JPH10108675A - コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の新規な細胞表層蛋白質 - Google Patents
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の新規な細胞表層蛋白質Info
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- JPH10108675A JPH10108675A JP8265661A JP26566196A JPH10108675A JP H10108675 A JPH10108675 A JP H10108675A JP 8265661 A JP8265661 A JP 8265661A JP 26566196 A JP26566196 A JP 26566196A JP H10108675 A JPH10108675 A JP H10108675A
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- dna
- corynebacterium ammoniagenes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに
おいてアミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質の発現及び
分泌のための新たな系を提供する。 【解決手段】コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに
由来し、細胞表層蛋白質をコードするＤＮＡ（ａ）、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスに由来するプロモ
ーター配列、リボゾーム結合配列、シグナル配列のいず
れかまたはすべてを含むＤＮＡ（ｂ）、前記ＤＮＡ
（ｂ）の下流に有用蛋白質をコードする構造遺伝子が連
結されて得られるＤＮＡ、前記ＤＮＡ（ｂ）の下流に前
記ＤＮＡ（ａ）が連結され、さらにその下流に有用蛋白
質をコードする構造遺伝子が連結されて得られるＤＮ
Ａ、前記ＤＮＡとベクターが連結されて得られる組換え
ＤＮＡ、および前記ＤＮＡが導入された微生物。さらに
は、前記微生物を培地に培養し、有用蛋白質を細胞外に
分泌させることを特徴とする有用タンパク質の製造法。
おいてアミノ酸、ポリペプチドまたは蛋白質の発現及び
分泌のための新たな系を提供する。 【解決手段】コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに
由来し、細胞表層蛋白質をコードするＤＮＡ（ａ）、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスに由来するプロモ
ーター配列、リボゾーム結合配列、シグナル配列のいず
れかまたはすべてを含むＤＮＡ（ｂ）、前記ＤＮＡ
（ｂ）の下流に有用蛋白質をコードする構造遺伝子が連
結されて得られるＤＮＡ、前記ＤＮＡ（ｂ）の下流に前
記ＤＮＡ（ａ）が連結され、さらにその下流に有用蛋白
質をコードする構造遺伝子が連結されて得られるＤＮ
Ａ、前記ＤＮＡとベクターが連結されて得られる組換え
ＤＮＡ、および前記ＤＮＡが導入された微生物。さらに
は、前記微生物を培地に培養し、有用蛋白質を細胞外に
分泌させることを特徴とする有用タンパク質の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アミノ酸、ポリペ
プチドまたは蛋白質の発現及び分泌に関する。
プチドまたは蛋白質の発現及び分泌に関する。
【０００２】
【従来の技術】コリネバクテリウム属細菌を用いて有用
蛋白質を発現分泌させる試みは、コリネバクテリウム・
グルタミカムにおいて知られている（ＷＯ９３／０３１
５８）。
蛋白質を発現分泌させる試みは、コリネバクテリウム・
グルタミカムにおいて知られている（ＷＯ９３／０３１
５８）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】コリネバクテリウム・
アンモニアゲネスにおいてアミノ酸、ポリペプチドまた
は蛋白質の発現及び分泌のための新たな系を提供するこ
とにある。
アンモニアゲネスにおいてアミノ酸、ポリペプチドまた
は蛋白質の発現及び分泌のための新たな系を提供するこ
とにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、コリネバ
クテリウム・アンモニアゲネス由来の細胞表層蛋白質の
発現・分泌のしくみに着目し、そのプロモーター配列、
リボゾーム結合配列、シグナル配列および構造遺伝子を
単離し、構造を解析することによって本発明を完成する
に至った。
クテリウム・アンモニアゲネス由来の細胞表層蛋白質の
発現・分泌のしくみに着目し、そのプロモーター配列、
リボゾーム結合配列、シグナル配列および構造遺伝子を
単離し、構造を解析することによって本発明を完成する
に至った。
【０００５】すなわち、本発明は、コリネバクテリウム
・アンモニアゲネスに由来し、細胞表層蛋白質をコード
するＤＮＡ（ａ）である。また、本発明は、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスに由来するプロモーター配
列、リボゾーム結合配列、シグナル配列のいずれかまた
はすべてを含むＤＮＡ（ｂ）である。さらに、本発明
は、前記ＤＮＡ（ｂ）の下流に有用蛋白質をコードする
構造遺伝子が連結されて得られるＤＮＡである。さら
に、本発明は、前記ＤＮＡ（ｂ）の下流に前記ＤＮＡ
（ａ）が連結され、さらにその下流に有用蛋白質をコー
ドする構造遺伝子が連結されて得られるＤＮＡである。
さらに、本発明は、前記ＤＮＡとベクターが連結されて
得られる組換えＤＮＡであり、前記ＤＮＡが導入された
微生物である。本発明は、前記微生物を培地に培養し、
有用蛋白質を細胞外に分泌させることを特徴とする有用
タンパク質の製造法である。
・アンモニアゲネスに由来し、細胞表層蛋白質をコード
するＤＮＡ（ａ）である。また、本発明は、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスに由来するプロモーター配
列、リボゾーム結合配列、シグナル配列のいずれかまた
はすべてを含むＤＮＡ（ｂ）である。さらに、本発明
は、前記ＤＮＡ（ｂ）の下流に有用蛋白質をコードする
構造遺伝子が連結されて得られるＤＮＡである。さら
に、本発明は、前記ＤＮＡ（ｂ）の下流に前記ＤＮＡ
（ａ）が連結され、さらにその下流に有用蛋白質をコー
ドする構造遺伝子が連結されて得られるＤＮＡである。
さらに、本発明は、前記ＤＮＡとベクターが連結されて
得られる組換えＤＮＡであり、前記ＤＮＡが導入された
微生物である。本発明は、前記微生物を培地に培養し、
有用蛋白質を細胞外に分泌させることを特徴とする有用
タンパク質の製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明のコリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネスに由来するプロモーター配列、リボゾー
ム結合配列、シグナル配列、細胞表層蛋白質をコードす
るＤＮＡは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由
来で細胞表層蛋白質をコードする遺伝子であればいずれ
の遺伝子からのものも用いることができる。コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスとしては コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７２ コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７１ などがある。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに
由来するプロモーター配列、リボゾーム結合配列、シグ
ナル配列は、例えば配列表配列番号４に記載される塩基
配列において１番目のアデニン残基から６０１番目のグ
アニン残基までの配列中に存在する。コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスに由来する細胞表層蛋白質をコー
ドするＤＮＡは、例えば配列表配列番号４に記載される
アミノ酸配列において１番目のアラニン残基から３３３
番目のフェニルアラニン残基までの配列を含むものがあ
る。
ンモニアゲネスに由来するプロモーター配列、リボゾー
ム結合配列、シグナル配列、細胞表層蛋白質をコードす
るＤＮＡは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由
来で細胞表層蛋白質をコードする遺伝子であればいずれ
の遺伝子からのものも用いることができる。コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスとしては コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７２ コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７１ などがある。コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに
由来するプロモーター配列、リボゾーム結合配列、シグ
ナル配列は、例えば配列表配列番号４に記載される塩基
配列において１番目のアデニン残基から６０１番目のグ
アニン残基までの配列中に存在する。コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスに由来する細胞表層蛋白質をコー
ドするＤＮＡは、例えば配列表配列番号４に記載される
アミノ酸配列において１番目のアラニン残基から３３３
番目のフェニルアラニン残基までの配列を含むものがあ
る。
【０００７】コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに
由来するプロモーター配列、リボゾーム結合配列、シグ
ナル配列、細胞表層蛋白質をコードするＤＮＡは、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２
株の染色体ＤＮＡから、以下のようにして得ることがで
きる。
由来するプロモーター配列、リボゾーム結合配列、シグ
ナル配列、細胞表層蛋白質をコードするＤＮＡは、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２
株の染色体ＤＮＡから、以下のようにして得ることがで
きる。
【０００８】まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲ
ネス ＡＴＣＣ６８７２株を培養し、培養液あるいは菌
体抽出物から細胞表層蛋白質を精製し、Ｎ末端のアミノ
酸配列を決定する。具体的にはソディウムドデシルサル
フェイト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）の後ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）
膜に転写し、アミノ酸解析を行うことができる。コリネ
バクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２株
から得られる分子量４６，０００Ｄａの蛋白質のＮ末端
アミノ酸配列は配列表配列番号１に示す通りである。
ネス ＡＴＣＣ６８７２株を培養し、培養液あるいは菌
体抽出物から細胞表層蛋白質を精製し、Ｎ末端のアミノ
酸配列を決定する。具体的にはソディウムドデシルサル
フェイト−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）の後ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）
膜に転写し、アミノ酸解析を行うことができる。コリネ
バクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２株
から得られる分子量４６，０００Ｄａの蛋白質のＮ末端
アミノ酸配列は配列表配列番号１に示す通りである。
【０００９】次に、適当な制限酵素で切断された染色体
ＤＮＡ断片をカセットと呼ばれる二本鎖のオリゴヌクレ
オチドと連結し、Ｎ末端のアミノ酸配列をもとに合成さ
れたオリゴヌクレオチドと、カセットの配列を基に合成
されたオリゴヌクレオチドとをプライマとして用いてポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）を
行うことにより、目的ＤＮＡ断片を取得できる（Molecu
lar and Cellular Probes, 6, 467 (1992)）。プライマ
ーとしては、塩基組成がランダムでＧ＋Ｃ含量が５０％
付近であり、特殊な２次構造を形成せず、プライマー同
士が互いに相補的でない、との条件を満たすものであ
り、長さは通常１８ないし３０塩基のものがよく用いら
れる。プライマーの配列は具体的に例示すると、配列表
配列番号２および３に示すようなものが挙げられる。
ＤＮＡ断片をカセットと呼ばれる二本鎖のオリゴヌクレ
オチドと連結し、Ｎ末端のアミノ酸配列をもとに合成さ
れたオリゴヌクレオチドと、カセットの配列を基に合成
されたオリゴヌクレオチドとをプライマとして用いてポ
リメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）を
行うことにより、目的ＤＮＡ断片を取得できる（Molecu
lar and Cellular Probes, 6, 467 (1992)）。プライマ
ーとしては、塩基組成がランダムでＧ＋Ｃ含量が５０％
付近であり、特殊な２次構造を形成せず、プライマー同
士が互いに相補的でない、との条件を満たすものであ
り、長さは通常１８ないし３０塩基のものがよく用いら
れる。プライマーの配列は具体的に例示すると、配列表
配列番号２および３に示すようなものが挙げられる。
【００１０】ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡ断片を
ベクターに連結して組換えＤＮＡとしてクローニングを
行う。ベクターとしてはエシェリヒア・コリ由来のベク
ター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が用いられ
る。作成した組換えＤＮＡの受容菌としては、ベクター
の複製に好適なものであればいずれの菌株でもよく、例
えばＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等のエシェリヒア
・コリ菌株が用いられる。
ベクターに連結して組換えＤＮＡとしてクローニングを
行う。ベクターとしてはエシェリヒア・コリ由来のベク
ター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が用いられ
る。作成した組換えＤＮＡの受容菌としては、ベクター
の複製に好適なものであればいずれの菌株でもよく、例
えばＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ５等のエシェリヒア
・コリ菌株が用いられる。
【００１１】上記で得られたＤＮＡは細胞表層蛋白質構
造遺伝子を含むが、同時にプロモーター配列、リボゾー
ム結合配列およびシグナル配列を含む構造遺伝子上流の
機能性配列を得ることができる。具体的には、コリネバ
クテリウム・アンモニアゲネス染色体ＤＮＡを適当な制
限酵素で切断した物をエシェリヒア・コリ由来のベクタ
ーに連結し、これで適当な受容菌を形質転換する。コロ
ニーハイブリダイゼーション法により、形質転換された
エシェリヒア・コリのうち、ラベルした細胞表層蛋白質
構造遺伝子断片とハイブリダイズする組換えＤＮＡを有
するものを選択する。
造遺伝子を含むが、同時にプロモーター配列、リボゾー
ム結合配列およびシグナル配列を含む構造遺伝子上流の
機能性配列を得ることができる。具体的には、コリネバ
クテリウム・アンモニアゲネス染色体ＤＮＡを適当な制
限酵素で切断した物をエシェリヒア・コリ由来のベクタ
ーに連結し、これで適当な受容菌を形質転換する。コロ
ニーハイブリダイゼーション法により、形質転換された
エシェリヒア・コリのうち、ラベルした細胞表層蛋白質
構造遺伝子断片とハイブリダイズする組換えＤＮＡを有
するものを選択する。
【００１２】選択された形質転換体から組換えＤＮＡを
抽出し、挿入された断片の塩基配列を決定することで細
胞表層蛋白質構造遺伝子および構造遺伝子上流の機能性
配列を決定することが出来る。決定された２３２３塩基
対の塩基配列と、そこにコードされる細胞表層蛋白質の
アミノ酸配列を配列表配列番号４に示した。細胞表層蛋
白質は３５８アミノ酸残基からなり、３３３アミノ酸残
基からなる成熟蛋白質と、そのＮ末端側に位置する２５
アミノ酸残基のシグナルペプチドとからなる。成熟蛋白
質の分子量は３６、６５４Ｄａと計算される。予想され
るアミノ酸配列を蛋白質データベース（ＮＢＲＦ）上で
検索したところ、新規蛋白質であることが判明した。
抽出し、挿入された断片の塩基配列を決定することで細
胞表層蛋白質構造遺伝子および構造遺伝子上流の機能性
配列を決定することが出来る。決定された２３２３塩基
対の塩基配列と、そこにコードされる細胞表層蛋白質の
アミノ酸配列を配列表配列番号４に示した。細胞表層蛋
白質は３５８アミノ酸残基からなり、３３３アミノ酸残
基からなる成熟蛋白質と、そのＮ末端側に位置する２５
アミノ酸残基のシグナルペプチドとからなる。成熟蛋白
質の分子量は３６、６５４Ｄａと計算される。予想され
るアミノ酸配列を蛋白質データベース（ＮＢＲＦ）上で
検索したところ、新規蛋白質であることが判明した。
【００１３】リボゾーム結合配列は翻訳開始点の数塩基
上流にあることが知られていることから推定することが
できる（Nature, 254, 34 (1975)）。配列表配列番号４
に記載される塩基配列においては、４６３番目のシトシ
ン残基から４６８番目のチミン残基までの領域である。
上流にあることが知られていることから推定することが
できる（Nature, 254, 34 (1975)）。配列表配列番号４
に記載される塩基配列においては、４６３番目のシトシ
ン残基から４６８番目のチミン残基までの領域である。
【００１４】また、プロモーター配列は転写開始点の数
塩基上流にあることが知られていることから、公知の方
法によって転写開始点を決定し、決定される転写開始点
の情報に基づいて推定できる。転写開始点の決定法は、
例えばプライマー伸張法によって決定できる。配列表配
列番号４に記載される塩基配列においては、４３８番目
のチミン残基から４４４番目のチミン残基までの領域で
ある。
塩基上流にあることが知られていることから、公知の方
法によって転写開始点を決定し、決定される転写開始点
の情報に基づいて推定できる。転写開始点の決定法は、
例えばプライマー伸張法によって決定できる。配列表配
列番号４に記載される塩基配列においては、４３８番目
のチミン残基から４４４番目のチミン残基までの領域で
ある。
【００１５】こうして得られた、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネスに由来し、プロモーター配列、リボゾ
ーム結合配列、およびシグナル配列の下流に、有用蛋白
質をコードする構造遺伝子を連結し、さらにこれとベク
ターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
アンモニアゲネスに由来し、プロモーター配列、リボゾ
ーム結合配列、およびシグナル配列の下流に、有用蛋白
質をコードする構造遺伝子を連結し、さらにこれとベク
ターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
【００１６】本発明の有用蛋白質は特に限定されない
が、例えば、酵素、生理活性蛋白質などがあげられ、由
来も、微生物、植物、動物等のものが用いられる。天然
に存在する蛋白質であってもよく、人工的に変異が導入
された蛋白質であってもよい。
が、例えば、酵素、生理活性蛋白質などがあげられ、由
来も、微生物、植物、動物等のものが用いられる。天然
に存在する蛋白質であってもよく、人工的に変異が導入
された蛋白質であってもよい。
【００１７】ベクターＤＮＡとは、ＤＮＡを人為的に細
胞に導入するためのいわゆる「運び屋」である。これに
は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン等がある。
コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターとして
は、ｐＨＭ１５１９、ｐＡＭ３３０等のプラスミドベク
ターがあり、トランスポゾンをベクターとして用いた例
は特表平５−８１８１５１号公報に記載されている。
胞に導入するためのいわゆる「運び屋」である。これに
は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン等がある。
コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターとして
は、ｐＨＭ１５１９、ｐＡＭ３３０等のプラスミドベク
ターがあり、トランスポゾンをベクターとして用いた例
は特表平５−８１８１５１号公報に記載されている。
【００１８】コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由
来のシグナル配列と、有用蛋白質との間に、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネス由来の細胞表層蛋白質構造
遺伝子全部またはＮ末端側一部分をコードするＤＮＡを
挿入しても良い。該挿入によって有用蛋白質の発現・分
泌が効率的になる場合がある。ただし、分泌される有用
蛋白質はコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の
細胞表層蛋白質との融合蛋白質となるので、ペプチダー
ゼを用いて不要な部分を除去する工程が必要となる場合
がある。
来のシグナル配列と、有用蛋白質との間に、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネス由来の細胞表層蛋白質構造
遺伝子全部またはＮ末端側一部分をコードするＤＮＡを
挿入しても良い。該挿入によって有用蛋白質の発現・分
泌が効率的になる場合がある。ただし、分泌される有用
蛋白質はコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の
細胞表層蛋白質との融合蛋白質となるので、ペプチダー
ゼを用いて不要な部分を除去する工程が必要となる場合
がある。
【００１９】組換えＤＮＡは公知の方法によって宿主細
胞に導入される。宿主細胞としては、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２ コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７１ などがある。
胞に導入される。宿主細胞としては、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２ コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７１ などがある。
【００２０】組換えＤＮＡが導入された形質転換体を適
当な培地で培養して、有用蛋白質を細胞外に分泌させ、
これを回収する。形質転換体を培養する培地、培養方
法、有用蛋白質の回収方法はいずれも公知の方法を採用
できる。
当な培地で培養して、有用蛋白質を細胞外に分泌させ、
これを回収する。形質転換体を培養する培地、培養方
法、有用蛋白質の回収方法はいずれも公知の方法を採用
できる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。なお、制限酵素は市販品（宝酒造社製）を用
いた。
説明する。なお、制限酵素は市販品（宝酒造社製）を用
いた。
【００２２】実施例１（コリネバクテリウム・アンモニ
アゲネス由来の細胞表層蛋白質のＮ末端アミノ酸配列の
決定） コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７２株をグルコース２０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム
０．５ｇ／ｌ、リン酸１カリウム １ｇ／ｌ、リン酸２
カリウム ３ｇ／ｌ、塩化カルシウム ０．０１ｇ／
ｌ、硫酸鉄 ０．０１ｇ／ｌ、硫酸マンガン ０．００
５ｇ／ｌ、チアミン塩酸塩 ０．０１ｇ／ｌ、パントテ
ン酸カルシウム ０．０１ｇ／ｌ、ビオチン ３０μｇ
／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ、イーストエキスト
ラクト １ｇ／ｌ、尿素 ２ｇ／ｌからなる培地で３２
℃，２４時間培養した。この培養液４００ｍｌから遠心
分離により集菌し、得られた菌体を２０ｍｌの５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２％ＳＤＳに懸濁
し、１００℃で５分間処理した。この処理液を遠心分離
し上清を細胞壁画分とした。細胞壁画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで解析したところ最も多量な蛋白質として、分子量
４６，０００の蛋白質が検出された。細胞壁画分４０μ
ｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後、ＰＶＤＦ膜（ミリ
ポア社製）にセミドライブロッティングした（遺伝子ク
ローニングのためのタンパク質構造解析東京化学同人(1
993)）。ＰＶＤＦ膜をクマシーブリリアントブルー染色
した後、脱染、風乾した。分子量４６、０００の蛋白質
部分を切り取り、プロテインシークエンサー（モデル４
７６Ａ、パーキン・エルマー社製）でＮ末端アミノ酸配
列の解析を行った。決定したアミノ酸配列を配列表配列
番号１に示した。２９アミノ酸残基のうち２アミノ酸残
基は同定できなかった。
アゲネス由来の細胞表層蛋白質のＮ末端アミノ酸配列の
決定） コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７２株をグルコース２０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム
０．５ｇ／ｌ、リン酸１カリウム １ｇ／ｌ、リン酸２
カリウム ３ｇ／ｌ、塩化カルシウム ０．０１ｇ／
ｌ、硫酸鉄 ０．０１ｇ／ｌ、硫酸マンガン ０．００
５ｇ／ｌ、チアミン塩酸塩 ０．０１ｇ／ｌ、パントテ
ン酸カルシウム ０．０１ｇ／ｌ、ビオチン ３０μｇ
／ｌ、硫酸アンモニウム ５ｇ／ｌ、イーストエキスト
ラクト １ｇ／ｌ、尿素 ２ｇ／ｌからなる培地で３２
℃，２４時間培養した。この培養液４００ｍｌから遠心
分離により集菌し、得られた菌体を２０ｍｌの５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２％ＳＤＳに懸濁
し、１００℃で５分間処理した。この処理液を遠心分離
し上清を細胞壁画分とした。細胞壁画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで解析したところ最も多量な蛋白質として、分子量
４６，０００の蛋白質が検出された。細胞壁画分４０μ
ｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後、ＰＶＤＦ膜（ミリ
ポア社製）にセミドライブロッティングした（遺伝子ク
ローニングのためのタンパク質構造解析東京化学同人(1
993)）。ＰＶＤＦ膜をクマシーブリリアントブルー染色
した後、脱染、風乾した。分子量４６、０００の蛋白質
部分を切り取り、プロテインシークエンサー（モデル４
７６Ａ、パーキン・エルマー社製）でＮ末端アミノ酸配
列の解析を行った。決定したアミノ酸配列を配列表配列
番号１に示した。２９アミノ酸残基のうち２アミノ酸残
基は同定できなかった。
【００２３】実施例２（コリネバクテリウム・アンモニ
アゲネス由来の細胞表層蛋白質遺伝子の取得） Ｎ末端アミノ配列から推定される塩基配列中で縮重の少
ない部位を選びプライマーを作製した。作製したプライ
マーの配列を配列表配列番号２および３に示した。鋳型
としては、斉藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Act
a., 72, 619, (1963)）により調製したコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２株染色体の
ＥｃｏＲＩ切断断片とカセットとの連結物を調製した。
反応には宝酒造社製ＬＡ インビトロ クローニングキ
ットを用い、反応条件は供給者の指示に従って行った。
約１，９００塩基の特異的なバンドの増幅が認められ
た。この断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて
回収した。増幅された遺伝子断片をプローブとしてコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス染色体をMolecularC
loning 2nd edition (J. Sambrook, E. F. Fritsch and
T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Pres
s, p9.31(1989)）記載のサザンハイブリダイゼーション
法により解析したところＥｃｏＲＩ切断により６，３０
０塩基のバンドが検出された。コリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネス染色体のＥｃｏＲＩ切断断片をアガロー
スゲル電気泳動の後、目的の長さ周辺の断片を回収、ｐ
ＭＷ２１８（日本ジーン社製）に連結し、Molecular Cl
oning 2nd edition (J. Sambrook,E. F. Fritsch and
T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press,
p1.90(1989)）記載のコロニーハイブリダイゼーション
法により目的遺伝子断片の選択を行い、同断片を含むプ
ラスミドｐＭＷＥ６．３を得た。この断片の制限酵素地
図を図１に示した。この断片のうち目的遺伝子を含むと
考えられた７００塩基のＨｉｎｄIII切断断片と１，６
００塩基のＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩ切断断片をｐＵＣ１
８（宝酒造社製）に挿入した。これらの断片の塩基配列
を決定し、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来
の細胞表層蛋白質構造遺伝子の塩基配列及びその機能性
配列の塩基配列を明らかにした。塩基配列の決定は、ダ
イ ターミネーター サイクル シークエンシング キ
ット（パーキン・エルマー社製）とＤＮＡシークエンサ
ー（モデル３７３Ａ、パーキン・エルマー社製）を用い
て行った。
アゲネス由来の細胞表層蛋白質遺伝子の取得） Ｎ末端アミノ配列から推定される塩基配列中で縮重の少
ない部位を選びプライマーを作製した。作製したプライ
マーの配列を配列表配列番号２および３に示した。鋳型
としては、斉藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Act
a., 72, 619, (1963)）により調製したコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７２株染色体の
ＥｃｏＲＩ切断断片とカセットとの連結物を調製した。
反応には宝酒造社製ＬＡ インビトロ クローニングキ
ットを用い、反応条件は供給者の指示に従って行った。
約１，９００塩基の特異的なバンドの増幅が認められ
た。この断片をグラスパウダー（宝酒造社製）を用いて
回収した。増幅された遺伝子断片をプローブとしてコリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネス染色体をMolecularC
loning 2nd edition (J. Sambrook, E. F. Fritsch and
T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Pres
s, p9.31(1989)）記載のサザンハイブリダイゼーション
法により解析したところＥｃｏＲＩ切断により６，３０
０塩基のバンドが検出された。コリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネス染色体のＥｃｏＲＩ切断断片をアガロー
スゲル電気泳動の後、目的の長さ周辺の断片を回収、ｐ
ＭＷ２１８（日本ジーン社製）に連結し、Molecular Cl
oning 2nd edition (J. Sambrook,E. F. Fritsch and
T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press,
p1.90(1989)）記載のコロニーハイブリダイゼーション
法により目的遺伝子断片の選択を行い、同断片を含むプ
ラスミドｐＭＷＥ６．３を得た。この断片の制限酵素地
図を図１に示した。この断片のうち目的遺伝子を含むと
考えられた７００塩基のＨｉｎｄIII切断断片と１，６
００塩基のＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩ切断断片をｐＵＣ１
８（宝酒造社製）に挿入した。これらの断片の塩基配列
を決定し、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来
の細胞表層蛋白質構造遺伝子の塩基配列及びその機能性
配列の塩基配列を明らかにした。塩基配列の決定は、ダ
イ ターミネーター サイクル シークエンシング キ
ット（パーキン・エルマー社製）とＤＮＡシークエンサ
ー（モデル３７３Ａ、パーキン・エルマー社製）を用い
て行った。
【００２４】実施例３（プライマー伸張法による転写開
始点の決定） コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７２株を実施例１記載の培地に植菌し、３２℃で５時間
培養した。この培養液１００ｍｌを遠心分離により集菌
した。この菌体からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を
用いてその指示に従って全ＲＮＡ抽出を行った。得られ
た全ＲＮＡ濃度は０．２ｇ／ｌであった。配列表配列番
号５に示した配列のプライマーを合成し、[γ-32Ｐ] Ａ
ＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって末端標識
を行った。全ＲＮＡ１０μｇに対し、１０ｐｍｏｌのラ
ベルしたプライマーを混合し、４０℃で１２時間アニー
ルした。これを１０ＵのＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ社
製）と混合し、逆転写反応を行った。反応にはリバース
トランスクリプション システム（プロメガ社製）を
用いて、反応条件はその指示に従った。Molecular Clon
ing 2nd edition (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T.
Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p
7.79(1989)）記載の方法に従って、変性ゲルにて反応物
を解析し、転写開始点を決定した。その結果、転写開始
点は配列表配列番号４に記載される塩基配列の４５４番
目のシトシン残基であった。
始点の決定） コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８
７２株を実施例１記載の培地に植菌し、３２℃で５時間
培養した。この培養液１００ｍｌを遠心分離により集菌
した。この菌体からＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を
用いてその指示に従って全ＲＮＡ抽出を行った。得られ
た全ＲＮＡ濃度は０．２ｇ／ｌであった。配列表配列番
号５に示した配列のプライマーを合成し、[γ-32Ｐ] Ａ
ＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって末端標識
を行った。全ＲＮＡ１０μｇに対し、１０ｐｍｏｌのラ
ベルしたプライマーを混合し、４０℃で１２時間アニー
ルした。これを１０ＵのＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ社
製）と混合し、逆転写反応を行った。反応にはリバース
トランスクリプション システム（プロメガ社製）を
用いて、反応条件はその指示に従った。Molecular Clon
ing 2nd edition (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T.
Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p
7.79(1989)）記載の方法に従って、変性ゲルにて反応物
を解析し、転写開始点を決定した。その結果、転写開始
点は配列表配列番号４に記載される塩基配列の４５４番
目のシトシン残基であった。
【００２５】
配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Cory
nebacterium ammoniagenes） 株名：ATCC6872 配列 Ala Glu Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Gly Asp Thr Ala Leu Ser 1 5 10 15 Glu Ile Gln Glu Leu Xaa Val Asp Ser Thr Ile Xaa Gly Gln 20 25
nebacterium ammoniagenes） 株名：ATCC6872 配列 Ala Glu Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Gly Asp Thr Ala Leu Ser 1 5 10 15 Glu Ile Gln Glu Leu Xaa Val Asp Ser Thr Ile Xaa Gly Gln 20 25
【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GARAARACNC CNGCNGAYAT ２０
【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＹＡＴＨＧＣＮＧ ＧＮＧＡＹＡＣＮＧＣ
20
20
【００２８】配列番号：４ 配列の長さ：2323 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Cory
nebacterium ammoniagenes） 株名：ATCC6872 配列の特徴 特徴を表す記号：-10 signal 存在位置：438..444 特徴を決定した方法：E 配列の特徴 特徴を表す記号：RBS 存在位置：463..468 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：479..1552 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：479..553 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：554..1552 特徴を決定した方法：P 配列 AAGCTTTGCC CAGAAGCCCA AAATTGAGAT TTGTTCCATG ATAAATGAAC TTTTCGGTTT 60 TGGGATTCGG TCCACGCGCC GTCAAGAGCC TGAAAAGATT ATGACATATT TGTCACATTC 120 GCACCAGCAG TCCTGCCATT CTACTGTTAA GCTGTCTGTG TCCCTTCTCT TATGCTCCAT 180 CTTTGCTAGA AGTCATACAG GTTTCTTTAA CAGGCTTTTG AGAAACTCCC CTTTCCAGCT 240 CCAAAACCCG TTAGCCTAGG AGATTTTGGG AACTGATAAC GAAATCTGGA TAGTCTGCGA 300 TAATTAAACA GCGGAATAAT ATCTCGCACC TAGTCATTTT TCAGGTATCT GATAGAAATG 360 AAGCGACGCC TTGTTTTCGT AGGGATTTCT TCTACGTTTG CGCGTTGTGA AGAACTAGCA 420 GAGGATTAAT CGGAACCTTC CATTCCCTTA ACTCACACAG AACGGAATAA TTAACACC 478 ATG AAA CGC ATG AAA TCG CTG GCT GCG GCG CTC ACC GTC GCT GGG GCC 526 Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala -25 -20 -15 -10 ATG CTG GCC GCA CCT GTG GCA ACG GCA GCA GAA AAA ACT CCT GCT GAT 574 Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Ala Glu Lys Thr Pro Ala Asp -5 1 5 ATC GCT GGA GAC ACT GCA CTG TCT GAG ATT CAG GAA TTG GAA GTT GAC 622 Ile Ala Gly Asp Thr Ala Leu Ser Glu Ile Gln Glu Leu Glu Val Asp 10 15 20 TCC ACA ATT GAA GGG CAG AAG TGG TAC CAA AAG TAC GCA GAT GAT GAG 670 Ser Thr Ile Glu Gly Gln Lys Trp Tyr Gln Lys Tyr Ala Asp Asp Glu 25 30 35 CGG GTG CTC AAG CTT CAA GCG ACC TCC CCA GCA ATG GAT GGT CGT AAG 718 Arg Val Leu Lys Leu Gln Ala Thr Ser Pro Ala Met Asp Gly Arg Lys 40 45 50 55 GTT CCG CTC GCC ATC ATT CGG GCT CAA AAC CCA GAC CGT CCA ACG ATC 766 Val Pro Leu Ala Ile Ile Arg Ala Gln Asn Pro Asp Arg Pro Thr Ile 60 65 70 TAC CTG CTC AAC GGC GCA GGC AGC GCT GAG CAG GAT ACA GAC TGG TTG 814 Tyr Leu Leu Asn Gly Ala Gly Ser Ala Glu Gln Asp Thr Asp Trp Leu 75 80 85 AAC CAG TCG GAG GCA GTA GAC TTC TAC GCC GAT AAA GAC GTA AAC GTC 862 Asn Gln Ser Glu Ala Val Asp Phe Tyr Ala Asp Lys Asp Val Asn Val 90 95 100 GTT ATT CCC CAG GCC GGT GCG TTT TCT TAC TAC ACC GAC TGG AAC ACC 910 Val Ile Pro Gln Ala Gly Ala Phe Ser Tyr Tyr Thr Asp Trp Asn Thr 105 110 115 ACC CCT AAT AAG AGC TAC CTG AAG GGC CCG CAG AAG TGG GAG ACC TTC 958 Thr Pro Asn Lys Ser Tyr Leu Lys Gly Pro Gln Lys Trp Glu Thr Phe 120 125 130 135 TTG ACC AAG GAA CTA CCT GGT CCA CTG GAA GAG CGT CTG CAG TCC AAT 1006 Leu Thr Lys Glu Leu Pro Gly Pro Leu Glu Glu Arg Leu Gln Ser Asn 140 145 150 AAC AAG CGC GCA ATT GCA GGC ATG TCC ATG TCT GCT ACC TCT TCC CTA 1054 Asn Lys Arg Ala Ile Ala Gly Met Ser Met Ser Ala Thr Ser Ser Leu 155 160 165 TTA TTG GCT CAG CAC AAT CAG GGC TTC TAC GAT GCA GTT GGC TCC TAT 1102 Leu Leu Ala Gln His Asn Gln Gly Phe Tyr Asp Ala Val Gly Ser Tyr 170 175 180 GCT GGG TGT GCT GGT ACC TCC ACG CCA TTT GAG TAC GAG GCT ATG CGC 1150 Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ser Thr Pro Phe Glu Tyr Glu Ala Met Arg 185 190 195 CTG ACT GTG AAC CGT GGT GGT GGC GAG CCA GAG CAG ATG TGG GGC AAG 1198 Leu Thr Val Asn Arg Gly Gly Gly Glu Pro Glu Gln Met Trp Gly Lys 200 205 210 215 ATG GGA TCT CGC ACC AAT CGC TAT AAT GAT GCG CTG CTG AAC TCC GAC 1246 Met Gly Ser Arg Thr Asn Arg Tyr Asn Asp Ala Leu Leu Asn Ser Asp 220 225 230 AAG CTG CGT GGC ACC GCA CTG TAC ATC TCC TCG GGC AAT GGC CTG CCA 1294 Lys Leu Arg Gly Thr Ala Leu Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Gly Leu Pro 235 240 245 GGT GAG ACT GAC ATG CCT TCC TAC TAC ACC AAG CAG GGT GTA GAC CCA 1342 Gly Glu Thr Asp Met Pro Ser Tyr Tyr Thr Lys Gln Gly Val Asp Pro 250 255 260 ACC ACA GCT TCC GTT GGC GCA GCT ACC TTG CAG ATT GAA GGC GGC ATC 1390 Thr Thr Ala Ser Val Gly Ala Ala Thr Leu Gln Ile Glu Gly Gly Ile 265 270 275 ATC GAA GCT GGC GTA AAC CAC TGC ACT CAC AAC TTG GAA GCC AAA CTG 1438 Ile Glu Ala Gly Val Asn His Cys Thr His Asn Leu Glu Ala Lys Leu 280 285 290 295 AAG AGC CAG AAC ATC CCA GCT ATC TAC AAC TTC CGC GAC ACC GGC ACC 1486 Lys Ser Gln Asn Ile Pro Ala Ile Tyr Asn Phe Arg Asp Thr Gly Thr 300 305 310 CAC TCT TGG CCG GGC TGG CGC GAA GAC TTG GAG AAG TCG TGG CCA GTA 1534 His Ser Trp Pro Gly Trp Arg Glu Asp Leu Glu Lys Ser Trp Pro Val 315 320 325 TTT GAA AAG GCA CTC TTC TAATTCGA 1560 Phe Glu Lys Ala Leu Phe 330 GTTGAGCCAG ATTAGGTAGA AACCTAAAGG GCGGTAGAAT TGCAGCATCA TGAAATCGCT 1620 GCTTTCTACC GCCCTTCGGC GTTTATCCGG GGAATTTACA GACCCTTACA CCGGTATTGA 1680 TTACAACGTC GGCTTTTCCA TCTACCATTA TGATTTGGAA TTGGTCTACC GGGTTGAGCC 1740 GAATTTACTC TCCGGCGTTG CCCACCTGCA CATTTCCATG GCAGAGGACT TAGACAATCT 1800 CACGCTAGAT TTGGGCGGAG CGATGGCCGC GCGTCGCATC TCGGCTAATA AGCACATCAA 1860 AATTACGCGC TTTCGCCAAT CCGGCGGCAA GATCCGCGTC GCTTTTGATG AGGTTATCGA 1920 AGCTGGAACA GAGTTTGTCC TGACTGTGCG CTACGGCGGC AATCCGCGTC CAATTCGCAC 1980 GACGTGGGGT GAAATCGGCT GGGAAGAAAC CGAGTCTGGT GCTCTCGTTG CATCACAGCC 2040 CAATGGCGCG CCGAGCTGGT TCCCGTGTGA CGACACCCCC AGTGAAAAAG CCACCTATGA 2100 CATCCGTGTG ACCGCCGATG ATCCCTTCAC TGTGATATCC AACGGCACTT TGGTGTCGAA 2160 GAAGCGTCGC AATAGTGCCA CAGAATGGAA CTATAAGGTC AAAAGCCCCA TGGCGACGTA 2220 CCTTGCGACG ATGCAGATAG GCGAATTTAC CGAGTTCAAA CTCGGTCGCA ATACCACCGC 2280 CTGGGCCCCG GGGCACTTGC GTGCGCGTGT GCTGGAAGAA TTC 2323
nebacterium ammoniagenes） 株名：ATCC6872 配列の特徴 特徴を表す記号：-10 signal 存在位置：438..444 特徴を決定した方法：E 配列の特徴 特徴を表す記号：RBS 存在位置：463..468 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：479..1552 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：479..553 特徴を決定した方法：P 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：554..1552 特徴を決定した方法：P 配列 AAGCTTTGCC CAGAAGCCCA AAATTGAGAT TTGTTCCATG ATAAATGAAC TTTTCGGTTT 60 TGGGATTCGG TCCACGCGCC GTCAAGAGCC TGAAAAGATT ATGACATATT TGTCACATTC 120 GCACCAGCAG TCCTGCCATT CTACTGTTAA GCTGTCTGTG TCCCTTCTCT TATGCTCCAT 180 CTTTGCTAGA AGTCATACAG GTTTCTTTAA CAGGCTTTTG AGAAACTCCC CTTTCCAGCT 240 CCAAAACCCG TTAGCCTAGG AGATTTTGGG AACTGATAAC GAAATCTGGA TAGTCTGCGA 300 TAATTAAACA GCGGAATAAT ATCTCGCACC TAGTCATTTT TCAGGTATCT GATAGAAATG 360 AAGCGACGCC TTGTTTTCGT AGGGATTTCT TCTACGTTTG CGCGTTGTGA AGAACTAGCA 420 GAGGATTAAT CGGAACCTTC CATTCCCTTA ACTCACACAG AACGGAATAA TTAACACC 478 ATG AAA CGC ATG AAA TCG CTG GCT GCG GCG CTC ACC GTC GCT GGG GCC 526 Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala -25 -20 -15 -10 ATG CTG GCC GCA CCT GTG GCA ACG GCA GCA GAA AAA ACT CCT GCT GAT 574 Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala Ala Glu Lys Thr Pro Ala Asp -5 1 5 ATC GCT GGA GAC ACT GCA CTG TCT GAG ATT CAG GAA TTG GAA GTT GAC 622 Ile Ala Gly Asp Thr Ala Leu Ser Glu Ile Gln Glu Leu Glu Val Asp 10 15 20 TCC ACA ATT GAA GGG CAG AAG TGG TAC CAA AAG TAC GCA GAT GAT GAG 670 Ser Thr Ile Glu Gly Gln Lys Trp Tyr Gln Lys Tyr Ala Asp Asp Glu 25 30 35 CGG GTG CTC AAG CTT CAA GCG ACC TCC CCA GCA ATG GAT GGT CGT AAG 718 Arg Val Leu Lys Leu Gln Ala Thr Ser Pro Ala Met Asp Gly Arg Lys 40 45 50 55 GTT CCG CTC GCC ATC ATT CGG GCT CAA AAC CCA GAC CGT CCA ACG ATC 766 Val Pro Leu Ala Ile Ile Arg Ala Gln Asn Pro Asp Arg Pro Thr Ile 60 65 70 TAC CTG CTC AAC GGC GCA GGC AGC GCT GAG CAG GAT ACA GAC TGG TTG 814 Tyr Leu Leu Asn Gly Ala Gly Ser Ala Glu Gln Asp Thr Asp Trp Leu 75 80 85 AAC CAG TCG GAG GCA GTA GAC TTC TAC GCC GAT AAA GAC GTA AAC GTC 862 Asn Gln Ser Glu Ala Val Asp Phe Tyr Ala Asp Lys Asp Val Asn Val 90 95 100 GTT ATT CCC CAG GCC GGT GCG TTT TCT TAC TAC ACC GAC TGG AAC ACC 910 Val Ile Pro Gln Ala Gly Ala Phe Ser Tyr Tyr Thr Asp Trp Asn Thr 105 110 115 ACC CCT AAT AAG AGC TAC CTG AAG GGC CCG CAG AAG TGG GAG ACC TTC 958 Thr Pro Asn Lys Ser Tyr Leu Lys Gly Pro Gln Lys Trp Glu Thr Phe 120 125 130 135 TTG ACC AAG GAA CTA CCT GGT CCA CTG GAA GAG CGT CTG CAG TCC AAT 1006 Leu Thr Lys Glu Leu Pro Gly Pro Leu Glu Glu Arg Leu Gln Ser Asn 140 145 150 AAC AAG CGC GCA ATT GCA GGC ATG TCC ATG TCT GCT ACC TCT TCC CTA 1054 Asn Lys Arg Ala Ile Ala Gly Met Ser Met Ser Ala Thr Ser Ser Leu 155 160 165 TTA TTG GCT CAG CAC AAT CAG GGC TTC TAC GAT GCA GTT GGC TCC TAT 1102 Leu Leu Ala Gln His Asn Gln Gly Phe Tyr Asp Ala Val Gly Ser Tyr 170 175 180 GCT GGG TGT GCT GGT ACC TCC ACG CCA TTT GAG TAC GAG GCT ATG CGC 1150 Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ser Thr Pro Phe Glu Tyr Glu Ala Met Arg 185 190 195 CTG ACT GTG AAC CGT GGT GGT GGC GAG CCA GAG CAG ATG TGG GGC AAG 1198 Leu Thr Val Asn Arg Gly Gly Gly Glu Pro Glu Gln Met Trp Gly Lys 200 205 210 215 ATG GGA TCT CGC ACC AAT CGC TAT AAT GAT GCG CTG CTG AAC TCC GAC 1246 Met Gly Ser Arg Thr Asn Arg Tyr Asn Asp Ala Leu Leu Asn Ser Asp 220 225 230 AAG CTG CGT GGC ACC GCA CTG TAC ATC TCC TCG GGC AAT GGC CTG CCA 1294 Lys Leu Arg Gly Thr Ala Leu Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Gly Leu Pro 235 240 245 GGT GAG ACT GAC ATG CCT TCC TAC TAC ACC AAG CAG GGT GTA GAC CCA 1342 Gly Glu Thr Asp Met Pro Ser Tyr Tyr Thr Lys Gln Gly Val Asp Pro 250 255 260 ACC ACA GCT TCC GTT GGC GCA GCT ACC TTG CAG ATT GAA GGC GGC ATC 1390 Thr Thr Ala Ser Val Gly Ala Ala Thr Leu Gln Ile Glu Gly Gly Ile 265 270 275 ATC GAA GCT GGC GTA AAC CAC TGC ACT CAC AAC TTG GAA GCC AAA CTG 1438 Ile Glu Ala Gly Val Asn His Cys Thr His Asn Leu Glu Ala Lys Leu 280 285 290 295 AAG AGC CAG AAC ATC CCA GCT ATC TAC AAC TTC CGC GAC ACC GGC ACC 1486 Lys Ser Gln Asn Ile Pro Ala Ile Tyr Asn Phe Arg Asp Thr Gly Thr 300 305 310 CAC TCT TGG CCG GGC TGG CGC GAA GAC TTG GAG AAG TCG TGG CCA GTA 1534 His Ser Trp Pro Gly Trp Arg Glu Asp Leu Glu Lys Ser Trp Pro Val 315 320 325 TTT GAA AAG GCA CTC TTC TAATTCGA 1560 Phe Glu Lys Ala Leu Phe 330 GTTGAGCCAG ATTAGGTAGA AACCTAAAGG GCGGTAGAAT TGCAGCATCA TGAAATCGCT 1620 GCTTTCTACC GCCCTTCGGC GTTTATCCGG GGAATTTACA GACCCTTACA CCGGTATTGA 1680 TTACAACGTC GGCTTTTCCA TCTACCATTA TGATTTGGAA TTGGTCTACC GGGTTGAGCC 1740 GAATTTACTC TCCGGCGTTG CCCACCTGCA CATTTCCATG GCAGAGGACT TAGACAATCT 1800 CACGCTAGAT TTGGGCGGAG CGATGGCCGC GCGTCGCATC TCGGCTAATA AGCACATCAA 1860 AATTACGCGC TTTCGCCAAT CCGGCGGCAA GATCCGCGTC GCTTTTGATG AGGTTATCGA 1920 AGCTGGAACA GAGTTTGTCC TGACTGTGCG CTACGGCGGC AATCCGCGTC CAATTCGCAC 1980 GACGTGGGGT GAAATCGGCT GGGAAGAAAC CGAGTCTGGT GCTCTCGTTG CATCACAGCC 2040 CAATGGCGCG CCGAGCTGGT TCCCGTGTGA CGACACCCCC AGTGAAAAAG CCACCTATGA 2100 CATCCGTGTG ACCGCCGATG ATCCCTTCAC TGTGATATCC AACGGCACTT TGGTGTCGAA 2160 GAAGCGTCGC AATAGTGCCA CAGAATGGAA CTATAAGGTC AAAAGCCCCA TGGCGACGTA 2220 CCTTGCGACG ATGCAGATAG GCGAATTTAC CGAGTTCAAA CTCGGTCGCA ATACCACCGC 2280 CTGGGCCCCG GGGCACTTGC GTGCGCGTGT GCTGGAAGAA TTC 2323
【００２９】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGACGGTGA GCGCCGCAGC CAGCGATTTC 30
【図１】 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス染色
体のＥｃｏＲＩ切断６，３００塩基断片の制限酵素地
図。矢印は塩基配列決定の戦略を示す。太矢印は細胞表
層蛋白質構造遺伝子の位置及び方向を示す。
体のＥｃｏＲＩ切断６，３００塩基断片の制限酵素地
図。矢印は塩基配列決定の戦略を示す。太矢印は細胞表
層蛋白質構造遺伝子の位置及び方向を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (7)
- 【請求項１】 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
に由来し、配列表配列番号４に記載されるアミノ酸配列
において１番目のアラニン残基から３３３番目のフェニ
ルアラニン残基までの配列を含む、細胞表層蛋白質をコ
ードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
に由来し、配列表配列番号４に記載される塩基配列にお
いて１番目のアデニン残基から６０１番目のグアニン残
基までの配列中に存在するプロモーター配列、リボゾー
ム結合配列、シグナル配列のいずれかまたはすべてを含
むＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項２記載のＤＮＡの下流に有用蛋白
質をコードする構造遺伝子が連結されて得られるＤＮ
Ａ。 - 【請求項４】 請求項２記載のＤＮＡの下流に請求項１
記載のＤＮＡが連結され、さらにその下流に有用蛋白質
をコードする構造遺伝子が連結されて得られるＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項３または４記載のＤＮＡとベクタ
ーが連結されて得られる組換えＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項３ないし５記載のＤＮＡが導入さ
れた微生物。 - 【請求項７】 請求項６記載の微生物を培地に培養し、
有用蛋白質を細胞外に分泌させることを特徴とする有用
タンパク質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26566196A JP3711658B2 (ja) | 1996-10-07 | 1996-10-07 | コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の新規な細胞表層蛋白質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26566196A JP3711658B2 (ja) | 1996-10-07 | 1996-10-07 | コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の新規な細胞表層蛋白質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10108675A true JPH10108675A (ja) | 1998-04-28 |
| JP3711658B2 JP3711658B2 (ja) | 2005-11-02 |
Family
ID=17420244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26566196A Expired - Lifetime JP3711658B2 (ja) | 1996-10-07 | 1996-10-07 | コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来の新規な細胞表層蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3711658B2 (ja) |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2006065095A1 (en) * | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Cj Corporation | Novel promoter nucleic acid derived from corynebacterium genus bacteria, expression cassette comprising the promoter and vector comprising the cassette, host cell comprising the vector and method for expressing a gene using the cell |
| US7252972B2 (en) | 2001-03-30 | 2007-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Methods for secretory production of proteins |
| JP2008212155A (ja) * | 2003-12-18 | 2008-09-18 | Basf Se | Ｐｅｆ−ｔｕ発現ユニット |
| JP2008212156A (ja) * | 2004-07-20 | 2008-09-18 | Basf Se | Ｐｅｆ−ｔｓ発現ユニット |
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