JP2008212155A

JP2008212155A - Ｐｅｆ−ｔｕ発現ユニット

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Publication number: JP2008212155A
Application number: JP2008095756A
Authority: JP
Inventors: Burkhard Kroeger; クレーガー，ブルクハルト; Oskar Zelder; ゼルダー，オスカー; Corinna Klopprogge; クロップロッゲ，コリンナ; Hartwig Schroeder; シュレーダー，ハルトヴィッヒ; Stefan Haefner; ハエフナー，シュテファン
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2008-04-02
Publication date: 2008-09-18
Anticipated expiration: 2024-12-15
Also published as: ES2439946T3; CA2548349A1; EP1697525A2; US7785779B2; EP1908842A3; DE10359594A1; MXPA06006131A; KR101162226B1; IN2006CH02598A; WO2005059093A3; US20080166775A1; CN101255419A; EP1908842A2; US8044191B2; IN2008CH00415A; AR047150A1; CN1894412A; PL1908842T3; KR20070000431A; RU2006125501A

Abstract

【課題】遺伝子転写および発現を調節する核酸配列、新規なプロモーターおよび発現ユニット、遺伝子転写速度および／または発現速度を変化もしくは生起させる方法、前記発現ユニットを含んでなる発現カセット、変化もしくは生起させた転写速度および／または発現速度を有する遺伝的に改変された微生物、ならびに前記遺伝的に改変された微生物を培養することにより生合成産物を生成する方法を提供する。
【解決手段】特定の配列からなりプロモーター活性を有する核酸、前記核酸を含む発現ユニット、前記発現ユニットを含む発現ベクター、前記プロモーター活性を有する核酸で遺伝子改変された微生物及び前記微生物を培養することにより生合成産物、特にリジンを調製する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子の転写および発現を調節するための核酸配列の使用、新規なプロモーターおよび発現ユニット自体、遺伝子の転写速度および／または発現速度を変化させるかまたは生起する方法、前記発現ユニットを含んでなる発現カセット、変化したかまたは生起された転写速度および／または発現速度を伴う遺伝的に改変された微生物、ならびに前記遺伝的に改変された微生物を培養することにより生合成産物を調製する方法に関する。

多様な生合成産物、例えば精製化学製品（fine chemical）、中でも、アミノ酸、ビタミン類、またさらにはタンパク質などが細胞中で天然の代謝過程によって産生され、化粧品、飼料、食品および製薬産業をはじめとする多くの産業分野で使用されている。これらの物質は精製化学製品／タンパク質と総称されるが、中でも有機酸、タンパク質生成（proteinogenic）およびタンパク質非生成（non-proteinogenic）アミノ酸の両者、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン類および補因子、ならびにタンパク質および酵素を含む。これらの生産は最も便宜的には、特定の所望の物質を大量に産生および分泌するように開発された細菌を培養することによって、工業規模で実施される。この目的に特に好適な生物はコリネ型細菌、グラム陽性非病原性細菌である。

アミノ酸はコリネ型細菌、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の株の発酵によって調製されることが知られている。多大な重要性のため、その生産方法の改良について継続した研究がなされている。方法の改良は例えば以下のような発酵技術面についてである：発酵中の撹拌および酸素供給、または栄養培地の組成（例えば糖濃度）、あるいはイオン交換クロマトグラフィーまたはスプレー乾燥によるなどの、産物を取得するための作業、あるいは微生物自体の固有の性能。

組換えＤＮＡ技術の方法もここ数年、精製化学製品／タンパク質を産生するコリネバクテリウム株についての菌株の改良に利用されてきており、これは、個々の遺伝子を増幅し、精製化学製品／タンパク質の産生への影響を調べることによる。

精製化学製品、アミノ酸もしくはタンパク質の生産方法の開発、または精製化学製品、アミノ酸もしくはタンパク質の既存の生産方法の生産性の増大もしくは改善のための他の手段は、１以上の遺伝子の発現を増大もしくは変化させ、かつ／または好適なポリヌクレオチド配列によってｍＲＮＡの翻訳に影響を与えることである。これに関しては、影響を与えることとしては、増大させること、低下させること、あるいは時系列発現パターンなどの遺伝子の発現の他のパラメーターが挙げられる。

細菌の調節配列の種々の構成要素は当業者に公知である。調節因子のための結合サイト(オペレーターとも称される)、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素のための結合サイト(−３５および−１０領域とも称される)、ならびにリボソーム１６ＳＲＮＡのための結合サイト（リボソーム結合サイトもしくはシャイン・ダルガノ配列とも称される）が区別されている。

シャイン・ダルガノ配列とも称されるリボソーム結合サイトの配列とは、本発明の目的にとっては、翻訳開始コドンの上流の２０塩基までに位置するポリヌクレオチド配列を意味する。

文献（E. coli and S. typhimurium、Neidhardt F.C. 1995 ASM Press）に、シャイン・ダルガノ配列のポリヌクレオチド配列の構成、塩基の配列文字列ばかりでなく、シャイン・ダルガノ配列中に存在するポリヌクレオチド配列の距離が翻訳開始率にかなり影響することが報告されている。

プロモーター活性を有する核酸配列は多様な様相でｍＲＮＡの形成に影響し得る。その活性が生物の生理学的増殖期と無関係なプロモーターは構成性と称される。それに対して、他のプロモーターは、外部からの化学的および物理的刺激、例えば酸素、代謝物、熱、ｐＨ等に反応する。その他のものはその活性が増殖期の違いに強く依存する。例えば、微生物の対数増殖期中に特に顕著な活性を示すプロモーター、あるいは微生物の増殖の静止期には倹約的なプロモーターが文献に記載されている。プロモーターの両方の特性が代謝経路に応じて精製化学製品およびタンパク質の産生についての生産性に有益な影響を有すると見られる。

例えば、増殖中に遺伝子の発現のスイッチを切るが、最適増殖後にはスイッチを入れるプロモーターを使用して、代謝物の産生を制御する遺伝子を調節することができる。それにより、改変された菌株は出発菌株と同様の増殖パラメーターを示すが、細胞あたりではより多くの産物を産生する。このタイプの改変では力価(産物ｇ／リットル)およびＣ収率(産物ｇ／Ｃ源ｇ)の両方を増大させることができる。

コリネバクテリウムの菌種について、遺伝子発現を増大または減少させるのに使用することができるヌクレオチド配列を単離することが、すでに可能になっている。これらの調節されたプロモーターは、細胞の内的および／または外的条件に応じて、ある遺伝子を転写する速度を増大または低下させることができる。いくつかの場合、インデューサーとして知られる特定の因子の存在が、プロモーターの転写速度を刺激することができる。インデューサーはプロモーターからの転写に直接または間接的に影響することがある。サプレッサーとして知られる別のクラスの因子は、プロモーターからの転写を低下させるか抑制することができる。インデューサーと同様に、サプレッサーも直接または間接的に作用することができる。しかし、温度で調節されるプロモーターも知られている。この場合、こうしたプロモーターの転写のレベルは、例えば成長温度をその細胞の通常の増殖温度よりも上昇させることによって、増大または低下させることができる。

Ｃ．グルタミカム由来の少数のプロモーターが現在までに知られている。Ｃ．グルタミカム由来のリンゴ酸シンターゼ遺伝子のプロモーターがＤＥ４４４０１１８に記載されている。このプロモーターを、あるタンパク質をコードする構造遺伝子の上流に挿入した。かかる構築物のコリネ型細菌への形質転換後、そのプロモーターの下流の構造遺伝子の発現が調節される。構造遺伝子の発現は適切なインデューサーを培地に添加するとすぐに誘導される。

Reinscheidら、Microbiology 145:503 (1999)には、Ｃ．グルタミカム由来のｐｔａ−ａｃｋプロモーターとレポーター遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）との転写融合体が記載されている。このような転写融合体を含んでなるＣ．グルタミカムの細胞は、酢酸塩含有培地上での増殖時にレポーター遺伝子の発現の増大を示した。これと比較すると、グルコース上で増殖させた形質転換された細胞はこのレポーター遺伝子の発現の増大を示さなかった。

Pa'tekら、Microbiology 142:1297 (1996)には、Ｃ．グルタミカムの細胞中のレポーター遺伝子の発現を増強することができる、Ｃ．グルタミカム由来のいくつかのＤＮＡ配列が記載されている。Ｃ．グルタミカムプロモーターのコンセンサス配列を明らかにするため、これらの配列同士を比較した。

遺伝子発現を調節するのに使用することができるＣ．グルタミカム由来の別のＤＮＡ配列が、ＷＯ０２／４０６７９に記載されている。これらの単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子発現を増大させるかまたは低下させるのに使用することができる、コリネバクテリウム・グルタミカム由来の発現ユニットである。この特許出願にはさらに、このコリネバクテリウム・グルタミカム由来の発現ユニットを異種起源の遺伝子と連結させた組換えプラスミドが記載されている。そこに記載された、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプロモーターを異種起源の遺伝子と融合させる方法は、とりわけアミノ酸生合成の遺伝子を調節するために利用することができる。
ＤＥ４４４０１１８ＷＯ０２／４０６７９ E. coli and S. typhimurium、Neidhardt F.C. 1995 ASM Press Reinscheidら、Microbiology 145:503 (1999) Pa'tekら、Microbiology 142:1297 (1996)

有益な特性を有するさらなるプロモーターおよび／または発現ユニットを提供することが、本発明の目的である。

我々はこの目的が、
Ａ）配列番号１の核酸配列、または
Ｂ）ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号１の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｃ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｄ）Ａ）、Ｂ）もしくはＣ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなる、プロモーター活性を有する核酸の、遺伝子の転写のための使用によって達成されることを見出した。

「転写」とは、本発明において、ＤＮＡ鋳型から出発して相補的ＲＮＡ分子を作り出す過程を意味する。ＲＮＡポリメラーゼ、いわゆるシグマ因子および転写調節タンパク質などのタンパク質がこの過程に関与する。次に合成されたＲＮＡを翻訳過程で鋳型として使用し、これがその後生合成において活性があるタンパク質をもたらす。

生合成において活性なタンパク質が産生される形成速度とは転写および翻訳の速度の結果である。本発明によれば、両方の速度に影響を与え、それによって微生物での産物の形成速度に影響を与えることができる。

「プロモーター」または「プロモーター活性を有する核酸」とは、本発明において、転写対象の核酸と機能的に連結し、この核酸の転写を調節する核酸を意味する。

これに関して、「機能的連結」とは、例えばプロモーター活性を有する本発明の核酸の１つと、転写対象の核酸配列、および適当ならば、さらなる調節エレメント（例えば核酸の転写を保証する核酸配列）、ならびに例えばターミネーターなどについての、それぞれの調節エレメントが核酸配列の転写において機能を発揮することができるような様式での連続的配置を意味する。そのためには化学的な意味での直接的連結は絶対に必要なものではない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列などは、もっと離れた位置から、または別のＤＮＡ分子からでさえも、標的配列に対してその機能を発揮することができる。転写対象の核酸配列が本発明のプロモーター配列の後ろ（すなわち３’末端）に位置し、２つの配列同士が共有結合していることが好ましい。これに関して、プロモーター配列とトランスジェニックでの発現対象の核酸配列の間の距離は、好ましくは２００塩基対より小さく、特に好ましくは１００塩基対未満、非常に好ましくは５０塩基対未満である。

「プロモーター活性」とは本発明において、一定時間内にそのプロモーターによって形成されるＲＮＡの量、すなわち転写速度を意味する。

本発明における「プロモーター比活性」とは、各プロモーターについての、一定時間内にそのプロモーターによって形成されるＲＮＡの量を意味する。

本発明における用語「野生型」とは、適切な出発微生物を意味する。

文脈に応じて、用語「微生物」は出発微生物(野生型)または本発明の遺伝的に改変された微生物、あるいはその両方を意味する。

好ましくは、また特には微生物もしくはその野生型を明白に指定できない場合には、「野生型」は、プロモーター活性もしくは転写速度を変化させるかまたは生起することについて、発現活性もしくは発現速度を変化させるかまたは生起することについて、および生合成産物量の増大についての各場合での参照生物を意味する。

好ましい実施形態では、この参照生物はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２である。

好ましい実施形態では、使用する出発微生物はすでにその所望の精製化学製品を産生することができるものである。これに関して、特に好ましい微生物はコリネバクテリウム属の細菌、そして特に好ましい精製化学製品はＬ−リジン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トレオニンであって、特に好ましいのは、すでにＬ−リジン、Ｌ−メチオニンおよび／またはＬ−トレオニンを産生することができるそれらの出発微生物である。これらのものとして、例えば、アスパルトキナーゼをコードする遺伝子(ａｓｋ遺伝子)が脱調節されているか、あるいはフィードバック阻害が失われたかまたは低下しているコリネバクテリア属細菌が特に好ましい。こうした細菌は、例えば、フィードバック阻害の低下もしくは消失をもたらす突然変異、例えば、ａｓｋ遺伝子の突然変異Ｔ３１１Ｉを有する。

野生型と比較してある遺伝子に関して「生起されたプロモーター活性」または生起された転写速度といった場合には、したがって、野生型と比較して、野生型ではそのようには存在しなかったＲＮＡの形成が引き起こされている。

ある遺伝子に関して野生型と比較して変化したプロモーター活性または転写速度といった場合には、したがって、野生型と比較して、一定時間内に産生されるＲＮＡの量が変化している。

これに関して「変化した」とは、好ましくは増大したことまたは低下したことを意味する。

これは例えば本発明の内在性プロモーターについて、そのプロモーターを突然変異させるか、あるいはそのプロモーターを刺激または阻害して、プロモーター比活性を増大または低下させることによって遂行することができる。

別の可能性は、例えばプロモーター活性を有する本発明の核酸によるか、または増大したプロモーター比活性を伴う核酸により、微生物での遺伝子の転写を調節することによって、プロモーター活性または転写速度の増大を達成することであり、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である。

プロモーター活性を有する本発明の核酸によるか、または増大したプロモーター比活性を伴う核酸による微生物での遺伝子の転写の調節は、好ましくは、
変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
該微生物のゲノムに１以上の遺伝子を導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

プロモーター活性を有する本発明の核酸としては、
Ａ）配列番号１の核酸配列、または
Ｂ）ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号１の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｃ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｄ）Ａ）、Ｂ）もしくはＣ）の配列と機能的に等価なフラグメント、
が含まれる。

配列番号１の核酸配列は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のタンパク質翻訳伸長因子ＴＵ（ＰＥＦ−ＴＵ）のプロモーター配列である。配列番号１は野生型のプロモーター配列に相当する。

本発明はさらに、この配列からヌクレオチドの置換、挿入または欠失によって誘導された配列を含んでなり、かつ配列番号１の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する、プロモーター活性を有する核酸に関する。

本発明のプロモーターについての本発明の別の天然の例は、例えばそのゲノム配列が知られている種々の生物から、データベースからの核酸配列と配列番号１の配列との同一性の比較によって、容易に見出すことができる。

本発明の人工的プロモーター配列は、配列番号１の配列から出発し、例えばヌクレオチドの置換、挿入または欠失による人工的変異および突然変異によって、容易に見出すことができる。

本説明中の用語「置換」は、１個または数個のヌクレオチドの１個または数個のヌクレオチドによる交換を意味する。「欠失」は、ヌクレオチドと直接結合との交換である。挿入は、直接結合と１個または数個のヌクレオチドとの形式上の交換による核酸配列中へのヌクレオチドの挿入である。

２つの核酸間の同一性とは、各場合の核酸の完全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味し、特にＣｌｕｓｔａｌ法（Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1）を使用し、以下のパラメーターを設定して、Ｉｎｆｏｒｍａｘ社（USA）製のＶｅｃｔｏｒＮＴＩＳｕｉｔｅ７．１ｓｏｆｔｗａｒｅでの比較によって算出した同一性である：
多重アライメントパラメーター：
ギャップ開放ペナルティ１０
ギャップ伸長ペナルティ１０
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティｏｆｆ
アラインメントディレイについての％同一性 4０
残基特異的ギャップｏｆｆ
親水性残基ギャップｏｆｆ
トランジション重み付け０
ペアワイズアラインメントパラメーター：
ＦＡＳＴアルゴリズムｏｎ
Ｋ−ｔｕｐｌｅサイズ１
ギャップペナルティ３
ウインドウサイズ５
ベストダイアゴナルの数５

したがって配列番号１の配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列とは、特に上記のパラメーターセットを用いた上記のプログラミングアルゴリズムに従い、配列番号１の配列とその配列を比較したとき、少なくとも９０％の同一性を示す核酸配列を意味する。

特に好ましいプロモーターは配列番号１の核酸配列と９１％、さらに好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、特に好ましくは９９％の同一性を示す。

プロモーターの別の天然の例はさらに、上記の核酸配列から出発して、特に配列番号１の配列から出発して、それ自体公知の手法でのハイブリダイゼーション技術によって、そのゲノム配列が未知の種々の生物からも容易に見出すことができる。

したがって、本発明の別の態様は、配列番号１の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでなる、プロモーター活性を有する核酸に関する。この核酸配列は少なくとも１０、さらに好ましくは１２、１５、３０、５０より多く、または特に好ましくは１５０より多くのヌクレオチドを含む。

ハイブリダイゼーションは本発明ではストリンジェントな条件下で行う。そのようなハイブリダイゼーション条件は例えば以下に記載されている：Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57ページまたは Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは特に以下を意味する：
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｇ／ｍｌ変性細断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃で一晩のインキュベーション；その後６５℃、０.１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄。

「機能的に等価なフラグメント」とは、出発配列と実質的に同一またはそれ以上のプロモーター比活性を有する、プロモーター活性を有する核酸配列のフラグメントを意味する。
「実質的に同一」とは、出発配列のプロモーター比活性の少なくとも５０％、好ましくは６０％、さらに好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％の同一性を示すプロモーター比活性を意味する。

「フラグメント」とは、実施形態Ａ)、Ｂ)またはＣ)に記載されたプロモーター活性を有する核酸の部分配列を意味する。これらのフラグメントは配列番号１の核酸配列の好ましくは１０より多く、しかしより好ましくは１２、１５、３０、５０より多く、または特に好ましくは１５０より多くの連続したヌクレオチドを有する。

プロモーターとしての、すなわち遺伝子の転写のための、配列番号１の核酸配列の使用が特に好ましい。

配列番号１は機能についての注釈を伴わないでＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＰ００５２８３に記載されている。したがって、本発明はさらに、プロモーター活性を有する本発明の新規な核酸配列に関する。

本発明は特に、
Ａ）配列番号１の核酸配列、または
Ｂ）ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号１の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｃ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｄ）Ａ）、Ｂ）もしくはＣ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなり、但し配列番号１の配列からなる核酸は除く、プロモーター活性を有する核酸に関する。

上述したプロモーター活性を有する核酸はすべて、ヌクレオチド部品から化学合成によって、例えば、二重らせんの個々の重複する相補的核酸部品の断片縮合によって、それ自体公知の手法で調製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は例えばホスホルアミダイト法による公知の手法で行うことができる（Voet, Voet, 第２版, Wiley Press New York, pp. 896-897）。合成オリゴヌクレオチドの添加ならびにＤＮＡポリメラーゼのKlenowフラグメントを使用するギャップの補完およびライゲーション反応、ならびに一般的クローニング方法は以下に記載されている： Sambrookら(1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press。

本発明はさらに、プロモーター活性を有する本発明の核酸のうち１つと、機能的に連結されたリボ核酸の翻訳を保証する核酸配列をさらに含んでなる発現ユニットの、遺伝子の発現のための使用に関する。

本発明において、発現ユニットとは、発現活性を有する核酸、すなわち発現対象の核酸または遺伝子と機能的に連結されて、該核酸または該遺伝子の発現、すなわち転写および翻訳を調節する核酸を意味する。

これに関して、「機能的連結」とは、例えば本発明の発現ユニットのうち１つと、トランスジェニック発現の対象の核酸配列、および適当ならば別の調節エレメント、例えばターミネーターについての、それぞれの調節エレメントが核酸配列のトランスジェニック発現において機能を発揮することができるような連続的配置を意味する。そのためには化学的な意味での直接的連結は絶対に必要なものではない。遺伝的制御配列、例えばエンハンサー配列などは、より離れた位置から、または別のＤＮＡ分子からでさえも、標的配列に対してその機能を発揮することができる。トランスジェニック発現の対象の核酸配列が本発明の発現ユニット配列の後ろ（すなわち３’末端）に位置し、２つの配列同士が共有結合している配置が好ましい。この場合、発現ユニット配列とトランスジェニック発現の対象の核酸配列との間の距離は好ましくは２００塩基対より少なく、特に好ましくは１００塩基対未満、非常に好ましくは５０塩基対未満である。

「発現活性」とは本発明において、一定時間内に発現ユニットから産生されるタンパク質の量、すなわち発現速度を意味する。

本発明において「発現比活性」とは、各発現ユニットについて一定時間内にその発現ユニットから産生されるタンパク質の量を意味する。

遺伝子に関して、野生型と比較して「生起された発現活性」または生起された発現速度といった場合には、したがって、野生型と比較して、野生型ではそのようには存在しなかったタンパク質の産生が引き起こされている。

ある遺伝子に関して、野生型と比較して「変化した発現活性」または変化した発現速度といった場合には、したがって、野生型と比較して、一定時間内に産生されるタンパク質の量が変化している。

これに関して「変化した」とは、好ましくは増大していることまたは減少していることを意味する。

これは内在性発現ユニットについて、例えばその発現ユニットを突然変異させるか、あるいはその発現ユニットを刺激または阻害して、その比活性を増大または低下させることによって遂行することができる。

発現活性または発現速度の増大はさらに、例えば本発明の発現ユニットによるか、または増大した発現比活性を伴う発現ユニットによって、微生物での遺伝子の発現を調節することによって達成することができ、ここで、該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である。

本発明の発現ユニットによる、または増大した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットによる、微生物での遺伝子の発現の調節は、好ましくは、
変化した発現比活性を適宜伴う本発明の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う導入された本発明の発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化した比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入した該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
変化した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を微生物に導入するステップ、
により達成される。

本発明の発現ユニットは、プロモーター活性を有する上記の本発明の核酸と、さらに機能的に連結された、リボ核酸の翻訳を保証する核酸配列を含んでなる。

リボ核酸の翻訳を保証する核酸配列は好ましくは、リボソーム結合サイトとして配列番号４２の核酸配列を含む。

好ましい実施形態では、本発明の発現ユニットは、
Ｅ) 配列番号２の核酸配列、または
Ｆ) ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号２の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｇ) ストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｈ) Ｅ)、Ｆ)もしくはＧ)の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなる。

配列番号２の核酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカム由来のタンパク質翻訳伸長因子ＴＵ（ＰＥＦ−ＴＵ）の発現ユニットの核酸配列である。配列番号２は野生型の発現ユニットの配列に相当する。

本発明はさらに、ヌクレオチドの置換、挿入または欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号２の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列を含んでなる発現ユニットに関する。

本発明の発現ユニットについての本発明の別の天然の例は、例えばそのゲノム配列が知られている種々の生物から、データベースからの核酸配列と配列番号２の配列との同一性の比較によって、容易に見出すことができる。

本発明の発現ユニットの人工的配列は、配列番号２の配列から出発し、例えばヌクレオチドの置換、挿入または欠失による人工的変異および突然変異誘発によって、容易に見出すことができる。

したがって配列番号２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列とは、特に上記のパラメーターセットを用いて、上記のプログラミングアルゴリズムに従い配列番号２の配列とその配列を比較したときに、少なくとも９０％の同一性を示す核酸配列を意味する。

特に好ましい発現ユニットは、配列番号２の核酸配列と９１％、さらに好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、特に好ましくは９９％の同一性を示す。

発現ユニットの別の天然の例はさらに、上記の核酸配列から出発して、特に配列番号２の配列から出発して、それ自体公知の手法でのハイブリダイゼーション技術によって、そのゲノム配列が未知の種々の生物からも容易に見出すことができる。

したがって本発明の別の態様は、ストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列を含んでなる発現ユニットに関する。この核酸配列は少なくとも１０、さらに好ましくは１２、１５、３０、５０より多く、または特に好ましくは１５０より多くのヌクレオチドを含む。

「ハイブリダイゼーション」とは、ストリンジェントな条件下で実質的に相補的な配列と結合するが、相補的でない相手との非特異的結合はこれらの条件下では発生しない、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの能力を意味する。このためには、その配列は好ましくは９０〜１００％の相補性を有するべきである。互いに特異的に結合することができる相補的配列の特性を、例えばノーザンもしくはサザンブロット技術またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲでのプライマーの結合に使用する。

ハイブリダイゼーションは本発明ではストリンジェントな条件下で行う。このようなハイブリダイゼーション条件は例えば以下に記載されている： Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57ページまたはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6。

ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは特に以下を意味する：
５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０ｇ／ｍｌ変性細断サケ精子ＤＮＡよりなる溶液中、４２℃で一晩のインキュベーション；その後、６５℃、０.１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄。

本発明のヌクレオチド配列はさらに、他の細胞タイプおよび微生物において相同配列を同定および／またはクローン化するために用いることができるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このようなプローブおよびプライマーは通常、本発明の核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約２５、例えば約４０、５０もしくは７５の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含んでいる。

また、いわゆるサイレント突然変異を含むか、または具体的に言及した配列と比較して、特定の起源生物もしくは宿主生物中のコドン使用頻度に従い改変された核酸配列、同様に天然に存在する変異体、例えば、そのスプライスバリアントまたはアリール変異体も本発明に含まれる。

「機能的に等価なフラグメント」とは、出発配列と実質的に同一またはそれ以上の発現比活性を有する発現ユニットフラグメントを意味する。
「実質的に同一」とは、出発配列の発現比活性の少なくとも５０％、好ましくは６０％、さらに好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％を示す発現比活性を意味する。

「フラグメント」とは、実施形態Ｅ)、Ｆ)またはＧ)に記載された発現ユニットの部分配列を意味する。これらのフラグメントは配列番号１の核酸配列の好ましくは１０より多く、しかしより好ましくは１２、１５、３０、５０より多く、または特に好ましくは１５０より多くの連続したヌクレオチドを有する。

発現ユニットとして、すなわち遺伝子の発現のために配列番号２の核酸配列を使用するのが特に好ましい。

配列番号２は機能についての注釈を伴わないでＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＰ００５２８３に記載されている。したがって、本発明はさらに、本発明の新規な発現ユニットに関する。

本発明は特に、プロモーター活性を有する本発明の核酸と、さらに機能的に連結された、リボ核酸の翻訳を保証する核酸配列とを含んでなる発現ユニットに関する。

本発明は特に好ましくは、
Ｅ) 配列番号２の核酸配列、または
Ｆ) ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号２の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｇ) ストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｈ) Ｅ)、Ｆ)もしくはＧ)の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなり、但し配列番号２の配列からなる核酸は除く、発現ユニットに関する。

本発明の発現ユニットは以下の遺伝的エレメントのうち１種以上を含む：マイナス１０(「−１０」)配列；マイナス３５(「−３５」)配列；転写配列開始点、エンハンサー領域；およびオペレーター領域。

これらの遺伝的エレメントは好ましくはコリネバクテリウムの種、特にコリネバクテリウム・グルタミカムに特異的なものである。

上述の発現ユニットはすべて、ヌクレオチド部品からの化学合成によって、例えば、二重らせんの個別の重複する相補的核酸部品の断片縮合によって、それ自体公知の手法で調製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は例えばホスホルアミダイト法による公知の手法で実行することができる（Voet, Voet, 第２版, Wiley Press New York, pp. 896-897）。合成オリゴヌクレオチドの添加ならびにＤＮＡポリメラーゼのKlenowフラグメントを用いたギャップの補完およびライゲーション反応、ならびに一般的クローニング方法は以下に記載されている：Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press。

本出願中で本発明のために使用する方法および技術は微生物および組換えＤＮＡ技術について訓練を受けた当業者には公知である。細菌細胞の増殖、単離したＤＮＡ分子の宿主細胞中への導入および単離した核酸分子の単離、クローン化および配列決定などがそのような技術および方法の例である。これらの方法は以下の多くの標準的な文献に記載されている：Davisら、Basic Methods In Molecular Biology (1986)；J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972)；J.H. Miller, A Short Course in Bacteria Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992)；M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991)；J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)；P.B. Kaufmannら, Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995)；Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson（編）, CRC Press, Boca Raton, Florida (1993)；およびP.F. Smith-Keary, Molecular Genetic
s of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989)。

本発明の核酸分子はすべて、単離した核酸分子の形態であるのが好ましい。「単離した」核酸分子はその核酸の天然の供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されたもので、さらに、組換え技術で調製した場合にはその他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まず、あるいは化学合成した場合には、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものである。

本発明にはその上、具体的に記載したヌクレオチド配列に相補的な核酸分子、またはその一部分が含まれる。

本発明のプロモーターおよび／または発現ユニットは例えば、以下に記載するように、発酵による生合成産物の調製のための改良された方法に使用するのが特に有益である。

本発明のプロモーターおよび／または発現ユニットは、これらが強力な構成性プロモーターおよび発現ユニットである点において、特に有益である。

プロモーター活性を有する本発明の核酸を使用して、野生型と比較して、微生物での遺伝子の転写速度を変化させる、すなわち増大もしくは低下させるか、またはそれを生起することができる。

本発明の発現ユニットを使用して、野生型と比較して、微生物での遺伝子の発現速度を変化させる、すなわち増大もしくは低下させるか、またはそれを生起することができる。

プロモーター活性を有する本発明の核酸および本発明の発現ユニットは、各種の生合成産物、例えば精製化学製品、タンパク質、特にアミノ酸などについて、微生物、特にコリネバクテリウム属の種での産生を調節および強化するためにも役立てることができる。

したがって本発明は、微生物での遺伝子の転写速度を、野生型と比較して変化させるかまたは生起する方法であって、
ａ）プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸であって、内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性を野生型と比較して変化させるステップ、または
ｂ）プロモーター活性を有する本発明の核酸により、または実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を有する核酸により、該微生物での遺伝子の転写を調節するステップ、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である、
による方法に関する。

実施形態ａ）では、微生物でのプロモーター比活性を変化させる、すなわち増大もしくは低下させることにより、微生物での遺伝子の転写速度を野生型と比較して変化させるかまたは生起することができる。これは例えばプロモーター活性を有する本発明の核酸配列の部位特異的突然変異、すなわちヌクレオチドの部位特異的置換、欠失または挿入によって行うことができる。プロモーター活性の増大または低下は、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素結合サイト(当業者には−１０領域および−３５領域としても知られている)のヌクレオチドを交換することによって達成することができる。さらに、ヌクレオチドを欠失させるかヌクレオチドを挿入することによって、上記ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素結合サイトの互いの距離を減少または増加させることによっても達成することができる。さらに、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の結合サイトの配置上の近傍に調節タンパク質（当業者にはリプレッサーもしくはアクチベーターとして知られている）のための結合サイト（当業者にはオペレーターとしても知られている）を設けることによって、プロモーター配列と結合した後、これらの調節因子がＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の結合および転写活性を低下させるか強化することができるようにするか、あるいはこれを新たな調節的作用の下に置くようにする。

配列番号４２の核酸配列は好ましくは本発明の発現ユニットのリボソーム結合サイトであり、配列番号３９、４０または４１の配列は本発明の発現ユニットの−１０領域である。これらの領域の核酸配列の変更は、発現比活性の変化をもたらす。

したがって、本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌中で遺伝子の発現を可能にする発現ユニット中でのリボソーム結合サイトとしての、配列番号４２の核酸配列の使用に関する。

本発明はさらに、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌中で遺伝子の発現を可能にする発現ユニット中の−１０領域としての配列番号３９、４０または４１の核酸配列の使用に関する。

本発明は特に、配列番号４２の核酸配列を含んでなる、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌中で遺伝子の発現を可能にする発現ユニットに関する。この場合、配列番号４２の核酸配列を好ましくはリボソーム結合サイトとして使用する。

本発明はさらに、配列番号３９、４０または４１の核酸配列を含んでなる、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌中で遺伝子の発現を可能にする発現ユニットに関する。この場合、配列番号３９、４０または４１の核酸配列を好ましくは−１０領域として使用する。

「プロモーター比活性」に関して、野生型と比較した増大または低下とは、野生型のプロモーター活性を有する本発明の核酸と比較した、すなわち例えば配列番号１と比較した、比活性の増大または低下を意味する。

実施形態ｂ）では、プロモーター活性を有する本発明の核酸によるか、または実施形態ａ)に従い変化したプロモーター比活性を伴う核酸により、微生物での遺伝子の転写を調節することによって、該微生物での該遺伝子の転写速度を野生型と比較して変化させるかまたは生起することができ、この場合、該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である。

これは好ましくは、
ｂ１）変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ２）該微生物のゲノムに１以上の遺伝子を導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ３）変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ
により達成される。

例えば、
実施形態ｂ１）に従い、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
実施形態ｂ２）に従い、該微生物のゲノムに１以上の内在性遺伝子を導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
実施形態ｂ３）に従い、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の内在性核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ、
により、野生型の内在性遺伝子の転写速度を変化させる、すなわち増大または低下させることが可能である。

例えば、さらに、
実施形態ｂ２）に従い、該微生物のゲノムに１以上の内在性遺伝子を導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸の制御下に、１以上の導入された外来性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
実施形態ｂ３）に従い、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の外来性核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ、
により、野生型と比較して外来性の遺伝子の転写速度を生起することが可能である。

実施形態ｂ２）に従う遺伝子の挿入はさらに、遺伝子をコード領域または非コード領域に組み込むことによって、行うことができる。挿入は好ましくは非コード領域に行う。

実施形態ｂ３）に従う核酸構築物の挿入はさらに、染色体内または染色体外に行われる。好ましいのは核酸構築物の染色体内挿入である。「染色体内」組み込みは、宿主細胞の染色体内への外来性ＤＮＡフラグメントの挿入である。この用語は外来性ＤＮＡフラグメントと宿主細胞の染色体上の適切な領域との相同組換えについても使用される。

実施形態ｂ）では、実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を伴う本発明の核酸の使用も好ましい。実施形態ｂ）では、実施形態ａ）で記載したのと同様に、これらが該微生物中に存在するかそこで調製されるか、あるいはこれらを単離した形態で該微生物に導入してもよい。

「内在性」とは、野生型ゲノムにすでに存在する遺伝情報、例えば遺伝子などを意味する。

「外来性」とは、野生型ゲノムに存在しない遺伝情報、例えば遺伝子などを意味する。

プロモーター活性を有する本発明の核酸による転写の調節に関して、用語「遺伝子」は好ましくは、転写対象の領域、すなわち例えば翻訳を調節する領域、およびコード領域、ならびに適切ならばさらなる調節エレメント、例えばターミネーターなどを含んでなる核酸を意味する。

本明細書で以後記載する、本発明の発現ユニットによる発現の調節に関して、用語「遺伝子」は好ましくは、コード領域、および適切ならば、さらなる調節エレメント、例えばターミネーターなどを含んでなる核酸を意味する。
「コード領域」とは、タンパク質をコードする核酸配列を意味する。

プロモーター活性を有する核酸と遺伝子に関して、「異種起源」とは、使用する遺伝子は野生型ではプロモーター活性を有する本発明の核酸の調節下に転写されないが、野生型には存在しない新たな機能的連結が形成されること、および、プロモーター活性を有する本発明の核酸と特定の遺伝子との機能的組み合わせが野生型には存在しないことを意味する。

発現ユニットと遺伝子に関して、「異種起源」とは、使用する遺伝子は野生型ではプロモーター活性を有する本発明の発現ユニットの調節下に発現されず、野生型には存在しない新たな機能的連結が形成されていること、および、本発明の発現ユニットと特定の遺伝子との機能的組み合わせが野生型には存在しないことを意味する。

本発明はさらに、好ましい実施形態では、微生物での遺伝子の転写速度を、野生型と比較して増大させるかまたは生起するための方法であって、
ａｈ）プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸であって、内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性を、野生型と比較して増大させるステップ、または
ｂｈ）プロモーター活性を有する本発明の核酸により、または実施形態ａ）に従い増大したプロモーター比活性を有する核酸により、該微生物での遺伝子の転写を調節するステップ、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である、
による方法に関する。

プロモーター活性を有する本発明の核酸によるか、または実施形態ａｈ）に従い増大させたプロモーター比活性を伴う本発明の核酸による、該微生物での遺伝子の転写の調節は好ましくは、
ｂｈ１）増大したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する導入された本発明の核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ３）増大したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する本発明の核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

本発明はさらに、好ましい実施形態では、微生物での遺伝子の転写速度を野生型と比較して低下させるための方法であって、
ａｒ）プロモーター活性を有する本発明の内在性核酸であって、内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性を、野生型と比較して低下させるステップ、または
ｂｒ）実施形態ａ）に従い低下したプロモーター比活性を有する核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、低下したプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、
による方法に関する。

本発明はさらに、微生物中の遺伝子の発現速度を野生型と比較して変化させるかまたは生起するための方法であって、
ｃ）本発明の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性を野生型と比較して変化させるステップ、または
ｄ）本発明の発現ユニットにより、または実施形態ｃ）に従い変化した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現を調節するステップ、ここで該遺伝子は、該発現ユニットとの関係では異種起源である、
による、上記方法に関する。

実施形態ｃ）では、野生型と比較した微生物中の遺伝子の発現速度の変化または生起は、該微生物での発現比活性を変化させる、すなわち増大または低下させることによって行うことができる。これは例えばプロモーター活性を有する本発明の核酸配列の部位特異的突然変異、すなわちヌクレオチドの部位特異的置換、欠失または挿入によって行うことができる。例えば、シャイン・ダルガノ配列と翻訳開始コドンとの間の距離の延長は通常発現比活性の変化、低下または強化をもたらす。発現比活性の変化は、シャイン・ダルガノ領域（リボソーム結合サイト）の配列の翻訳開始コドンからの距離を、ヌクレオチドの欠失もしくは挿入によって短縮または延長することによっても達成することができる。しかし、シャイン・ダルガノ領域の配列を、相補的な３'側の１６ＳｒＲＮＡとの相同性を強化または低下させるように変化させることによっても、達成することができる。

「発現比活性」に関して、野生型と比較した増大または低下とは、野生型の本発明の発現ユニットと比較した、すなわち例えば配列番号２と比較した、比活性の増大または低下を意味する。

実施形態ｄ）では、微生物中の遺伝子の発現速度の変化または生起を、本発明の発現ユニットによるか、または実施形態ｃ）に従い変化した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の転写を調節することによって行い、ここで該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である。

これは好ましくは、
ｄ１）変化した発現比活性を適宜伴う本発明の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ３）変化した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、微生物に導入するステップ
によって達成される。

例えば、
実施形態ｄ１）に従い、変化した発現比活性を適宜伴う本発明の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようにするステップ、または
実施形態ｄ２）に従い、１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようにするステップ、または
実施形態ｄ３）に従い、変化した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
によって、野生型の内在性遺伝子の発現速度を変化、すなわち増大または低下させることが可能である。

例えばさらに、
実施形態ｄ２）に従い、１以上の外来性遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入した該遺伝子の発現が行われるようにするステップ、または
実施形態ｄ３）に従い、変化した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の外来性核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
によって、野生型と比較して内在性遺伝子の発現速度を生起することが可能である。

実施形態ｄ２）に従う遺伝子の挿入はさらに、遺伝子をコード領域または非コード領域に組み込むことによって行うことができる。挿入は好ましくは非コード領域に行う。

実施形態ｄ３）に従う核酸構築物の挿入はさらに、染色体内または染色体外に行われる。好ましいのは核酸構築物の染色体内挿入である。

核酸構築物は以下、発現カセットとも称される。

実施形態ｄ）では、実施形態ｃ）により変化した発現比活性を有する本発明の発現ユニットの使用も好ましい。実施形態ｄ）では、実施形態ｃ）で記載したのと同様に、これらが微生物に存在するかそこで調製されるか、あるいはこれらを単離した形態で微生物に導入してもよい。

本発明はさらに、好ましい実施形態では、微生物での遺伝子の発現速度を野生型と比較して増大させるかまたは生起するための方法であって、
ｃｈ）本発明の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの該微生物での発現比活性を、野生型と比較して増大させるステップ、または
ｄｈ）本発明の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現を調節するステップ、ここで該遺伝子は、該発現ユニットとの関係では異種起源である、
による方法に関する。

本発明の発現ユニットによるか、または実施形態ｃ)に従い増大した発現比活性を伴う発現ユニットによる、該微生物での遺伝子の発現の調節は、好ましくは、
ｄｈ１) 増大した発現比活性を適宜伴う１以上の本発明の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようにするステップ、または
ｄｈ２) １以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、導入された１以上の該遺伝子の発現が行われるようにするステップ、または
ｄｈ３) 増大した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
により達成される。

本発明はさらに、微生物での遺伝子の発現速度を野生型と比較して低下させるための方法であって、
ｃｒ）本発明の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの該微生物での発現比活性を、野生型と比較して低下させるステップ、または
ｄｒ）実施形態ｃｒ）に従い低下した発現比活性を有する発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、低下した発現活性を伴う導入した該発現ユニットの制御下に、内在性遺伝子の発現が行われるようにするステップ、
による方法に関する。

微生物での遺伝子の転写速度および／または発現速度を変化させるかまたは生起するための、上記の本発明の方法の好ましい実施形態では、遺伝子は精製化学製品の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸の群から選択され、その場合この遺伝子は場合によってはさらなる調節エレメントを含んでいてもよい。

微生物での遺伝子の転写速度および／または発現速度を変化させるかまたは生起するための、上記の本発明の方法の特に好ましい実施形態では、遺伝子は以下のものからなる群より選択される：タンパク質生成およびタンパク質非生成アミノ酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ビタミン類の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ならびに酵素の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸。この場合、該遺伝子は場合によってはさらなる調節エレメントを含んでいてもよい。

特に好ましい実施形態では、アミノ酸の生合成経路中のタンパク質は以下のものからなる群より選択される：アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子ＬｕｘＲ、転写調節因子ＬｙｓＲ１、転写調節因子ＬｙｓＲ２、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンエクスポーター・キャリア、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リジンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼＩ、システインシンターゼＩＩ、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性、硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット１および２、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＲＸＡ００６５５調節因子、ＲＸＮ２９１０調節因子、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７、タンパク質ＯｐｃＡ、１−ホスホフルクトキナーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ。

アミノ酸の生合成経路中の上記のタンパク質について、好ましいタンパク質およびこれらのタンパク質をコードする核酸はそれぞれ微生物由来のタンパク質配列および核酸配列であり、好ましくはコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌、好ましくはコリネ型細菌、特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム由来のものである。

アミノ酸の生合成経路中の特に好ましいタンパク質配列およびこれらのタンパク質をコードする対応する核酸配列の例、それらを引用する文献、ならびに参照文献中のそれらの表示を表１に挙げる：

アミノ酸の生合成経路中の特に好ましいタンパク質配列およびこのタンパク質をコードする対応する核酸配列の別の例は、ｆｂｒ２とも称されるフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ２の配列（配列番号３８）およびフルクトース−１，６−ビスホスファターゼ２をコードする対応する核酸配列（配列番号３７）である。

アミノ酸の生合成経路中の特に好ましいタンパク質配列およびこのタンパク質をコードする対応する核酸配列の別の例は、ＲＸＡ０７７とも称される硫酸還元についてのタンパク質の配列（配列番号４）および硫酸還元についてのタンパク質をコードする対応する核酸配列（配列番号３）である。

アミノ酸の生合成経路中の別の特に好ましいタンパク質配列は、それぞれの場合、このタンパク質について表１に示したアミノ酸配列を有するが、ここで対応するタンパク質はそのアミノ酸配列について表２／第２欄に示す少なくとも１ヵ所のアミノ酸位置に、同行中の表２／第３欄に示す対応するアミノ酸とは異なるタンパク質生成アミノ酸を有する。別の好ましい実施形態では、そのタンパク質は、そのアミノ酸配列について表２／第２欄に示す少なくとも１ヵ所のアミノ酸位置に、同行中の表２／第４欄に示すアミノ酸を有する。表２に示すタンパク質はアミノ酸の生合成経路の突然変異したタンパク質であって、これは特に有益な特性を有し、したがって本発明のプロモーターによって対応する核酸を発現させるため、およびアミノ酸を産生するために特に好適である。例えば、突然変異Ｔ３１１Ｉはａｓｋのフィードバック阻害を抑制する。

表２からの上記の突然変異したタンパク質をコードする対応する核酸は、通常の方法によって調製することができる。

突然変異したタンパク質をコードする核酸配列を調製するために好適な出発点は、例えば、American Type Culture Collectionから表示ＡＴＣＣ１３０３２として入手可能な、コリネバクテリウム・グルタミカム株のゲノム、または表１で引用されている核酸配列である。突然変異したタンパク質のアミノ酸配列の、これらのタンパク質をコードする核酸配列への逆翻訳のためには、該核酸配列を導入するか、該核酸配列が存在する生物のコドン使用頻度を用いるのが有利である。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムについては、コリネバクテリウム・グルタミカムのコドン使用頻度を用いるのが有利である。特定の生物のコドン使用頻度はそれ自体公知の手法でデータベースから、または所望の生物由来の少なくとも１種のタンパク質およびこのタンパク質をコードする遺伝子が記載されている特許出願から明らかにすることができる。

表２の情報は以下のように理解されるべきものである：
第１欄「識別記号」では、表１との関係で各配列について明らかな表示を示す。
第２欄「ＡＡ位置」では、各番号は表１からの対応するポリペプチド配列のアミノ酸位置に相当する。「ＡＡ位置」欄中、「２６」はしたがって、対応して示されているポリペプチド配列のアミノ酸位置２６を意味する。この位置の番号付けはＮ末端で＋１から開始する。
第３欄「ＡＡ野生型」では、各文字は表１からの配列の対応する野生型株中の第２欄に示す位置のアミノ酸（１文字コードで表記）を示す。
第４欄「ＡＡ突然変異体」では、各文字は対応する変異体株中の第２欄に示す位置のアミノ酸（１文字コードで表記）を示す。
第５欄「機能」では、対応するポリペプチド配列の生理学的機能を示す。

特定の機能（第５欄）および特定の当初アミノ酸配列（表１）を有する突然変異したタンパク質について、第２、３および４欄には少なくとも１ヵ所の突然変異を、またいくつかの配列については複数の突然変異を記載する。この複数の突然変異では常に上記の各場合（表１）において最も近い当初アミノ酸配列を引用している。特定のアミノ酸配列について、用語「アミノ酸位置の少なくとも１ヵ所」とは、好ましくはこのアミノ酸配列について第２、３および４欄に記載した突然変異の少なくとも１つを意味する。

タンパク質生成アミノ酸の１文字コード：
Ａアラニン
Ｃシステイン
Ｄアスパラギン酸
Ｅグルタミン酸
Ｆフェニルアラニン
Ｇグリシン
Ｈヒスチジン
Ｉイソロイシン
Ｋリジン
Ｌロイシン
Ｍメチオニン
Ｎアスパラギン
Ｐプロリン
Ｑグルタミン
Ｒアルギニン
Ｓセリン
Ｔトレオニン
Ｖバリン
Ｗトリプトファン
Ｙチロシン

微生物での遺伝子の転写速度および／または発現速度を変化させるかまたは生起するための上記の本発明の方法、ならびに遺伝的に改変された微生物を作製するための以下に記載する方法、以下に記載する遺伝的に改変された微生物、および生合成産物を製造するための以下に記載する方法の中では、プロモーター活性を有する本発明の核酸、本発明の発現ユニット、上記の遺伝子、および上記の核酸構築物または発現カセットの、その微生物、特にコリネ型細菌中への導入は、好ましくはＳａｃＢ法により行う。

ＳａｃＢ法は当業者に公知であり、例えば以下に記載されている：Schafer A., Tauch A., Jager W., Kalinowski J., Thierbach G., Puhler A.; Small Mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22;145(1):69-73 およびBlomfield IC., Vaughn V., Rest RF., Eisenstein BI.; Alleric exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtulis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun;5(6):1447-57。

上記の本発明の方法の好ましい実施形態では、微生物での遺伝子の転写速度および／または発現速度の変化もしくは生起は、プロモーター活性を有する本発明の核酸または本発明の発現ユニットを該微生物に導入することによって行われる。

上記の本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、微生物での遺伝子の転写速度および／または発現速度の変化もしくは生起は、上記の核酸構築物または発現カセットを該微生物に導入することによって行われる。

したがって、本発明は、
少なくとも１つの本発明の発現ユニット、
少なくとも１つの発現対象のさらなる核酸配列、すなわち発現対象の遺伝子、および、
適宜、さらなる遺伝子制御エレメント、例えば、ターミネーターなど、
を含んでなる発現カセットに関し、ここで、少なくとも１つの発現ユニットと発現対象のさらなる核酸配列とは互いに機能的に連結され、また発現対象のさらなる核酸配列は、該発現ユニットとの関係では異種起源である。

発現対象の核酸配列は好ましくは精製化学製品の生合成経路中のタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸である。

発現対象の核酸配列は特に好ましくは以下のものからなる群より選択される：タンパク質生成およびタンパク質非生成アミノ酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ビタミン類の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ならびに酵素の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸。

アミノ酸の生合成経路中の好ましいタンパク質を上に記載したが、その例は表１および２に記載されている。

本発明の発現カセット中での、発現対象の遺伝子に対する発現ユニットの物理的位置関係は、発現ユニットが発現対象の遺伝子の転写および好ましくは翻訳をも調節して、１種以上のタンパク質の産生を可能にするように選定される。これに関して、「産生を可能にすること」には、産生の構成的増大、特定の条件下での産生の減少もしくは阻止および／または特定の条件下での産生の増大が含まれる。これに関して、「条件」には以下が含まれる：
（１）ある成分の培養培地への添加、（２）ある成分の培養培地からの除去、（３）培養培地中のある成分と別の成分との交換、（４）培養培地の温度の上昇、（５）培養培地の温度の低下、および（６）培養培地を維持する雰囲気条件、例えば、酸素もしくは窒素濃度の調節。

本発明はさらに、上記の本発明の発現カセットを含んでなる発現ベクターに関する。

ベクターは当業者に周知であり、”Cloning Vectors”（Pouwels P.H.ら編, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985）に見出すことができる。プラスミドの他には、ベクターとは当業者に公知の他のすべてのベクターを意味し、例えば、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および直線状もしくは環状ＤＮＡなどである。これらのベクターは宿主生物中で自律的に複製されるか、または染色体複製される。

好適で特に好ましいプラスミドは、コリネ型細菌中で複製するものである。多数の公知のプラスミドベクター、例えばｐＺ１（Menkelら、Applied and Environmental Microbiology(1989) 64: 549-554）、ｐＥＫＥｘ１（Eikmannsら, Gene 102: 93-98 (1991)）またはｐＨＳ２−１（Sonnenら, Gene 107: 69-74 (1991)）は潜在性プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づいている。その他のプラスミドベクター、例えば、ｐＣＬｉＫ５ＭＣＳ、またはｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ４，４８９，１６０）もしくはｐＮＧ２（Serwold-Davisら, FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)）もしくはｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ５，１５８，８９１）に基づくものも、同様の方法で使用することができる。

例えば、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンの複製および増幅について、Reinscheidら（Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)）に記載されているような、染色体への組み込みによる遺伝子増幅法に使用することができるプラスミドベクターも好適である。この方法では、完全遺伝子を、宿主（典型的には大腸菌）中では複製することができるが、Ｃ．グルタミカムでは複製されないプラスミドベクター中にクローン化する。好適なベクターの例は以下のものである：ｐＳＵＰ３０１（Sirnonら, Bio/Technology 1,784-791 (1983)）、ｐＫ１８ｍｏｂもしくはｐＫ１９ｍｏｂ（Schaferら, Gene 145,69-73 (1994)、Bernardら, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)）、ｐＥＭ１（Schrumpfら, 1991. Journal of Bacteriology 173: 4510-4516）またはｐＢＧＳ８（Sprattら, 1986, Gene 41: 337-342）。増幅対象の遺伝子を含むプラスミドベクターは次に形質転換によって所望のＣ．グルタミカム株中に導入する。形質転換のための方法は例えば以下に記載されている：Thierbachら（Applied Microbiology and Biotechnology 29. 356-362 (1988)）、Dunican and Shivnan（Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)）およびTauchら（FEMS Microbiological Letters 123,343-347(1994)）。

本発明はさらに、遺伝的に改変された微生物に関し、この場合遺伝的改変は少なくとも１種の遺伝子の転写速度が野生型と比較して変化しまたは生起されることにつながり、かつ、
ａ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する少なくとも１つの内在性核酸であって、少なくとも１種の内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性を変化させるステップ、または
ｂ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、該微生物での遺伝子の転写を調節するステップ、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である
による。

方法について上述したように、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸によるか、または実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、該微生物での遺伝子の転写の調節は、
ｂ１）変化したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ３）変化したプロモーター比活性を適宜伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

本発明はさらに、少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して増大したか生起された転写速度を有する、遺伝的に改変された微生物であって、
ａｈ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸であって、内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｂｈ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態ａｈ）に従い増大したプロモーター比活性を伴う核酸により、該微生物での遺伝子の転写が調節されており、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である、
上記微生物に関する。

方法について上述したように、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、または実施形態ａ）に従い増大したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、前記微生物での遺伝子の転写の調節は、
ｂｈ１) 増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ２) １以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ３) 増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

本発明はさらに、少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して低下した転写速度を有する遺伝的に改変された微生物であって、
ａｒ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する少なくとも１つの内在性核酸であって、少なくとも１種の内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性が、野生型と比較して低下している、または
ｂｒ）実施形態ａ）に従い低下したプロモーター比活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、低下したプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、少なくとも１種の内在性遺伝子の転写が行われるようになっている、
上記微生物に関する。

本発明はさらに、遺伝的に改変された微生物であって、該遺伝的改変が、少なくとも１種の遺伝子の発現速度が野生型と比較して変化しまたは生起されることにつながり、かつ
ｃ）請求項２もしくは３に記載の少なくとも１つの内在性発現ユニットであって、少なくとも１種の内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性を野生型と比較して変化させるステップ、または
ｄ）請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い変化した発現比活性を伴う請求項２または３に記載の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現を調節するステップ、ここで該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である、
によるものである、上記微生物に関する。

方法について上述したように、請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、または実施形態ａ)に従い変化した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、前記微生物での遺伝子の発現の調節は、
ｄ１）変化した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の導入した発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ３）変化した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

本発明はさらに、少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して増大したか生起された発現速度を有する遺伝的に改変された微生物であって、
ｃｈ）請求項２もしくは３に記載の少なくとも１つの内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｄｈ）請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現が調節されており、ここで該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である、
上記微生物に関する。

方法について上述したように、請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによるか、または実施形態ａ)に従い増大した発現比活性を有する請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、前記微生物での遺伝子の発現の調節は、
ｄｈ１) 増大した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う請求項２または３に記載の導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ２) １以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入した該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ３) 増大した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された発現対象の１以上の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ、
によって達成される。
本発明はさらに、少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して低下した発現速度を有する遺伝的に改変された微生物であって、
ｃｒ）請求項２もしくは３に記載の少なくとも１つの内在性発現ユニットであって、少なくとも１種の内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性が野生型と比較して低下している、または
ｄｒ）低下した発現活性を伴う請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、低下した発現活性を伴う請求項２もしくは３に記載の導入された該発現ユニットの制御下に、少なくとも１種の内在性遺伝子の発現が行われるようになっている、
上記微生物に関する。

本発明はさらに、請求項２または３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された発現対象の遺伝子とを含んでなる遺伝的に改変された微生物であって、該遺伝子が該発現ユニットとの関係では異種起源である、上記微生物に関する。

この遺伝的に改変された微生物は、特に好ましくは本発明の発現カセットを含む。

本発明は特に好ましくは、遺伝的に改変された微生物、特にコリネ型細菌であって、本発明で定義した少なくとも１つの組換え核酸構築物を保有しているベクター、特にシャトルベクターまたはプラスミドベクターを含む、上記微生物に関する。

遺伝的に改変された微生物の好ましい実施形態では、上記の遺伝子は精製化学製品の生合成経路中のタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸である。

遺伝的に改変された微生物の特に好ましい実施形態では、上記の遺伝子は以下のものからなる群より選択される：タンパク質生成およびタンパク質非生成アミノ酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ビタミン類の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ならびに酵素の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸。この場合、該遺伝子は場合によってはさらに調節エレメントを含んでいてもよい。

アミノ酸の生合成経路中の好ましいタンパク質は以下のものからなる群より選択される：アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子ＬｕｘＲ、転写調節因子ＬｙｓＲ１、転写調節因子ＬｙｓＲ２、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンエクスポーター・キャリア、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リジンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼＩ、システインシンターゼＩＩ、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性、硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット１および２、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＲＸＡ００６５５調節因子、ＲＸＮ２９１０調節因子、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７、タンパク質ＯｐｃＡ、１−ホスホフルクトキナーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ。

アミノ酸の生合成経路中のタンパク質および遺伝子の特に好ましい例は上の表１および表２に記載されている。

好ましい微生物または遺伝的に改変された微生物は、細菌、藻類、真菌または酵母である。

特に好ましい微生物は、特にコリネ型細菌である。

好ましいコリネ型細菌は以下のものである：コリネバクテリウム属の細菌、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・メラッセコラ（Corynebacterium melassecola）およびコリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）種のもの、またはブレビバクテリウム属の細菌、特にブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）およびブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）種のもの。

特に好ましいコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属の細菌は以下の群から選択される：コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネスＦＥＲＭＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・メラッセコラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・エフィシエンスＤＳＭ４４５４７、コリネバクテリウム・エフィシエンスＤＳＭ４４５４８、コリネバクテリウム・エフィシエンスＤＳＭ４４５４９、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ディバリカタムＡＴＣＣ１４０２０、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１００６５およびコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ２１６０８。

略語ＫＦＣＣはKorean Federation of Culture Collection、略語ＡＴＣＣはAmerican type strain culture collection、そして略語ＤＳＭはDeutsche Sammlung von Mikroorganismenを意味している。

別の特に好ましいコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属の細菌を表３に挙げる。

略語は以下の意味を有する：
ＡＴＣＣ：American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA
ＦＥＲＭ：Fermentation Research Institute, Chiba, Japan
ＮＲＲＬ：ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA
ＣＥＣＴ：Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain
ＮＣＩＭＢ：National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK
ＣＢＳ：Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL
ＮＣＴＣ：National Collection of Type Cultures, London, UK
ＤＳＭＺ：Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany

プロモーター活性を有する本発明の核酸および本発明の発現ユニットにより、上記の本発明の方法を使用して、上記の本発明の遺伝的に改変された微生物での所定の生合成産物に向かう代謝経路を調節することが可能である。

この目的のため、例えば、所定の生合成産物をもたらす代謝経路を、その生合成経路の遺伝子の転写速度または発現速度を生起するかまたは増大させることによって強化するが、この際、タンパク質の量の増大が所望の生合成経路のこれらのタンパク質の総合活性の増大をもたらし、それによって所望の生合成産物に向かう代謝の流れを強化する。

その上、所定の生合成産物から分岐する代謝経路を、この分岐した生合成経路の遺伝子の転写速度または発現速度を低下させることによって弱めることができるが、この際、タンパク質の量の減少が望ましくない生合成経路のこれらのタンパク質の総合活性の低下をもたらし、それによってさらに所望の生合成産物に向かう代謝の流れを強化する。

本発明の遺伝的に改変された微生物は、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でんぷん、セルロースに由来するか、またはグリセロールおよびエタノールに由来する生合成産物を産生することができる。

本発明はしたがって、本発明の遺伝的に改変された微生物を培養することにより、生合成産物を生産するための方法に関する。

所望の生合成産物に応じて、種々の遺伝子の転写速度もしくは発現速度を増大または低下させなければならない。通常は、複数の遺伝子の転写速度または発現速度を変化させる、すなわち遺伝子の組み合わせの転写速度または発現速度を増大させ、かつ／あるいは遺伝子の組み合わせの転写速度または発現速度を低下させるのが有利である。

本発明の遺伝的に改変された微生物では、遺伝子の転写速度または発現速度の変化、すなわち増大もしくは低下のうち少なくとも１つが、プロモーター活性を有する本発明の核酸または本発明の発現ユニットに起因するものである。

その上、遺伝的に改変された微生物での別の遺伝子の転写速度または発現速度の付加的な変化、すなわち付加的な増大もしくは低下は、プロモーター活性を有する本発明の核酸または本発明の発現ユニットから誘導されるものでもよいが、そうである必要はない。

したがって、本発明はさらに、本発明の遺伝的に改変された微生物を培養することによる、生合成産物を生産するための方法に関する。

好ましい生合成産物は精製化学製品である。

用語「精製化学製品」（fine chemical）は当該技術分野で公知であり、生物によって産生され、多様な産業分野、例えば限定するわけではないが製薬産業、農業、化粧品、食品および飼料産業、で使用される化合物が含まれる。これらの化合物としては以下のものが挙げられる：有機酸（例えば、酒石酸、イタコン酸およびピメリン酸）ならびにタンパク質生成およびタンパク質非生成アミノ酸、プリン塩基およびピリミジン塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例えば、Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related Compounds, pp. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehmら編, VCH: Weinheim、およびこの中に示されている引用文献に記載のもの）、脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えばアラキドン酸）、ジオール（例えばプロパンジオールおよびブタンジオール）、炭水化物（例えばヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（例えば芳香族アミン、バニリンおよびインジゴ）、ビタミン類および補因子（以下に記載されたものなど：Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim、およびその中に示されている引用文献；ならびにA.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, １９９４年９月１−３日開催, in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)）、酵素ならびに以下に記載されているその他のすべての化学物質：Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086、およびその中に示されている引用文献。いくつかの精製化学製品の代謝およびその利用をさらに以下で説明する。

Ｉ. アミノ酸の代謝および利用
アミノ酸とは、すべてのタンパク質の基本構造単位を包含し、したがって正常な細胞機能のために必須である。用語「アミノ酸」は当該技術分野で公知である。タンパク質生成アミノ酸は２０タイプあるが、タンパク質の構造単位として働き、その中ではこれらは互いにペプチド結合で連結されている。一方、タンパク質非生成アミノ酸（数百種が知られている）は通常タンパク質中には存在しない（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol, A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)を参照のこと）。アミノ酸はＤまたはＬ立体配置を採り得る。但し、天然に存在するタンパク質中では通常Ｌ−アミノ酸のみが見られる。２０種のタンパク質生成アミノ酸のそれぞれの生合成および分解経路は原核および真核細胞の両方で十分明らかにされている（例えば、Stryer, L. Biochemistry, 第３版, pp. 578-590 (1988)を参照のこと）。「必須」アミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン）は、その生合成の複雑性のために食物により摂取しなければならないので、このように称されるが、単純な生合成経路によってその他の１１種の「非必須」アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシン）に変換される。高等動物はこれらのアミノ酸のいくつかを合成する能力を有するが、必須アミノ酸は、正常なタンパク質合成を行うためには、食品とともに摂取しなければならない。

タンパク質生合成でのその機能とは別に、これらのアミノ酸はそれ自体が興味深い化学物質であり、その多くが食品、飼料、化学物質、化粧品、農業および製薬産業における種々の適用での用途を有することが明らかになっている。リジンはヒトの栄養ばかりでなく、単胃種動物、例えば家禽類およびブタなどにとっても重要なアミノ酸である。グルタミン酸は香味添加剤（グルタミン酸一ナトリウム、ＭＳＧ）として最も頻繁に用いられ、かつ食品産業において広範に使用されているが、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシンおよびシステインも同様である。グリシン、Ｌ−メチオニンおよびトリプトファンはいずれも製薬産業で使用される。グルタミン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、アルギニン、プロリン、セリンおよびアラニンは製薬産業および化粧品産業で使用される。トレオニン、トリプトファンおよびＤ／Ｌ−メチオニンは広範に使用される飼料添加剤である（Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp.466-502, Rehmら編 Biotechnology vol. 6, 第１４ａ章, VCH: Weinheim)。これらのアミノ酸はその上、以下のような合成アミノ酸およびタンパク質の合成のための好適な前駆体であることがわかっている：Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−カルボキシメチル−Ｌ−システイン、(Ｓ)−５−ヒドロキシトリプトファンおよび以下に記載されているその他の物質：Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp.57-97, VCH, Weinheim, 1985。

これらを産生することができる生物、例えば細菌中でのこれらの天然アミノ酸の生合成は十分明らかにされている（細菌によるアミノ酸生合成およびその調節についての総説として、Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606を参照のこと）。グルタミン酸はクエン酸回路中の中間体であるαケトグルタル酸の還元的アミノ化によって合成される。グルタミン、プロリンおよびアルギニンはそれぞれグルタミン酸から連続的に生成される。セリンの生合成は３ステップ法で行われ、３−ホスホグリセリン酸（解糖の中間体）から出発し、酸化、アミノ基転移および加水分解ステップ後、このアミノ酸が得られる。システインおよびグリシンはそれぞれセリンから生産されるが、前者はホモシステインとセリンの縮合、後者はセリントランスヒドロキシメチラーゼにより触媒される反応での側鎖β炭素のテトラヒドロ葉酸への転移による。フェニルアラニンおよびチロシンは、解糖およびペントースリン酸経路の前駆体であるエリトロース４−リン酸およびホスホエノールピルビン酸から９ステップの生合成経路で合成されるが、プレフェン酸の合成後の最後の２ステップのみが異なっている。トリプトファンもこれらの２つの出発分子から生産されるが、その合成は１１ステップの経路で行われる。チロシンもフェニルアラニンからフェニルアラニンヒドロキシラーゼにより触媒される反応で生産することができる。アラニン、バリンおよびロイシンはそれぞれ、解糖の最終生成物であるピルビン酸の生合成産物である。アスパラギン酸はクエン酸回路の中間体であるオキサロ酢酸から形成される。アスパラギン、メチオニン、トレオニンおよびリジンはそれぞれアスパラギン酸の変換によって生産される。イソロイシンはトレオニンから形成される。ヒスチジンは活性化糖である５−ホスホリボシル１−ピロリン酸から複雑な９ステップ経路で形成される。

細胞のタンパク質生合成の必要量よりも過剰な量のアミノ酸は貯蔵することができないので、分解されて、中間体がその細胞の主要な代謝経路に供給されるようになる（総説として、Stryer, L., Biochemistry, 第３版, 第２１章 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; pp. 495-516 (1988)を参照のこと)。細胞は不要なアミノ酸を有用な代謝中間体に転換することはできるが、アミノ酸産生は、その合成に必要なエネルギー、前駆体分子および酵素の面で負担のかかるものである。したがって、アミノ酸生合成がフィードバック阻害によって調節され、この場合、特定のアミノ酸の存在がその産生の速度を低下させるか、または完全に停止させることは驚くべきことではない（アミノ酸生合成経路のフィードバックメカニズムの総説としては、以下を参照のこと：Stryer, L., Biochemistry, 第３版, 第２４章, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)）。したがって、特定のアミノ酸のアウトプットは細胞内のそのアミノ酸の量によって制限される。

ＩＩ. ビタミン類、補因子および栄養補助物質の代謝および利用
ビタミン類、補因子および栄養補助物質はまた別の分子群である。高等動物はこれらの合成能力を失っているので、これらを摂取する必要がある。但し、これらは細菌などの他の生物では容易に合成される。これらの分子はそれ自体が電子運搬体として作用する生物学的に活性な分子であるか、もしくは生物学的に活性な物質の前駆体であるか、または多数の代謝経路中の中間体である。これらの化合物はその栄養的価値とは別に、着色剤、抗酸化剤、および触媒またはその他の加工助剤としても、顕著な産業上の価値を有する（これらの化合物の構造、活性および産業上の適用についての総説としては、以下を参照のこと：Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996)。用語「ビタミン」は当該技術分野で公知であり、正常な機能発揮のために生物により必要とされるが、その生物自身はそれを合成することができない栄養物質が挙げられる。ビタミン類の群には補因子および栄養補助化合物も含まれる。用語「補因子」には、正常な酵素活性の発揮にとって必要な非タンパク質化合物が含まれる。これらの化合物は有機性または無機性の場合がある。本発明の補因子分子は好ましくは有機性である。用語「栄養補助物質」には植物および動物、特にヒトの健康を促進する食品添加物が含まれる。こうした分子の例は、ビタミン類、抗酸化剤、同様にある種の脂質（例えば多価不飽和脂肪酸）である。

これらの分子を産生することができる細菌などの生物中でのこれらの生合成は、詳細に明らかにされている（Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996；Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons；Ong, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asia, １９９４年９月１−３日開催, in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S）。

チアミン（ビタミンＢ₁）はピリミジンおよびチアゾール単位の化学的カップリングによって形成される。リボフラビン(ビタミンＢ₂)はグアノシン５’−三リン酸(ＧＴＰ)およびリボース５’−リン酸から合成される。リボフラビンは次に、フラビンモノヌクレオチド(ＦＭＮ)およびフラビン−アデニンジヌクレオチド(ＦＡＤ)の合成に使用される。「ビタミンＢ_６」と総称されるファミリーの化合物（例えばピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサル５’−リン酸および商業的に使用されている塩酸ピリドキシン）はすべて、共通の構造ユニットである５−ヒドロキシ−６−メチルピリジンの誘導体である。パントテネート（パントテン酸、Ｒ−(＋)−Ｎ−(２,４−ジヒドロキシ−３，３−ジメチル−１−オキソブチル)−βアラニン）は化学合成または発酵のいずれかによって生産することができる。パントテン酸生合成の最終ステップは、ＡＴＰによって駆動されるβアラニンとパントイン酸との縮合で構成される。パントイン酸、βアラニンへの変換およびパントテン酸への縮合のための生合成ステップを担う酵素は公知である。パントテネートの代謝的に活性な形態は補酵素Ａであり、その生合成は５つの酵素ステップによって進行する。パントテネート、ピリドキサル５−リン酸、システインおよびＡＴＰが補酵素Ａの前駆体である。これらの酵素はパントテネートの形成だけでなく、(Ｒ)−パントイン酸、(Ｒ)−パントラクトン、(Ｒ)−パンテノール（プロビタミンＢ_５）、パンテテイン（およびその誘導体）ならびに補酵素Ａの生成をも触媒する。

前駆体分子であるピメロイル−ＣｏＡからの微生物でのビオチンの生合成は詳細に研究され、関与するいくつかの遺伝子が同定されている。対応するタンパク質の多くがＦｅクラスター合成に関与し、ｎｉｆＳタンパク質のクラスに属する点が明らかになっている。リポ酸はオクタン酸から誘導され、エネルギー代謝において補酵素として作用する。この場合、これはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体およびαケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体の構成成分となる。葉酸塩はすべて葉酸から誘導される物質の１グループであり、葉酸はＬ−グルタミン酸、ｐ−アミノ安息香酸および６−メチルプテリンから誘導される。代謝中間体であるグアノシン５’−三リン酸(ＧＴＰ)、Ｌ−グルタミン酸およびｐ−アミノ安息香酸から出発する、葉酸およびその誘導体の生合成は、いくつかの微生物において詳細に研究されている。
コリノイド（コバラミンなど、特にビタミンＢ₁₂）およびポルフィリンはテトラピロール環系により特徴付けられる化学物質のグループに属している。ビタミンＢ₁₂の生合成は非常に複雑なので、いまだに完全には明らかにされていないが、関与する酵素および基質の大部分が現在公知となっている。ニコチン酸（ニコチネート）およびニコチンアミドはピリジン誘導体であり、「ナイアシン」とも称される。ナイアシンは重要な補酵素であるＮＡＤ（ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＰ（ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチドリン酸）ならびにこれらの還元型の前駆体である。

これらの化合物の工業的規模での生産は大部分が無細胞系の化学合成を基礎としているが、これらの化学物質のいくつかは、微生物の大規模培養によっても生産されており、そのようなものとしてはリボフラビン、ビタミンＢ₆、パントテネートおよびビオチンなどがある。ビタミンＢ₁₂だけは、その合成が複雑であるので、発酵によってのみ生産されている。in vitro法は、材料および時間のかなりの消費を要し、高コストであることが多い。

ＩＩＩ. プリン、ピリミジン、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの代謝および利用
プリンならびにピリミジンの代謝に関する遺伝子およびそれに対応するタンパク質は新生物疾患およびウイルス感染症の治療のための重要な標的である。用語「プリン」または「ピリミジン」には、核酸、補酵素およびヌクレオチドの構成成分である含窒素塩基が含まれる。用語「ヌクレオチド」には核酸分子の基本構造単位が包含され、これは含窒素塩基、ペントース糖（ＲＮＡ中の糖はリボース、そしてＤＮＡ中の糖はＤ−デオキシリボースである）およびリン酸を含有する。用語「ヌクレオシド」はヌクレオチドの前駆体として働く分子を包含するが、これはヌクレオチドとは異なって、リン酸単位を有しない。これらの分子の生合成または核酸分子の形成のためのこれらの分子の動態化を阻害することによって、ＲＮＡおよびＤＮＡ合成を阻害することが可能である。癌原性細胞中でのこの活性の特異的阻害によって、腫瘍細胞の分裂および複製能力を抑制することができる。

核酸分子を形成しないが、エネルギー貯蔵体（すなわちＡＭＰ）として、または補酵素（すなわちＦＡＤおよびＮＡＤ）として働くヌクレオチドもある。

プリンおよび／またはピリミジンの代謝が影響を受けるこうした医学的症候のためのこれらの化学物質の使用については、いくつかの刊行物に記載されている（例えば、Christopherson, R.I. and Lyons, S.D. (1990)"Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res. Reviews 10: 505-548）。プリンおよびピリミジン代謝に関与する酵素についての研究は、例えば免疫抑制剤または抗増殖剤として使用することができる新規な医薬の開発に集中している（Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902）。しかし、プリンおよびピリミジン塩基、ヌクレオシドならびにヌクレオチドには、以下のような考えられる他の用途もある：各種の精製化学製品の生合成における中間体として（例えばチアミン、Ｓ−アデノシルメチオニン、葉酸塩またはリボフラビン）、細胞のためのエネルギーキャリアとして（例えばＡＴＰまたはＧＴＰ）、またそれ自体化学薬品として（香味増強剤として一般的に使用されている（例えばＩＭＰまたはＧＭＰ））、または多くの医療用途のため（例えば、Kuninaka, A., (1996)"Nucleotides and Related Compounds" Biotechnology, vol, 6, Rehmら編, VCH: Weinheim, pp. 561-612を参照のこと。プリン、ピリジン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド代謝に関与する酵素はまた、作物の保護のための化学薬品（例えば殺菌剤、除草剤および殺虫剤）の開発のための標的としての役割も果たすようになってきている。

細菌中でのこれらの化合物の代謝について明らかにされている（総説として、例えば以下を参照のこと：Zalkin, H. and Dixon, J.E. (1992)"De novo purin nucleotide biosynthesis, Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, vol. 42, Academic Press, pp. 259-287; およびMichal, G. (1999)"Nucleotides and Nucleosides; 第８章 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York）。集中的な研究の対象であるプリン代謝は、細胞の正常な機能発揮のために必須である。高等動物でのプリン代謝の障害は重篤な疾患、例えば痛風の原因となり得る。プリンヌクレオチドはリボース５−リン酸から中間体化合物であるイノシン５’−リン酸(ＩＭＰ)を経て多数のステップを介して合成され、これからグアノシン５’−一リン酸(ＧＭＰ)またはアデノシン５’−一リン酸(ＡＭＰ)の産生につながり、これらからは、ヌクレオチドとして使用される三リン酸形態を容易に調製することができる。これらの化合物はエネルギー貯蔵体としても用いられ、その分解が細胞内での様々な生化学プロセスのためのエネルギーを供給する。ピリミジン生合成は、リボース５−リン酸からウリジン５’−一リン酸(ＵＭＰ)の形成を経て行われる。次に、ＵＭＰがシチジン５’−三リン酸(ＣＴＰ)に転換される。すべてのヌクレオチドのデオキシ型はヌクレオチドの二リン酸リボース型から１ステップの還元反応によって調製され、ヌクレオチドの二リン酸デオキシリボース型が得られる。リン酸化の後、これらの分子はＤＮＡ合成に用いることができるようになる。

ＩＶ. トレハロースの代謝および利用
トレハロースは互いにα,α−１，１結合で連結されている２個のグルコース分子からなっている。これは食品産業で甘味剤として、乾燥食品もしくは冷凍食品への添加剤として、また飲料中に一般的に使用される。しかし、製薬産業、化粧品およびバイオテクノロジー産業でも使用されている（例えば以下を参照のこと：Nishimotoら、(1998)米国特許第５７５９６１０号；Singer, M.A. and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467；Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314；およびShiosaka, M. FFIJ. Japan 172 (1997) 97-102)。トレハロースは多くの微生物の酵素によって産生され、周囲の培地に自然に放出され、そこから当該技術分野で公知の方法によって単離することができる。

特に好ましい生合成産物は以下の群から選択される：有機酸、タンパク質、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、タンパク質生成性およびタンパク質非生成性のアミノ酸、脂質および脂肪酸、ジオール、炭水化物、芳香族化合物、ビタミン類および補因子、酵素ならびにタンパク質。

好ましい有機酸は酒石酸、イタコン酸およびジアミノピメリン酸である。

好ましいヌクレオシドおよびヌクレオチドは例えばKuninaka, A. (1996)"Nucleotides and Related Compounds", pp. 561-612, in Biotechnology, vol. 6, Rehmら編, VCH: Weinheim、およびその中に示された引用文献に記載されている。

好ましい生合成産物はさらに以下のものである：脂質、飽和および不飽和脂肪酸（例えばアラキドン酸）、ジオール（例えばプロパンジオールおよびブタンジオール）、炭水化物（例えばヒアルロン酸およびトレハロース）、芳香族化合物（例えば、芳香族アミン、バニリンおよびインジゴ）、ビタミン類および補因子（例えば以下に記載されているもの：Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheimおよびその中の引用文献；ならびにOng, A.S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asia, １９９４年９月開催, in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)）、酵素、ポリケチド（Caneら (1998) Science 282: 63-68)ならびに以下に記載されているその他のすべての化学物質：Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 およびその中に示された引用文献。

特に好ましい生合成産物はアミノ酸、特に好ましくは必須アミノ酸、特に以下のものである：Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸およびＬ−トレオニン、Ｌ−ホモセリン、特にＬ−リジン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トレオニン。アミノ酸、例えばリジン、メチオニンおよびトレオニンなどは以下、ＬおよびＤ型のアミノ酸の両方、好ましくはＬ型、すなわち例えばＬ−リジン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トレオニンを意味する。

本発明は特に、少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して増大したか生起された発現速度を有する、遺伝的に改変された微生物を培養することによる、リジンの生産方法であって、
ｃｈ）少なくとも１つの本発明の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｄｈ）本発明の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現が調節されており、ここで該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である、
上記方法に関する。

そして前記の場合、遺伝子は以下の群から選択される：アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、転写調節因子ＬｕｘＲをコードする核酸、転写調節因子ＬｙｓＲ１をコードする核酸、転写調節因子ＬｙｓＲ２をコードする核酸、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼをコードする核酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、リジンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼをコードする核酸、タンパク質ＯｐｃＡをコードする核酸、１−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸および６−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸。

方法について上述したように、本発明の発現ユニットによる、または実施形態ｃｈ）に従い増大した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットによる、前記微生物でのこれらの遺伝子の発現の調節は、
ｄｈ１) 増大した発現比活性を適宜伴う本発明の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う導入された本発明の該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ２) １以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、導入された１以上の該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ３) 増大した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

リジンを調製するための上記の方法の特に好ましい別の実施形態は、以下の群から選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して増大した活性をさらに有する、遺伝的に改変された微生物を含む：アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、転写調節因子ＬｕｘＲ活性、転写調節因子ＬｙｓＲ１活性、転写調節因子ＬｙｓＲ２活性、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ活性、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リジンエクスポーター活性、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ活性、タンパク質ＯｐｃＡ活性、１−ホスホフルクトキナーゼ活性、６−ホスホフルクトキナーゼ活性およびビオチンリガーゼ活性。

リジンを調製するための上記の方法のさらに好ましい実施形態は、以下の群から選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して低下した活性をさらに有する、遺伝的に改変された微生物を含む：トレオニンデヒドラターゼ活性、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ホモセリンキナーゼ活性、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性、トレオニンエクスポーター活性、トレオニン排出タンパク質活性、アスパラギナーゼ活性、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性およびトレオニンシンターゼ活性。

上記の活性のうち少なくとも１つについて、増大するかまたは低下したさらなる活性は、プロモーター活性を有する本発明の核酸および／または本発明の発現ユニットより生起されたものでもよいが、そうである必要はない。

本発明はさらに、少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して増大したか生起された発現速度を有する、遺伝的に改変された微生物を培養することによる、メチオニンの生産方法であって、
ｃｈ）本発明の少なくとも１つの内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｄｈ）本発明の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現が調節されており、ここで該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である、
上記方法に関する。

そして前記の場合、遺伝子は以下の群から選択される：アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、シスタチオニンγ−シンターゼをコードする核酸、シスタチオニンβ−リアーゼをコードする核酸、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする核酸、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする核酸、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする核酸、ホスホセリンホスファターゼをコードする核酸、セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、システインシンターゼＩをコードする核酸、システインシンターゼＩＩ活性をコードする核酸、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ活性をコードする核酸、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性をコードする核酸、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ活性をコードする核酸、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ活性をコードする核酸、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ活性をコードする核酸、フェレドキシンＮＡＤＰＨレダクターゼ活性をコードする核酸、フェレドキシン活性をコードする核酸、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７をコードする核酸、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８をコードする核酸、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７をコードする核酸、ＲＸＡ０６５５調節因子をコードする核酸およびＲＸＮ２９１０調節因子をコードする核酸。

方法について上述したように、本発明の発現ユニットによる、または実施形態ｃｈ）に従い増大した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットによる、前記微生物でのこれらの遺伝子の発現の調節は、
ｄｈ１) 増大した発現比活性を適宜伴う本発明の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う導入された本発明の該発現ユニットの制御下に、１以上のこれらの内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ２) １以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、導入された１以上の該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ３) 増大した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

メチオニンを調製するための上記の方法の特に好ましい別の実施形態は、以下の群から選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して増大した活性をさらに有する、遺伝的に改変された微生物を含む：アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、シスタチオニンβ−リアーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンアセチルトランスフェラーゼ活性、システインシンターゼＩ活性、システインシンターゼＩＩ活性、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ活性、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ活性、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ活性、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ活性、フェレドキシンＮＡＤＰＨレダクターゼ活性、フェレドキシン活性、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７活性、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８活性、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７活性、ＲＸＡ６５５調節因子活性およびＲＸＮ２９１０調節因子活性。

メチオニンを調製するための上記の方法の特に好ましい別の実施形態は、以下の群から選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して低下した活性をさらに有する、遺伝的に改変された微生物を含む：ホモセリンキナーゼ活性、トレオニンデヒドラターゼ活性、トレオニンシンターゼ活性、メソ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性およびジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼ活性。

上記の活性のうち少なくとも１つについて、増大したかまたは低下したこれらのさらなる活性は、プロモーター活性を有する本発明の核酸および／または本発明の発現ユニットにより生起されたものでもよいが、そうである必要はない。
本発明はさらに、少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して増大したか生起された発現速度を有する、遺伝的に改変された微生物を培養することによる、トレオニンの生産方法であって、
ｃｈ）少なくとも１つの本発明の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｄｈ）本発明の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットにより該微生物での遺伝子の発現が調節されており、ここで該遺伝子は、該発現ユニットとの関係では異種起源である、
上記方法に関する。

そして前記の場合、遺伝子は以下の群から選択される：アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリンキナーゼをコードする核酸、トレオニンシンターゼをコードする核酸、トレオニンエクスポーター・キャリアをコードする核酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼをコードする核酸、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、リジンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トレオニン排出タンパク質をコードする核酸、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼをコードする核酸、ＯｐｃＡタンパク質をコードする核酸、１−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、６−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸およびホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸。

方法について上述したように、本発明の発現ユニットによる、または実施形態ｃｈ)に従い増大した発現比活性を伴う本発明の発現ユニットによる、前記微生物でのこれらの遺伝子の発現の調節は、
ｄｈ１) 増大した発現比活性を適宜伴う本発明の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う導入された本発明の該発現ユニットの制御下に、１以上のこれらの内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ２) １以上のこれらの遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う本発明の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ３) 増大した発現比活性を適宜伴う本発明の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ、
によって達成される。

トレオニンを調製するための上記の方法の特に好ましい別の実施形態は、以下の群から選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して増大した活性をさらに有する、遺伝的に改変された微生物を含む：アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、トレオニンシンターゼ活性、トレオニンエクスポーター・キャリア活性、トランスアルドラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ活性、ホモセリンキナーゼ活性、ビオチンリガーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トレオニン排出タンパク質活性、タンパク質ＯｐｃＡ活性、１−ホスホフルクトキナーゼ活性、６−ホスホフルクトキナーゼ活性、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性およびホモセリンデヒドロゲナーゼ活性。

トレオニンを調製するための上記の方法の特に好ましい別の実施形態は、以下の群から選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して低下した活性をさらに有する、遺伝的に改変された微生物を含む：トレオニンデヒドラターゼ活性、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、メソ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性、アスパラギナーゼ活性、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性、リジンエクスポーター活性、アセト乳酸シンターゼ活性、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性、分岐鎖アミノトランスフェラーゼ活性、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ活性、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性およびジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼ活性。

上記の活性の少なくとも１つについて、増大するかまたは低下したさらなる活性は、プロモーター活性を有する本発明の核酸および／または本発明の発現ユニットにより生起されたものでもよいが、そうである必要はない。

タンパク質の「活性」との用語は、酵素の場合は、対応するタンパク質の酵素活性を意味し、また、他のタンパク質、例えば構造タンパク質もしくは輸送タンパク質の場合は、そのタンパク質の生理学的活性を意味する。

酵素は通常、基質を生成物に変換するか、またはその変換ステップを触媒することができるものである。

したがって、酵素の「活性」は、その酵素によって一定時間内に変換される基質の量、または形成される生成物の量を意味する。

例えば、ある活性が野生型と比較して増大している場合、一定時間内に変換される基質の量、または形成される生成物の量が野生型と比較して増大する。

「活性」のこの増大は、上記および下記のすべての活性について好ましくは、「野生型の活性」の少なくとも５％、さらに好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも３００％、さらにより好ましくは少なくとも５００％、特には少なくとも６００％の量である。

例えば、ある活性が野生型と比較して低下している場合、一定時間内に変換される基質の量、または形成される生成物の量が野生型と比較して減少する。

低下した活性とは、好ましくは各種の細胞生物学的メカニズムに基づく、微生物中のこの酵素についての、部分的または実質的に完全な機能性の抑制または阻止を意味する。
活性の低下は、酵素の量的減少、最大でその酵素の実質的に完全な不在（すなわち対応する活性の検出不能、またはその酵素の免疫学的検出不能）を含む。微生物中の活性は好ましくは、野生型と比較して、少なくとも５％、さらに好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは１００％低下する。「低下」は特に対応する活性の完全な不在をも意味する。

遺伝的に改変された微生物および野生型での特定の酵素の活性、例えば酵素活性の増大または低下は、例えば酵素アッセイなどの公知の方法によって測定することができる。

例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼは、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸塩に変換する酵素活性を示すタンパク質を意味する。

したがって、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性は、一定時間内にピルビン酸カルボキシラーゼタンパク質によって変換されるピルビン酸塩の量、または形成されるオキサロ酢酸塩の量を意味する。

例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が野生型と比較して増大している場合、一定時間内にピルビン酸カルボキシラーゼタンパク質によって変換されるピルビン酸塩の量、または形成されるオキサロ酢酸塩の量が野生型と比較して増大している。

ピルビン酸カルボキシラーゼ活性のこの増大は、好ましくは、野生型のピルビン酸カルボキシラーゼ活性の少なくとも５％、さらに好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも３００％、さらにより好ましくは少なくとも５００％、特には少なくとも６００％である。

また、例えばホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性とは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの酵素活性を意味する。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼとは、オキサロ酢酸塩をホスホエノールピルビン酸塩に変換する酵素活性を示すタンパク質を意味する。

したがって、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性とは、一定時間内にホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼタンパク質によって変換されるオキサロ酢酸塩の量、または形成されるホスホエノールピルビン酸塩の量を意味する。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が野生型と比較して低下している場合、したがって、一定時間内にホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼタンパク質によって変換されるオキサロ酢酸塩の量、または形成されるホスホエノールピルビン酸塩の量が野生型と比較して低下している。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の低下は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの量的減少、最大でホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの実質的に完全な不在（すなわちホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の検出不能、またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの免疫学的検出不能）を含む。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性は好ましくは、野生型と比較して少なくとも５％、さらに好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは１００％低下する。特に、「低下」とは対応するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の完全な不在をも意味する。

付加的な活性の増大は様々な手法で実現することができるが、例えば発現およびタンパク質レベルで抑制的調節メカニズムを抑制することによるか、または上記のタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比較して増大させることによる。

上記のタンパク質をコードする核酸の遺伝子発現についての野生型と比較した増大は、同様に様々な手法で実現することができる。例えば、その遺伝子をアクチベーターによって誘導するか、あるいは上述のように、プロモーター活性を増大させるか発現活性を増大させることによるか、または１以上の遺伝子コピーをその微生物に導入することによる。
タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現の増大とは、本発明においては、その微生物に固有の内在性タンパク質の発現の操作をも意味する。

これは例えば、上述のように、その遺伝子のプロモーターおよび／または発現ユニット配列を変更することによって、達成することができる。遺伝子の発現速度の増大をもたらすこのような変更は、例えばＤＮＡ配列の欠失または挿入によって実現することができる。

上述のように、外来性刺激の付加によって内在性タンパク質の発現を変更することが可能である。これは特定の生理学的条件により、すなわち外来性物質の付加により、実現することができる。

当業者であれば、遺伝子発現の増大を達成するために、さらに別の操作法を、単独で、または組み合わせて用いることができる。これについては、例えば、特定の遺伝子のコピー数を増大させるか、あるいは、プロモーターおよび調節領域またはその構造遺伝子の上流に位置するリボソーム結合サイトを突然変異させることができる。さらに、誘導性プロモーターを介して、発酵産生中の発現を増大させることが可能である。ｍＲＮＡの寿命を延長させる操作も同様に発現を改善する。酵素活性は同様に、酵素タンパク質の分解を抑制することによって増強される。遺伝子または遺伝子構築物は、そのコピー数を変更してプラスミド中に存在させるか、または染色体中に組み込んで増幅させる。あるいはまた、培地の組成の変更および培養の管理によって、対応する遺伝子の過剰発現を実現することも可能である。

当業者はこれについての手引きを、とりわけ以下から得ることができる：Martinら（Biotechnology 5, 137-146 (1987)）、Guerreroら（Gene 138, 35-41 (1994)）、Tsuchiya and Morinaga（Bio/Technology 6, 428-430 (1988)）、Eikmannsら（Gene 102, 93-98 (1991)）、欧州特許第０４７２８６９号、米国特許第４，６０１，８９３号、Schwarzer and Puhler（Biotechnology 9, 84-87(1991))、Reinscheidら（Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)）、LaBarreら（Journal of Bacteriology 175, 10011007 (1993)）、特許出願ＷＯ９６／１５２４６、Malumbresら（Gene 134, 15-24 (1993)）、日本国公開公報ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１、Jensen and Hammer（Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)）、Makrides（Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)）、ならびに遺伝学および分子生物学の周知の教科書。

さらに、生合成産物、特にＬ−リジン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トレオニンの生産のためには、遺伝子の発現または強化の他に、不要な副反応を排除することが有利である（Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms"、in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (編), Academic Press, London, UK, 1982）。

好ましい実施形態では、上記のタンパク質の１つをコードする核酸の遺伝子発現を、対応するタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を微生物に導入することによって、増大させる。核酸の導入は染色体内もしくは染色体外で、すなわち染色体上のコピー数を増大させること、および／または宿主微生物中で複製するプラスミド上の遺伝子のコピーによって、行うことができる。

例えば、核酸を含む発現カセットの形態での核酸の導入は、好ましくは染色体内に、特には上記のＳａｃＢ法によって行う。

原理上、上記のタンパク質の１つをコードするいずれの遺伝子でも、この目的のために使用することが可能である。

イントロンを含んでいる真核生物起源のゲノム核酸配列の場合、宿主微生物が対応するタンパク質を発現する能力がないか、それを可能にすることができないならば、すでにプロセシングを受けた核酸配列（例えば対応するｃＤＮＡ）を使用するのが好ましい。

対応する遺伝子の例は表１および２に掲載している。

微生物中の上記の活性は好ましくは、以下の方法の少なくとも１つにより低下させる：
・共抑制を誘発するための少なくとも１つのセンスリボ核酸配列、またはその発現を保証する発現カセットの導入
・対応する遺伝子、ＲＮＡもしくはタンパク質に対する少なくとも１つのＤＮＡもしくはタンパク質結合因子、またはその発現を保証する発現カセットの導入
・ＲＮＡの分解を引き起こす少なくとも１つのウイルス核酸配列、またはその発現を保証する発現カセットの導入
・機能の喪失（例えば遺伝子中での挿入、欠失、転化もしくは突然変異の生起による、例えば遺伝子の終止コドンの創出またはリーディングフレームのシフトなど）をもたらす少なくとも１つの構築物の導入。所望の標的遺伝子中への、相同組換えまたはその標的遺伝子に対して配列特異的なヌクレアーゼの導入による部位特異的挿入によって、ノックアウト突然変異体を作製するのが可能であり、好ましい。
・低下したプロモーター活性を有するプロモーターまたは低下した発現活性を持つ発現ユニットの導入

当業者であれば、その活性または機能を低下させるために、別の方法もまた本発明の範囲内で利用することができることに気づく。例えば、あるタンパク質のドミナントネガティブ変異体またはその発現を保証する発現カセットの導入もまた有利である。
さらに、これらの方法のそれぞれが、タンパク質の量、ｍＲＮＡの量および／またはタンパク質の活性の低下をもたらすことが可能である。組み合わせた使用もあり得る。別の方法も当業者に公知であり、以下が含まれる：タンパク質のプロセシング、またはタンパク質もしくはそのｍＲＮＡの輸送の妨害もしくは抑制、リボソーム結合の阻害、ＲＮＡスプライシングの阻害、ＲＮＡ分解酵素の誘導および／あるいは翻訳伸長もしくは終結の阻害。

生合成産物を生産するための本発明の方法では、遺伝的に改変された微生物の培養のステップに、好ましくはその微生物または発酵液からの生合成産物の単離が続く。これらのステップは培養ステップと同時に、および／または好ましくはその後に行うことができる。

生合成産物、特にＬ−リジン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トレオニンを生産するために、本発明の遺伝的に改変された微生物を、バッチ法(バッチ培養)、または流加法もしくは反復流加法で、連続的もしくは不連続的に培養することができる。公知の培養方法の概要は以下に見出すことができる：Chmielの教科書（Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik （Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991））またはStorhasの教科書（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen （Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994））。

使用する培養培地は、各菌株の要求を好適な様式で満足するものでなければならない。種々の微生物のための培養培地については、以下の参考書に記載されている："Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)。

本発明に従い使用することができるこれらの培地は、通常、１種以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類および／または微量元素を含む。

好ましい炭素源は単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。極めて優良な炭素源の例は以下のものである：グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、でんぷんまたはセルロース。糖類は、糖蜜などの複合化合物またはその他の糖精製の副産物として培地に加えることもできる。種々の炭素源の混合物を添加することも有利である。その他の考えられる炭素源は以下のものである：油および脂質（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ脂など）、脂肪酸（例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸など）、アルコール（例えばグリセロール、メタノールまたはエタノールなど）、ならびに有機酸（例えば酢酸または乳酸など）。

窒素源は通常は有機もしくは無機窒素化合物またはこれらの化合物を含有する物質である。窒素源の例としては以下が挙げられる：アンモニアガスまたはアンモニウム塩（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウムなど）、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複合窒素源（例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、食肉抽出物）など。窒素源は単独で、または混合物として使用することができる。

培地中に存在させることができる無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩である。

精製化学製品、特にメチオニンを生産するため、硫黄源として例えば硫酸塩、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、テトラチオネート、チオ硫酸塩、硫化物などの無機化合物を用いることが可能であるが、メルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物もまた用いることができる。

リン源としてリン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することが可能である。

溶液中に金属イオンを維持するために、キレート剤を培地に添加することができる。特に好適なキレート剤には、カテコールもしくはプロトカテク酸塩などのジヒドロキシフェノール、またはクエン酸などの有機酸が含まれる。

本発明に従い使用される発酵培地は、通常、ビタミン類または増殖促進剤などの他の成長因子を含んでなる。これらとしては例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンが挙げられる。成長因子および塩類は、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの、培地の複合成分に由来することが多い。好適な前駆体を培養培地に添加することもできる。培地中の化合物の正確な組成は、行う特定の実験によって決まり、各特定の場合ごとに個別に決定される。培地の最適化についての情報は以下の教科書から取得することができる："Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" （P.M. Rhodes, P.F. Stanbury編, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 9635773）。増殖培地は市販業者から購入することもでき、例えばＳｔａｎｄａｒｄ１（Merck）またはＢＨＩ（Brain heart infusion、DIFCO）などがある。

培地の成分のすべてを加熱（１．５バールおよび１２１℃で２０分）または滅菌濾過のいずれかによって滅菌する。成分は一緒に、または必要ならば別々に滅菌することができる。培地のすべての成分を培養の開始時に存在させるか、または場合によっては連続的もしくはバッチ毎に添加してもよい。

培養の温度は通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であり、一定に維持するか、実験の間に変化させることができる。培地のｐＨは５〜８.５の範囲、好ましくは約７.０とすべきである。培養のためのｐＨは、塩基性化合物（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくは水性アンモニアなど）、または酸性化合物（例えばリン酸もしくは硫酸など）を添加することによって培養中制御することができる。泡の形成は、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤の利用によって制御することができる。プラスミドの安定性は、例えば抗生物質などの選択作用を有する好適な物質の培地への添加によって、維持することができる。好気条件は、培養物中に酸素または例えば外気などの酸素含有ガスを導入することによって維持する。培養の温度は通常２０℃〜４５℃である。培養は所望の生成物の最大形成まで継続する。この目標には通常１０時間〜１６０時間で到達する。

このようにして得られる発酵液中の乾燥物質含量は通常、７.５〜２５重量％である。

少なくとも発酵時間の最後、特に少なくともその３０％を過ぎた時点では、糖を制限して発酵を行うことも有利である。これは、この時間に、発酵培地中の利用可能な糖の濃度を０〜３ g／ｌに維持するか、または低下させることを意味する。

必要な生合成産物および生合成副産物の物理的／化学的特性に従い、それ自体公知の手法で、生合成産物を発酵液および／または微生物から単離する。

発酵液は例えば以下のようにさらに処理することができる。必要に応じて、例えば遠心分離、濾過、デカンテーションもしくはこれらの方法の組み合わせなどの分離方法によって、バイオマスを発酵液から完全にまたは部分的に除去するか、あるいは完全にその中に残しておくことができる。

発酵液を次に、例えばロータリーエバポレーター、薄膜エバポレーター、流下膜エバポレーターを使用するか、逆浸透圧またはナノ濾過などの公知の方法によって、濃縮することができる。この濃縮発酵液を次に凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧顆粒化またはその他の方法によって処理することができる。
しかし、生合成産物、特にＬ−リジン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−トレオニンをさらに精製することも可能である。この目的のため、生成物を含有する培養液を、バイオマスの除去後に、適当な樹脂を使用するクロマトグラフィーにかけて、所望の産物または不純物が完全にまたは部分的にクロマトグラフィー樹脂上に残留するようにする。必要ならば、同一または別のクロマトグラフィー樹脂を使用して、これらのクロマトグラフィーステップを反復することができる。当業者は好適なクロマトグラフィー樹脂の選択およびその最も効果的な使用に習熟している。精製した産物を濾過または限外濾過によって濃縮してその産物の安定性が最大となる温度で貯蔵することができる。

生合成産物は最終的に種々の形態、例えばその塩またはエステルの形態とすることができる。

単離した化合物(群)の特性および純度は、従来技術によって判定することができる。これらには高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、分光分析法、染色法、薄層クロマトグラフィー、ＮＩＲＳ、酵素アッセイまたは微生物学的アッセイが含まれる。これらの分析方法は以下に総括されている：Patekら (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140；Malakhovaら (1996) Biotekhnologiya 11 27-32；およびSchmidtら (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70、Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, pp.89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581およびpp. 581-587；Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons；Fallon, A.ら (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17。

ここで、本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに詳細に記述する。

ベクターｐＣＬｉＫ５ＭＣＳの調製
まず、ベクターｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性および複製起点を、配列番号５と配列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
配列番号５：
５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧ−３’
配列番号６：
５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧ−３’

配列番号５のオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＢＲ３２２の配列と相補的な配列の他に、５’−３’方向に、制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩおよびＡｓｃＩの切断サイトを包含し、また配列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−３’方向に、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩおよびＤｒａＩの切断サイトを包含する。ＰＣＲ反応は、ＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）を用いて、Innisら（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)）と同様の標準的な方法により行った。約２．１ｋｂのサイズを有する得られたＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて精製した。ＤＮＡ断片の平滑末端を、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造元の説明書に従って用いてライゲーションし、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)）が記載のような標準的な方法により、ライゲーション混合物でコンピテント大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, USA）を形質転換した。プラスミド保有細胞を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上で平板培養することで選別した。

個々のクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐｓｐｉｎミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造元の説明書に従って用いて単離し、制限消化によりチェックした。このようにして得られたプラスミドをｐＣＬｉＫ１と呼ぶ。

プラスミドｐＷＬＴ１（Lieblら, 1992）をＰＣＲ反応の鋳型として出発して、配列番号７と配列番号８のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてカナマイシン耐性カセットを増幅した。
配列番号７：
５’−ＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡ−３’
配列番号８：
５’−ＧＡＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡ−３’

配列番号７のオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＷＬＴ１と相補的な配列の他に、５’−３’方向に、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩの切断サイトを有し、また配列番号８のオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−３’方向に、制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩおよびＮｈｅＩの切断サイトを有する。ＰＣＲ反応は、ＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）を用いて、Innisら（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)）と同様の標準的な方法により行った。約１．３ｋｂのサイズを有する得られたＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて精製した。ＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＡｓｃＩ（New England Biolabs, Beverly, USA）を用いて切断し、続いてＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて、再度精製した。ベクターｐＣＬｉＫ１を同様に制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＡｓｃＩを用いて切断し、アルカリホスファターゼ（Ｉ（Roche Diagnostics, Mannheim））を製造元の説明書に従って用いて脱リン酸化した。０．８％アガロースゲルでの電気泳動後、直線化したベクター（約２．１ｋｂ）を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて単離した。このベクター断片を迅速ＤＮＡライゲーションキット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造元の説明書に従って用い、切断したＰＣＲ断片とライゲーションして、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)）が記載のような標準的な方法により、ライゲーション混合物でコンピテント大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, USA）を形質転換した。プラスミド保有細胞を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上で平板培養することで選別した。

個々のクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐｓｐｉｎミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造元の説明書に従って用いて単離し、制限消化によりチェックした。このようにして得られたプラスミドをｐＣＬｉＫ２と呼ぶ。

ベクターｐＣＬｉＫ２を制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩ（New England Biolabs, Beverly, USA）を用いて切断した。０．８％アガロースゲルでの電気泳動後、約２．３ｋｂのサイズのベクター断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて単離した。このベクター断片を迅速ＤＮＡライゲーションキット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造元の説明書に従って用いて再ライゲーションし、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)）が記載のような標準的な方法により、ライゲーション混合物でコンピテント大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, USA）を形質転換した。プラスミド保有細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上で平板培養することで選別した。

個々のクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐｓｐｉｎミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造元の説明書に従って用いて単離し、制限消化によりチェックした。このようにして得られたプラスミドをｐＣＬｉＫ３と呼ぶ。

プラスミドｐＷＬＱ２（Liebl ら, 1992）をＰＣＲ反応の鋳型として出発して、複製起点ｐＨＭ１５１９を、配列番号９と配列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。
配列番号９：
５’−ＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧＴＧＡＡ−３’
配列番号１０：
５’−ＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＧＴＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣ−３’

配列番号９および配列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＷＬＱ２と相補的な配列の他に、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩの切断サイトを有する。ＰＣＲ反応は、ＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, USA）を用いて、Innisら（PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)）と同様の標準的な方法により行った。約２．７ｋｂのサイズを有する得られたＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて精製した。ＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ（New England Biolabs, Beverly, USA）を用いて切断し、続いてＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて、再度精製した。ベクターｐＣＬｉＫ３を、同様に制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩを用いて切断し、アルカリホスファターゼ（Ｉ（Roche Diagnostics, Mannheim））を製造元の説明書に従って用いて脱リン酸化した。０．８％アガロースゲルでの電気泳動後、直線化したベクター（約２．３ｋｂ）を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて単離した。このベクター断片を、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造元の説明書に従って用い、切断したＰＣＲ断片とライゲーションして、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)）が記載のような標準的な方法により、ライゲーション混合物でコンピテント大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, USA）を形質転換した。プラスミド保有細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上で平板培養することで選別した。

個々のクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐｓｐｉｎミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造元の説明書に従って用いて単離し、制限消化によりチェックした。このようにして得られたプラスミドをｐＣＬｉＫ５と呼ぶ。

マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）によりｐＣＬｉＫ５を伸長するために、配列番号１１と配列番号１２のほとんど相補的な２種類の合成オリゴヌクレオチド（制限エンドヌクレアーゼＳｗａＩ、ＸｈｏＩ、ＡａｔＩ、ＡｐａＩ、Ａｓｐ７１８、ＭｌｕＩ、ＮｄｅＩ、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＶ、ＳａｌＩ、ＣｌａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＳｍａＩの切断サイトを有する）を、一緒にして９５℃に加熱し、緩やかに冷却することにより組み合わせて、二本鎖ＤＮＡ断片を得た。
配列番号１１：
５’−ＴＣＧＡＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＣＧＴＣＧＧＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＡＴ−３’
配列番号１２：
５’−ＧＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＣＴＡＧＧＴＣＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＡＣＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴ−３’

ベクターｐＣＬｉＫ５を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ（New England Biolabs, Beverly, USA）を用いて切断し、アルカリホスファターゼ（Ｉ（Roche Diagnostics, Mannheim））を製造元の説明書に従って用いて脱リン酸化した。０．８％アガロースゲルでの電気泳動後、直線化したベクター（約５．０ｋｂ）を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて単離した。このベクター断片を、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造元の説明書に従って用い、合成二本鎖ＤＮＡ断片とライゲーションして、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)）が記載のような標準的な方法により、ライゲーション混合物でコンピテント大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, USA）を形質転換した。プラスミド保有細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上で平板培養することで選別した。

個々のクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐｓｐｉｎミニプレップキット（Qiagen, Hilden）を製造元の説明書に従って用いて単離し、制限消化によりチェックした。このようにして得られたプラスミドをｐＣＬｉＫ５ＭＣＳと呼ぶ。

シーケンス反応を、Sanger ら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467により記載のように行った。シーケンス反応物を、ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７（PE Applied Biosystems, Weiterstadt）を用いて分離し、評価した。

得られたプラスミドｐＣＬｉＫ５ＭＣＳは配列番号１３として記載する。

プラスミドＰｍｅｔＡｍｅｔＡの調製
Tauch ら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmanns ら (1994) Microbiology 140:1817-1828に記載のようにして、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から染色体ＤＮＡを調製した。非コード５’領域を含むｍｅｔＡ遺伝子は、配列番号１４と配列番号１５のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体ＤＮＡ、ならびにＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼ（Stratageneより）を用いて、Innis ら (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Pressに記載のような標準的な方法によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
配列番号１４：
５’−ＧＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴ−３’
配列番号１５：
５’−ＣＴＣＴＡＣＴＡＧＴＴＴＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＣＴＣＧＡＴＧＴ−３’

約１．３ｋｂのサイズを有する得られたＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて精製した。次にこれを制限酵素Ａｓｐ７１８およびＳｐｅＩ（Roche Diagnostics, Mannheim）を用いて切断し、ＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キットを用いて精製した。

配列番号１３のベクターｐＣＬｉＫ５ＭＣＳを制限酵素Ａｓｐ７１８およびＳｐｅＩを用いて切断し、電気泳動による分離後、５ｋｂのサイズの断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キットを用いて単離した。

該ベクター断片を、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造元の説明書に従って用い、該ＰＣＲ断片とライゲーションして、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)）が記載のような標準的な方法により、ライゲーション混合物でコンピテント大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, USA）を形質転換した。プラスミド保有細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上で平板培養することで選別した。

プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎから提供された方法により、また材料を用いて調製した。シーケンス反応は、Sanger ら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467により記載のように行った。シーケンス反応物を、ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７（PE Applied Biosystems, Weiterstadt）を用いて分離し、評価した。

得られたプラスミドｐＣＬｉＫ５ＭＣＳＰｍｅｔＡｍｅｔＡは配列番号１６として記載する。

プラスミドｐＣＬｉＫ５ＭＣＳＰＥＦ−ＴＵｍｅｔＡの調製
Tauch ら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmanns ら (1994) Microbiology 140:1817-1828に記載のようにして、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から染色体ＤＮＡを調製した。スーパーオキシドジスムターゼ（Ｐｓｏｄ）の非コード５’領域（プロモーター領域）に由来する約２００塩基対のＤＮＡ断片は、配列番号１７と配列番号１８のオリゴヌクレオチドプライマー、鋳型として染色体ＤＮＡ、ならびにＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼ（Stratageneより）を用いて、Innis ら (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Pressと同様の標準的な方法によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
配列番号１７：
５’−ＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＡＡＴＧ−３’
配列番号１８：
５’−ＣＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＴＴＧＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣ−３’

得られたＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を製造元の説明書に従って用いて精製した。

配列番号１６のプラスミドＰｍｅｔＡｍｅｔＡをＰＣＲ反応の鋳型として出発して、配列番号１９と配列番号２０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてｍｅｔＡの一部分を増幅した。
配列番号１９：
５’−ＣＣＣＡＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＴＴＣＡＧ−３’
配列番号２０：
５’−ＣＴＧＧＧＴＡＣＡＴＴＧＣＧＧＣＣＣ−３’

約４７０塩基対の得られたＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キットを製造元の説明書に従って用いて精製した。

さらなるＰＣＲ反応では、上記で得られた２種類の断片を、鋳型として共に用いた。配列番号１８のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて導入したｍｅｔＡと相同な配列により、ＰＣＲ反応の間、２種類の断片を互いに接着させ、用いたポリメラーゼによって伸長して連続的なＤＮＡ鎖を得た。配列番号１７と配列番号２０の用いるオリゴヌクレオチドプライマーを、２回目のサイクルの開始時に初めて反応混合物に添加することで、標準的な方法を改変した。

約６７５塩基対の増幅されたＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キットを製造元の説明書に従って用いて精製した。続いてこれを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩ（Roche Diagnostics, Mannheim）を用いて切断し、ゲル電気泳動により分離した。次に、約６２０塩基対のサイズのＤＮＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を用いてアガロースから精製した。配列番号１６のプラスミドＰｍｅｔＡｍｅｔＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｐｅＩ（Roche Diagnostics, Mannheim）で切断した。ゲル電気泳動による分離後、約０．７ｋｂのサイズのｍｅｔＡ断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キットを用いてアガロースから精製した。

配列番号１３のベクターｐＣＬｉＫ５ＭＣＳを制限酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（Roche Diagnostics, Mannheim）で切断し、電気泳動による分離後、５ｋｂのサイズの断片を、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キットを用いて単離した。

ベクター断片を、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Roche Diagnostics, Mannheim）を製造元の説明書に従って用いて、該ＰＣＲ断片および該ｍｅｔＡ断片とライゲーションし、Sambrookら（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)）が記載のような標準的な方法により、ライゲーション混合物でコンピテント大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, La Jolla, USA）を形質転換した。プラスミド保有細胞を、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上で平板培養することで選別した。

得られたプラスミドｐＣＬｉＫ５ＭＣＳＰ＿ＥＦＴＵｍｅｔＡは配列番号２１として記載する。

ＭｅｔＡ活性
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株を、プラスミドｐＣＬｉＫ５ＭＣＳ、ｐＣＬｉＫ５ＭＣＳＰｍｅｔＡｍｅｔＡ、ｐＣＬｉＫ５ＭＣＳＰＥＦ−ＴＵｍｅｔＡのそれぞれを用いて記載された方法（Lieblら (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303）により形質転換した。形質転換混合物を、プラスミド保有細胞を選別するためにカナマイシン２０ｍｇ／ｌをさらに含有するＣＭ平板培地上にて平板培養した。得られたカナマイシン耐性クローンを回収して単離した。

これらのプラスミド構築物のうち１種類を有するＣ．グルタミカム株を、ＭＭＡ培地（４０ｇ／ｌスクロース、２０ｇ／ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ｌＫ_２ＨＰＯ_４、０．２５ｇ／ｌＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、５４ｇＡｃｅｓ、ＣａＣｌ_２（１０ｇ／ｌ）１ｍｌ、プロトカテク酸（３００ｍｇ／１０ｍｌ）１ｍｌ、微量元素溶液（１０ｇ／ｌＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、１０ｇ／ｌＭｎＳＯ_４×Ｈ_２Ｏ、２ｇ／ｌＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／ｌＣｕＳＯ_４、０．０２ｇ／ｌＮｉＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ）１ｍｌ、１００μｇ／ｌビタミンＢ_１２、０．３ｍｇ／ｌチアミン、１ｍＭロイシン、１ｍｇ／ｌピリドキサルＨＣｌ、ビオチン（１００ｍｇ／ｌ）１ｍｌ、ｐＨ７．０）中で、３０℃にて一晩培養した。細胞を４℃にて遠沈し、続いて冷却Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（０．１％、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。再度の遠心後、細胞を冷却Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（０．１％、ｐＨ８．０）中に回収してＯＤ_６００を１６０に調整した。細胞を破壊するために、この細胞懸濁液の１ｍｌをＨｙｂａｉｄ社製の２ｍｌＲｉｂｏｌｙｓｅｒ試験管に移して、Ｈｙｂａｉｄ社製Ｒｉｂｏｌｙｓｅｒ中で回転設定６．０として各回３０秒間にて３回溶解した。溶解液をエッペンドルフ遠心機中で１５，０００ｒｐｍ、４℃にて３０分間遠心することにより透明化し、上清を新しいエッペンドルフ容器に移した。タンパク質含有量をBradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254により記載の通りに測定した。

ｍｅｔＡの酵素活性測定は以下のように行った。１ｍｌの反応混合液は、１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、５ｍＭＭｇＣｌ_２、１００μＭアセチルＣｏＡ、５ｍＭＬ−ホモセリン、５００μＭＤＴＮＢ（エルマン試薬）および細胞抽出液を含むものとした。各タンパク質溶解液を添加することによりアッセイを開始し、室温にてインキュベートした。続いて反応動態を４１２ｎｍにて１０分間記録した。

結果を表１ａに示す。

外来性発現ユニットを用いることにより、ＭｅｔＡ活性を顕著に増大させることが可能であった。

プラスミドｐＣＩＳｌｙｓＣの構築
株構築の第１ステップでは、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２中のｌｙｓＣ野生型遺伝子の対立遺伝子交換を行った。この場合には、ｌｙｓＣ遺伝子内でヌクレオチド交換を行い、得られるタンパク質では３１１位のアミノ酸ＴｈｒがＩｌｅで置き換えられるようにした。ＰＣＲ反応の鋳型としてＡＴＣＣ１３０３２由来の染色体ＤＮＡから出発して、ＰｆｕＴｕｒｂｏＰＣＲシステム（Stratagene USA）を製造元の説明書に従って用いて、配列番号２２と配列番号２３のオリゴヌクレオチドプライマーでｌｙｓＣを増幅した。染色体ＤＮＡは、Tauch ら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmanns ら (1994) Microbiology 140:1817-1828により記載の通りにして、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２から調製した。増幅された断片には、５’末端にＳａｌＩ制限サイトが、３’末端にＭｌｕＩ制限サイトがつながっている。クローニングの前に、該増幅断片をこれら２種類の制限酵素を用いて消化し、ＧＦＸ^ＴＭＰＣＲ、ＤＮＡおよびゲルバンド精製キット（Amersham Pharmacia, Freiburg）を用いて精製した。
配列番号２２：
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＣＧＣＡＴＣ−３’
配列番号２３：
５’−ＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＴＴＡＣＧＧＣＣＴＧ−３’

得られたポリヌクレオチドは、ＳａｌＩおよびＭｌｕＩ制限サイトを介してＳａｃＢ組み込みｐＣＬｉＫ５ＭＣＳ（以下、ｐＣＩＳと呼ぶ（配列番号２４））にクローニングし、大腸菌ＸＬ−１ｂｌｕｅを形質転換した。プラスミド保有細胞の選別は、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天（Lennox, 1955, Virology, 1:190）上での平板培養により行った。プラスミドを単離し、期待されるヌクレオチド配列をシーケンスにより確認した。プラスミドＤＮＡの調製はＱｉａｇｅｎから提供された方法により、また材料を用いて行った。シーケンス反応は、Sanger ら (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467により記載のように行った。シーケンス反応物を、ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７（PE Applied Biosystems, Weiterstadt）を用いて分離し、評価した。得られたプラスミドｐＣＩＳｌｙｓＣは配列番号２５として記載する。

Ｃ．グルタミカム由来のｌｙｓＣ遺伝子の突然変異誘発
Ｃ．グルタミカム由来のｌｙｓＣ遺伝子の部位特異的突然変異誘発は、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅキット（Stratagene/USAより）を製造元の説明書に従って用いて行った。配列番号２５のプラスミドｐＣＩＳｌｙｓＣについて突然変異誘発を行った。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ法（Stratagene）によるｔｈｒ３１１から３１１ｉｌｅへの交換のために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した：
配列番号２６：
５’−ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＧＴＴＣＣＧ−３’
配列番号２７：
５’−ＣＧＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧ−３’

Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ反応中でこれらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、配列番号２８のｌｙｓＣ遺伝子内の９３２位でのヌクレオチドの交換が生じる（ＣからＴへ）。ｌｙｓＣ遺伝子内にもたらされたアミノ酸交換Ｔｈｒ３１１Ｉｌｅは、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅの形質転換およびプラスミド調製の後に、シーケンス反応により確認した。該プラスミドはｐＣＩＳｌｙｓＣｔｈｒ３１１ｉｌｅと名付け、配列番号２９として記載する。

Liebl ら (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303により記載の通りにして、エレクトロポレーションによりプラスミドｐＣＩＳｌｙｓＣｔｈｒ３１１ｉｌｅでＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を形質転換した。プロトコールの改変はＤＥ１００４６８７０に記載されている。個々の形質変換体のｌｙｓＣ遺伝子座の染色体内配置を、Sambrook ら (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harborに記載のような標準的な方法を用いて、サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションによりチェックした。これにより、形質転換体が形質転換したプラスミドを相同組換えによりｌｙｓＣ遺伝子座に組み込んでいることを確かめた。そのようなコロニーを、抗生物質を含まない培地中で一晩増殖させた後、細胞をスクロースＣＭ寒天培地（１０ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌ牛肉抽出物、５ｇ／ｌ酵母抽出物、２．５ｇ／ｌＮａＣｌ、２ｇ／ｌ尿素、１％グルコース、１０％スクロース、ｐＨ６．８）上に播種し、３０℃にて２４時間インキュベートした。ベクターｐＣＩＳｌｙｓＣｔｈｒ３１１ｉｌｅ中に存在するｓａｃＢ遺伝子はスクロースを毒性産物に変換するため、増殖することができるコロニーは、野生型ｌｙｓＣ遺伝子と突然変異型ｌｙｓＣｔｈｒ３１１ｉｌｅ遺伝子との間の２回目の相同組換えにより、ｓａｃＢ遺伝子を欠失しているもののみである。相同組換えの際、ｓａｃＢ遺伝子と共に野生型遺伝子または突然変異型遺伝子のいずれかの欠失が見られる。野生型遺伝子と共にＳａｃＢ遺伝子が欠失すると、突然変異型形質転換体が得られる。

増殖したコロニーを回収し、カナマイシン感受性表現型について調べた。ＳａｃＢ遺伝子を欠失したクローンは、同時にカナマイシン感受性増殖性を示すはずである。そのようなカナマイシン感受性クローンを、振盪中のフラスコでそのリジン産生能について調べた（実施例６を参照のこと）。未処理のＣ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を比較のために培養した。対照と比較してリジン産生が増大しているクローンを選択し、染色体ＤＮＡを単離して、ｌｙｓＣ遺伝子に相当する領域をＰＣＲ反応により増幅し、シーケンスした。増大したリジン合成特性および示されたｌｙｓＣ中の９３２位での突然変異を有するクローンを、ＡＴＣＣ１３０３２ｌｙｓＣ^ｆｂｒと名付けた。

外来性発現ユニットＰｅｆｔｕ（配列番号２）を用いたｌｙｓＣ遺伝子の過剰発現のための組み込み用プラスミドの調製
伸長因子Ｔｕをコードする遺伝子のプロモーターの増幅のために、以下のオリゴヌクレオチドを決定した。
配列番号３０：
ＣＫ３５２：５’−ＣＧＣＣＡＡＴＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＧＡＡＴＧ−３’
配列番号３１：
ＣＫ３５３：５’−ＴＴＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＴＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’

該プライマーを、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応で用いた。このアプローチを用いて、約２００ｂｐの期待したサイズに相当するＤＮＡ断片を増幅することができた。

アスパルトキナーゼ（aspartokinase）をコードする遺伝子の増幅のために、以下のオリゴヌクレオチドを決定した。
配列番号３２：
ＣＫ３５４：５’−ＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＡ−３’
配列番号３３：
ＣＫ３５５：５’−ＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＴ−３’

該プライマーを、Ｃ．グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ｌｙｓＣ^ｆｂｒ由来の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応で用いた。このアプローチを用いて、約６２０ｂｐの期待したサイズに相当するＤＮＡ断片を増幅することができた。

プライマーＣＫ３５４とＣＫ３５３とは重複する配列を含み、その５’末端で互いに相同である。

上記のようにして得られたＰＣＲ産物を、プライマーＣＫ３５２とＣＫ３５５を用いる次のＰＣＲのための鋳型として用いた。

このアプローチを用いて、約８２０ｂｐの期待したサイズに相当するＤＮＡ断片を増幅することができた。このＰｅｆｔｕ／ｌｙｓＣ^ｆｂｒ融合体を、制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｍａＩを用いて切断した。

ｌｙｓＣ遺伝子の５’領域の増幅のために、以下のオリゴヌクレオチドを決定した。
配列番号３４：
ＣＫ３５６：５’−ＣＧＣＧＡＣＧＴＣＣＧＴＣＣＣＡＡＡＡＣＧＡＴＣＡＴＧＡＴ−３’
配列番号３５：
ＣＫ３５７：５’−ＣＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＴＴＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴ−３’

該プライマーを、Ｃ．グルタミカム由来の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応で用いた。このアプローチを用いて、約６００ｂｐの期待したサイズに相当するＤＮＡ断片を増幅することができた。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＡａｔＩＩおよびＭｕｎＩを用いて消化した。次に、この断片および消化済みＰｅｆｔｕ／ｌｙｓＣ^ｆｂｒ融合体をベクターｐＣＩＳ中にクローニングし、ここで該ベクターは、制限酵素ＡａｔＩＩおよびＳｍａＩを用いて予め消化しておいた。得られたプラスミドをｐＣＩＳＰｅｆｔｕｌｙｓＣ^ｆｂｒ（配列番号３６）と名付けた。このステップまで、すべてのクローニングは大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ（Stratagene, Amsterdam, Netherlandsより）中で行った。

続いて形質転換プラスミドｐＣＩＳＰｅｆｔｕｌｙｓＣ^ｆｂｒで、Liebl ら (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303により記載の通りにして、プラスミドｐＴｃ１５ＡｃｇｌＭと一緒に、大腸菌Ｍｎ５２２（Stratagene, Amsterdam, Netherlandsより）を形質転換した。プラスミドｐＴｃ１５ＡｃｇｌＭは、コリネバクテリウム・グルタミカムのメチル化パターンに従いＤＮＡをメチル化することを可能にする（ＤＥ１００４６８７０）。このステップにより、コリネバクテリウム・グルタミカムを次に組み込み用プラスミドｐＣＩＳＰｅｆｔｕｌｙｓＣ^ｆｂｒを用いてエレクトロポレーションすることが可能になる。このエレクトロポレーションおよびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を有するＣＭ平板培地上での引き続く選別により、複数のトランス接合体（transconjugant）を得た。２回目の組換えイベントについての選別（ｌｙｓＣプロモーターおよびｌｙｓＣ遺伝子を共に有するベクターの排除をもたらすはずである）のために、これらのトランス接合体を、カナマイシンを含まないＣＭ培地中で培養し、つぎに選別のために１０％スクロースを有するＣＭ平板上に播種した。ベクターｐＣＩＳ上に存在するｓａｃＢ遺伝子はレバンスクラーゼをコードし、スクロースを用いた増殖の際にレバンの合成をもたらす。レバンはＣ．グルタミカムにとっては有毒なので、スクロース含有培地上で増殖することができるＣ．グルタミカム細胞は、２回目の組換えステップを通じて組み込み用プラスミドを失ったもののみである（Jager ら, Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466）。１５０のスクロース耐性クローンについて、そのカナマイシン感受性を調べた。試験したクローンのうち５６について、スクロース耐性だけでなくカナマイシン感受性も示すことができた。Ｐｅｆｔｕプロモーターによる天然プロモーターの所望の置換も行われたかどうかチェックするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた。この解析のために当初の株および２０種類のクローンから染色体ＤＮＡを単離した。この目的で、各クローンを爪楊枝で寒天平板上から取り出し、１００μｌのＨ_２Ｏ中に懸濁し、９５℃にて１０分間加熱した。得られた溶液の一部である１０μｌをＰＣＲでの鋳型として用いた。用いたプライマーは、ＰｅｆｔｕプロモーターおよびｌｙｓＣ遺伝子と相同なオリゴヌクレオチドであった。ＰＣＲ条件は、以下のように選択した：前変性：９５℃にて５分間；変性：９５℃にて３０秒間；ハイブリダイゼーション：５５℃にて３０秒間；増幅：７２℃にて２分間；３０サイクル；最終伸長：７２℃にて５分間。当初の株のＤＮＡを有する混合物では、オリゴヌクレオチドの選択により、ＰＣＲ産物を得ることはできなかった。２回目の組換えがＰｅｆｔｕによる天然のプロモーター（ＰｌｙｓＣ）の置換をもたらしたクローンでのみ、期待した５５２ｂｐのサイズのバンド得られた。全体では、試験した２０クローンのうち３種類が陽性であった。

アスパルトキナーゼ（ｌｙｓＣ）アッセイ
天然のプロモーターを有するｌｙｓＣ^ｆｂｒ遺伝子の染色体コピーまたはＰｅｆｔｕｌｙｓＣ^ｆｂｒ構築物の染色体コピーのいずれかを保持するＣ．グルタミカム株をＣＭ培地（１０ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌ牛肉抽出物、５ｇ／ｌ酵母抽出物、２．５ｇ／ｌＮａＣｌ、２ｇ／ｌ尿素、１％グルコース、ｐＨ６．８）中で３０℃にて、ＯＤ_６００が８になるまで培養した。細胞を４℃にて遠沈し、続いて冷却Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（０．１％、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。再度の遠心後、細胞を冷却Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（０．１％、ｐＨ８．０）中に回収してＯＤ_６００を１６０に調整した。細胞を破壊するために、この細胞懸濁液１ｍｌをＨｙｂａｉｄ社製の２ｍｌＲｉｂｏｌｙｓｅｒ試験管に移して、Ｈｙｂａｉｄ社製Ｒｉｂｏｌｙｓｅｒ中で回転設定６．０として各回３０秒間にて３回溶解した。溶解液をエッペンドルフ遠心機中で１５，０００ｒｐｍ、４℃にて３０分間遠心することにより透明化し、上清を新しいエッペンドルフ容器に移した。タンパク質含有量をBradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254により記載の通りに測定した。

アスパルトキナーゼの酵素活性は以下のように測定した。１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、６００ｍＭヒドロキシルアミンＨＣｌ（１０ＮＫＯＨにてｐＨ７．０とした）、４ｍＭＡＴＰ、２００ｍＭアスパラギン酸（ナトリウム塩）および１ｍｌまでのＨ_２Ｏを含む１ｍｌの反応混合液を、３０℃にて１０分間インキュベートした。各タンパク質溶解液を添加することによりアッセイを開始し、３０℃にて３０分間インキュベートした。１ｍｌの停止溶液（１０％塩化鉄、３．３％トリクロロ酢酸、０．７ＮＮａＣｌ）を反応混合液に添加することにより反応を停止した。遠心ステップの後、上清のＯＤ_５４０を測定した。この場合の１単位は、タンパク質ｍｇ当たり、１分間に形成されたアスパラギン酸ヒドロキサメート１ｎｍｏｌに相当する。

結果を表２ａに示す。

ＰｅｆｔｕｌｙｓＣ^ｆｂｒ構築物の染色体への組み込みにより、アスパルトキナーゼ活性を２．５倍増大させることができた。

リジン産生
リジン産生に対するＰｅｆｔｕｌｙｓＣ^ｆｂｒ構築物の影響を調べるために、ＡＴＣＣ１３０３２株、ＡＴＣＣ１３０３２ｌｙｓＣ^ｆｂｒ株またはＡＴＣＣ１３０３２ＰｅｆｔｕｌｙｓＣ^ｆｂｒ株をＣＭ平板培地（１０．０ｇ／ｌＤ−グルコース、２．５ｇ／ｌＮａＣｌ、２．０ｇ／ｌ尿素、１０．０ｇ／ｌ Bacto Peptone（Difco）、５．０ｇ／ｌ酵母抽出物（Difco）、５．０ｇ／ｌ牛肉抽出物（Difco）、２２．０ｇ／ｌ寒天（Difco）、オートクレーブ（２０分、１２１℃））上で３０℃にて２日間培養した。次に細胞を平板培地からかき取り、生理食塩液中に再懸濁した。主培養のため、１００ｍｌアーレンマイヤーフラスコ中の培地Ｉ１０ｍｌおよびオートクレーブ済みＣａＣＯ_３（Riedel de Haen）０．５ｇに、細胞懸濁液を接種してＯＤ_６００を１．５とし、ＩｎｆｏｒｓＡＪ１１８型の振盪器（Infors, Bottmingen, Switzerlandより）上で２２０ｒｐｍにて３９時間インキュベートした。続いて培地中に分泌されたリジン濃度を測定した。

培地Ｉ：
４０ｇ／ｌスクロース
６０ｇ／ｌ糖蜜（糖含有率１００％として換算）
１０ｇ／ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４
０．４ｇ／ｌＭｇＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ
０．６ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４
０．３ｍｇ／ｌチアミン^＊ＨＣｌ
１ｍｇ／ｌビオチン（１ｍｇ／ｍｌストック溶液（フィルター滅菌およびＮＨ_４ＯＨでｐＨ８．０に調整済み）より）
２ｍｇ／ｌＦｅＳＯ_４
２ｍｇ／ｌＭｎＳＯ_４
ＮＨ_４ＯＨでｐＨ７．８に調整、オートクレーブ（１２１℃、２０分）
さらに、ビタミンＢ_１２（ヒドロキシコバラミン、Sigma Chemicals）（ストック溶液（２００μｇ／ｍｌ、フィルター滅菌）から）を終濃度１００μｇ／ｌになるまで加える。

アミノ酸濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＬＣシステムＨＰＬＣでのＡｇｉｌｅｎｔ高圧液体クロマトグラフィーにより測定した。オルトフタルアルデヒドでのプレカラム誘導体化により形成されたアミノ酸の定量を可能とし、そしてアミノ酸混合物をＨｙｐｅｒｓｉｌＡＡカラム（Agilent）にて分離する。

調査の結果を表３ａに示す。

Claims

プロモーター活性を有する核酸の使用であって、該核酸が、
Ａ）配列番号１の核酸配列、または
Ｂ）ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号１の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｃ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｄ）Ａ）、Ｂ）もしくはＣ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなる、遺伝子の転写のための、上記使用。
請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸と、さらに機能的に連結された、リボ核酸の翻訳を保証する核酸配列を含んでなる発現ユニットの、遺伝子の発現のための使用。
前記発現ユニットが、
Ｅ）配列番号２の核酸配列、または
Ｆ）ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号２の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｇ）ストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｈ）Ｅ）、Ｆ）もしくはＧ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなる、請求項２に記載の使用。
前記発現ユニットが配列番号２の配列の核酸からなる、請求項３に記載の使用。
プロモーター活性を有する核酸であって、
Ａ）配列番号１の核酸配列、または
Ｂ）ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号１の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｃ）ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｄ）Ａ）、Ｂ）もしくはＣ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなり、但し配列番号１の配列からなる核酸は除く、上記核酸。
請求項５に記載のプロモーター活性を有する核酸と、さらに機能的に連結された、リボ核酸の翻訳を保証する核酸配列を含んでなる、発現ユニット。
請求項６に記載の発現ユニットであって、
Ｅ）配列番号２の核酸配列、または
Ｆ）ヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により該配列から誘導され、かつ配列番号２の配列と核酸レベルで少なくとも９０％の同一性を有する配列、または
Ｇ）ストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列、または
Ｈ）Ｅ）、Ｆ）もしくはＧ）の配列と機能的に等価なフラグメント
を含んでなり、但し配列番号２の配列からなる核酸は除く、上記発現ユニット。
微生物での遺伝子の転写速度を、野生型と比較して変化させるかまたは生起する方法であって、
ａ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸であって、内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性を野生型と比較して変化させるステップ、または
ｂ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、該微生物での遺伝子の転写を調節するステップ、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である
による、上記方法。
請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、または実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、前記微生物での遺伝子の転写の調節が、
ｂ１）変化したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ２）微生物のゲノムに１以上の遺伝子を導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ３）変化したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項８に記載の方法。
微生物での遺伝子の転写速度を、野生型と比較して増大させるかまたは生起するために、
ａｈ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸、または内在性遺伝子の転写を調節する内在性核酸の、該微生物でのプロモーター比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｂｈ）該微生物での遺伝子の転写が、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態ａ）に従い増大したプロモーター比活性を有する核酸により調節されており、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である、
請求項８または９に記載の方法。
請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、または実施形態ａ）に従い増大したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、前記微生物での遺伝子の転写の調節が、
ｂｈ１）増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ３）増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項１０に記載の方法。
微生物での遺伝子の転写速度を、野生型と比較して低下させるために、
ａｒ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸であって、内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター非活性が、野生型と比較して低下している、または
ｂｒ）実施形態ａ）に従い低下したプロモーター比活性を有する核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、低下したプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、内在性遺伝子の転写が行われるようになっている、
請求項８または９に記載の方法。
微生物での遺伝子の発現速度を、野生型と比較して変化させるかまたは生起する方法であって、
ｃ）請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性を野生型と比較して変化させるステップ、または
ｄ）該微生物での遺伝子の発現を、請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、または実施形態ｃ）に従い変化した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより調節するステップ、ここで該遺伝子は、該発現ユニットとの関係では異種起源である
による、上記方法。
請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、または実施形態ａ）に従い変化した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、該微生物での遺伝子の発現の調節が、
ｄ１）変化した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ３）変化した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項１３に記載の方法。
微生物での遺伝子の発現速度を、野生型と比較して増大させるかまたは生起するために、
ｃｈ）請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの該微生物での発現比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｄｈ）請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現が調節されており、ここで、該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である、
請求項１３または１４に記載の方法。
請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる該微生物での遺伝子の発現の調節が、
ｄｈ１）増大した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現活性を適宜伴う導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｄｈ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ３）増大した発現活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項１５に記載の方法。
微生物での遺伝子の発現速度を、野生型と比較して低下させるために、
ｃｒ）請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの該微生物での発現比活性が、野生型と比較して低下している、または
ｄｒ）実施形態ｃｒ）に従い低下した発現比活性を伴う発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、低下した発現活性を伴う導入された該発現ユニットの制御下に、内在性遺伝子の発現が行われるようになっている、
請求項１３または１４に記載の方法。
前記遺伝子が、タンパク質生成およびタンパク質非生成アミノ酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ビタミン類の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸および酵素の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸からなる群より選択され、ここで該遺伝子はさらなる調節エレメントを含んでいてもよい、請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法。
アミノ酸の生合成経路中のタンパク質が、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子ＬｕｘＲ、転写調節因子ＬｙｓＲ１、転写調節因子ＬｙｓＲ２、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンエクスポーター・キャリア、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リジンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼＩ、システインシンターゼＩＩ、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ、硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット１および２、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＲＸＡ００６５５調節因子、ＲＸＮ２９１０調節因子、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７、タンパク質ＯｐｃＡ、１−ホスホフルクトキナーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
ａ）請求項２または３に記載の少なくとも１つの発現ユニットおよび
ｂ）少なくとも１つの発現対象のさらなる核酸、および
ｃ）適宜、さらなる遺伝的制御エレメント
を含んでなる発現カセットであって、少なくとも１つの発現ユニットと発現対象のさらなる核酸配列とは互いに機能的に連結され、また発現対象のさらなる核酸配列は、該発現ユニットとの関係では異種起源である、上記発現カセット。
前記発現対象のさらなる核酸が、タンパク質生成およびタンパク質非生成アミノ酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ビタミン類の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸および酵素の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、請求項２０に記載の発現カセット。
アミノ酸の生合成経路中のタンパク質が、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子ＬｕｘＲ、転写調節因子ＬｙｓＲ１、転写調節因子ＬｙｓＲ２、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンエクスポーター・キャリア、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リジンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼＩ、システインシンターゼＩＩ、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性、硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット１および２、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＲＸＡ００６５５調節因子、ＲＸＮ２９１０調節因子、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７、タンパク質ＯｐｃＡ、１−ホスホフルクトキナーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載の発現カセット。
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の発現カセットを含んでなる、発現ベクター。
遺伝的に改変された微生物であって、遺伝的改変が、少なくとも１種の遺伝子の発現速度が野生型と比較して変化しまたは生じることにつながり、かつ
ａ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する少なくとも１つの内在性核酸であって、すくなくとも１種の内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性を変化させるステップ、または
ｂ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、該微生物での遺伝子の転写を調節するステップ、ここで、該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である
によるものである、上記微生物。
請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、または実施形態ａ）に従い変化したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、前記微生物での遺伝子の転写の調節が、
ｂ１）変化したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化したプロモーター比活性を適宜伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂ３）変化したプロモーター比活性を適宜伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項２４に記載の遺伝的に改変された微生物。
少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して増大したか生起された転写速度を有する、請求項２４もしくは２５に記載の遺伝的に改変された微生物であって、
ａｈ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸であって、内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｂｈ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態ａｈ）に従い増大したプロモーター比活性を有する核酸により、該微生物での遺伝子の転写が調節されており、ここで該遺伝子はプロモーター活性を有する該核酸との関係では異種起源である、
上記微生物。
請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、または実施形態ａ）に従い増大したプロモーター比活性を伴う請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸による、該微生物での遺伝子の転写の調節が、
ｂｈ１）増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、プロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、１以上の内在性遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する内在性核酸の制御下に、１以上の導入された該遺伝子の転写が行われるようになるステップ、または
ｂｈ３）増大したプロモーター比活性を適宜伴う、請求項１に記載のプロモーター活性を有する核酸と、機能的に連結された１以上の転写対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項２６に記載の遺伝的に改変された微生物。
少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して低下した転写速度を有する、請求項２４もしくは２５に記載の遺伝的に改変された微生物であって、
ａｒ）請求項１に記載のプロモーター活性を有する少なくとも１つの内在性核酸であって、少なくとも１種の内在性遺伝子の転写を調節する核酸の、該微生物でのプロモーター比活性が、野生型と比較して低下している、または
ｂｒ）実施形態ａ）に従い低下したプロモーター比活性を有する１以上の核酸を該微生物のゲノムに導入することにより、低下したプロモーター活性を有する導入された該核酸の制御下に、少なくとも１種の内在性遺伝子の転写が行われるようになっている、
上記微生物。
遺伝的に改変された微生物であって、遺伝的改変が、少なくとも１種の遺伝子の発現速度が野生型と比較して変化しまたは生起されることにつながり、かつ
ｃ）請求項２もしくは３に記載の少なくとも１つの内在性発現ユニットであって、少なくとも１種の内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性を、野生型と比較して変化させるステップ、または
ｄ）請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い変化した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現を調節するステップ、ここで、該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である
によるものである、上記微生物。
請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、または実施形態ａ）に従い変化した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、該微生物での遺伝子の発現の調節が、
ｄ１）変化した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、変化した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄ３）変化した発現比活性を適宜伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項２９に記載の遺伝的に改変された微生物。
少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して増大したか生起された転写速度を有する、請求項２９もしくは３０に記載の遺伝的に改変された微生物であって、
ｃｈ）請求項２もしくは３に記載の少なくとも１つの内在性発現ユニットであって、内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性が、野生型と比較して増大している、または
ｄｈ）請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットにより、該微生物での遺伝子の発現が調節されており、ここで該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である、
上記微生物。
請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、または実施形態ａ）に従い増大した発現比活性を伴う請求項２もしくは３に記載の発現ユニットによる、該微生物での遺伝子の発現の調節が、
ｄｈ１）増大した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の導入された該発現ユニットの制御下に、１以上の内在性遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ２）１以上の遺伝子を該微生物のゲノムに導入することにより、増大した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の内在性発現ユニットの制御下に、１以上の導入された該遺伝子の発現が行われるようになるステップ、または
ｄｈ３）増大した発現比活性を適宜伴う、請求項２もしくは３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された１以上の発現対象の核酸とを含んでなる１以上の核酸構築物を、該微生物に導入するステップ
により達成される、請求項３１に記載の遺伝的に改変された微生物。
少なくとも１種の遺伝子について野生型と比較して低下した発現速度を有する、請求項２９もしくは３０に記載の遺伝的に改変された微生物であって、
ｃｒ）請求項２もしくは３に記載の少なくとも１つの内在性発現ユニットであって、少なくとも１種の内在性遺伝子の発現を調節する発現ユニットの、該微生物での発現比活性が、野生型と比較して低下している、または
ｄｒ）低下した発現活性を伴う請求項２もしくは３に記載の１以上の発現ユニットを該微生物のゲノムに導入することにより、低下した発現活性を伴う請求項２もしくは３に記載の導入された該発現ユニットの制御下に、少なくとも１種の遺伝子の発現が行われるようになっている、
上記微生物。
請求項２または３に記載の発現ユニットと、機能的に連結された発現対象の遺伝子とを含んでなる遺伝的に改変された微生物であって、該遺伝子は該発現ユニットとの関係では異種起源である、上記微生物。
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の発現カセットを含んでなる、請求項３４に記載の遺伝的に改変された微生物。
前記遺伝子が、タンパク質生成およびタンパク質非生成アミノ酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、ビタミン類の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸および酵素の生合成経路中のタンパク質をコードする核酸からなる群より選択され、該遺伝子はさらなる制御エレメントを含んでいてもよい、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物。
アミノ酸の生合成経路中のタンパク質が、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写調節因子ＬｕｘＲ、転写調節因子ＬｙｓＲ１、転写調節因子ＬｙｓＲ２、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγ−シンターゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンエクスポーター・キャリア、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リジンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼＩ、システインシンターゼＩＩ、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ、硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット１および２、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ、フェレドキシンＮＡＤＰレダクターゼ、３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＲＸＡ００６５５調節因子、ＲＸＮ２９１０調節因子、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン排出タンパク質、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７、タンパク質ＯｐｃＡ、１−ホスホフルクトキナーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼからなる群より選択される、請求項３６に記載の遺伝的に改変された微生物。
請求項２４〜３７のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物を培養することにより、生合成産物を調製する方法。
請求項２４、２５、３１または３２のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物を培養することによりリジンを調製する方法であって、前記遺伝子が、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、転写調節因子ＬｕｘＲをコードする核酸、転写調節因子ＬｙｓＲ１をコードする核酸、転写調節因子ＬｙｓＲ２をコードする核酸、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼをコードする核酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、リジンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼをコードする核酸、タンパク質ＯｐｃＡをコードする核酸、１−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸および６−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸からなる群より選択される、上記方法。
前記遺伝的に改変された微生物が、アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ活性、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、転写調節因子ＬｕｘＲ活性、転写調節因子ＬｙｓＲ１活性、転写調節因子ＬｙｓＲ２活性、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ活性、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、トランスアルドラーゼ活性、リジンエクスポーター活性、アルギニル−ｔＲＮＡ合成酵素活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ活性、タンパク質ＯｐｃＡ活性、１−ホスホフルクトキナーゼ活性、６−ホスホフルクトキナーゼ活性およびビオチンリガーゼ活性からなる群より選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して増大した活性をさらに有する、請求項３９に記載の方法。
前記遺伝的に改変された微生物が、トレオニンデヒドラターゼ活性、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ホモセリンキナーゼ活性、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性、トレオニンエクスポーター活性、トレオニン排出タンパク質活性、アスパラギナーゼ活性、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性およびトレオニンシンターゼ活性からなる群より選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して低下した活性をさらに有する、請求項３９または４０に記載の方法。
請求項２４、２５、３１または３２のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物を培養することによりメチオニンを調製する方法であって、前記遺伝子が、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、シスタチオニンγ−シンターゼをコードする核酸、シスタチオニンβ−リアーゼをコードする核酸、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする核酸、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼをコードする核酸、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする核酸、ホスホセリンホスファターゼをコードする核酸、セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、システインシンターゼＩをコードする核酸、システインシンターゼＩＩをコードする核酸、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼをコードする核酸、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼをコードする核酸、硫酸アデニリルトランスフェラーゼをコードする核酸、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼをコードする核酸、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼをコードする核酸、フェレドキシンＮＡＤＰＨレダクターゼをコードする核酸、フェレドキシン活性をコードする核酸、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７をコードする核酸、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８をコードする核酸、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７をコードする核酸、ＲＸＡ０６５５調節因子をコードする核酸およびＲＸＮ２９１０調節因子をコードする核酸からなる群より選択される、上記方法。
前記遺伝的に改変された微生物が、アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性、シスタチオニンγ−シンターゼ活性、シスタチオニンβ−リアーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ活性、ホスホセリンホスファターゼ活性、セリンアセチルトランスフェラーゼ活性、システインシンターゼＩ活性、システインシンターゼＩＩ活性、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ活性、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ活性、ホスホアデノシン−ホスホ硫酸レダクターゼ活性、フェレドキシン−亜硫酸レダクターゼ活性、フェレドキシンＮＡＤＰＨレダクターゼ活性、フェレドキシン活性、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ０７７活性、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４８活性、硫酸還元タンパク質ＲＸＡ２４７活性、ＲＸＡ６５５調節因子活性およびＲＸＮ２９１０調節因子活性からなる群より選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して増大した活性をさらに有する、請求項４２に記載の方法。
前記遺伝的に改変された微生物が、ホモセリンキナーゼ活性、トレオニンデヒドラターゼ活性、トレオニンシンターゼ活性、メソ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性およびジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼ活性からなる群より選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して低下した活性をさらに有する、請求項４２または４３に記載の方法。
請求項２４、２５、３１または３２のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物を培養することによりトレオニンを調製する方法であって、前記遺伝子が、アスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリンキナーゼをコードする核酸、トレオニンシンターゼをコードする核酸、トレオニンエクスポーター・キャリアをコードする核酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼをコードする核酸、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、リジンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トレオニン排出タンパク質をコードする核酸、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼをコードする核酸、タンパク質ＯｐｃＡをコードする核酸、１−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、６−ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸およびホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸からなる群より選択される、上記方法。
前記遺伝的に改変された微生物が、アスパラギン酸キナーゼ活性、アスパラギン酸−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ活性、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トリオースリン酸イソメラーゼ活性、トレオニンシンターゼ活性、トレオニンエクスポート・キャリア活性、トランスアルドラーゼ活性、トランスケトラーゼ活性、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性、リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼ活性、ホモセリンキナーゼ活性、ビオチンリガーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性、トレオニン排出タンパク質活性、タンパク質ＯｐｃＡ活性、１−ホスホフルクトキナーゼ活性、６−ホスホフルクトキナーゼ活性、フルクトース−１−６−ビスホスファターゼ活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性およびホモセリンデヒドロゲナーゼ活性からなる群より選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して増大した活性をさらに有する、請求項４５に記載の方法。
前記遺伝的に改変された微生物が、トレオニンデヒドラターゼ活性、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ活性、メソ−ジアミノピメリン酸Ｄ−デヒドロゲナーゼ活性、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、ピルビン酸オキシダーゼ活性、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ活性、アスパラギナーゼ活性、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性、リジンエクスポーター活性、アセト乳酸シンターゼ活性、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性、分岐鎖アミノトランスフェラーゼ活性、補酵素Ｂ１２依存性メチオニンシンターゼ活性、補酵素Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼ活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性およびジアミノピコリン酸デカルボキシラーゼ活性からなる群より選択される活性のうち少なくとも１つについて、野生型と比較して低下した活性をさらに有する、請求項４５または４６に記載の方法。
培養ステップの後および／またはその間に、培養培地から生合成産物を単離し、かつ適宜精製する、請求項３８〜４７のいずれか１項に記載の方法。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌で遺伝子を発現可能にする発現ユニット中のリボソーム結合サイトとしての、配列番号４２の核酸配列の使用。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌で遺伝子を発現可能にする発現ユニット中の−１０領域としての、配列番号３９、４０または４１の核酸配列の使用。
配列番号４２の核酸配列を含んでなる、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌で遺伝子を発現可能にする発現ユニット。
配列番号４２の核酸配列をリボソーム結合サイトとして用いる、請求項５１に記載の発現ユニット。
配列番号３９、４０または４１の核酸配列のうち少なくとも１つを含んでなる、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌で遺伝子を発現可能にする発現ユニット。
配列番号３９、４０または４１の核酸配列のうちの１つを−１０領域として用いる、請求項５３に記載の発現ユニット。