えてＸ－１番目またはＸ＋１番目のアミノ酸残基となるが、「野生型PhoSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とみなされる。具体的には、例えば、配列番号２９～３４に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「Ｗ３０２」とは、それぞれ、３０２位、３０２位、３０２位、３２１位、２７５位、および２８６位のトリプトファン残基を指す。また、配列番号２９～３４に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基（自己リン酸化されるヒスチジン残基）」とは、それぞれ、２７６位、２７６位、２７６位、２９５位、２４９位、および２６０位のヒスチジン残基を指す。また、また、配列番号２９～３４に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「野生型PhoSタンパク質の２６６～３３０位のアミノ酸残基からなる領域（ＨｉｓＫＡドメイン）」とは、それぞれ、２６６～３３０位、２６６～３３０位、２６６～３３０位、２８５～３４９位、２３９～３０３位、および２５０～３１４位のアミノ酸残基からなる領域を指す。
　なお、ここでいう「Ｗ３０２」は、通常トリプトファン残基であるが、トリプトファン残基でなくてもよい。すなわち、野生型PhoSタンパク質が配列番号２９～３４に示すアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有する場合には、「Ｗ３０２」はトリプトファン残基でないことがあり得る。よって、例えば、「Ｗ３０２がシステイン残基に置換される変異」には、「Ｗ３０２」がトリプトファン残基である場合に当該トリプトファン残基がシステイン残基に置換される変異に限られず、「Ｗ３０２」がK（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、Y（Tyr）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、またはQ（Gln）である場合に当該アミノ酸残基がシステイン残基に置換される変異も包含される。他の変異についても同様である。
　任意のPhoSタンパク質のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号２９におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のPhoSタンパク質のアミノ酸配列と配列番号２９のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
　変異型phoS遺伝子は、例えば、野生型phoS遺伝子を、コードされるPhoSタンパク質が上述した「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変の元になる野生型phoS遺伝子は、例えば、野生型phoS遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型phoS遺伝子は、野生型phoS遺伝子を介さずに取得することもできる。例えば、化学合成により変異型phoS遺伝子を直接取得してもよい。取得した変異型phoS遺伝子は、さらに改変して利用してもよい。
　遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
　以下、変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変する手法について説明する。
　変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、変異型phoS遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより達成できる。また、変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、コリネ型細菌の染色体上のphoS遺伝子に上述した「特定の変異」を導入することによっても達成できる。染色体上の遺伝子への変異導入は、自然変異、変異原処理、または遺伝子工学的手法により達成できる。
　変異型phoS遺伝子をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。本発明の細菌において、変異型phoS遺伝子は、コリネ型細菌で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、phoS遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。本発明の細菌において、変異型phoS遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の細菌は、１種類の変異型phoS遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型phoS遺伝子を有していてもよい。変異型phoS遺伝子の導入は、例えば、後述する、遺伝子の発現を上昇させる手法における遺伝子の導入や、本発明に用いられる遺伝子構築物の導入と同様に行うことができる。
　本発明の細菌は、野生型phoS遺伝子を有していてもよく、有していなくともよいが、有していないのが好ましい。
　野生型phoS遺伝子を有さないコリネ型細菌は、染色体上の野生型phoS遺伝子を破壊することにより取得できる。野生型phoS遺伝子の破壊は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型phoS遺伝子のプロモーター領域および／またはコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型phoS遺伝子を破壊できる。
　また、染色体上の野生型phoS遺伝子を変異型phoS遺伝子で置換することにより、野生型phoS遺伝子を有さず、且つ、変異型phoS遺伝子を有するように改変されたコリネ型細菌を取得できる。このような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などが挙げられる（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
　PhoSタンパク質は、レスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質と共役して機能する、すなわち環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する。したがって、本発明の細菌は、変異型PhoSタンパク質が機能するよう、phoR遺伝子を有する。phoR遺伝子は、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質をコードする遺伝子である。「phoR遺伝子を有する」ことを、「PhoRタンパク質を有する」ともいう。通常、本発明の細菌が本来的に有するPhoRタンパク質が変異型PhoSタンパク質と共役して機能すれば足りる。一方、本発明の細菌には、本発明の細菌が本来的に有するphoR遺伝子に加えて、あるいは代えて、適当なphoR遺伝子が導入されていてもよい。導入されるphoR遺伝子は、変異型PhoSタンパク質と共役して機能するPhoRタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。
　phoR遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のphoR遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のphoR遺伝子として、具体的には、例えば、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. glutamicum ATCC14067株、C. callunae、C. crenatum、およびC. efficiensのphoR遺伝子が挙げられる。C. glutamicum ATCC13032株のphoR遺伝子の塩基配列およびPhoRタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３５および３６に示す。
　phoR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したphoR遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、PhoRタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したPhoRタンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、「phoR遺伝子」という用語には、上記例示したphoR遺伝子に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。同様に、「PhoRタンパク質」という用語には、上記例示したPhoRタンパク質に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。PhoRタンパク質およびphoR遺伝子のバリアントについては、上述したLepBタンパク質およびlepB遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、phoR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、phoR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、PhoRタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRタンパク質としての機能（例えば、配列番号３６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の機能）を有することであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、PhoRタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能を有することであってもよい。すなわち、「PhoRタンパク質としての機能」とは、具体的には、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能であってよい。「PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能」とは、具体的には、センサーキナーゼであるPhoSタンパク質と共役して環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する機能であってよい。「PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能」とは、より具体的には、環境中のリン酸欠乏を感知して自己リン酸化されたPhoSタンパク質からのリン酸基転移により活性化され、環境中のリン酸欠乏に応答する遺伝子の発現を制御する機能であってもよい。
　PhoRタンパク質のバリアントがPhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能を有するか否かは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をコリネ型細菌のphoR遺伝子の欠損株に導入し、リン酸欠乏に対する応答性が相補されるか否かを確認することにより、確認できる。リン酸欠乏に対する応答性の相補は、例えば、リン酸欠乏条件での生育の向上として、またはリン酸欠乏条件で発現が誘導されることが知られている遺伝子の発現の誘導として、検出できる（J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)）。コリネ型細菌のphoR遺伝子の欠損株としては、例えば、C. glutamicum YDK010株のphoR遺伝子欠損株や、C. glutamicum ATCC13032株のphoR遺伝子欠損株を用いることができる。
＜１－３－２＞細胞表層タンパク質の活性低下
　本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下しているものであってよい。本発明の細菌は、具体的には、細胞表層タンパク質の活性が非改変株と比較して低下しているものであってよい。「細胞表層タンパク質の活性が低下する」とは、特に、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が低下することを意味してもよい。以下に、細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子について説明する。
　細胞表層タンパク質は、細菌や古細菌の細胞表層（Ｓ層）を構成するタンパク質である。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumのPS1およびPS2（CspB）（特表平6-502548）、ならびにC. stationisのSlpA（CspA）（特開平10-108675）が挙げられる。これらの中では、PS2タンパク質の活性を低下させるのが好ましい。
　C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPS2タンパク質（CspBタンパク質）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３７および３８に示す。
　また、例えば、28株のC. glutamicumについて、CspBホモログのアミノ酸配列が報告されている（J Biotechnol., 112, 177-193(2004)）。これら28株のC. glutamicumとcspB遺伝子ホモログのＮＣＢＩデータベースのGenBank accessionナンバーを以下に例示する（カッコ内がGenBank accessionナンバーを示す）。
C. glutamicum ATCC13058（AY524990）
C. glutamicum ATCC13744（AY524991）
C. glutamicum ATCC13745（AY524992）
C. glutamicum ATCC14017（AY524993）
C. glutamicum ATCC14020（AY525009）
C. glutamicum ATCC14067（AY524994）
C. glutamicum ATCC14068（AY525010）
C. glutamicum ATCC14747（AY525011）
C. glutamicum ATCC14751（AY524995）
C. glutamicum ATCC14752（AY524996）
C. glutamicum ATCC14915（AY524997）
C. glutamicum ATCC15243（AY524998）
C. glutamicum ATCC15354（AY524999）
C. glutamicum ATCC17965（AY525000）
C. glutamicum ATCC17966（AY525001）
C. glutamicum ATCC19223（AY525002）
C. glutamicum ATCC19240（AY525012）
C. glutamicum ATCC21341（AY525003）
C. glutamicum ATCC21645（AY525004）
C. glutamicum ATCC31808（AY525013）
C. glutamicum ATCC31830（AY525007）
C. glutamicum ATCC31832（AY525008）
C. glutamicum LP-6（AY525014）
C. glutamicum DSM20137（AY525015）
C. glutamicum DSM20598（AY525016）
C. glutamicum DSM46307（AY525017）
C. glutamicum 22220（AY525005）
C. glutamicum 22243（AY525006）
　コリネ型細菌が属する種又は菌株によって、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した細胞表層タンパク質をコードする遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、細胞表層タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示した細胞表層タンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「cspB遺伝子」という用語には、上記例示したcspB遺伝子に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。同様に、「CspBタンパク質」という用語には、上記例示したCspBタンパク質に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したLepBタンパク質およびlepB遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、細胞表層タンパク質にあっては、例えば、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有することであってよい。
　「コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質」とは、コリネ型細菌で活性を低下させたときに非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する能力をコリネ型細菌に付与する性質をいう。「非改変株」とは、細胞表層タンパク質の活性が低下していない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株の、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、特に好ましくは２倍以上の量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。
　あるタンパク質がコリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するかどうかは、コリネ型細菌に属する菌株を基にそのタンパク質の活性が低下するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
　本発明において、「細胞表層タンパク質の活性が低下している」ことには、細胞表層タンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌が改変された場合、および、コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合が包含される。「コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合」には、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合が包含される。すなわち、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌としては、例えば、もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌が挙げられる。「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合」としては、例えば、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質をコードする遺伝子を有さない場合が挙げられる。なお、「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、コリネ型細菌が、当該コリネ型細菌が属する種の他の株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質をもともと有さないことであってよい。例えば、「C. glutamicumがもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、C. glutamicum株が、他のC. glutamicum株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質、すなわち、例えばPS1および／またはPS2（CspB）、をもともと有さないことであってよい。もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌としては、例えば、もともとcspB遺伝子を有さないC. glutamicum ATCC 13032が挙げられる。
＜１－３－３＞タンパク質の分泌系
　本発明の細菌は、タンパク質の分泌系であるTat系（Tat系分泌装置）を有する。本発明の細菌は、本来的にTat系分泌装置を有していてよい。本発明の細菌は、Tat系分泌装置の活性が増大するように改変されていてもよい。本発明の細菌は、具体的には、Tat系分泌装置の活性が非改変株と比較して増大するように改変されていてもよい。Tat系分泌装置の活性は、例えば、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇させることにより、増大させることができる。すなわち、本発明の細菌は、より具体的には、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されていてもよい。Tat系分泌装置をコードする遺伝子の発現を上昇させる手法については特許第4730302号に記載されている。Tat系分泌装置の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することにより、TorAシグナルペプチドを利用する際の同細菌の異種タンパク質（具体的には、完全切断型の異種タンパク質）を分泌生産する能力を向上させることができる、すなわち、同細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質（具体的には、完全切断型の異種タンパク質）の分泌生産を増大させることができる、と期待される。
　Tat系分泌装置をコードする遺伝子としては、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子が挙げられる。
　Tat系分泌装置をコードする遺伝子として、具体的には、C. glutamicumのtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子が挙げられる。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、1571065～1571382位の配列の相補配列、1167110～1167580位の配列、および1569929～1570873位の配列の相補配列に相当する。また、C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_600707 (version NP_600707.1 GI:19552705、locus_tag="NCgl1434")、GenBank accession NP_600350 (version NP_600350.1 GI:19552348、locus_tag="NCgl1077")、およびGenBank accession NP_600706 (version NP_600706.1 GI:19552704、locus_tag="NCgl1433")として登録されている。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子の塩基配列ならびにTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３９～４４に示す。
　また、Tat系分泌装置をコードする遺伝子として、具体的には、E. coliのtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子が挙げられる。E.coli K-12 MG1655のtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4019968～4020237位の配列、4020241～4020756位の配列、4020759～4021535位の配列、658170～658373位の配列に相当する。また、E.coli K-12 MG1655のTatAタンパク質、TatBタンパク質、TatCタンパク質、およびTatEタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418280 (version NP_418280.4 GI:90111653、locus_tag="b3836")、GenBank accession YP_026270 (version YP_026270.1 GI:49176428、locus_tag="b3838")、GenBank accession NP_418282 (version NP_418282.1 GI:16131687、locus_tag="b3839")、およびGenBank accession NP_415160 (version NP_415160.1 GI:16128610、locus_tag="b0627")として登録されている。
　Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系分泌装置をコードする遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、Tat系分泌装置は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系分泌装置のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「tatA遺伝子」、「tatB遺伝子」、「tatC遺伝子」、および「tatE遺伝子」という用語には、それぞれ、上記例示したtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。同様に、「TatAタンパク質」、「TatBタンパク質」、「TatCタンパク質」、および「TatEタンパク質」という用語には、それぞれ、上記例示したTatAタンパク質、TatBタンパク質、TatCタンパク質、およびTatEタンパク質に加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。Tat系分泌装置およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したLepBタンパク質およびlepB遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、例えば、Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、Tat系分泌装置にあっては、TorAシグナルペプチド等のTat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質を細胞外に分泌する機能を有することであってよい。
　Tat系分泌装置の活性が増大したことは、例えば、TorAシグナルペプチド等のTat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量が増大したことを確認することにより確認できる。Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
＜１－４＞タンパク質の活性を増大させる手法
　以下に、LepBタンパク質等のタンパク質の活性を増大させる手法（遺伝子の発現を増大させる手法も含む）について説明する。
　「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して増大することを意味する。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株に対して増大することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、コリネ型細菌の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して増大してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum YDK010株と比較して増大してもよい。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。また、「タンパク質の活性が増大する」ことには、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することも包含される。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
　タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその活性が測定できる程度に生産されていてよい。
　タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成できる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。
　遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
　遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。具体的には、標的遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換し、宿主の染色体上の標的部位と相同組み換えを起こすことにより、該遺伝子を宿主の染色体上に導入することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、標的遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、該遺伝子の両端に染色体上の標的部位の上流および下流に相同な塩基配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、標的部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、標的部位を該遺伝子に置換することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の導入に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
　染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
　また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およびpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（US2006-0141588）；pVC7（特開平9-070291）；pVS7（WO2013/069634）が挙げられる。
　遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に宿主に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、宿主で機能するプロモーターによる制御を受けて発現するように保持されていればよい。プロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
　遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。
　各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
　また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。
　導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的の部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。あるいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。
　なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が標的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
　遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5'-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
　遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
　また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
　上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
　また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
　形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1977. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。
　タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
　上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質の活性増強や任意の遺伝子の発現増強に利用できる。
＜１－５＞タンパク質の活性を低下させる手法
　以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。なお、以下に記載するタンパク質の活性を低下させる手法は、野生型PhoSタンパク質の破壊にも利用できる。
　「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、コリネ型細菌の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち本発明の細菌が属する種の基準株）と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum YDK010株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子の発現調節配列を改変することにより達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列は、例えば、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部の領域を欠失（欠損）させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（例えば、活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。
　遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１～２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
　遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。タンパク質のアミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
　染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の破壊に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
　上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-Seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の量が低下したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことができる。また、タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
　上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質の活性低下や任意の遺伝子の発現低下に利用できる。
＜１－６＞異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物とその導入
　分泌性タンパク質（secretory protein）は、一般に、プレタンパク質（プレペプチドともいう）またはプレプロタンパク質（プレプロペプチドともいう）として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質（mature protein）になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断されて成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。よって、本発明の方法においては、異種タンパク質の分泌生産にシグナルペプチドを利用する。なお、本発明において、分泌型タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌型タンパク質前駆体」という場合がある。
　本発明に用いられる遺伝子構築物は、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む。TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター配列の下流に、同プロモーターによる制御を受けてTorAシグナルペプチドが発現するよう連結されていればよい。異種タンパク質をコードする核酸配列は、TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、同シグナルペプチドとの融合タンパク質として異種タンパク質が発現するよう連結されていればよい。当該融合タンパク質を「本発明の融合タンパク質」ともいう。なお、上述の通り、本発明の方法においては、TorAシグナルペプチドが完全に除去された異種タンパク質（完全切断型の異種タンパク質）が分泌生産される。すなわち、最終的に得られる異種タンパク質はTorAシグナルペプチドを有さない。よって、「異種タンパク質がTorAシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する」とは、異種タンパク質が発現時にTorAシグナルペプチドとの融合タンパク質を構成していることを意味し、最終的に得られる異種タンパク質がTorAシグナルペプチドとの融合タンパク質を構成していることを意味しない。核酸配列は「遺伝子」と読み替えてもよい。例えば、異種タンパク質をコードする核酸配列を「異種タンパク質をコードする遺伝子」または「異種タンパク質遺伝子」ともいう。核酸配列としては、ＤＮＡが挙げられる。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、コリネ型細菌で本発明の融合タンパク質を発現させるために有効な制御配列（オペレーター、ＳＤ配列、ターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。
　本発明で使用されるプロモーターは、コリネ型細菌で機能するプロモーターである限り特に制限されない。プロモーターは、コリネ型細菌由来（例えば宿主由来）のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、異種タンパク質遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。
　異種由来のプロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、およびaraBADプロモーター等のE.coli由来のプロモーターが挙げられる。中でも、tacプロモーター等の強力なプロモーターや、araBADプロモーター等の誘導型のプロモーターが好ましい。
　コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質であるPS1、PS2（CspBともいう）、SlpA（CspAともいう）の遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターが挙げられる。各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート（PRPP）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
　また、コリネ型細菌で機能するプロモーターとしては、上述したような、コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
　本発明で使用されるシグナルペプチドは、TorAシグナルペプチドである。TorAシグナルペプチドは、Tat系依存シグナルペプチドである。「Tat系依存シグナルペプチド」とは、Tat系によって認識されるシグナルペプチドをいう。「Tat系依存シグナルペプチド」とは、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌されるペプチドであってよい。Tat系依存シグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有する。ツイン・アルギニンモチーフとしては、R-R-X-#-#（#:疎水性残基）（配列番号４５）が挙げられる。TorAシグナルペプチドとしては、E. coli等の腸内細菌科の細菌のTorAタンパク質（トリメチルアミン-N-オキシドレダクターゼ）のシグナルペプチドが挙げられる。E. coliのTorAシグナルペプチドのアミノ酸配列は「MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号４６）」である。
　TorAシグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有し、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示したTorAシグナルペプチドのバリアントであってもよい。TorAシグナルペプチドおよびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したLepBタンパク質およびlepB遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、TorAシグナルペプチドは、上記例示したTorAシグナルペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。なお、TorAシグナルペプチドのバリアントにおける上記「１又は数個」とは、具体的には、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個を意味する。また、例えば、TorAシグナルペプチドは、上記例示したTorAシグナルペプチドのアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。本発明において、「TorAシグナルペプチド」という用語には、配列番号４６に記載のペプチドに加え、その保存的バリアントが包含されるものとする。
　TorAシグナルペプチドについての「元の機能が維持されている」とは、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有することをいう。「Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有する」とは、Tat系によって認識されることをいい、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌される機能を有することであってよい。あるペプチドがTat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するかどうかは、例えば、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の増強により増大することを確認することや、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の欠損により減少することを確認することにより確認できる。
　TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列は、上記のようなTorAシグナルペプチドをコードするものであれば、特に制限されない。
　本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質としては、例えば、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、ワクチンとして使用される抗原タンパク質、酵素、その他任意のタンパク質が挙げられる。
　酵素としては、例えば、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼ、およびキチナーゼ等が挙げられる。トランスグルタミナーゼとしては、例えば、Streptoverticillium mobaraense IFO 13819（WO01/23591）、Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852、Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776、Streptomyces lydicus（WO9606931）等の放線菌や、Oomycetes（WO9622366）等の糸状菌の分泌型のトランスグルタミナーゼが挙げられる。プロテイングルタミナーゼとしては、例えば、Chryseobacterium proteolyticumのプロテイングルタミナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。イソマルトデキストラナーゼとしては、例えば、Arthrobacter globiformisのイソマルトデキストラナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。
　生理活性タンパク質としては、例えば、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカイン、抗体関連分子が挙げられる。
　成長因子（増殖因子）として、具体的には、例えば、上皮成長因子（Epidermal growth factor；EGF）、インスリン様成長因子-1（Insulin-like growth factor-1；IGF-1）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor；TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor；NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor；BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor；VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin；EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin；TPO）、酸性線維芽細胞増殖因子（acidic fibroblast growth factor；aFGFまたはFGF1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；bFGFまたはFGF2）、角質細胞増殖因子（Keratinocyte growth factor；KGF-1またはFGF7やKGF-2またはFGF10）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；HGF）が挙げられる。
　ホルモンとして、具体的には、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（somatostatin）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）、カルシトニン（calcitonin）、エキセナチド（exenatide）が挙げられる。
　サイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。
　なお、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインは互いに厳密に区別されなくともよい。例えば、生理活性タンパク質は、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインから選択されるいずれか１つのグループに属するものであってもよく、それらから選択される複数のグループに属するものであってもよい。
　また、生理活性タンパク質は、タンパク質全体であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生理活性を有する部分が挙げられる。生理活性を有する部分として、具体的には、例えば、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）の成熟体のN末端３４アミノ酸残基からなる生理活性ペプチドTeriparatideが挙げられる。
　抗体関連分子とは、完全抗体を構成するドメインから選択される単一のドメインまたは２もしくはそれ以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。完全抗体を構成するドメインとしては、重鎖のドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびに軽鎖のドメインであるＶＬおよびＣＬが挙げられる。抗体関連分子は、上述の分子種を含む限り、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。なお、抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。抗体関連分子として、具体的には、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、ＶＨＨフラグメント（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））が挙げられる。抗体関連分子として、より具体的には、例えば、トラスツズマブ（Trastuzumab）、アダリムマブ（Adalimumab）、ニボルマブ（Nivolumab）が挙げられる。
　レセプタータンパク質は、特に制限されず、例えば、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質であってよい。その他の生理活性物質としては、例えば、ドーパミン等の神経伝達物質が挙げられる。また、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。
　ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよい。
　また、その他のタンパク質として、Liver-type fatty acid-binding protein（LFABP）、蛍光タンパク質、イムノグロブリン結合タンパク質、アルブミン、細胞外タンパク質が挙げられる。蛍光タンパク質としては、Green Fluorescent Protein（GFP）が挙げられる。イムノグロブリン結合タンパク質としては、Protein A、Protein G、Protein Lが挙げられる。アルブミンとしては、ヒト血清アルブミンが挙げられる。
　細胞外タンパク質としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、ラミニン、それらの部分配列が挙げられる。ラミニンは、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンとしては、哺乳類のラミニンが挙げられる。哺乳類としては、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等のその他の各種哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、特に、ヒトが挙げられる。ラミニンのサブユニット鎖（すなわち、α鎖、β鎖、およびγ鎖）としては、５種のα鎖（α１～α５）、３種のβ鎖（β１～β３）、３種のγ鎖（γ１～γ３）が挙げられる。ラミニンは、これらサブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンとして、具体的には、例えば、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン211、ラミニン213、ラミニン221、ラミニン311、ラミニン321、ラミニン332、ラミニン411、ラミニン421、ラミニン423、ラミニン511、ラミニン521、ラミニン523が挙げられる。ラミニンの部分配列としては、ラミニンのE8断片であるラミニンE8が挙げられる。ラミニンE8は、具体的には、α鎖のE8断片（α鎖E8）、β鎖のE8断片（β鎖E8）、およびγ鎖のE8断片（γ鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンE8のサブユニット鎖（すなわち、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）を総称して、「E8サブユニット鎖」ともいう。E8サブユニット鎖としては、上記例示したラミニンサブユニット鎖のE8断片が挙げられる。ラミニンE8は、これらE8サブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンE8として、具体的には、例えば、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、ラミニン521E8が挙げられる。
　これらのタンパク質等の異種タンパク質をコードする遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。異種タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、使用する宿主に応じて、および／または望みの活性を得るために、改変することができる。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子は、コードされる異種タンパク質のアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加が含まれるよう改変されてもよい。上述したLepBタンパク質およびlepB遺伝子のバリアントに関する記載は、本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。なお、由来する生物種で特定されるタンパク質は、当該生物種において見出されるタンパク質そのものに限られず、当該生物種において見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。それらバリアントは、当該生物種において見出されてもよく、見出されなくてもよい。すなわち、例えば、「ヒト由来タンパク質」とは、ヒトにおいて見出されるタンパク質そのものに限られず、ヒトにおいて見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。また、異種タンパク質をコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてもよい。
　本発明の方法により最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、TorAシグナルペプチドが完全に除去されている限り、天然のタンパク質と同一であってもよく、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と比較して、１又は数個のアミノ酸を余分に付加された、あるいは欠失したものであってもよい。なお上記「１又は数個」とは、目的の異種タンパク質の全長や構造等によっても異なるが、具体的には好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　また、分泌生産される異種タンパク質は、プロ構造部が付加したタンパク質（プロタンパク質）であってもよい。分泌生産される異種タンパク質がプロタンパク質である場合、最終的に得られる異種タンパク質はプロタンパク質であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、プロタンパク質はプロ構造部を切断されて成熟タンパク質になってもよい。切断は、例えば、プロテアーゼにより行うことができる。プロテアーゼを使用する場合は、最終的に得られるタンパク質の活性という観点から、プロタンパク質は一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のタンパク質と完全に同じ位置で切断され天然のものと同一の成熟タンパク質が得られるのがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロタンパク質を切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。しかしながら、上述の通り、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、生産される異種タンパク質の種類や使用目的等によっては、天然のタンパク質に比較してN末端がアミノ酸１～数個分長いあるいは短いタンパク質がより適切な活性を有することがある。本発明において使用できるプロテアーゼには、Dispase（ベーリンガーマンハイム社製）のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。
　本発明に用いられる遺伝子構築物をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。「本発明に用いられる遺伝子構築物の導入」とは、同遺伝子構築物を宿主に保持させることをいう。「本発明に用いられる遺伝子構築物の導入」には、予め構築した同遺伝子構築物を宿主に一括して導入する場合に限られず、少なくとも異種タンパク質遺伝子が宿主に導入され、且つ宿主内で同遺伝子構築物が構築される場合も含まれる。本発明の細菌において、本発明に用いられる遺伝子構築物は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明に用いられる遺伝子構築物の導入は、例えば、上述した、遺伝子の発現を上昇させる手法における遺伝子の導入と同様に行うことができる。なお、本発明の細菌を構築するに当たり、本発明に用いられる遺伝的構築物の導入、LepBタンパク質の活性の増大、およびその他の改変は、任意の順番で行うことができる。
　本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、同遺伝子構築物を含むベクターを用いて宿主に導入できる。例えば、本発明に用いられる遺伝子構築物をベクターと連結して同遺伝子構築物の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子構築物を宿主に導入することができる。また、例えば、ベクターがコリネ型細菌で機能するプロモーターを備える場合、当該プロモーターの下流に本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を連結することによっても、本発明に用いられる遺伝子構築物の発現ベクターを構築することができる。ベクターは、コリネ型細菌で自律複製可能なものであれば特に制限されない。コリネ型細菌で利用できるベクターについては上述の通りである。
　また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、人工トランスポゾン等のトランスポゾンを使用して宿主の染色体上に導入できる。トランスポゾンが使用される場合は、相同組換えまたはそれ自身の転移能によって本発明に用いられる遺伝子構築物が染色体上に導入される。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、その他、相同組換えを利用する導入法により宿主の染色体上に導入できる。相同組換えを利用する導入法としては、例えば、直鎖状ＤＮＡ、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミド、または宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクター等を用いる方法が挙げられる。また、少なくとも異種タンパク質遺伝子を染色体上に導入し、本発明に用いられる遺伝子構築物を染色体上に構築してもよい。その場合、異種タンパク質遺伝子以外の、本発明に用いられる遺伝子構築物の構成要素の一部または全部は宿主の染色体上にもともと存在するものであってもよい。具体的には、例えば、宿主の染色体上にもともと存在するプロモーター配列をそのまま利用し、同プロモーター配列の下流に接続された遺伝子のみをTorAシグナルペプチドをコードする核酸配列および目的の異種タンパク質遺伝子に置換することによっても、染色体上に本発明に用いられる遺伝子構築物が構築され、本発明の細菌を構築できる。異種タンパク質遺伝子等の、本発明に用いられる遺伝子構築物の一部の染色体への導入は、本発明に用いられる遺伝子構築物の染色体への導入と同様に行うことができる。
　本発明に用いられる遺伝子構築物やその構成要素（プロモーター配列、TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列、異種タンパク質をコードする核酸配列、等）は、例えば、クローニングにより取得できる。具体的には、例えば、目的の異種タンパク質を有する生物からのクローニングにより異種タンパク質遺伝子を取得し、TorAシグナルペプチドをコードする塩基配列の導入やプロモーター配列の導入等の改変を行い、本発明に用いられる遺伝子構築物を取得できる。また、本発明に用いられる遺伝子構築物やその構成要素は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子構築物やその構成要素は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
　なお、２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、目的の異種タンパク質の分泌発現が達成できるように本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、例えば、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。「２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合」とは、例えば、２またはそれ以上の種類の異種タンパク質が分泌生産される場合や、ヘテロ多量体タンパク質が分泌生産される場合をいう。
　本発明に用いられる遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等を使用することができる。
＜２＞異種タンパク質の製造方法
　上記のようにして得られる本発明の細菌を培養し、異種タンパク質を発現させることにより、菌体外に分泌された多量の異種タンパク質が得られる。
　本発明の細菌は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、本発明の細菌は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
　炭素源としてはグルコースおよびスクロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養はpH5.0～8.5、15℃～37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１～７日間程度培養する。また、コリネ型細菌のＬ－アミノ酸生産における培養条件や、シグナルペプチドを用いたタンパク質の分泌生産法に記載の条件を用いることができる（WO01/23591、WO2005/103278参照）。また、異種タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。なお、本発明の方法によれば、生産された異種タンパク質は菌体外に分泌されるため、例えばトランスグルタミナーゼ等の微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であるタンパク質も、致死的影響を受けることなく連続的に生産できる。
　本発明の方法によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。また、ある場合には、培養物や培養上清をそのまま使用してもよい。本発明の方法によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用してもよい。
　目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの分子量を確認することにより確認できる。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、抗体を用いたウェスタンブロットによって確認できる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、プロテインシークエンサーを用いて目的タンパク質のN末端アミノ酸配列を検出することによって確認できる。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、質量分析計を用いて、目的タンパク質の質量を決定することによって確認できる。また、目的の異種タンパク質が酵素や何らかの測定可能な生理活性を有するものである場合には、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、目的の異種タンパク質の酵素活性または生理活性を測定することにより確認できる。
　以下、非限定的な実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：C. glutamicum ATCC13869由来シグナルペプチダーゼ遺伝子（lepB）増幅用ベクターの構築
　C. glutamicum ATCC13869株のゲノム配列およびType I signal peptidase（LepB）をコードするlepB遺伝子の塩基配列は既に決定されている（GenBank Accession No. AP017557、NCBI locus_tag CGBL_0119390）。C. glutamicum ATCC13869株由来のlepB遺伝子の塩基配列を<配列番号01>に、LepBタンパク質のアミノ酸配列を<配列番号02>に示す。
　PurElute(TM) Genomic DNA Kit（EdgeBio）を用いて調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号03>と<配列番号04>のプライマーを用いてlepB遺伝子のコーディング領域とその5'側上流約0.2 kbpを含む領域をPCR法によって増幅し、約1.0 kbpのDNA断片を得た。<配列番号03>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号04>のプライマーには制限酵素ApaIおよびXbaIの認識配列がそれぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
　このPCR断片を制限酵素KpnIおよびXbaIで消化し、WO2016/171224に記載のpPK5ベクターのKpnI-XbaI部位にライゲーション反応により挿入することによって、lepB遺伝子増幅用のベクターpPK5lepBを構築した。同様に、同PCR断片を制限酵素KpnIおよびApaIで消化し、WO2016/171224に記載のpPK6ベクターのKpnI-ApaI部位にライゲーション反応により挿入することによって、tatABC分泌装置遺伝子およびlepB遺伝子増幅用のベクターpPK6lepBを構築した。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit <Mighty Mix>（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。尚、pPK5ベクターは特開平9-322774に記載のpPK4ベクター中のNaeI制限酵素サイトを改変したベクターであり、pPK6ベクターはpPK5ベクターにtatABC遺伝子を搭載したTatABC分泌装置増幅用ベクターである（図1のパネルAおよびC）。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りのlepB遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
　pPK5lepBあるいはpPK6lepBを発現ベクターとして目的タンパク質の発現カセットをサブクローニングする際は、KpnIサイトもしくはApaI-XbaIサイトを利用することによって、lepB遺伝子と目的タンパク質の発現カセットの搭載順を調節することができる（図1のパネルBおよびD）。
実施例２：TorAシグナル配列を用いたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ（PTG）分泌発現におけるlepB遺伝子増幅効果の評価
（１）既存（lepB遺伝子非増幅）の条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたPTGの分泌発現
　WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_PTG株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン 0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）で30℃、72時間培養した。なお、pPK6_T_PTGは、tatABC遺伝子増幅用ベクターpPK6から構築されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ（PTG）の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のcspB遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたE. coli由来のTorAシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたStreptomyces mobaraense由来のPTG遺伝子を有するプラスミドである（WO2016/171224）。YDK010::phoS(W302C) 株は、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）の細胞表層タンパク質CspBの欠損株であるYDK010株（WO2002/081694）の染色体上のphoS遺伝子中にPhoS(W302C) 変異を導入した株である（WO2016/171224）。培養終了後、培養液を遠心分離して得られた培養上清1.0 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20（Cosmo Bio）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された（図2のパネルA、lanes 3-5）。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではPTGのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列（GMLGPSLLTP；配列番号４７）が確認され、低分子側のバンドではPTGのN末端アミノ酸配列（DNGAGEETKS；配列番号４８）が確認された（図2のパネルB）。即ち、TorAシグナル配列を用いたPTG分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存していることが分かった。
（２）pPK6lepBベクターを用いたPTG分泌発現用ベクター構築
　WO2016/171224に記載のPTG分泌発現用ベクターpPK6_T_PTGを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号06>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号08>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナルペプチド-PTGの発現カセットを含む約1.9 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号06>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号08>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
　これらのDNA断片を、実施例１で構築したpPK6lepBベクターのKpnI部位あるいはApaI部位にそれぞれインフュージョン反応により挿入することによって、tatABC分泌装置遺伝子、lepB遺伝子、TorAシグナル配列を融合したPTG遺伝子の共発現プラスミドであるpPK6lepB(K)_T_PTGおよびpPK6lepB(A)_T_PTGを構築した（図1のパネルD）。プラスミド名の (K) および (A) は、それぞれPTGの発現カセットを挿入したpPK6lepBベクターの制限酵素部位（KpnIサイトおよびApaIサイト）を表している。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（３）lepB遺伝子増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたPTGの分泌発現
　実施例２（２）で構築したPTG分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_PTGおよびpPK6lepB(A)_T_PTGを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_PTG株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_PTG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清1.0 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20（Cosmo Bio）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_PTG導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_PTGおよびpPK6lepB(A)_T_PTG導入株では、いずれも、高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した（図2のパネルA、lanes 6-11）。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではPTGのN末端アミノ酸配列（DNGAGEETKS；配列番号４８）が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたPTG分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するPTGの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
実施例３：TorAシグナル配列を用いたプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼ（PPG）分泌発現におけるlepB遺伝子増幅効果の評価
（１）既存（lepB遺伝子非増幅）の条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたPPGの分泌発現
　WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_PPG株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。なお、pPK6_T_PPGは、tatABC遺伝子増幅用ベクターpPK6から構築されたプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼ（PPG）の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のcspB遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたE. coli由来のTorAシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたChryseobacterium proteolyticum由来のPPG遺伝子を有するプラスミドである（WO2016/171224）。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20（Cosmo Bio）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された（図3のパネルA、lanes 3-5）。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではPPGのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列（GMLGPSLLTP；配列番号４７）が確認され、低分子側のバンドではPPGのN末端アミノ酸配列（DSNGNQEING；配列番号４９）が確認された（図3のパネルB）。即ち、TorAシグナル配列を用いたPPG分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存していることが分かった。
（２）pPK6lepBベクターを用いたPPG分泌発現用ベクター構築
　WO2016/171224に記載のPPGの分泌発現用ベクターpPK6_T_PPGを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号09>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号10>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-PPGの発現カセットを含む約1.6 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号09>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号10>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
　これらのDNA断片を、実施例１で構築したpPK6lepBベクターのKpnI部位あるいはApaI部位にそれぞれインフュージョン反応により挿入することによって、tatABC分泌装置遺伝子、lepB遺伝子、TorAシグナル配列を融合したPPG遺伝子の共発現プラスミドであるpPK6lepB(K)_T_PPGおよびpPK6lepB(A)_T_PPGを構築した（図1のパネルD）。プラスミド名の (K) および (A) は、それぞれPPGの発現カセットを挿入したpPK6lepBベクターの制限酵素部位（KpnIサイトおよびApaIサイト）を表している。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（３）lepB遺伝子増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたPPGの分泌発現
　実施例３（２）で構築したPPG分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_PPGおよびpPK6lepB(A)_T_PPGを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_PPG株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_PPG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20（Cosmo Bio）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_PPG導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_PPGおよびpPK6lepB(A)_T_PPG導入株では、いずれも高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した（図3のパネルA、lanes 6-11）。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではPPGのN末端アミノ酸配列（DSNGNQEING；配列番号４９）が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたPPG分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するPPGの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
実施例４：TorAシグナル配列を用いたβ－ラクタマーゼ（Bla）分泌発現におけるlepB遺伝子増幅効果の評価
（１）Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたBlaをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
　β－ラクタマーゼ（β-lactamase；以下、Blaと表記する）の一種である、TEM-型に属するクラスA広域性β－ラクタマーゼTEM-116のアミノ酸配列は既に知られている（GenBank Accesson No. WP_000027050）。このアミノ酸配列のうち、N末端のシグナル配列を除いた24-286位の263残基のアミノ酸配列を<配列番号11>に示す。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、配列番号11のBlaをコードする塩基配列をデザインした。デザインした塩基配列を<配列番号12>に示す。
　次に、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーターの下流にE. coli由来のTorAタンパク質（UniProt Accession number: P33225）のシグナルペプチド39アミノ酸残基をコードするDNAおよび<配列番号12>に記載のDNAを連結し、さらに5’-側にKpnIサイト、3’-側にApaIサイトを付加した、TorAシグナルペプチドとBlaとの融合タンパク質の発現カセットを全合成した。全合成したDNA断片を、WO2016/171224に記載のpPK6ベクターのKpnI-ApaI部位に挿入することによって、TorAシグナル配列を用いたBlaの分泌発現プラスミドであるpPK6_T_Blaを構築した（図1のパネルC）。挿入断片の塩基配列決定の結果、設計通りのBla遺伝子発現カセットが構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（２）lepB遺伝子非増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたBlaの分泌発現
　実施例４（１）で構築したBlaの分泌発現プラスミドpPK6_T_Blaを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_Bla株を得た。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel（Thermo Fisher Scientific）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された（図4のパネルA、lanes 3-5）。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではBlaのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列（GMLGPSLLTP；配列番号４７）が確認され、低分子側のバンドはBlaのN末端アミノ酸配列（HPETLVKVKD；配列番号５０）が確認された（図4のパネルB）。即ち、TorAシグナル配列を用いたBla分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存していることが分かった。
（３）pPK6lepBベクターを用いたBla分泌発現用ベクター構築
　実施例４（１）で構築したBlaの分泌発現用ベクターpPK6_T_Blaを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号13>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号14>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-Blaの発現カセットを含む約1.5 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号13>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号14>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
　これらのDNA断片を、実施例１で構築したpPK6lepBベクターのKpnI部位あるいはApaI部位にそれぞれインフュージョン反応により挿入することによって、tatABC分泌装置遺伝子、lepB遺伝子、TorAシグナル配列を融合したBla遺伝子の共発現プラスミドであるpPK6lepB(K)_T_BlaおよびpPK6lepB(A)_T_Blaを構築した（図1のパネルD）。プラスミド名の (K) および (A) は、それぞれBlaの発現カセットを挿入したpPK6lepBベクターの制限酵素部位（KpnIサイトおよびApaIサイト）を表している。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（４）lepB遺伝子増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたBlaの分泌発現
　実施例４（３）で構築したBla分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_BlaおよびpPK6lepB(A)_T_Blaを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_Bla株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_Bla株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel（Thermo Fisher Scientific）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_Bla導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_BlaおよびpPK6lepB(A)_T_Bla導入株では、いずれも高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した（図4のパネルA、lanes 6-11）。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではBlaのN末端アミノ酸配列（HPETLVKVKD；配列番号５０）が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたBla分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するBlaの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
実施例５：TorAシグナル配列を用いたチオレドキシン（Trx）分泌発現におけるlepB遺伝子増幅効果の評価
（１）Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたTrxをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
　チオレドキシン（Thioredoxin；以下、Trxと表記する）の一種である、E. coli由来のTrxAタンパク質のアミノ酸配列は既に知られている（GenBank Accesson No. WP_001323277）。このアミノ酸配列からN末端19残基を除き、さらにN末端にAlaを1残基付加して得られた改変型Trxの109残基のアミノ酸配列を<配列番号15>に示す。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、配列番号15のTrxをコードする塩基配列をデザインした。デザインした塩基配列を<配列番号16>に示す。
　次に、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーターの下流にE. coli由来のTorAタンパク質（UniProt Accession number: P33225）のシグナルペプチド39アミノ酸残基をコードするDNAおよび<配列番号16>に記載のDNAを連結し、さらに5’-側にKpnIサイト、3’-側にApaIサイトを付加した、TorAシグナルペプチドとTrxとの融合タンパク質の発現カセットを全合成した。全合成したDNA断片を、WO2016/171224に記載のpPK6ベクターのKpnI-ApaI部位に挿入することによって、Trxの分泌発現プラスミドであるpPK6_T_Trxを構築した（図1のパネルC）。挿入断片の塩基配列決定の結果、設計通りのTrx遺伝子発現カセットが構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（２）lepB遺伝子非増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたTrxの分泌発現
　実施例５（１）で構築したTrxの分泌発現プラスミドpPK6_T_Trxを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_Trx株を得た。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、NuPAGE(R) 12% Bis-Tirs Gel（Thermo Fisher Scientific）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された（図5のパネルA、lanes 3-5）。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではTrxのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列（GMLGPSLLTP；配列番号４７）が確認され、低分子側のバンドではTrxのN末端アミノ酸配列（ASDKIIHLTD；配列番号５１）が確認された（図5のパネルB）。即ち、TorAシグナル配列を用いたTrx分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存していることが分かった。
（３）pPK6lepBベクターを用いたTrx分泌発現用ベクター構築
　実施例５（１）で構築したTrxの分泌発現用ベクターpPK6_T_Trxを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号17>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号18>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-Trxの発現カセットを含む約1.1 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号17>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号18>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
　これらのDNA断片を、実施例１で構築したpPK6lepBベクターのKpnI部位あるいはApaI部位にそれぞれインフュージョン反応により挿入することによって、tatABC分泌装置遺伝子、lepB遺伝子、TorAシグナル配列を融合したTrx遺伝子の共発現プラスミドであるpPK6lepB(K)_T_TrxおよびpPK6lepB(A)_T_Trxを構築した（図1のパネルD）。プラスミド名の (K) および (A) は、それぞれTrxの発現カセットを挿入したpPK6lepBベクターの制限酵素部位（KpnIサイトおよびApaIサイト）を表している。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（４）lepB遺伝子増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたTrxの分泌発現
　実施例５（３）で構築したTrx分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_TrxおよびpPK6lepB(A)_T_Trxを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_Trx株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_Trx株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、NuPAGE(R) 12% Bis-Tirs Gel（Thermo Fisher Scientific）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_Trx導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_BlaおよびpPK6lepB(A)_T_Bla導入株では、いずれも高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した（図5のパネルA、lanes 6-11）。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではTrxのN末端アミノ酸配列（ASDKIIHLTD；配列番号５１）が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたTrx分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するTrxの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
実施例６：TorAシグナル配列を用いたLiver-type fatty acid-binding protein（LFABP）分泌発現におけるlepB遺伝子増幅効果の評価
（１）Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたLFABPをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
　ヒトのLiver-type fatty acid-binding protein（以下、LFABPと表記する）のアミノ酸配列は既に知られている（GenBank Accession No. NP_001434）。この127残基のアミノ酸配列を<配列番号19>に示す。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、配列番号19のLFABPをコードする塩基配列をデザインした。デザインした塩基配列を<配列番号20>に示す。
　次に、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーターの下流にE. coli由来のTorAタンパク質（UniProt Accession number: P33225）のシグナルペプチド39アミノ酸残基をコードするDNAおよび<配列番号20>に記載のDNAを連結し、さらに5’-側にKpnIサイト、3’-側にApaIサイトを付加した、TorAシグナルペプチドとLFABPとの融合タンパク質の発現カセットを全合成した。全合成したDNA断片を、WO2016/171224に記載のpPK6ベクターのKpnI-ApaI部位に挿入することによって、LFABPの分泌発現プラスミドであるpPK6_T_LFABPを構築した（図1のパネルC）。挿入断片の塩基配列決定の結果、設計通りのLFABP遺伝子発現カセットが構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（２）lepB遺伝子非増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたLFABPの分泌発現
　実施例６（１）で構築したLFABPの分泌発現プラスミドpPK6_T_LFABPを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_LFABP株を得た。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel（Thermo Fisher Scientific）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby（Life Technologies）にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された（図6のパネルA、lanes 3-5）。尚、高分子側のバンドは、ネガティブコントロールであるYDK010::phoS(W302C)/pPK6株の培養上清にも検出されたため（図6のパネルA、lane2）、宿主であるC. glutamicum由来のタンパク質が含まれていることが推定された。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではLFABPのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列（GMLGPSLLTP；配列番号４７）、およびC. glutamicum由来のresuscitation-promoting factor Rpf1（GenBank Accession No. AP017557、NCBI locus_tag CGBL_0109030）の成熟タンパク質のN末端配列（APDSDWDRLA；配列番号５２）が検出され、高分子側のバンドは主にこれら2種類のタンパク質の混合バンドであることが確認された（図6のパネルB）。なお、Rpf1シグナル配列のC末端側の部分配列が残存していることを示すアミノ酸配列は検出されず、Rpf1については正常にシグナルペプチド全長が切断されていることが確認された。一方、低分子側のバンドではLFABPのN末端アミノ酸配列（MSFSGKYQLQ；配列番号５３）が確認された（図6のパネルB）。即ち、TorAシグナル配列を用いたLFABP分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存していることが分かった。
（３）pPK6lepBベクターを用いたLFABP分泌発現用ベクター構築
　実施例６（１）で構築したLFABPの分泌発現用ベクターpPK6_T_LFABPを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号21>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号22>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-LFABPの発現カセットを含む約1.1 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号21>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号22>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列がそれぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
　これらのDNA断片を、実施例１で作製したpPK6lepBベクターのKpnI部位あるいはApaI部位にそれぞれインフュージョン反応により挿入することによって、tatABC分泌装置遺伝子、lepB遺伝子、TorAシグナル配列を融合したLFABP遺伝子の共発現プラスミドであるpPK6lepB(K)_T_LFABPおよびpPK6lepB(A)_T_FABPを構築した（図1のパネルD）。プラスミド名の (K) および (A) は、それぞれLFABPの発現カセットを挿入したpPK6lepBベクターの制限酵素部位（KpnIサイトおよびApaIサイト）を表している。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（４）lepB遺伝子増幅条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたLFABPの分泌発現
　実施例６（３）で構築したLFABP分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_LFABPおよびpPK6lepB(A)_T_LFABPを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_LFABP株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_LFABP株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel（Thermo Fisher Scientific）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby（Life Technologies）にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_LFABP導入株では主な2本のバンドがおよそ等量ずつ検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_FABPおよびpPK6lepB(A)_T_FABP導入株では、いずれも低分子側の目的LFABPのバンドが顕著に増加した（図6のパネルA、lanes 6-11）。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではLFABPのN末端アミノ酸配列（MSFSGKYQLQ；配列番号５３）が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたLFABP分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するLFABPの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
　以上の結果より、C. glutamicumにおいてTorAシグナル配列を用いて異種タンパク質を分泌発現させる際に、発現させるタンパク質の種類によらず、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存すること、およびlepB遺伝子の増幅によってシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有する異種タンパク質の生産効率を顕著に向上できることが分かった。
実施例７：SlpAシグナル配列を用いたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ（PTG）分泌発現におけるlepB遺伝子増幅効果の評価
（１）pPK5ベクターを用いたPTG分泌発現用ベクター構築
　WO2002/081694に記載のPTGの分泌発現用ベクターpPKSPTG1を鋳型に、<配列番号23>と<配列番号24>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-SlpAシグナル配列-PTGの発現カセットを含む約1.8 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号23>と<配列番号24>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列がそれぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を、WO2016/171224に記載のpPK5ベクターのKpnI部位にインフュージョン反応により挿入することによって、SlpAシグナル配列を用いたPTG分泌発現ベクターであるpPK5_S_PTGを構築した（図1のパネルA）。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（２）pPK5lepBベクターを用いたPTG分泌発現用ベクター構築
　実施例７（１）と同様に、WO2002/081694に記載のPTGの分泌発現用ベクターpPKSPTG1を鋳型に、<配列番号23>と<配列番号25>のプライマー、または<配列番号26>と<配列番号27>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-SlpAシグナル配列-PTGの発現カセットを含む約1.8 kbpのDNA断片をPCR法によってそれぞれ増幅した。<配列番号23>と<配列番号25>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号26>と<配列番号27>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列がそれぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を、実施例１で構築したpPK5lepBベクターのKpnI部位あるいはApaI部位にそれぞれインフュージョン反応により挿入することによって、lepB遺伝子と、SlpAシグナル配列を用いたPTG分泌の共発現ベクターであるpPK5lepB(K)_S_PTGおよびpPK5lepB(A)_S_PTGを構築した（図1のパネルB）。プラスミド名の (K) および (A) は、それぞれPTGの発現カセットを挿入したpPK5lepBベクターの制限酵素部位（KpnIサイトおよびApaIサイト）を表している。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（３）lepB遺伝子の増幅および非増幅条件下におけるSlpAシグナルペプチド-PTGの分泌発現
　実施例７（１）および（２）で構築した、SlpAシグナル配列を用いたPTG分泌発現プラスミドであるpPK5_S_PTG、pPK5lepB(K)_S_PTG、およびpPK5lepB(A)_S_PTGを用いてWO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK5_S_PTG株、YDK010::phoS(W302C)/pPK5lepB(K)_S_PTG株、およびYDK010::phoS(W302C)/pPK5lepB(A)_S_PTG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20（Cosmo Bio）を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange（Thermo Fisher Scientific）にて染色を行った。その結果、TorAシグナル配列を用いた場合とは異なり、SlpAシグナル配列を用いた場合では、lepB遺伝子を増幅していないpPK5_S_PTG導入株においてPTGの単一バンドが検出され、SlpAシグナルペプチドC末端側の部分配列が残存した切れ残り型は全く検出されなかった（図7のパネルA、lane 7）。また、lepB遺伝子を増幅したpPK5lepB(K)_S_PTGおよびpPK5lepB(A)_S_PTG導入株においてもバンドパターンは変化せず、むしろPTGの分泌発現量が減少した（図7のパネルA、lanes 8-9）。
　即ち、C. glutamicumを用いた異種タンパク質分泌生産において、lepB遺伝子の増幅は必ずしも全てのシグナル配列において有効ではないことが分かった。
　本発明により、異種タンパク質を効率よく分泌生産することができる。
〔配列表の説明〕
配列番号１：C. glutamicum ATCC 13869のlepB遺伝子の塩基配列
配列番号２：C. glutamicum ATCC 13869のLepBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３～１０：プライマー
配列番号１１：β－ラクタマーゼTEM-116のアミノ酸配列
配列番号１２：β－ラクタマーゼTEM-116をコードする塩基配列
配列番号１３～１４：プライマー
配列番号１５：E. coliの改変型TrxAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６：E. coliの改変型TrxAタンパク質をコードする塩基配列
配列番号１７～１８：プライマー
配列番号１９：ヒトのLFABPのアミノ酸配列
配列番号２０：ヒトのLFABPをコードする塩基配列
配列番号２１～２７：プライマー
配列番号２８：C. glutamicum YDK010のphoS遺伝子の塩基配列
配列番号２９：C. glutamicum YDK010のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３０：C. glutamicum ATCC 13032のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：C. glutamicum ATCC 14067のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３２：C. callunaeのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３３：C. crenatumのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３４：C. efficiensのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３５：C. glutamicum ATCC 13032のphoR遺伝子の塩基配列
配列番号３６：C. glutamicum ATCC 13032のPhoRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７：C. glutamicum ATCC 13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号３８：C. glutamicum ATCC 13869のCspBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３９：C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子の塩基配列
配列番号４０：C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１：C. glutamicum ATCC 13032のtatB遺伝子の塩基配列
配列番号４２：C. glutamicum ATCC 13032のTatBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：C. glutamicum ATCC 13032のtatC遺伝子の塩基配列
配列番号４４：C. glutamicum ATCC 13032のTatCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５：ツイン・アルギニンモチーフのアミノ酸配列
配列番号４６：TorAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号４７～５３：Ｎ末端アミノ酸配列
配列番号５４～５９：シグナルペプチドを含むタンパク質のＮ末端アミノ酸配列

Claims (17)

  1. 　異種タンパク質の製造方法であって、
    　異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および
    　分泌生産された異種タンパク質を回収することを含み、
    　前記コリネ型細菌が、LepBタンパク質の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
    　前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
    　前記異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
  2. 　前記LepBタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１に記載の方法：
    （ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　lepB遺伝子の発現を上昇させることにより、前記LepBタンパク質の活性が増大した、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記lepB遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記TorAシグナルペプチドが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のペプチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法：
    （ａ）配列番号４６に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
    （ｂ）配列番号４６に示すアミノ酸配列において、１～３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド；
    （ｃ）配列番号４６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド。
  6. 　前記TorAシグナルペプチドが、配列番号４６に示すアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記分泌生産された異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドが完全に除去された異種タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記コリネ型細菌が、さらに、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号２９の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項９または１０に記載の方法：
    （ａ）配列番号２９～３４のいずれかに示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号２９～３４のいずれかに示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２９～３４のいずれかに示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質。
  12. 　前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１種またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇するように改変されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）に由来する改変株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869に由来する改変株である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が非改変株と比較して低下しているコリネ型細菌である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
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