JP2002191370A

JP2002191370A - 新規ポリヌクレオチド

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Publication number: JP2002191370A
Application number: JP2000405096A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakagawa; 智中川; Hiroshi Mizoguchi; 寛溝口; Kiyoko Ando; 聖子安藤; Mikiaki Hayashi; 幹朗林; Keiko Ochiai; 恵子落合; Haruhiko Yokoi; 治彦横井; Naoko Tateishi; 直子立石; Teruhiro Senoo; 彰宏妹尾; Masato Ikeda; 正人池田; Akio Ozaki; 明夫尾崎
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2002-07-09
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: EP2107128B1; KR100961398B1; ATE441724T1; EP1108790A2; EP1108790B1; US7332310B2; EP1108790A8; KR20090077738A; KR20010082585A; EP1108790A3; KR100970106B1; US20020197605A1; EP2107128A3; EP2107128A2; US20060228712A1; DE60042872D1; JP4623825B2

Abstract

(57)【要約】【課題】産業上有用なコリネ型細菌由来のポリヌクレ
オチドおよびポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの配列情報、該微生物の解析方法、該解析
に用いる装置およびシステム、および該微生物の育種
法。【解決手段】コリネ型細菌に属する微生物由来のポリ
ヌクレオチドおよびその断片、該ポリヌクレオチドおよ
びその断片よりコードされるポリペプチド、該ポリヌク
レオチドおよびその断片を含むポリヌクレオチドアレ
イ、該ポリヌクレオチドおよびその断片の塩基配列を記
録したコンピュータで読みとり可能な記録媒体およびそ
れらの使用、ならびに該ポリヌクレオチドおよび／また
はペプチド配列情報を用いた比較方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はコリネ型細菌（cory
neform bacteria）に属する微生物由来のポリヌクレオ
チドおよびその断片、該ポリヌクレオチドおよびその断
片よりコードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチド
およびその断片を含むポリヌクレオチドアレイ、該ポリ
ヌクレオチドおよびその断片の塩基配列を記録したコン
ピュータで読みとり可能な記録媒体およびそれらの使
用、ならびに該ポリヌクレオチドおよび／またはペプチ
ド配列情報を用いた比較方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】コリネ型細菌はアミノ酸、核酸、ビタミ
ン、糖（例えばリブロース）、有機酸（例えばピルビン
酸）、および上記物質の類縁体（例えばＮ−アセチルア
ミノ酸）等の様々な有用物質の生産に利用され産業上非
常に有用な微生物であり、多数の変異株が知られてい
る。例えば、Corynebacterium glutamicumはグルタミン
酸生産菌として同定されたグラム陽性バクテリアであ
り、その変異株により多くのアミノ酸が生産されてい
る。例えば、旨味調味料として有用なＬ−グルタミン酸
は全世界で年間100万トン、家畜飼料の添加物等に重要
なＬ−リジンは年間25万トン、それ以外にもＬ−アルギ
ニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−トリプトフ
ァン等のアミノ酸がこの菌により各々年間数百トン以上
のスケールで生産されている（日経バイオ年鑑９９、日
経ＢＰ社製、１９９８）。

【０００３】Corynebacterium glutamicumによるアミノ
酸生産は、おもに代謝径路およびその調節機構が変化し
た変異株（代謝変異株）により行われている。一般に生
物は、必要量以上のアミノ酸を作らないように、さまざ
まな代謝調節機構を有している。例えば、Ｌ−リジンの
生合成において、Corynebacterium属に属する微生物で
は、リジンおよびスレオニン、メチオニンの共通生合成
酵素アスパルトキナーゼに対するリジンとスレオニンに
よる協奏的な活性阻害により、過剰生産が起こらないよ
うに調節されている〔J. Biochem., 65, 849-859 (196
9) 〕。またアルギニンについては、その生合成酵素遺
伝子の発現量がアルギニンにより抑制され、過剰生産が
起こらないように調節されている〔Microbiology, 142,
99-108 (1996)〕。アミノ酸生産変異株では、このよう
な代謝調節機構が解除されていると考えられている。核
酸、ビタミン、糖、有機酸、および上記物質の類縁体等
の生産変異株についても同様に代謝制御の解除により目
的産物の生産性を向上させている。

【０００４】しかしながら、大腸菌や枯草菌等と比べ
て、コリネ型細菌に関しては、基本的な遺伝学的、生化
学的、分子生物学的な知識の集積が十分とは言えず、ア
ミノ酸生産変異株における変異遺伝子についても、ごく
わずかな知見しかない。このように、これら微生物にお
いては未だ知られていないさまざまな生育、および代謝
調節機構が存在している。Corynebacterium glutamicum
ATCC13032株に関しては、染色体の物理地図が作成さ
れ、ゲノムサイズが約3,100キロベースであることが報
告されている〔Mol.Gen. Genet., 252, 255-265 (199
6)〕。通常のバクテリアの遺伝子密度から算定すると、
この約3,100キロベースのゲノム中には約3,000の遺伝子
が存在すると予想されが、Corynebacterium glutamicum
では、アミノ酸生合成遺伝子を中心として百程度の遺伝
子しか知られておらず、大部分の遺伝子について塩基配
列は未だ解明されていない。

【０００５】近年、いくつかの微生物、例えば大腸菌、
結核菌、酵母等についてそのゲノムの全塩基配列決定が
報告されている〔Science, 277, 1453-62 (1997)、Natur
e, 393, 537-544 (1998)、Nature, 387, 5-105 (199
7)〕。決定された全塩基配列に基づき、遺伝子領域の推
定、公知の遺伝子との塩基配列と比較が行われており、
遺伝学的、生化学的、分子生物学的な実験をすることな
く、膨大な数の遺伝子の機能の推定がなされている。ま
た近年、遺伝子あるいは遺伝子領域以外のゲノム領域の
部分核酸断片を固体支持体に固着したＤＮＡチップある
いはＤＮＡアレイ等を用い、膨大な数の遺伝子について
発現状況を同時に見たり、変異を検出する技術が開発さ
れ、酵母、結核菌、およびＢＣＧワクチンに用いられる
Mycobacterium bovis等の微生物の解析に成果を上げて
いる〔Science, 278, 680-686 (1997)、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 96, 12833-38 (1999)、Science, 284, 152
0-23 (1999)〕。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、産業
上有用なコリネ型細菌由来のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
配列情報、該微生物の解析方法、該解析に用いる装置お
よびシステム、および該微生物の育種法を提供すること
にある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Coryneba
cterium glutamicum由来の全塩基配列を決定することに
より、未だ同定されていない遺伝子領域の特定、公知遺
伝子の塩基配列および公知遺伝子に由来するアミノ酸配
列との比較による該微生物由来の未知遺伝子の機能推
定、該微生物による有用生産物の代謝調節機構の推定に
よる有用な生産変異株の取得が可能と考え、鋭意研究を
重ねた結果、全ゲノムショットガン法を適用することに
よりCorynebacterium glutamicumのゲノムの全ての塩基
配列を決定することができることを見出し、本発明を完
成するに至った。

【０００８】本発明は、コリネ型細菌由来のポリヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチド、該ポリヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチドを固着したオリゴヌクレオチ
ドアレイ、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチ
ド、該ポリペプチドを認識する抗体、該ポリペプチドま
たは該抗体を固着したポリペプチドアレイ、該ポリヌク
レオチドおよびオリゴヌクレオチドの塩基配列並びに該
ポリペプチドのアミノ酸配列を記録したコンピュータで
読みとり可能な記録媒体および該記録媒体を用いるコン
ピュータを用いたシステム、ならびに該ポリヌクレオチ
ドおよび／またはポリペプチド配列情報を用いた比較方
法を提供するものである。

【０００９】本発明は、以下の（１）〜（６８）に関す
る。（１）［１］コリネ型細菌の変異株由来の遺伝子の変
異点の同定、［２］コリネ型細菌由来の遺伝子の発現量
を測定、［３］コリネ型細菌由来の遺伝子の発現プロフ
ァイルの解析、［４］コリネ型細菌由来の遺伝子の発現
パターンを分析、または［５］被検遺伝子と相同な遺伝
子をコリネ型細菌で検索するための、下記（ａ）〜
（ｄ）の工程を有する方法；（ａ）配列番号1〜3501のいずれかに示される塩基配列
からなる第１のポリヌクレオチド類、該ポリヌクレオチ
ドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第
２のポリヌクレオチド類、または第１または第２のポリ
ヌクレオチド類の連続する少なくとも10〜200塩基配列
からなる第３のポリヌクレオチド類からなる群から選ば
れる2種類以上のポリヌクレオチドを固体支持体に固着
し、ポリヌクレオチドアレイを作製する工程、（ｂ）該
ポリヌクレオチドアレイに固着されたポリヌクレオチド
と、コリネ型細菌由来の標識化ポリヌクレオチド、コリ
ネ型細菌の変異株由来の標識化ポリヌクレオチドまたは
被検標識化ポリヌクレオチドの少なくとも一つとをハイ
ブリダイズ条件下でインキュベートする工程、（ｃ）ハ
イブリダイゼーションを検出する検出工程、および
（ｄ）ハイブリダイゼーション結果を解析する解析工
程。ここで、２種類以上のポリヌクレオチドは、例え
ば、第１のポリヌクレオチド類から選ばれる２種類以
上、第２のポリヌクレオチド類から選ばれる２種類以
上、第３のポリヌクレオチド類から選ばれる２種類以
上、第１、第２および第３のポリヌクレオチド類を組合
わせて選ばれる２種類以上のいずれでもよい。（２）コリネ型細菌が、Corynebacterium属、Breviba
cterium属、またはMicrobacterium属に属する微生物で
ある、上記（１）記載の方法。

【００１０】（３） Corynebacterium属に属する微生
物がCorynebacterium glutamicum、Corynebacterium ac
etoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、C
orynebacterium callunae、Corynebacterium herculi
s、Corynebacterium lilium、Corynebacterium melasse
cola、Corynebacterium thermoaminogenes、およびCory
nebacterium ammoniagenesから選ばれる微生物である、
上記（２）記載の方法。（４）コリネ型細菌由来の該ポリヌクレオチド、コリ
ネ型細菌の変異株由来の該ポリヌクレオチドまたは該被
検ポリヌクレオチドが、アミノ酸、核酸、ビタミン、
糖、有機酸、およびそれらの類縁体から選ばれる少なく
とも一種の生合成に関わる遺伝子である上記（１）記載
の方法。（５）該被検ポリヌクレオチドがEscherichia coli由
来である、上記（１）記載の方法。（６）配列番号1〜3501のいずれかに示される塩基配
列からなる第１のポリヌクレオチド類、該第１のポリヌ
クレオチド類とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする第２のポリヌクレオチド類、または第１または
第２のポリヌクレオチド類の連続する少なくとも10〜20
0塩基配列からなる第３のポリヌクレオチド類からなる
群の中から選ばれる２種類以上のポリヌクレオチドを、
固体支持体に固着したポリヌクレオチドアレイ。ここ
で、２種類以上のポリヌクレオチドは、例えば、第１の
ポリヌクレオチド類から選ばれる２種類以上、第２のポ
リヌクレオチド類から選ばれる２種類以上、第３のポリ
ヌクレオチド類から選ばれる２種類以上、第１、第２お
よび第３のポリヌクレオチド類を組合わせて選ばれる２
種類以上のいずれでもよい。（７）配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌ
クレオチドまたは該ポリヌクレオチドと80％以上の相同
性を有するポリヌクレオチド。

【００１１】（８）配列番号2〜3431のいずれかに示
される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリ
ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするポリヌクレオチド。（９）配列番号3502〜6931のいずれかに示されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドまたは該ポリヌクレチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。（１０）配列番号1に示される塩基配列を有するポリ
ヌクレオチドにおいて、配列番号2〜3431から選ばれる
塩基配列を有するポリヌクレオチドの５’上流または
３’下流に位置し、該ポリヌクレオチドの発現を調節す
る活性を有するポリヌクレオチド。（１１）上記（７）〜（１０）のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドが有する塩基配列中の連続する少な
くとも10〜200塩基からなる配列を有するポリヌクレオ
チドまたは該ポリヌクレオチドと相補的な配列を有する
ポリヌクレオチド。（１２）上記（８）〜（１１）のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドを含む組換え体ＤＮＡ。（１３）上記（８）〜（１１）のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドまたは上記（１２）記載の組換え体
ＤＮＡを含む形質転換体。（１４）上記（１３）記載の形質転換体を培地に培養
し、培養物中に上記（８）または（９）に記載のポリヌ
クレオチドにコードされるポリペプチドを生成蓄積さ
せ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴
とする該ポリペプチドの製造方法。

【００１２】（１５）上記（１３）記載の形質転換体
を培地に培養し、培養物中にアミノ酸、核酸、ビタミ
ン、糖、有機酸、およびそれらの類縁体から選ばれる少
なくとも一種を生成蓄積させ、該培養物からアミノ酸、
核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁体か
ら選ばれる少なくとも一種を採取することを特徴とする
アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそれら
の類縁体から選ばれる少なくとも一種の製造法。（１６）配列番号2〜3431から選ばれる塩基配列を有
するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド。（１７）配列番号3502〜6931から選ばれるアミノ酸配
列を有するポリペプチド。（１８）上記（１６）または（１７）記載のポリペプ
チドのアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠
失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加
されていない該ポリペプチドの有する活性と実質的に同
一の活性を有するポリペプチド。（１９）上記（１６）または（１７）記載のポリペプ
チドのアミノ酸配列と60％以上の相同性を有するアミノ
酸配列を含み、かつ該ポリペプチドの有する活性と実質
的に同一の活性を有するポリペプチド。

【００１３】（２０）上記（１６）〜（１９）のいず
れか1項に記載のポリペプチドを認識する抗体。（２１）上記（１６）〜（１９）に記載のポリペプチ
ドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドから選
ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペプチドを１種
類以上、個体支持体に固着したポリペプチドアレイ。（２２）上記（１６）〜（１９）に記載のポリペプチ
ドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドから選
ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペプチドを認識
する抗体を１種類以上、個体支持体に固着したポリペプ
チドアレイ。

【００１４】（２３）コリネ型細菌由来の標的配列ま
たは標的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(i
v)の手段を備えることを特徴とするコンピュータを用い
たシステム； (i)配列番号1〜3501から選ばれる1以上の塩基配列情
報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
するための入力手段、(ii)入力された情報を少なくとも
一時的に記録するためのデータ記録手段、(iii)該デー
タ記録手段により記録された、配列番号1〜3501から選
ばれる１以上の塩基配列情報と標的配列または標的構造
モチーフ情報とを比較し、標的配列または標的構造モチ
ーフ情報と一致または類似する塩基配列情報を検索また
は解析するコンパレータ手段、および(iv)該コンパレー
タ手段により得られた検索または解析結果を表示するた
めの出力手段。（２４）コリネ型細菌由来の標的配列または標的構造
モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の工程を含
むことを特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号1〜3501から選ばれる1以上の塩基配列情
報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
する工程、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に記
録する工程、(iii)配列番号1〜3501から選ばれる１以上
の塩基配列情報と標的配列または標的構造モチーフ情報
とを比較する工程、および(iv)標的配列または標的構造
モチーフ情報と一致または類似する塩基配列情報を検索
または解析する工程。

【００１５】（２５）コリネ型細菌由来の標的配列ま
たは標的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(i
v)の手段を備えることを特徴とするコンピュータを用い
たシステム； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
を入力するための入力手段、(ii)入力された情報を少な
くとも一時的に記録するためのデータ記録手段、(iii)
該データ記録手段により記録された、配列番号3502〜70
01から選ばれる１以上のアミノ酸配列情報と標的配列ま
たは標的構造モチーフ情報とを比較し、標的配列または
標的構造モチーフ情報と一致または類似するアミノ酸配
列情報を検索または解析するコンパレータ手段、および
(iv)該コンパレータ手段により得られた検索または解析
結果を表示するための出力手段。

【００１６】（２６）コリネ型細菌由来の標的配列ま
たは標的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(i
v)の工程を含有することを特徴とするコンピュータを用
いた方法； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
を入力するための入力する工程、(ii)入力された情報を
少なくとも一時的に記録する工程、(iii)該データ記録
手段により記録された、配列番号3502〜7001から選ばれ
る１以上のアミノ酸配列情報と標的配列または標的構造
モチーフ情報とを比較する工程、および(iv)標的配列ま
たは標的構造モチーフ情報と一致または類似するアミノ
酸配列情報を検索または解析する工程。

【００１７】（２７）コリネ型細菌由来の標的塩基配
列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチ
ドの機能を決定するための、下記(i)〜(iv)の手段を備
えることを特徴とするコンピュータを用いたシステム； (i)配列番号2〜3501から選ばれる１以上の塩基配列情報
および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
報、並びに標的塩基配列情報を入力するための入力手
段、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録する
ためのデータ記録手段、(iii)該データ記録手段により
記録された、配列番号2〜3501から選ばれる1以上の塩基
配列情報と標的塩基配列情報とを比較し、配列番号2〜3
501から選ばれる1以上の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドと一致または類似する標的塩基配列を有するポリヌ
クレオチドがコードするポリペプチドの機能を決定する
コンパレータ手段、および(iv)該コンパレータ手段によ
り得られた機能を表示するための出力手段。

【００１８】（２８）コリネ型細菌由来の標的塩基配
列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチ
ドの機能を決定するための、下記(i)〜(iv)の工程を含
むことを特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号2〜3501から選ばれる１以上の塩基配列情報
および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
報、並びに標的塩基配列情報を入力する工程、(ii)入力
された情報を少なくとも一時的に記録する工程、(iii)
該データ記録手段により記録された、配列番号2〜3501
から選ばれる1以上の塩基配列情報と標的塩基配列情報
とを比較する工程、(iv)配列番号2〜3501から選ばれる1
以上のアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドと一致ま
たは類似する標的塩基配列を有するポリヌクレオチドが
コードするポリペプチドの機能を決定する工程。

【００１９】（２９）コリネ型細菌由来の標的アミノ
酸配列を有するポリペプチドの機能を決定するための、
下記(i)〜(iv)の手段を備えることを特徴とするコンピ
ュータを用いたシステム； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
ミノ酸配列情報を入力するための入力手段、(ii)入力さ
れた情報を少なくとも一時的に記録するためのデータ記
録手段、(iii)該データ記録手段により記録された、配
列番号3502〜7001から選ばれる1以上のアミノ酸配列情
報と標的アミノ酸配列情報とを比較し、配列番号3502〜
7001から選ばれる1以上のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドと一致または類似する標的アミノ酸配列を有する
ポリペプチドの機能を決定するコンパレータ手段、およ
び(iv)該コンパレータ手段により得られた機能を表示す
るための出力手段。

【００２０】（３０）コリネ型細菌由来の標的アミノ
酸配列を有するポリペプチドの機能を決定するための、
下記(i)〜(iv)の工程を含むコンピュータを用いた方
法； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
ミノ酸配列情報を入力する工程、(ii)入力された情報を
少なくとも一時的に記録する工程、(iii)該データ記録
手段により記録された、配列番号3502〜7001から選ばれ
る1以上のアミノ酸配列情報と標的アミノ酸配列情報と
を比較する工程、および(iv)配列番号3502〜7001から選
ばれる1以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドと一
致または類似する標的アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの機能を決定する工程。

【００２１】（３１）コリネ型細菌が、Corynebacter
ium属、Brevibacterium属、またはMicrobacterium属に
属する微生物である、上記（２３）、（２５）、（２
７）および（２９）のいずれか１項に記載のシステム。（３２）コリネ型細菌が、Corynebacterium属、Brevi
bacterium属、またはMicrobacterium属に属する微生物
である、上記（２４）、（２６）、（２８）および（３
０）のいずれか１項に記載の方法。（３３） Corynebacterium属に属する微生物がCoryneb
acterium glutamicum、Corynebacterium acetoacidophi
lum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacter
ium callunae、Corynebacterium herculis、Corynebact
erium lilium、Corynebacterium melassecola、Coryneb
acterium thermoaminogenes、およびCorynebacterium a
mmoniagenesから選ばれる微生物である、上記（３１）
項記載のシステム。（３４） Corynebacterium属に属する微生物がCoryneb
acterium glutamicum、Corynebacterium acetoacidophi
lum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacter
ium callunae、Corynebacterium herculis、Corynebact
erium lilium、Corynebacterium melassecola、Coryneb
acterium thermoaminogenes、およびCorynebacterium a
mmoniagenesから選ばれる微生物である、上記（３２）
項記載の方法。

【００２２】（３５）配列番号1〜3501から選ばれる1
以上の塩基配列情報または該配列に基づく機能情報を記
録したコンピューターで読み取り可能な記録媒体であっ
て、上記（２３）または（２７）記載のシステムまたは
上記（２４）または（２８）記載の方法に用いることの
できる記録媒体または記憶装置。（３６）配列番号3502〜7001から選ばれる1以上のア
ミノ酸配列情報または該配列に基づく機能情報を記録し
たコンピューターで読み取り可能な記録媒体であって、
上記（２５）または（２９）記載のシステムまたは上記
（２６）または（３０）記載の方法に用いることのでき
る記録媒体または記憶装置。（３７）コンピューターで読み取り可能な媒体が、フ
ロッピーディスク、ハードディスク、磁気テープ、ラン
ダムアクセスメモリ(RAM)、読み出し専用メモリ(ROM)、
磁気光学ディスク(MO)、CD-ROM、CD-R、CD-RW、DVD-RO
M、DVD-RAMおよびDVD-RWからなる群から選ばれる上記
（３５）または（３６）記載のコンピューターで読み取
り可能な記録媒体または記憶装置。

【００２３】（３８）コリネ型細菌由来のホモセリン
デヒドロゲナーゼにおいて、N末端から59番目のVal残基
が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有する
ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチ
ド。（３９）配列番号6952記載のアミノ酸配列の59番目の
Val残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列
を有するポリペプチド。（４０）ポリペプチドが、59番目のVal残基がAla残基
に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る、上記（３８）または（３９）記載のポリペプチド。（４１）コリネ型細菌由来のピルビン酸カルボキシラ
ーゼにおいて、N末端から458番目のPro残基が他のアミ
ノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するピルビン酸
カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド。（４２）配列番号4265記載のアミノ酸配列の458番目
のPro残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配
列を有するポリペプチド。（４３）ポリペプチドが、458番目のPro残基がSer残
基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る、上記（４１）または（４２）記載のポリペプチド。（４４）ポリペプチドが、Corynebacterium glutamic
um由来のポリペプチドである、上記（３８）〜（４３）
のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【００２４】（４５）上記（３８）〜（４４）のいず
れか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。（４６）上記（４５）に記載のＤＮＡを含む組換え体
ＤＮＡ。（４７）上記（４６）に記載の組換え体ＤＮＡを含む
形質転換体。（４８）上記（４５）に記載のＤＮＡが染色体に組み
込まれた形質転換体。（４９）形質転換体が、コリネ型細菌である、上記
（４７）または（４８）記載の形質転換体。（５０）コリネ型細菌が、Corynebacterium glutamic
umである、上記（４９）記載の形質転換体。（５１）上記（４７）〜（５０）のいずれか１項に記
載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＬ−リジン
を生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取するこ
とを特徴とする、Ｌ−リジンの製造法。

【００２５】（５２）配列番号1〜3431に示される塩
基配列情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有するコ
リネ型細菌の育種方法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発
酵法により生産できるように変異育種された、コリネ型
細菌由来の生産菌株のゲノムまたは遺伝子の塩基配列
と、配列番号1〜3431内の対応する塩基配列とを比較す
る工程、(ii)(i)で得られた比較の結果より、上記生産
菌株に存在する変異点を同定する工程、(iii)(ii)の工
程で同定した変異点を、該変異を有しないコリネ型細菌
に導入する工程、および(iv)(iii)の工程で得られたコ
リネ型細菌の、(i)で選ばれた化合物の発酵法による生
産性を調べる工程。（５３）遺伝子が、生合成経路あるいはシグナル伝達
経路上の酵素をコードする遺伝子である、上記（５２）
記載の育種方法。（５４）変異点が生産性を向上または安定化させる有
効変異に関わる変異点である、上記（５２）記載の育種
方法。

【００２６】（５５）配列番号1〜3431に示される塩
基配列情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有するコ
リネ型細菌の育種方法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発
酵法により生産できるように変異育種された、コリネ型
細菌由来の生産菌株のゲノムまたは遺伝子の塩基配列
と、配列番号1〜3431内の対応する塩基配列とを比較す
る工程、(ii)(i)で得られた比較の結果より、上記生産
菌株に存在する変異点を同定する工程、(iii)(ii)の工
程で同定した変異点を、該変異を有するコリネ型細菌か
ら除去する工程、および(iv)(iii)の工程で得られたコ
リネ型細菌の、(i)で選ばれた化合物の発酵法による生
産性を調べる工程。

【００２７】（５６）遺伝子が、生合成経路あるいは
シグナル伝達経路上の酵素をコードする遺伝子である、
上記（５５）記載の育種方法。（５７）変異点が、生産性を低下あるいは不安定にさ
せる変異に関わる変異点である、上記（５５）記載の育
種方法。（５８）配列番号2〜3431に示される塩基配列情報を
用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有するコリネ型細菌の
育種方法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物の生
合成に関与するアイソザイムを配列番号2〜3431に示さ
れる塩基配列情報に基づき同定する工程、(ii)（i）の
工程で同定したアイソザイムを同じ活性を有するアイソ
ザイムに分類する工程、(iii)同じ活性を有するアイソ
ザイムコードしている全ての遺伝子を一括して変異させ
る工程、および(iv)(iii)の工程で得られた遺伝子を用
いて形質転換したコリネ型細菌の、(i)で選ばれた化合
物の発酵法による生産性を調べる工程。

【００２８】（５９）配列番号2〜3431に示される塩
基配列情報を用いた、下記(i)〜(v)の工程を有するコリ
ネ型細菌の育種方法； (i)配列番号2〜3431で示されるオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）の機能情報を整理する工程 (ii)公知の生合成経路あるいはシグナル伝達経路上の酵
素に、該整理されたＯＲＦを対応させる工程 (iii)コリネ型細菌において知られている生合成経路あ
るいはシグナル伝達経路に関する情報と組み合わせ、不
明であったコリネ型細菌における生合成経路およびシグ
ナル伝達経路を解明する工程、 (iv)(iii)の工程で解明された経路と所望の有用生産物
の生合成経路とを比較する工程、および (v)(iv)の工程で所望の有用生産物の生合成に重要と判
断される経路を強化するために、または(iv)の工程で所
望の有用生産物の生合成には重要ではない経路を弱める
ために、配列番号2〜3431に示される塩基配列情報に基
づき遺伝子工学的手法によりコリネ型細菌を変異させる
工程。

【００２９】（６０）上記（５２）〜（５９）のいず
れか１項に記載の育種方法により得られるコリネ型細
菌。（６１）コリネ型細菌が、Corynebacterium属、Brevi
bacterium属、またはMicrobacterium属に属する微生物
である、上記（６０）記載のコリネ型細菌。（６２） Corynebacterium属に属する微生物がCoryneb
acterium glutamicum、Corynebacterium acetoacidophi
lum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacter
ium callunae、Corynebacterium herculis、Corynebact
erium lilium、Corynebacterium melassecola、Coryneb
acterium thermoaminogenes、およびCorynebacterium a
mmoniagenesから選ばれる微生物である、上記（６１）
項記載のコリネ型細菌。（６３）上記（６０）〜（６２）のいずれか１項に記
載のコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中にアミノ
酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁
体から選ばれる少なくとも一種の化合物を生成蓄積さ
せ、該培養物から該化合物を採取することを特徴とする
該化合物の製造法。（６４）化合物がＬ−リジンである上記（６３）記載
の製造方法。

【００３０】（６５）プロテオーム解析に基づく、下
記(i)〜（vi）工程を有する有用変異に関わる蛋白質の
同定方法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発
酵法により生産できるように変異育種された、コリネ型
細菌由来の生産菌株および該生産菌株の親株の菌体より
それぞれ菌体由来の蛋白質を調製する工程、(ii)(i)の
工程で調製した蛋白質を２次元電気泳動法により分離す
る工程、(iii)分離された蛋白質を検出し、生産菌株由
来の蛋白質と親株由来の蛋白質の各発現量を比較する工
程、(iv)比較の結果、異なる発現量を示す蛋白質をペプ
チダーゼで処理し、ペプチド断片を抽出する工程、(v)
(iv)の工程で得られたペプチド断片のアミノ酸配列を解
析する工程、および(vi)(v)の工程で得られたアミノ酸
配列と配列番号3502〜7001に記載のアミノ酸配列とを比
較し、該アミノ酸配列を有する蛋白質を同定する工程。
ここで、プロテオーム(proteome)とは、蛋白質(protei
n)とゲノム(genome)からなる造語で、遺伝子の発現をポ
リペプチドのレベルで調べる方法である。

【００３１】（６６）コリネ型細菌が、Corynebacter
ium属、Brevibacterium属、またはMicrobacterium属に
属する微生物である、上記（６５）記載の同定方法。（６７） Corynebacterium属に属する微生物がCoryneb
acterium glutamicum、Corynebacterium acetoacidophi
lum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacter
ium callunae、Corynebacterium herculis、Corynebact
erium lilium、Corynebacterium melassecola、Coryneb
acterium thermoaminogenes、およびCorynebacterium a
mmoniagenesから選ばれる微生物である、上記（６６）
項記載の同定方法。（６８） Corynebacterium glutamicum AHP-3 (FERM B
P-7382)。

【００３２】

【発明の実施の形態】以下、コリネ型細菌の全塩基配列
決定に基づいて、本発明を詳細に説明する。１．コリネ型細菌の全塩基配列決定本発明でいうコリネ型細菌とは、Bergeys Manual of De
terminative Bacteriology, 8, 599 (1974)に定義され
る、Corynebacterium属、Brevibacterium属、またはMic
robacterium属に属する微生物をいう。具体的には、Cor
ynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium ace
toglutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebact
erium glutamicum、Corynebacterium herculis、Coryne
bacterium lilium、Corynebacterium melassecola、Cor
ynebacterium thermoaminogenes、Brevibacterium sacc
harolyticum、Brevibacterium immariophilum、Breviba
cterium roseum、Brevibacterium thiogenitalis、Micr
obacterium ammoniaphilum等をあげることができる。

【００３３】より具体的には、Corynebacterium acetoa
cidophilum ATCC13870、Corynebact erium acetoglutami
cum ATCC15806、Corynebacterium callunae ATCC1599
1、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebac
terium glutamicum ATCC13060、Corynebacterium gluta
micum ATCC13826（旧属種Brevibacterium flavum、ある
いはCorynebacterium lactofermentum）、Corynebacter
ium glutamicum ATCC14020（旧属種Brevibacterium div
aricatum）、Corynebacterium glutamicum ATCC13869
（旧属種Brevibacterium lactofermentum）、Corynebac
terium herculisATCC13868、Corynebacterium lilium A
TCC15990、Corynebacterium melassecolaATCC17965、Co
rynebacterium thermoaminogenes FERM9244、Brevibact
erium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium im
mariophilum ATCC14068、Brevibacterium roseum ATCC1
3825、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240、Micr
obacterium ammoniaphilum ATCC15354をあげることがで
きる。

【００３４】（１）コリネ型細菌のゲノムＤＮＡの調製コリネ型細菌を通常の方法により培養する。培地とし
て、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等
を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれ
ば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
例えば、Corynebacterium glutamicumでは、該培地とし
て、1% グリシンを含むＢＹ培地（7g/l 肉エキス、10g/
l ペプトン、3g/l 塩化ナトリウム、5g/l 酵母エキス、
pH7.2）等をあげることができる。培養方法としては、2
5〜35℃で終夜培養する。

【００３５】培養後、培養液より、遠心分離により菌体
を回収する。得られた菌体を洗浄液で洗浄する。該洗浄
液として、例えば、STEバッファー〔10.3% スクロー
ス、25mmol/l Tris塩酸塩、25mmol/l エチレンジアミン
四酢酸(以下、EDTAと略記)、pH8.0〕等をあげることがで
きる。該洗浄菌体からのゲノムＤＮＡの取得は、リゾチ
ームおよび界面活性剤であるＳＤＳ等を用いて該菌体の
細胞壁を溶解後、フェノール溶液およびフェノール／ク
ロロホルム溶液を用いて蛋白質等を除き、エタノール等
を用いてゲノムＤＮＡを沈殿させる一般的なゲノムＤＮ
Ａの取得法に準じて行うことができるが、具体的には以
下の方法を例示することができる。

【００３６】該洗浄菌体を、5〜20mg/mlのリゾチームを
含む洗浄液に懸濁し、振とう後、5〜20% ＳＤＳを添加
し溶菌させる。振とうは通常、25〜40℃で、30分〜2時
間緩やかに行う。振とう後に60〜70℃で5〜15分間保持
させることにより溶菌させることができる。溶菌後、常
温まで冷却し、5〜20mlのTris中和フェノールを加え、
室温で15〜45分間緩やかに振とうする。振とう後、遠心
分離（15,000×g、20分間、20℃）を行い、水層を分取
する。

【００３７】同様の操作でフェノール/クロロホルム抽
出、クロロホルム抽出（２回）を行った後、水層に1/10
量の3mol/l酢酸ナトリウム溶液（pH5.2）、２倍量のイ
ソプロパノールを加え、緩やかに混和し、ゲノムＤＮＡ
を沈殿させる。再びゲノムＤＮＡを0.01〜0.04mg/mlの
ＲＮａｓｅを含む緩衝液に溶解する。該緩衝液として、
例えば、TEバッファー（10mmol/l Tris塩酸塩、1mmol/l
EDTA、pH8.0）をあげることができる。溶解後、25〜40
℃で20〜50分間保持した後、上記と同様にフェノール抽
出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出
を行う。抽出後、イソプロパノール沈殿を行い、生じた
ゲノムＤＮＡ沈殿を70％エタノールで洗浄した後、風乾
し、TEバッファーに溶解することにより、ゲノムＤＮＡ
溶液を取得することができる。

【００３８】（２）ショットガンライブラリーの作製上記（１）で調製したコリネ型細菌のゲノムＤＮＡを用
いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製する方法として
は、Molecular Cloninng, A laboratory Manual,Second
Edition (1989)（以下、モレキュラー・クローニング
第２版と略す）に記載の方法を用いることができるが、
特にショットガン法による全塩基配列の決定に用いるの
に適したゲノムＤＮＡライブラリーの作製法としては、
以下に記載の方法を例示する事ができる。

【００３９】上記（１）で調製したコリネ型細菌のゲノ
ムＤＮＡ 0.01mgを、全量0.4mlになるように、TEバッフ
ァー等の緩衝液を加え、ソニケーター（yamato powerso
nicmodel50）を用い、1〜10 kbの断片に分断する。ソニ
ケーターの処理条件としては、出力20で連続5秒間処理
する条件をあげることができる。得られたゲノムＤＮＡ
断片の末端を、ＤＮＡブランティングキット (DNA blun
ting kit、宝酒造社製)等を用いて平滑化する。平滑化
したゲノム断片を、アガロースゲルまたはポリアクリル
アミドゲル電気泳動等により分画し、1〜2kbのゲノム断
片をゲルから切り出す。該ゲルに、ＤＮＡ溶出用の緩衝
液、例えばＭＧ溶出バッファー（0.5mol/l 酢酸アンモ
ニウム、10mmol/l 酢酸マグネシウム、1mmol/l EDT
A、0.1% SDS）等を0.2〜0.5ml加え、25〜40℃で終夜振
とうしてＤＮＡを溶出する。

【００４０】該ＤＮＡ溶出液をフェノール/クロロホル
ム処理後、エタノール沈殿しゲノムライブラリーインサ
ートを取得する。該インサートを、Ｔ４リガーゼ (T4 l
igase、宝酒造社製)等を用いて、適当なベクター、例え
ばpUC18 SmaI/BAP(Amersham Pharmacia Biotech社製)等
にライゲーションする。ライゲーション条件としては、
10〜20℃で、20〜50時間放置する条件をあげることがで
きる。得られたライゲーション反応物をエタノール沈殿
し、5〜20μlのTEバッファーに溶解する。該ライゲーシ
ョン溶液 0.5〜2μlを用いて、常法に従い大腸菌を形質
転換する。該形質転換の方法としては、大腸菌にELECTR
O MAX DH10B（Life Technologies社製）を用いたエレク
トロポレーション法を例示することができる。エレクト
ロポレーションは、添付実験書に記載の条件で行うこと
ができる。

【００４１】形質転換した大腸菌を、寒天を含有する適
当な選択培地、例えばクローニングベクターにpUC18を
用いた場合は、10〜100mg/lのアンピシリンを含むＬＢ
平板培地〔寒天を1.6%含むLB培地（10g/l バクトトリ
プトン、5g/l 酵母エキス、10g/l 塩化ナトリウム、p
H7.0）〕に塗布し、培養する。形質転換体は、該平板培
地上に形成されるコロニーとして取得することができ
る。このとき、該平板培地にＸ−ｇａｌおよびＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加
してこくことで、ゲノムＤＮＡを含有する組換え体ＤＮ
Ａを保有する形質転換株を白色コロニーとして選択する
ことが可能である。

【００４２】該形質転換体は、0.1mg/ml アンピシリン
を含むＬＢ培地を0.05mlずつ添加した96穴タイタープレ
ート中で静置培養し、培養により得られた培養物は下記
（４）の実験に用いることができる。また該培養液に20
%グリセロールを含むＬＢ培地を0.05mlずつ添加、混合
することにより、該培養液は-80℃で保存することが可
能で、要時に用いることができる。

【００４３】（３）コスミドライブラリーの作成上記（１）で調製したコリネ型細菌のゲノムＤＮＡ 0.1
mgを、制限酵素、例えばSau3AI等で部分消化し、10% ス
クロースバッファー（1mol/l ＮａＣｌ、20mmol/l Tr
is塩酸塩、5mmol/l EDTA、10% スクロース、pH8.0）
および40% スクロースバッファー（10% スクロースバッ
ファーのスクロースの濃度を40%としたもの）を用いて
作製した10〜40%ショ糖密度勾配を用いて、超遠心分離
（26,000rpm、18時間、20℃）を行う。遠心分離後、該
分離液を1mlずつチューブに分取し、アガロースゲル電
気泳動で各画分のＤＮＡ断片長を確認した後、約40 kb
のＤＮＡ断片を多く含む画分をエタノール沈殿する。

【００４４】得られたＤＮＡ断片を、該断片と連結可能
な付着末端を有するコスミドベクターに連結する。ゲノ
ムＤＮＡをSau3AIを用いて部分消化した場合は、例えば
superCos1(Stratagene社製)のBamHI部位に該部分消化物
を、添付実験手順書に従い連結することができる。得ら
れた連結産物は、モレキュラー・クローニング第２版記
載の方法により調製できるパッケージングエキストラ
クトを用いてパッケージング後、大腸菌の形質転換に用
いることができるが、より具体的には、市販のパッケー
ジングエキストラクトであるGigapack III Gold Pack
aging Extract（Stratagene社製）等を用いて、添付実
験手順書に従い、パッケージングし、大腸菌XL-1-BlueM
R（Stratagene社製）株等に導入することができる。

【００４５】形質転換した大腸菌は、アンピシリンを含
むＬＢ平板培地に塗布し、培養する。形質転換体は、該
平板培地上に形成されるコロニーとして取得することが
できる。該形質転換体を、アンピシリン0.1mg/mlを含む
ＬＢ培地0.05mlを添加した96穴タイタープレート中で静
置培養する。培養により得られた培養物は、下記（４）
の実験に用いることができる。該培養液に20%グリセロー
ルを含むＬＢ培地を0.05mlずつ添加、混合することによ
り、該培養液は-80℃で保存することが可能で、要時に用
いることができる。

【００４６】（４）塩基配列の決定（４−１）鋳型の調製コリネ型細菌ゲノムＤＮＡの全塩基配列は、全ゲノムシ
ョットガン法〔Science, 269, 496-512 (1995)〕を基本
として決定することができる。全ゲノムショットガン法
で用いる鋳型としては、上記（２）で調製したライブラ
リーを用い、ＰＣＲにより調製することができる〔DNA
Research, 5, 1-9 (1998)〕。具体的には、以下の方法
で鋳型を調製することができる。アンピシリン0.1mg/ml
を含むＬＢ培地をウェルあたり0.08mlずつ分注した96穴
タイタ−プレートの各ウェルに全ゲノムショットガンラ
イブラリー由来クローンをレプリケーター（GENETIX社
製）で植菌し、37℃で終夜静置培養を行う。

【００４７】該培養液を、TaKaRa Ex Taq（宝酒造社
製）を用いてＰＣＲ用反応液を0.025mlずつ分注した96
穴リアクションプレート（PE Biosystems社製）に、コ
ピープレート（トッケン社製）を用いて移し、GeneAmp
PCR System 9700 (PE Biosystems社製)を用い、牧野ら
のプロトコール〔DNA Research, 5, 1-9 (1998)〕に従
いＰＣＲを行い、挿入断片の増幅を行う。ＰＣＲ産物精
製用キット（Amersham Pharmacia Biotech社製）により
余剰プライマーおよびヌクレオチドの除去を行い、これ
をシーケンス反応の鋳型として用いる。また、２本鎖Ｄ
ＮＡプラスミドを鋳型にして、塩基配列を決定すること
もできる。

【００４８】鋳型として用いる２本鎖ＤＮＡプラスミド
は以下の方法で取得することができる。アンピシリン0.
05mg/mlを含む２×ＹＴ培地（16g/l バクトトリプト
ン、10g/l 酵母エキス、5g/l 塩化ナトリウム、pH7.
0）を1.5mlずつ分注した24穴または96穴プレートの各ウ
ェルに、全ゲノムショットガンライブラリー由来クロー
ンを植菌し、37℃で終夜振とう培養を行う。該培養液よ
り、プラスミド自動調製機KURABO PI-50（倉敷紡績社
製）、マルチスクリーン(Millipore社製)等を用い、倉
敷紡績社もしくはMillipore社のプロトコールに従っ
て、２本鎖ＤＮＡプラスミドを調製することができる。
プラスミドの精製には、ベックマンコールター社のバイ
オメック2000等を用いることができる。得られた精製２
本鎖ＤＮＡプラスミドを0.1mg/ml程度になるように水に
溶解しシーケンシングの鋳型として用いることができ
る。

【００４９】（４−２）シーケンス反応シーケンス反応は、市販のシーケンスキット等を用いて
行うことができ、具体的には以下に記載する方法を例示
することができる。ABI PRISM BigDye Terminator Cycl
e Sequencing Ready Reaction Kit（PE Biosystems社
製）溶液6μlに対し、M13順方向プライマー(M13-21)又
はM13逆方向プライマー(M13REV)〔DNA Research, 5, 1-
9 (1998)〕を各々1〜2pmol、および上記（４−１）で調
製した鋳型（ＰＣＲ産物又はプラスミド）50〜200ngを
混ぜ10μlのシーケンス反応液を調製する。

【００５０】該反応液を用い、GeneAmp PCR System 970
0 (PE Biosystems社製)等を用い、35〜55サイクルのダ
イターミネーターシーケンス反応を行う。サイクルパラ
メーターは市販のキット、例えばABI PRISM BigDye Ter
minator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等に付
属するマニュアルに従って行うことができる。サンプル
の精製は、MultiScreen HV plate（Millipore社製）等
の市販の製品を用い、市販の製品に付属のマニュアルに
従って行うことができる。精製された反応物をエタノー
ル沈殿、乾燥し、分析に用いる。該乾燥反応物は-30℃
の暗所で保存でき、要時に用いることができる。該乾燥
反応物は、市販のシーケンサーおよびアナライザーを用
い、付属のマニュアルに従って分析することができる。
市販のシーケンサーとしては、ABI PRISM 377 DNA Sequ
encer（PE Biosystems社製）等をあげることができる。
アナライザーとしては、ABI PRISM 3700 DNA Analyser
（PE Biosystems社製）等をあげることができる。

【００５１】（５）アセンブリ上記（４）で得られた配列情報の解析に用いるベースコ
ールにはphred(The University of Washington)等のソ
フトウェアを用いることができる。ベクター配列情報を
除去するには、Cross#Match(The University of Washin
gton)、SPS Cross#Match(Southwest Parallel Software
社製)等のソフトウェアを用いることができる。アセン
ブリにはphrap(The University of Washington)、SPS p
hrap(SouthwestParallel Software社製)等のソフトウェ
アを用いることができる。

【００５２】上記解析および結果の出力作業には、ＵＮ
ＩＸ、ＰＣ、マッキントッシュ等のコンピューターを用
いることができる。アセンブリの結果得られるコンティ
グは、グラフィカルエディターconsed(TheUniversity o
f Washington)等を用いて解析することができる。ベー
スコールからアセンブリまでの一連の作業をconsedに付
属するスクリプトphredPhrapを利用して一括して行うこ
ともできる。本発明で、ソフトウェアはコンパレータ
（比較器）とも記載する。

【００５３】（６）ギャップ部分の塩基配列決定上記（３）で構築したコスミドライブラリー中の各コス
ミドを（４−１）に記載した２本鎖ＤＮＡプラスミド調
製と同様な方法で調製する。このコスミドの挿入断片末
端部の塩基配列を、ABI PRISM BigDye Terminator Cycl
e Sequencing Ready Reaction Kit（PE Biosystems社
製)等の市販のキットを用い、付属するマニュアルに従
って決定する。コスミド約800クローンの挿入断片の両
末端のシーケンシングを行い、その配列と一致する
（５）で得られたショットガンシーケンシング由来コン
ティグ中の塩基配列を検索する。該作業により各コスミ
ドクローンと各コンティグの連鎖関係を解明し、相互整
列化を行う。また、この結果を公知のフィジカルマップ
と対応させることにより、コスミドとコンティグのマッ
ピングを行う。Corynebacterium glutamicum ATCC13032
株の場合にはMol. Gen. Genet., 252, 255-265 (1996)
のフィジカルマップを利用することができる。

【００５４】また、コンティグではカバーされない領域
（ギャップ部）の配列は、以下の方法で決定する。コン
ティグの末端に位置する配列を含むクローンを選抜す
る。これらの中から、挿入断片の片側の末端のみの配列
しか決定されていないクローンを選抜し、挿入断片の逆
末端の配列を決定する。2つのコンティグに、挿入断片
のそれぞれの末端の配列が含まれるような全ゲノム由来
ショットガンライブラリークローンまたはコスミドクロ
ーンを同定し、該クローンの挿入断片の全塩基配列を決
定する。該方法により、このギャップ部分の塩基配列を
決定することができる。

【００５５】ギャップ部分をカバーするショットガンラ
イブラリークローンもしくはコスミドクローンがない場
合には、そのコンティグ末端の配列に相補するプライマ
ーを作成し、ＰＣＲによってギャップ領域のＤＮＡ断片
を増幅する。該増幅ＤＮＡ断片を鋳型として用いたプラ
イマーウォーキング法により、もしくは該増幅ＤＮＡ断
片から調製したショットガンクローンの配列を決定する
ショットガン法によりシーケンシングを行い、該領域の
塩基配列を決定することができる。

【００５６】配列精度の低い領域については、consed(T
he University of Washington)のAUTOFINISH機能とNAVI
GATING機能を利用してプライマーを合成し、プライマー
ウォーキング法により配列決定を行い配列精度を高める
ことができる。このようにして決定される全ゲノムの塩
基配列として、例えば、配列番号１に示される、Coryne
bacterium glutamicum ATCC13032株ゲノムの全塩基配列
をあげることができる。

【００５７】（７）配列番号１で表される塩基配列を利
用した微生物ゲノムＤＮＡの塩基配列の決定上記で決定された、配列番号１記載のCorynebacterium
glutamicum ATCC13032株ゲノムの全塩基配列と80％以上
の相同性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を配列番
号１で表される塩基配列を利用して決定することがで
き、本発明の配列番号１で表される塩基配列と80％以上
の相同性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドも
本発明のポリヌクレオチドである。本発明の配列番号１
で表される塩基配列と80％以上の相同性を有する塩基配
列を有するポリヌクレオチドとは、配列番号１で表され
る塩基配列において、連続した５〜５０塩基からなるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、例えば染
色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法を利用して、その染色
体ＤＮＡの全塩基配列を決定できるポリヌクレオチドで
ある。全塩基配列を決定する上で特に好ましいプライマ
ーとしては、互いに300〜500bp程度離れて位置する塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌク
レオチドの中でも主要代謝経路に関わる蛋白質をコード
するＤＮＡから選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドは特に好ましい。該オリゴヌクレオチドを用いて
染色体ＤＮＡの全塩基配列を決定できるポリヌクレオチ
ドとしては、例えばコリネ属に属する微生物由来の染色
体ＤＮＡを構成するポリヌクレオチドをあげることがで
き、好ましくはCorynebacterium属に属する微生物由来
の染色体ＤＮＡを構成するポリヌクレオチド、より好ま
しくは、Corynebacteriumglitamicumの染色体ＤＮＡを
構成するポリヌクレオチドをあげることができる。

【００５８】２．全ゲノム塩基配列情報を利用したオー
プンリーディングフレーム〔open reading frame（転写
解読枠）；以下、ＯＲＦと略記する〕および発現調節断
片の同定並びにＯＲＦの機能推定上記１．により決定された、コリネ型細菌由来のゲノム
の全塩基配列情報により、ＯＲＦおよび発現調節断片を
同定することが可能であり、更に、同定されたＯＲＦの
機能を推定することが可能である。ＯＲＦとは、ｍＲＮ
Ａの塩基配列のうち、アミノ酸配列として翻訳され、蛋
白質となりうる連続した領域であり、ｍＲＮＡのＯＲＦ
をコードする、ＤＮＡ上の領域も、ＯＲＦと呼ばれる。
発現調節断片（expression modulating fragment、以下
ＥＭＦと略記する）とは、作動可能に連結されたＯＲＦ
またはその他の配列の発現を調節する一連のポリヌクレ
オチド断片を意味する。「作動可能に連結された配列の
発現を調節する」とは、ＥＭＦの存在により配列の発現
が変化することを意味する。ＥＭＦとしては、プロモー
ター、オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、リ
ボソーム結合配列、転写終結配列等をあげることができ
る。コリネ型細菌の場合、ＥＭＦは通常、遺伝子間セグ
メント（2つの遺伝子の間にある断片；長さ約10から200
ヌクレオチド）に存在する。即ち、長さ10ヌクレオチド
以上の遺伝子間セグメントには、ＥＭＦが存在する場合
が多い。ＥＭＦはまた公知のＥＭＦの配列を標的配列、
標的構造モチーフ（または標的モチーフ）に用いて、Ｆ
ＡＳＴＡ〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-48
(1988)〕、ＢＬＡＳＴ〔J. Mol. Biol., 215, 403-410
(1990)〕等の適当なソフトウェアまたはコンパレータに
より推定することが可能である。または公知のＥＭＦ捕
獲ベクター（例えば、pKK232-8； Amersham Pharmacia
Biotech社製）により、同定および評価が可能である。

【００５９】「標的配列」とは、6個以上のヌクレオチ
ドの塩基配列あるいは2個以上のアミノ酸配列またはそ
のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。標的配列
は、配列が長くなるほど、データベース中にランダムに
現れる可能性は少なくなる。標的配列のもっとも好まし
い長さは、約10から100個のアミノ酸、または約30から30
0個のヌクレオチド残基である。

【００６０】「標的構造モチーフ」または「標的モチー
フ」とは、任意の合理的に選択される配列または配列の
組み合わせをいい、当業者に公知の手段によりポリペプ
チドの折り畳みに際し形成される3次元構造に基づいて
選択されるもので、種々のモチーフが公知である。

【００６１】ポリペプチドの標的モチーフは、例えば酵
素活性部位、蛋白質―蛋白質相互作用部位やシグナル配
列であるが、これらに限定されることはない。核酸の標
的モチーフとしては、プロモーター配列、転写調節因子
結合配列やヘアピン構造等をあげることができる。

【００６２】有用性の高いＥＭＦとしては、例えば高効
率プロモーターや誘導発現プロモーターをあげることが
できる。これらの取得は、発現が高いことが示されてい
る、あるいは予想される遺伝子（例えばリボソームＲＮ
Ａ遺伝子：GenBankアクセッション番号M16175、Z4675
3）や目的の誘導パターンを示す遺伝子（例えば酢酸で
誘導されるイソクエン酸リアーゼ遺伝子：特開平5-5678
2）の塩基配列を、上記１．で決定した全ゲノム塩基配
列とアラインメントして位置決定し、その上流部分（通
常、翻訳開始位置から200ないし500ヌクレオチド）のゲ
ノム断片を単離する事により可能である。また、上記Ｅ
ＭＦ捕獲ベクターで捕獲したプロモーターの中から高効
率のものや目的の誘導パターンを示すものを選択するこ
とにより、有用性の高いＥＭＦを取得できる。

【００６３】ＯＲＦの同定は、個々のＯＲＦに共通する
特徴を抽出し、それに基づく一般的モデルを構築し、対
象配列とそのモデルとの適合度を測ることにより行うこ
とができる。該同定には、GeneMark〔Nuc. Acids. Re
s., 22, 4756-67 (1994)：GenePro社製〕、GeneMark.hm
m(GenePro社製)、GeneHacker〔蛋白質核酸酵素, 42, 30
01-07 (1997)〕、Glimmer〔The Institute of Genomic
Research；Nuc. Acids.Res. 26, 544-548 (1998)〕等の
ソフトウェアを用いることができる。通常、これらソフ
トウェアを用いた予測には、デフォルト（初期設定）の
パラメータを用いるが、必要に応じてパラメータを変更
してもよい。

【００６４】上記予測作業には、ＵＮＩＸ、ＰＣ、マッ
キントッシュ等のコンピューターを用いることができ
る。該方法により予測されるＯＲＦとして、例えば、配
列番号１に示されるCorynebacterium glutamicumゲノム
中に存在する、配列番号２〜3501で示される塩基配列を
有するＯＲＦ等をあげることができる。該ＯＲＦには配
列番号3502〜7001に示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドがコードされている。

【００６５】ＯＲＦの機能推定は、同定されたＯＲＦの
アミノ酸配列をGenBank database、OWL等由来の蛋白質
コード領域からなるデータベースであるSwiss-Prot、PI
R、GenBank-nr-aa、GenPeptのアミノ酸データベースに
対して、相同性検索ソフトウェアBLAST、FASTA、Smith
& Waterman等を用いた公知のホモローグ配列との相同性
検索することにより行うことができる。また、該相同性
検索により、公知の蛋白質のアミノ酸配列との同一性お
よび類似性も解析できる。

【００６６】同一性とは、例えば、３つのアミノ酸位置
が異なる10アミノ酸長の２つのポリペプチドは、70％の
同一性を有するとされる。また、互いに異なる３アミノ
酸の内の１つについて、アミノ酸は異なっても類似（例
えばロイシンとイソロイシン）であれば、80％の類似性
を有するとされる。

【００６７】具体例として、第１表（第１-１表〜第１
−１３５表）に、Corynebacterium glutamicum ATCC130
32株由来のＯＲＦの塩基配列と、最も相同性が高いと判
定される配列の公知データベースにおける登録番号およ
びその配列の遺伝子名、その遺伝子の機能、並びに該公
知のアミノ酸翻訳配列との比較における同一性および類
似性を示した。

【００６８】このように、本発明の方法によって、コリ
ネ型細菌由来のゲノムの全塩基配列を決定することによ
り、膨大な数のコリネ型細菌由来の新規遺伝子を同定す
ることができ、更に該遺伝子の機能の推定が可能とな
る。コリネ型細菌は産業上有用な微生物であるため、同
定された遺伝子の多くは産業上有用である。また、推定
された機能を分類することでその微生物の特徴が明らか
となり、育種上の貴重な情報を得ることができる。

【００６９】更に、上記で得られた、コリネ型細菌由来
のＯＲＦ情報より、該微生物より対応するＯＲＦを、モ
レキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により
調製し、取得することができる。即ち、ＯＲＦに隣接す
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それ
をプライマーとして、コリネ型細菌から得た染色体ＤＮ
Ａを鋳型として用い、通常のＰＣＲクローニング技法に
よりＯＲＦを単離、取得することができる。このように
して取得されるＯＲＦ配列として、例えば、配列番号2
〜3501のいずれかに示される塩基配列を有するポリヌク
レオチドをあげることができる。

【００７０】ＯＲＦあるいはプライマーは、上記配列情
報に基づき、ポリヌクレオチド合成機を用いても調製す
ることができる。本発明のポリヌクレオチドとしては、
上記で取得されるＯＲＦの塩基配列を含むポリヌクレオ
チドおよび該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドをあげるこ
とができる。

【００７１】本発明でいうポリヌクレオチドとは、一本
鎖および二本鎖ＤＮＡならびに一本鎖ＲＮＡを含有する
が、これらに限定されるものではない。上記で取得され
るＯＲＦの塩基配列を含むポリヌクレオチドとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドには、該ＯＲＦの縮重変異体が含まれる。縮重変異体
とは、塩基配列では本発明のＯＲＦの配列と異なってい
るが、遺伝コードの縮重により同一のアミノ酸配列をコ
ードするポリヌクレオチド断片をいう。

【００７２】具体的な例としては、配列番号2〜3431の
いずれかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチ
ド、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするポリヌクレオチド等をあげることが
できる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチドとは、上記で同定されたＯＲＦの塩
基配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして、コ
ロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブ
リダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダ
イゼーション法等を用いることにより得られるポリヌク
レオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラ
ーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを
用いて、0.7〜1.0mol/lの塩化ナトリウム存在下、65℃で
ハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のＳ
ＳＣ溶液(１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150mmol/l 塩
化ナトリウム、15mmol/l クエン酸ナトリウムよりなる）
を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより
同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。

【００７３】ハイブリダイゼーションは、モレキュラー
・クローニング第２版、Current Protocols in Molecul
ar Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、
カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイ
オロジーと略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques,
A Practical Approach, Second Edition, Oxford Unive
rsity (1995)等に記載されている方法に準じて行うこと
ができる。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとし
て具体的には、FASTA、BLAST、Smith-Waterman〔Meth.
Enzym., 164, 765 (1988)〕等の相同性検索ソフトウェ
アにより、デフォルト（初期設定）のパラメータを用い
て計算したときに、配列番号2〜3431に示される塩基配
列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好
ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、更に好ま
しくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげること
ができる。

【００７４】また、本発明のポリヌクレオチドとして、
配列番号3502〜6931のいずれかに示されるアミノ酸配列
からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドま
たは該ポリヌクレチドとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズするポリヌクレオチドをあげることができ
る。更に、本発明のポリヌクレオチドとして、配列番号
１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドにおい
て、配列番号２〜3431から選ばれる塩基配列を有するポ
リヌクレオチドの５’上流または３’下流領域に位置
し、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの発
現を調節する活性を有するポリヌクレオチドをあげるこ
とができる。該ポリヌクレオチドがコードするポリペプ
チドの発現を調節する活性を有するポリヌクレオチドと
して具体的には、上述したＥＭＦ即ち、プロモーター、
オペレーター、エンハンサー、サイレンサー、リボソー
ム結合配列、転写終結配列等をコードするポリヌクレオ
チドをあげることができる。

【００７５】上記ＰＣＲクローニング技法によりＯＲＦ
を取得する際に用いるプライマーとしては、該ＯＲＦお
よび隣接する領域の塩基配列中の連続した10〜200塩基
と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴ
ヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチ
ドをあげることができる。例えば、配列番号1〜3431の
何れかに示された塩基配列中の連続した10〜200塩基と
同じ配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌ
クレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド
をあげることができる。センスプライマーおよびアンチ
センスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温
度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記
のオリゴヌクレオチドが好ましい。

【００７６】本発明のオリゴヌクレオチドとして、配列
番号１〜3431の何れかに示された塩基配列中の連続した
10〜200塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチドま
たは該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリ
ゴヌクレオチドをあげることができる。

【００７７】更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体
（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明の
オリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オ
リゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド
中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合
に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレ
オチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホス
フォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘
導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエス
テル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレ
オチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−
５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド
誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チア
ゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導
体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニ
ルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オ
リゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シ
トシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換された
オリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリ
ボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリ
ゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中
のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換さ
れたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる
〔細胞工学, 16, 1463 (1997)〕。

【００７８】本発明の上記オリゴヌクレオチドおよびオ
リゴヌクレオチド誘導体は、プライマー以外にも、後述
のハイブリダイゼーション用プローブ、アンチセンス核
酸としても有用である。アンチセンス核酸として用いる
場合は、上記オリゴヌクレオチドに限らず、本発明のポ
リヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズし、かつ該ポリヌクレオチドがコードするポリペプ
チドの発現を調節する活性を有するポリヌクレオチドな
らば用いることができる。

【００７９】３．アイソザイムの推定コリネ型細菌を用いたアミノ酸、核酸、ビタミン、糖、
有機酸等の有用物質の生産において、これら有用物質の
生産に有用な変異株は多数取得されている。しかし、上
記微生物においては遺伝子配列情報の知見が少ないた
め、主として、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異
剤による変異操作により有用変異株が取得されてきた。
上記変異剤による変異法では、ランダムに遺伝子を変異
させることができるが、中間物質の代謝に関わる類似性
質を有するアイソザイムをコードする各々の遺伝子を一
括して変異させることは困難である。また、変異剤によ
る変異法では、ランダムに遺伝子が変異するため、生育
遅延や発泡性上昇等の培養特性低下をもたらす有害な変
異も同時に付与される可能性が高い。

【００８０】しかし、遺伝子配列情報があれば、目的と
するアイソザイムをコードする全遺伝子を目的に応じて
全て変異させることが可能となり、目的とする遺伝子以
外の有害な変異が導入されることはない。即ち、上記
２．で同定されたＯＲＦ情報により、コリネ型細菌中の
目的とするアイソザイムの正確な数、配列情報を取得す
ることが可能であり、該配列情報を利用し、モレキュラ
ー・クローニング第２版等に記載の部位特異的変異導入
法等により、目的のアイソザイム遺伝子全てを、目的の
性質を有する遺伝子に変異させ、有用物質の生産性が向
上した有用変異株を取得することができる。

【００８１】４．生合成経路、およびシグナル伝達経路
の解明生合成経路、およびシグナル伝達経路は多数の生物で解
明が試みられており、多くの知見がある。しかし、コリ
ネ型細菌においては、まだ多くの遺伝子が同定されてい
なかったため、不明な点が数多く存在する。

【００８２】このような不明な点は下記方法により解明
することができる。上記２．の方法により同定された、
コリネ型細菌由来のＯＲＦの推定機能情報を整理する。
ここでいう「整理」とは、推定された機能情報に従い、
各々のＯＲＦがどのような物質の生合成経路、あるいは
どのようなシグナル伝達経路に属するかを、公知の情報
を利用して分類することをいう。次に、公知の他生物の
生合成経路あるいはシグナル伝達経路上の酵素に、該整
理されたＯＲＦを対応させる。コリネ型細菌において知
られている情報と組み合わせ、不明であったコリネ型細
菌における生合成経路およびシグナル伝達経路を解明す
ることができる。

【００８３】不明あるいは明確でなかった経路を解明す
ることにより、目的とする有用生産物を生産するための
有用変異株を効率よく取得することが可能となる。即
ち、明確となった経路が目的とする有用生産物の生合成
に重要と判断される場合には、該経路を強化した変異株
を取得することにより有用変異株を取得することができ
る。また、明確となった経路が目的とする有用生産物の
生合成には重要ではないと判断される場合には、該経路
の利用頻度を低下させた変異株を取得することにより有
用変異株を取得することができる。

【００８４】５．有効変異点の解明コリネ型細菌において、アミノ酸、核酸、ビタミン、
糖、有機酸等の目的とする有用生産物の生産に適した有
用な変異株が多数取得されているが、どのような変異点
を遺伝子に付与すれば生産性を向上させることが可能か
ほとんど知られていない。しかし、コリネ型細菌から変
異手法によって育種された生産菌株のゲノムＤＮＡの所
望の配列を、上記１.および２.の方法により決定され
た、コリネ型細菌由来の対応するゲノムＤＮＡおよびＯ
ＲＦの塩基配列と比較解析することによって、生産菌株
が有する変異点を同定することができる。

【００８５】更に、代謝経路や代謝調節機構、酵素の構
造活性相関などに関する既知の情報に基づけば、それら
の変異点の中から生産に寄与している有効変異点を容易
に特定することが可能である。既知の情報により有効変
異の特定が難しい場合には、同定された変異点をコリネ
型細菌の野生型株または該変異を有していない生産菌に
導入し、生産にプラスの効果をもたらすか否かで確かめ
ることができる。例えば、Corynebacterium glutamicum
のリジン生産菌B-6株〔Appl. Microbiol. Biotechnol.,
32, 269-273 (1989)〕のホモセリンデヒドロゲナーゼ
遺伝子homの塩基配列を、本発明のCorynebacterium glu
tamicum ATCC13032ゲノムの対応する塩基配列と比較す
ることにより、59番目のバリンがアラニンに置換された
アミノ酸置換変異(Val59Ala)を同定することができる。
更に、この変異を遺伝子置換法でATCC13032株に導入し
て得た菌株はリジンを生産するようになることから、該
変異がリジン生産に寄与する有効変異であることが見出
せる。

【００８６】同様に、B-6株のピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子pycの塩基配列を、ATCC13032ゲノムの対応す
る塩基配列と比較することにより、458番目のプロリン
がセリンに置換されたアミノ酸置換変異(Pro458Ser)を
同定することができる。更に、この変異を遺伝子置換法
で、該変異を有していないCorynebacterium glutamicum
のリジン生産菌No.58株(FERM BP-7134)に導入して得た
菌株はリジン生産性がNo.58株に比べて向上することか
ら、該変異がリジン生産に寄与する有効変異であること
が見出せる。

【００８７】その他にも、B-6株のグルコース-６-リン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子zwfを同様に検索することに
より、リジン生産に関わる有効変異として、グルコース
-６-リン酸デヒドロゲナーゼ内の変異Ala213Thrを特定
することができる。更に、Corynebacterium glutamicum
ATCC13032のアスパルトキナーゼ遺伝子lysCの932番目
の塩基をシトシンに置換することにより、311番目のス
レオニンをイソロイシンに置換（Thr311Ile）すると、C
orynebacterium glutamicumによるリジンの生産性を向
上させることができることから、該変異がリジン生産に
寄与する有効変異であることが見出せる。

【００８８】同定された変異点が有効変異か否かを確か
める別の方法として、リジン生産菌の有する該変異を遺
伝子置換法で野生型の配列に戻し、生産にマイナスの影
響を及ぼすか否かで調べる方法もある。例えば、リジン
生産菌B-6株のhomが有するアミノ酸置換変異Val59Alaを
野生型に戻した菌株は、リジン生産性がB-6株に比べて
低下することから、該変異はリジン生産に寄与する有効
変異であることが見出せる。必要に応じて、後述のＤＮ
Ａアレイ解析やプロテオーム解析を組み合わせれば、有
用変異点の抽出をより効率的に、かつ網羅的に行うこと
ができる。

【００８９】６．工業的に有利な生産菌株の育種方法アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸等の目的とする
有用生産物の発酵生産に工業的に用いられている生産菌
株は、一般に、ＮＴＧなどの変異剤を用いたランダム変
異と選択に基づく変異育種を重ねることによって造成さ
れている。近年、組換えＤＮＡ技術による生産菌株の改
良例も多数報告されているが、これらの育種において
も、変異手法によって育種された生産菌株が親株として
使用されている場合がほとんどである〔W. Leuchtenber
ger, Amino Acids - Technical Production and Use. I
n: Roehr (ed) Biotechnology, second edition, vol.
6, products of primary metabolism. VCH Verlagsgese
llschaft mbH, Weinheim, P 465 (1996)〕。変異手法は
発酵工業に大きな貢献をもたらしてきたが、染色体の至
る所にランダムに多数の変異が入るという重大な欠点が
ある。菌株改良の度に多数の変異が、同一染色体上に蓄
積されていくため、変異育種された生産菌株は、野生型
株に比べて、一般に生育が悪い、糖の消費が遅い、温度
や酸素などのストレスに弱い等の性質を有するようにな
り、生産性が充分に上がらない、雑菌汚染の影響を受け
やすい、培養管理が煩雑になる等、実製造において製造
コストを高める要因となっている。また、ランダム変異
であるため、生産性向上の機構は明確ではなく、次の生
産性向上に向けての合理的な育種戦略を立て難い。

【００９０】本発明によれば、コリネ型細菌から変異手
法により育種された生産菌株の染色体上に蓄積された多
数の変異点の中から、生産に寄与する有効変異点を効率
よく特定することができるため、コリネ型細菌にそれら
の有効変異を組み上げていくという新たな育種方法を確
立することができる。該方法により、有用生産菌の再構
築を行うことが可能となり、野生型株からも、有用生産
菌株を構築することが可能となる。

【００９１】具体的には、以下の方法で有用変異株を構
築することができる。変異点の一つをコリネ型細菌の野
生型株に導入し、生産にプラスの効果をもたらすか否か
を調べる。この評価で効果があった場合はその変異点を
残し、効果がなかった場合はその変異点をはずす。次
に、効果があった変異点のみを有する菌株を親株とし
て、同様な操作を繰り返し行っていく。一般には生合成
経路の下流に律速点が存在すると、上流の変異の有効性
が明確に評価できない場合があるので、この方法を用い
る場合には、変異点の評価を下流から上流に向けて順
次、行っていくことが望ましい。

【００９２】以上のようにして、野生型株、あるいは野
生型株のように生育速度や糖の消費能力が高い菌株をベ
ースに有効変異を再構成すれば、上述のような従来法の
欠点を持たない、短時間で発酵生産が可能なあるいは発
酵をより高い温度で実施することのできる、工業的に有
利な菌株を造成することが可能になる。

【００９３】例えば、Corynebacterium glutamicumの野
生型株ATCC13032から多段階にわたり変異育種されたリ
ジン生産変異株B-6〔Appl. Microbiol. Biotechnol., 3
2, 269-273 (1989)〕では、リジン発酵を30〜34℃の間
で行うことができるが、34℃を超えると生育とリジンの
生産性が低下するため、発酵温度を34℃以下に保つ必要
がある。しかし、Corynebacterium glutamicum ATCC130
32を親株として用いて、上記５．であげたリジン生産に
関わる有効変異を再構成して得た生産菌株では、40〜42
℃の高温でも30〜34℃で培養した場合と同等以上の結果
を得ることができ、発酵時の冷却負担を大幅に軽減する
ことができるため、工業的に有利である。

【００９４】43℃を超える高温での培養が求められる場
合は、Corynebacterium属に属し、43℃を超える高温でも
生育できる微生物をベースに有効変異を再構成すれば、4
3℃を超える高温での発酵生産が可能な生産菌株を得る
ことができる。Corynebacterium属に属し、43℃を超え
る高温でも生育できる微生物としては、例えば、Coryne
bacterium thermoaminogenesをあげることができる。具
体的にはCorynebacterium thermoaminogenes FERM924
4、FERM9245、FERM9246、およびFERM9277をあげること
ができる。

【００９５】以上のようにして再構築した生産菌株を親
株にして、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ技術による
遺伝子増幅法や遺伝子置換法、形質導入法、あるいは細
胞融合法を用いて、更に育種をすれば、目的生産物の生
産性が一段と高まった菌株を得ることができる。従っ
て、本発明の微生物としては、育種の過程で、2つ以上
の有効変異をコリネ型細菌に集積させるという工程を経
た生産菌株であれば、変異株、細胞融合株、形質転換
株、形質導入株あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて造成
した組換え株のいずれであっても特に限定されるもので
はない。

【００９６】一方、生育や生産にとって有害であると判
断された変異点が特定された場合には、現在使用してい
る生産菌株に該変異点が存在するか否かを調べ、該変異
を有している場合には野生型の遺伝子に戻すことによ
り、更に有用な生産菌株に育種することも可能である。
以上のような育種方法は、コリネ型細菌以外の、産業上
有利な性質を有する微生物（より安価な炭素源を速やか
に利用できる微生物、より高温でも生育できる微生物
等）にも適用することが可能である。

【００９７】７．ポリヌクレオチドアレイの作製および
利用（１）ポリヌクレオチドアレイの作製上記１．および２．で取得される本発明のポリヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチドを用い、ポリヌクレオチドア
レイを作製することができる。具体的には、配列番号2
〜3501のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌク
レオチド、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、および/
またはこれらポリヌクレオチドの有する塩基配列中の連
続する少なくとも10〜200塩基からなる配列を有するポ
リヌクレオチドを、１以上固体支持体に固着したポリヌ
クレオチドアレイ、並びに配列番号3502〜7001のいずれ
かに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオ
チド、および/またはこれらポリヌクレオチドの有する
塩基配列中の連続する少なくとも10〜200塩基からなる
配列を有するポリヌクレオチドを、１以上固体支持体に
固着したポリヌクレオチドアレイをあげることができ
る。

【００９８】本発明においてポリヌクレオチドアレイと
は、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡマク
ロアレイ等と呼ばれるものを含み、固体支持体の表面に
複数のポリヌクレオチドまたは該断片を固着させたもの
をいう。固体支持体としては、平板ガラスやナイロン膜
等を用いることができる。ポリヌクレオチドまたは該断
片の固体支持体表面への固着には、アレイ作製の一般的
な手法を用いることができる。即ち、ポリリジン等のポ
リカチオンの付着等、化学的に表面処理した固体支持体
に固着させる方法〔Nat. Genet., 21, 15-19 (1999)〕
等を用いることができる。このような化学的に表面処理
した固体支持体は市販されており、該市販品を本発明の
ポリヌクレオチドアレイの固体支持体として用いること
ができる。

【００９９】固体支持体に固着させるポリヌクレオチド
あるいはオリゴヌクレオチドとしては、上記１．および
２．で取得される本発明のポリヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチドを用いることができる。固体支持体へポ
リヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドを高密度に
固着することにより、後述の解析を効率よく実施可能で
あるが、必ずしも高密度である必要はない。高密度に固
着するためのアレイヤーロボット等の装置は、宝酒造社
（GMS417 Arrayer）等より市販されており、該市販品を
用いることができる。

【０１００】また、光リソグラフ法等により本発明のオ
リゴヌクレオチドを固体支持体上で直接合成してもよい
〔Nat. Genet., 21, 20-24 (1999)〕。該方法ではま
ず、光照射により除去できる保護基を持ったリンカーを
スライドグラス等の固体支持体に固着させる。該固着部
位の限られた部分のみ光を透過させるためのマスク（光
リソグラフマスク）を通して光を当てる。該領域に、光
照射により除去できる保護基を持ったオリゴヌクレオチ
ドを加えることにより、光の当たった部分のみ、そのヌ
クレオチドとの連結反応が起こる。該操作を繰り返すこ
とにより、領域ごとに異なる、望みの配列のオリゴヌク
レオチドを合成することができる。通常、合成するオリ
ゴヌクレオチドの長さは、10〜30塩基である。

【０１０１】（２）ポリヌクレオチドアレイの利用上記（１）で作製されたポリヌクレオチドアレイを用
い、下記（ａ）、（ｂ）を行うことが可能となる。

【０１０２】（ａ）コリネ型細菌の変異株の変異点の同
定およびゲノムにコードされる遺伝子の発現量ならびに
発現プロファイルの解析コリネ型細菌の変異株由来遺伝子または被検遺伝子につ
いて、下記（i）〜（iv）の工程を実施することによ
り、該遺伝子の変異点の同定または該遺伝子の発現量な
らびに発現プロファイルを解析することができる。（i）上記（１）の方法でポリヌクレオチドアレイを作
製する工程（ii）（i）の工程で作製されたポリヌクレオチドアレ
イを用い、該ポリヌクレオチドアレイ上に固定化された
ポリペプチドと標識化されたコリネ型細菌の変異株由来
遺伝子とをハイブリダイズ条件下でインキュベートする
工程（iii）ハイブリダイゼーションを検出する検出工程（iv）ハイブリダイゼーション結果を解析する解析工程コリネ型細菌の変異株由来遺伝子または被検遺伝子とし
て、例えば、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、
およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の生
合成に関わる遺伝子をあげることができる。

【０１０３】具体的な方法を下記に詳述する。ポリヌク
レオチドアレイを用い、ヒトの2,300 kbにわたる領域中
のＳＮＰ（一塩基多型）が同定されている〔Science, 2
80, 1077-82 (1998)〕。該ＳＮＰの同定方法、およびSc
ience, 278, 680-686 (1997)、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA,96, 12833-38 (1999)、Science, 284, 1520-23 (1
999)等に記載の方法に準じ、上記（１）で作製されたポ
リヌクレオチドアレイおよびコリネ型細菌由来の核酸分
子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を用い、ハイブリダイゼーション
法により、アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸等に
有用である該微生物の有用変異株の変異点の同定および
遺伝子発現量ならびに発現プロファイルの解析が可能で
ある。

【０１０４】コリネ型細菌由来の核酸分子（ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ）の取得はモレキュラー・クローニング第２版等に
記載の常法に従って行うことができる。Corynebacteriu
m glutamicum由来のｍＲＮＡの取得に関しては、Borman
nらの方法〔Molecular Microbiology , 6, 317-326 (19
92)〕も用いることができる。通常、目的とするｍＲＮ
Ａに加え、大過剰のリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）も
取得されるが、解析の大きな支障にはならない。

【０１０５】取得されたコリネ型細菌由来の核酸分子を
標識化する。該標識には蛍光色素を用いる方法やラジオ
アイソトープを用いる方法等が用いられる。具体的に
は、微生物より抽出したＲＮＡにソラレン-ビオチンを
紫外光でクロスリンクさせ、ハイブリダイゼーション反
応後にストレプトアビジンを結合させた蛍光色素をビオ
チン部に結合させることにより標識化する方法〔Nat. B
iotechnol., 16, 45-48 (1998)〕、微生物より抽出した
ＲＮＡを鋳型、ランダムプライマーをプライマーにした
逆転写反応を行い、蛍光色素、例えばＣｙ３、Ｃｙ５を
結合させたｄＵＴＰ（Amersham Pharmacia Biotech社
製）をｃＤＮＡに取り込ませることにより標識化する方
法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12833-38 (199
9)〕等をあげることができる。

【０１０６】ランダムプライマーの代わりにＯＲＦの
３’端の相補配列群をプライマーに使用することで、標
識の特異性をより高めることも可能である〔J. Bacteri
ol., 181, 6425-40 (1999) 〕。ハイブリダイゼーショ
ン法における、ハイブリダイゼーションおよびその後の
洗浄操作は通常の方法で行うことができる〔Nat. Biote
chnol., 14, 1675-80 (1996)等〕。該操作後、標識に使
用した核酸分子のハイブリダイゼーション量に応じたハ
イブリダイゼーションの強度を測定することにより、変
異点の同定および遺伝子の発現量を算定することができ
る。

【０１０７】ハイブリダイゼーションの強度は、蛍光シ
グナル、放射能、発光量等を、レーザー共焦点顕微鏡、
ＣＣＤカメラ、放射線のイメージング装置（例えばAmer
shamPharmacia Biotech社製、ＳＴＯＲＭ）等により可
視化後、該可視化データを定量化することにより測定す
ることができる。固体支持体上のポリヌクレオチドアレ
イについての解析・定量には、GMS418 Array Scanner
（宝酒造社製）等の市販の装置を用いることもできる。
遺伝子発現量の解析には、市販の解析ソフトウェア（例
えば宝酒造社製、ImaGene；富士フイルム社製、Array G
auge； Amersham Pharmacia Biotech社製、ImageQuant
等）を使用することができる。コリネ型細菌由来の核酸
分子として、培養経時に応じて取得された核酸分子を用
いることにより、特定の遺伝子の発現変動を追跡するこ
とができる。該変動を把握することにより、培養条件を
最適化することが可能となる。

【０１０８】また該微生物の全ゲノム配列から明らかに
された多数の遺伝子の配列を有する核酸分子を用いるこ
とにより、該微生物の全遺伝子レベルでの発現プロファ
イル、すなわちゲノムにコードされる多数の遺伝子のう
ちどのような遺伝子群がどのような比率で発現している
かを明らかにすることができる。このようにして全ゲノ
ム配列から明らかにされた遺伝子の発現プロファイルを
把握することにより、該微生物の生物学的な状態を全遺
伝子レベルでの発現パターンとして捉えることができ
る。

【０１０９】（ｂ）被検遺伝子に相同な遺伝子のコリネ
型細菌での存在の確認上記（１）で作製されたポリヌクレオチドアレイを用
い、コリネ型細菌以外の生物に存在する被検遺伝子に相
同な遺伝子がコリネ型細菌に存在するか否かを、検索す
ることができる。該検索は、上記（ａ）の同定・解析方
法において、コリネ型細菌由来の核酸分子のかわりに、
コリネ型細菌以外の生物に存在する被検遺伝子を用いた
方法により行うことができる。

【０１１０】８．全ゲノム塩基配列およびＯＲＦ情報を
記録したコンピューターで読み取り可能な記録媒体「コンピューターで読み取り可能な記録媒体または記憶
装置」とは、コンピューターによって直接読みとられ、
アクセスされうる任意の記録媒体または記憶装置をい
う。このような記録媒体または記憶装置としては、フロ
ッピーディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気
記録媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶ
Ｄ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−ＲＷ等の光学記
録媒体、ＲＡＭやＲＯＭ等の電気記録媒体、およびこれ
らのカテゴリーのハイブリッド（例えばＭＯ等の磁気／
光学記録媒体）をあげることができるが、これらに限定
されるものではない。

【０１１１】上記記録媒体に記録または入力させるため
の機器、あるいは記録媒体中の情報を読み取るための機
器または装置の選択は、記録媒体の種類とアクセス方法
に基づく。また、種々のデータプロセッサープログラ
ム、ソフトウェア、コンパレータおよびフォーマット
が、本発明のポリヌクレオチド配列情報等を該媒体に記
録し、利用させるために用いられる。該情報は、例え
ば、市販のソフトウェアでフォーマットされたバイナリ
ーファイル、テキストファイルあるいはASCIIファイル
の形態で表しうる。これら配列情報にアクセスするため
のソフトウェアも公的に入手可能である。

【０１１２】該媒体に記録する情報としては、上記２．
で取得されたコリネ型細菌の、全ゲノム塩基配列情報、
ＯＲＦの塩基配列情報、該ＯＲＦにコードされるアミノ
酸配列情報、該アミノ酸配列を有するポリペプチドの有
する機能情報等をあげることができる。

【０１１３】本発明のコンピューターで読みとり可能な
記録媒体または記憶装置は、上記情報を記録した媒体で
ある。具体的には、配列番号1〜3501に示される塩基配
列情報、3502〜7001に示されるアミノ酸配列情報、配列
番号1〜3501に示される塩基配列が有する機能情報、およ
び3502〜7001に示されるアミノ酸配列が有する機能情
報、第１表（第１−１表〜第１−１３５表）に示される
情報等を記録したコンピューターで読み取り可能な記録
媒体または記憶装置をあげることができる。

【０１１４】９．本発明のコンピューターで読みとり可
能な記録媒体を利用したコンピューターを用いたシステ
ム「コンピューターを用いたシステム」とは、本発明のコ
ンピューターで読みとり可能な記録媒体に記録された情
報を分析するために使用される、ハードウェア手段、ソ
フトウェア手段、およびデータ記録手段より構成された
ものをいう。ハードウェア手段は基本的に、入力装置、
データ記録装置、中央演算処理装置、出力装置からな
る。

【０１１５】ソフトウェア手段は、記録された情報と上
記ハードウェア手段を用いて、本発明の媒体に記録され
た情報に関する検索あるいは解析を行う手段を行う。具
体的には、本発明の記録媒体に記録された塩基配列、ア
ミノ酸配列等の情報から生物学的に意味のある構造、情
報を検索、解析あるいは比較するために、コンピュータ
ーを用いたシステムで実行される一つまたはそれ以上の
プログラムを使用する手段を意味する。

【０１１６】ＯＲＦ、ＥＭＦ領域の同定のためのソフト
ウェアとしては、GeneMark〔Nuc. Acids. Res., 22, 47
56-67 (1994)〕、GeneHacker〔蛋白質核酸酵素, 42, 30
01-07 (1997)〕、Glimmer〔The Institute of Genomic
Research；Nuc. Acids. Res., 26, 544-548 (1998)〕等
をあげることができる。通常、これらソフトウェアを用
いた予測には、デフォルト（初期設定）のパラメータを
用いるが、必要に応じてパラメータを変更してもよい。
標的配列または標的構造モチーフに類似するゲノム領域
またはポリペプチド領域の同定（相同性検索）のための
ソフトウェアとしては、FASTA、BLAST、Smith-Waterma
n、GenetyxMac（Software Development社製）、GCGパッ
ケージ（Genetics Computer Group社製）、GenCore（Co
mpugen社製)等をあげることができる。通常、これらソ
フトウェアを用いた予測には、デフォルト（初期設定）
のパラメータを用いるが、必要に応じてパラメータを変
更してもよい。

【０１１７】このような全ゲノム配列の情報を含む記録
媒体は、コリネ型細菌のゲノムＤＮＡがコードする遺伝
子の発現量ならびに該微生物の全遺伝子レベルでの発現
プロファイル、すなわち該微生物のゲノムにコードされ
る多数の遺伝子のうちどのような遺伝子群がどのような
比率で発現しているかを明らかにすることができるポリ
ヌクレオチドアレイを作製するために有用である。

【０１１８】データ記録手段とは、本発明の記録媒体に
記録された情報および標的配列、標的構造モチーフ情報
等を記録するメモリ、およびそれにアクセスしうるメモ
リアクセス手段をいう。

【０１１９】即ち、本発明のコンピュータを用いたシス
テムは、(i)本発明の記録媒体に記録された情報、およ
び標的配列または標的構造モチーフ情報を入力するため
の入力手段、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に
記録するためのデータ記録手段、(iii)(ii)のデータ記
録手段により記録された、本発明の記録媒体に記録され
た情報と標的配列または標的構造モチーフ情報とを比較
し、標的配列または標的構造モチーフ情報と一致または
類似する塩基配列情報を検索または解析するコンパレー
タ手段、および(iv)(iii)のコンパレータ手段により得
られた検索または解析結果を表示するための出力手段を
備えたことを特徴とする、コンピュータを用いたシステ
ムである。

【０１２０】該システムを、上記２．〜５．の方法に用
いることにより、コリネ型細菌の、ＯＲＦ、ＥＭＦ領
域、標的配列、標的構造モチーフ等の検索・解析、ホモ
ローグの検索、アイソザイムの検索・解析、生合成経路
・シグナル伝達経路の解明、有用変異点の解明、および
プロテオーム解析で見出されたスポットの同定に利用す
ることができる。上記、ホモローグには、オーソロー
グ、パラローグ両者共に含まれる。

【０１２１】１０．コリネ型細菌由来のＯＲＦを利用し
たポリペプチドの製造上記２．の方法で取得されるＯＲＦを含むポリヌクレオ
チドを用い、本発明のポリペプチドを製造することがで
きる。即ち、本発明のポリペプチドは、モレキュラー・
クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン
・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を
用い、例えば以下の方法により、本発明のポリヌクレオ
チドまたはその断片を宿主細胞中で発現させて、製造す
ることができる。

【０１２２】全長ＯＲＦ配列をもとにして、必要に応じ
て、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さ
のＤＮＡ断片を調製する。また、必要に応じて、本発明
のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細
胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤ
ＮＡを調製する。該ＤＮＡは本発明のポリペプチドの効
率的製造に有用である。これらのＤＮＡ断片を適当な発
現ベクターのプロモーターの下流に挿入することによ
り、組換えベクターを作製する。

【０１２３】該組換えベクターを、該発現ベクターに適
合した宿主細胞に導入する。宿主細胞としては、細菌、
酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺
伝子を発現できるものであればいずれも用いることがで
きる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自
立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に
プロモーターを含有しているものが用いられる。細菌等
の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベ
クターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、少
なくともプロモーター、リボソーム結合配列、本発明の
ＤＮＡ、転写終結配列が作動可能な状態で構成されたベ
クターであることが好ましい。プロモーターを制御する
遺伝子が含まれていてもよい。

【０１２４】発現ベクターとしては、例えば、Coryneba
cterium glutamicumで複製可能なベクタープラスミドで
あるpCG1（特開昭57-134500）、pCG2（特開昭58-3519
7）、pCG4（特開昭57-183799）、pCG11（特開昭57-1345
00）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-1059
99）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMol. Gen. Gene
t., 196, 175-178 (1984）〕、およびEscherichia coli
で複製可能なベクターであるpET3、pET11（以上Stratag
ene社製）、pBAD、pThioHis、pTrcHis（以上、Invitrog
en社製）、pKK223-3、pGEX2T(以上、Amersham Pharmacia
Biotech社製）の他、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれ
もBoehringer Mannheim社製より市販）、pSE280（Invit
rogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGE
N社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agri
c. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Bi
ol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Ac
ad.Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK
(-)（Stratagene社製）、pTrs30〔Escherichia coli JM
109/pTrS30 （FERM BP-5407）より調製〕、pTrs32〔Esc
herichia coli JM109/pTrS32（FERM BP-5408）より調
製〕、pGHA2〔Escherichia coli IGHA2（FERM BP-400）
より調製、特開昭60-221091〕、pGKA2〔Escherichia co
li IGKA2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-22109
1〕、pTerm2（US4686191、US4939094、US5160735）、pS
upex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol.,
172, 2392 (1990)〕、pGEX（Pharmacia社製）、pETシス
テム（Novagen社製）等をあげることができる。

【０１２５】プロモーターとしては、宿主細胞中で機能
するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒ
ｐプロモーター（Ｐ_trp）、ｌａｃプロモーター、Ｐ_Lプ
ロモーター、Ｐ_Rプロモーター、Ｔ７プロモーター等
の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげ
ることができる。またＰ_trpを２つ直列させたプロモー
ター（Ｐ_trp×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７
プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に
設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-
Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例え
ば6〜18塩基)に調節したプラスミドを用いることが好ま
しい。

【０１２６】本発明の組換えベクターにおいては、本発
明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要では
ないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置するこ
とが好ましい。上記構成要素のコドンは、利用される宿
主細胞や環境状況に応じて、公知の方法により、最適化
することが可能である。

【０１２７】宿主細胞としては、Escherichia属、Serra
tia属、Bacillus属、Brevibacteriu m属、Corynebacteri
um属、Microbacterium属、Pseudomonas属等に属する微
生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherich
ia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichi
a coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichi
a coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia
coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia co
li W3110、Escherichia coli NY49、Escherich ia coli
GI698、Escherichia coli TB1、Serratia ficaria、Ser
ratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia m
arcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquef
acines、Corynebacterium ammoniagenes、Brevibacteri
um immariophilum ATCC14068、Brevibacterium sacchar
olyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATC
C13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Cory
nebacterium glutamicum ATCC14067（旧属種Brevibacte
rium flavum）、Corynebacterium glutamicum ATCC1386
9（旧属種Brevibacterium lactofermentum、あるいはCo
rynebacterium lactofermentum）、Corynebacterium ac
etoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium thermoam
inogenes FERM9244、Microbacterium ammoniaphilum AT
CC15354、Pseudomonas putida 、Pseudomonas sp. D-01
10等をあげることができる。

【０１２８】Corynebacterium glutamicumまたはその類
縁微生物を宿主とする場合、該ポリペプチドの発現に必
要なＥＭＦは、本発明のポリヌクレオチドがＥＭＦを含
む限り、ベクター側に特に備わっていなくてもよい。そ
のようなＥＭＦが該ポリヌクレオチドに含まれない場合
には、別にＥＭＦを調製し、作動可能な状態にポリヌク
レオチドに連結する必要がある。あるいは、より高い発
現量もしくは特異的な発現調節を期待する場合にも、そ
れに見合ったＥＭＦを作動可能な状態にポリヌクレオチ
ドに連結する必要がある。例えば、Microbiology, 142,
1297-1309 (1996)に具体例が示されている。

【０１２９】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-248394）、またはGene, 1
7, 107 (1982)若しくはMol. Gen. Genet., 168, 111 (1
979)に記載の方法等をあげることができる。酵母を宿主
細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例え
ば、pYES2（Invitrogen社製）、YEP13（ATCC37115）、Y
Ep24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS1
5等をあげることができる。

【０１３０】プロモーターとしては、酵母菌株中で発現
できるものであればいずれのものを用いてもよく、例え
ば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー
ター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｇ
ＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロ
モーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポ
リペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵ
Ｐ１プロモーター等をあげることができる。宿主細胞と
しては、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Kl
uyveromyces属、Trichosporon属、Schwanniomyces属、P
ichia属、Candida属等に属する微生物、例えば、Saccha
romyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Klu
yveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwann
iomyces alluvius、Candidautilis等をあげることがで
きる。

【０１３１】組換えベクターの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Meth. Enzy
m.,194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウ
ム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、Proc.Nat
l. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあ
げることができる。動物細胞を宿主として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、pcDNA3.1、pSinRep
5、pCEP4(Invitrogen社製)、pRev-Tre(Clontech社製)、
pAxCAwt(宝酒造社製)、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社製)、
pAGE107〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 133 (19
90)〕、pAS3-3(特開平2-227075)、pCDM8〔Nature, 329,
840(1987)〕、pcDNAI/Amp(Invitrogen社製)、pREP4(In
vitrogen社製)、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (19
87)〕、pAGE210等をあげることができる。

【０１３２】プロモーターとしては、動物細胞中で機能
するものであればいずれも用いることができ、例えば、
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（immediate ea
rly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモー
ター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネイ
ンプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲα
プロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭ
ＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用
いてもよい。

【０１３３】宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマ
ルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャ
イニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637
（特開昭63-299）等をあげることができる。動物細胞へ
の組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮ
Ａを導入する方法であればいずれも用いることができ、
例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology,
3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２
２７０７５）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456
(1973)等をあげることができる。

【０１３４】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・
バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors, A La
boratory Manual, W. H. Freeman and Company, New Yo
rk (1992)、Bio/Technology,6, 47 (1988)等に記載され
た方法によって、ポリペプチドを発現することができ
る。即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウ
イルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組
換えウイルスを得た後、更に組換えウイルスを昆虫細胞
に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。

【０１３５】該方法において用いられる遺伝子導入ベク
ターとしては、例えば、pBlueBac4.5、pVL1392、pVL139
3、pBlueBacIII（ともにInvitorogen社製）等をあげる
ことができる。バキュロウイルスとしては、例えば、夜
盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・
カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイル
ス(Autographa californica nuclear polyhedrosis vir
us)等を用いることができる。

【０１３６】昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperd
aの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Baculovirus Expr
ession Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman
andCompany, New York (1992)〕、Trichoplusia niの
卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Invitrogen社製）等を用い
ることができる。組換えウイルスを調製するための、昆
虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュ
ロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カル
シウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげ
ることができる。植物細胞を宿主細胞として用いる場合
には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、
タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができ
る。

【０１３７】プロモーターとしては、植物細胞中で発現
できるものであればいずれのものを用いてもよく、例え
ば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５
Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげ
ることができる。宿主細胞としては、タバコ、ジャガイ
モ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファル
ファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげる
ことができる。組換えベクターの導入方法としては、植
物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いる
ことができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacter
ium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/0097
7）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、
パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許
第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。

【０１３８】本発明の形質転換体として、上記の組換え
ベクターを保持する形質転換体のみならず、本発明のポ
リヌクレオチドを組換えベクターとしてではなく、その
もの自体として保持する形質転換体、即ち、本発明のポ
リヌクレオチドが、宿主の染色体に組み込まれ状態で保
持された形質転換体も含まれる。酵母、動物細胞、昆虫
細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖ある
いは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができ
る。

【０１３９】以上のようにして得られる本発明の形質転
換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチド
または本発明のＥＭＦの制御下で発現される任意のポリ
ペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することに
より、それらのポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培
養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母
等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場
合、該形質転換体を培養する。培地として、該形質転換
体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、
該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然
培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

【０１４０】炭素源としては、該形質転換体が資化し得
るものであればよく、グルコース、フラクトース、スク
ロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデン
プン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の
有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等
を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のア
ンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、
カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、
各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができ
る。

【０１４１】無機塩としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養
は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下
で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常
16時間〜7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保持す
ることが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、
アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を
用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリン
やテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。

【０１４２】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養す
るときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加
してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換
えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔ
ｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換し
た微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を
培地に添加してもよい。

【０１４３】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地〔The Journal of the American Medical Associ
ation, 199, 519 (1967)〕、イーグルのMEM培地〔Scien
ce, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変MEM培地〔Viro
logy, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the
Society for the Biological Medicine, 73, 1 (195
0)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等
を用いることができる。培養は、通常ｐＨ6〜8、30〜40
℃、5%ＣＯ₂存在下等の条件下で1〜7日間行う。また、
培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。

【０１４４】昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH
培地（Pharmingen社製）、Sf-900IISFM培地（Life Tech
nologies社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもJRH
Biosciences社製）、Grace'sInsect Medium〔Nature, 1
95, 788 (1962)〕等を用いることができる。培養は、通
常pH6〜7、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。ま
た、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質
を培地に添加してもよい。

【０１４５】植物細胞を宿主として得られた形質転換体
は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて
培養することができる。該形質転換体を培養する培地と
しては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スク
ーグ(ＭＳ)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら
培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを
添加した培地等を用いることができる。培養は、通常pH
5〜9、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。また、培養
中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の
抗生物質を培地に添加してもよい。

【０１４６】上記のとおり、本発明のポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有す
る微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換
体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチド
を生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取す
ることにより、該ポリペプチドを製造することができ
る。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレ
キュラー・クローニング第２版に記載されている方法等
に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うこ
とができる。

【０１４７】本発明のポリペプチドの生産方法として
は、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌さ
せる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法が
あり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの
構造を変えることにより、該方法を選択することができ
る。本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細
胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J. B
iol. Chem.，264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes De
velop., 4, 1288（1990)〕、および／または特開平5-33
6963、WO94/23021等に記載の方法を準用することによ
り、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させる
ことができる。

【０１４８】即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発
明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前
にシグナルペプチドを付加した形で発現させることによ
り、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌
させることができる。また、特開平2-227075に記載され
ている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を
用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させること
もできる。

【０１４９】更に、遺伝子が導入された動物個体（トラ
ンスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランス
ジェニック植物）を造成することにより、本発明のポリ
ペプチドを製造することもできる。形質転換体が動物個
体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育
または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物
個体または植物個体より該ポリペプチドを採取すること
により、該ポリペプチドを製造することができる。動物
個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法とし
ては、例えば公知の方法〔American Journal of Clinic
al Nutrition, 63, 639S (1996)、American Journal of
Clinical Nutrition, 63, 627S (1996)、Bio/Technolo
gy, 9, 830(1991)〕に準じて遺伝子を導入して造成した
動物中に本発明のポリペプチドを生産する方法をあげる
ことができる。

【０１５０】動物個体の場合は、例えば、本発明のポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニ
ック非ヒト動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に
生成、蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取す
ることにより、該ポリペプチドを製造することができ
る。該動物中の生成、蓄積場所としては、例えば、該動
物のミルク（特開昭63-309192）、卵等をあげることが
できる。この際に用いられるプロモーターとしては、動
物で発現できるものであればいずれも用いることができ
るが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるα
カゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラ
クトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプ
ロモーター等が好適に用いられる。

【０１５１】植物個体を用いて本発明のポリペプチドを
製造する方法としては、例えば本発明のポリペプチドを
コードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を
公知の方法〔組織培養, 20 (1994)、組織培養, 21 (199
5)、Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕に準じ
て栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成、蓄積さ
せ、該植物中より該ポリペプチドを採取することによ
り、該ポリペプチドを生産する方法をあげることができ
る。

【０１５２】本発明のポリペプチドはin vitro翻訳によ
り取得することもできる。in vitro翻訳系を用いて本発
明のポリペプチドを生産することもできる。in vitro翻
訳には、例えば、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳
型にする方法の２通りがあるが、鋳型ＲＮＡとしては、
全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、in vitro転写産物などが使用で
き、鋳型ＤＮＡとしては、転写プロモーターと翻訳開始
点の下流に組み込まれた目的遺伝子を含むプラスミドや
PCR/RT-PCR産物が使用できる。in vitro翻訳の最適なシ
ステムの選択には、合成する蛋白質をコードする遺伝子
の由来（原核細胞／真核細胞）、鋳型の種類（ＤＮＡ／
ＲＮＡ)、または合成後の蛋白質の使用目的などを考慮
して行なう必要がある。種々の特徴を有するin vitro翻
訳のキットが各社（Boehringer Mannheim社、Promega
社、Stratagene社等）から市販されているが、いずれの
キットを用いても、本発明のポリペプチドを製造するこ
とができる。

【０１５３】in vitro転写／翻訳システムE.coli T7 S3
0 Extract System for Circular DNA(Promega社製；カ
タログ番号L1130）を用いれば、Ｔ７プロモーターを含
むプラスミドにクローン化されたＤＮＡ塩基配列の転写
／翻訳を実施することができる。またin vitro翻訳転写
／翻訳システムE.coli S30 Extract System for Linear
Templates(Promega社製；カタログ番号L1030）を用いれ
ば、スーパーコイル非感受性のプロモーター、例えばｌ
ａｃＵＶ５、ｔａｃ、λＰＬ(ｃｏｎ)やλＰＲなどの持
つ直鎖上の原核生物のＤＮＡを鋳型として転写／翻訳を
実施することができる。直鎖上の原核生物のＤＮＡを鋳
型としては、ＤＮＡフラグメント、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ産
物、重複オリゴヌクレオチド連結体、in vitro転写ＲＮ
Ａ、原核生物ＲＮＡなどが使用できる。

【０１５４】このような系を用いることで、本発明のポ
リペプチドを製造できる他に、放射性標識蛋白質の合
成、クローン化遺伝子の発現能の確認、転写反応または
翻訳反応の機能解析研究などを実施することも可能であ
る。本発明の形質転換体により製造されたポリペプチド
を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用
いることができる。例えば本発明のポリペプチドが、細
胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞
を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音
波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナ
イザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出
液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得
られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒
抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による
沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロ
ース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等
のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、
Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（Pharmacia社製）等のレ
ジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチ
ルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用
いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲル
ろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマ
トフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等
の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得
ることができる。

【０１５５】また、該ポリペプチドが宿主細胞内に不溶
体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破
砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリ
ペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの
不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈
または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下
げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻
す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリ
ペプチドの精製標品を得ることができる。

【０１５６】本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペ
プチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細
胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチド
あるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができ
る。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法に
より処理することにより培養上清を取得し、該培養上清
から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精
製標品を得ることができる。

【０１５７】上記の方法で取得されるポリペプチドが本
発明のポリペプチドであり、例えば、配列番号2〜3431
から選ばれる塩基配列を有するポリヌクレオチドにコー
ドされるポリペプチド、または配列番号3502〜6931のい
ずれかに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
あげることができる。

【０１５８】さらに、該ポリペプチドの有するアミノ酸
配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入
または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該ポリペ
プチドの活性と実質的に同一の活性を有するポリペプチ
ドも本発明に含まれる。該ポリペプチドの活性と実質的
に同一の活性とは、欠失、置換、挿入または付加する前
のポリペプチドが有する固有の機能あるいは酵素活性な
どに代表される活性と同一の活性を意味している。該ポ
リペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版、
カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイ
オロジー、Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 3
15 (1985)、Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)、Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部
位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
例えば、配列番号3502〜6931のいずれかに示されるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部
位特異的変異を導入することにより、取得することがで
きる。欠失、置換、挿入もしくは付加されるアミノ酸残
基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法
等の周知の方法により欠失、置換、挿入もしくは付加で
きる程度の数であり、１〜数十個、好ましくは１〜２０
個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５
個である。

【０１５９】本発明のポリペプチドの有するアミノ酸配
列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入ま
たは付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは
複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数の
アミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があること
を意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じて
もよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天
然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基とし
ては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン
酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒス
チジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メ
チオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリ
ン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-
バリン、L-システインなどがあげられる。

【０１６０】以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の
例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換
可能である。Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリ
ン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオ
ニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチル
アラニン、シクロヘキシルアラニンＢ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギ
ン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミ
ノスベリン酸Ｃ群：アスパラギン、グルタミンＤ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノ
ブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシ
プロリンＦ群：セリン、スレオニン、ホモセリンＧ群：フェニルアラニン、チロシンまた、得られる変異ポリペプチドが、変異前のポリペプ
チドの有する活性と実質的に同一の活性を有するために
は、変異前のポリペプチドの有するアミノ酸配列と、BL
ASTやFASTA等の解析ソフトウェアで、デフォルト（初期
設定）のパラメータを用いて計算した時に、少なくとも
６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同
性を有していることが好ましい。

【０１６１】また、本発明のポリペプチドは、Fmoc法
（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法
（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によ
っても製造することができる。また、Advanced ChemTec
h社製、Perkin elmer社製、Pharmacia社製、Protein Te
chnology Instrument社製、Synthecell-Vega社製、PerS
eptive社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して
化学合成することもできる。

【０１６２】本発明の形質転換体は、本発明のポリペプ
チド生産以外の目的にも使用することができる。具体的
には、本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクター
を含む形質転換体を培地に培養し、培養物中にアミノ
酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁
体から選ばれる少なくとも一種を生成蓄積させ、該培養
物からアミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、および
それらの類縁体から選ばれる少なくとも一種を採取、製
造することが可能である。また、アミノ酸、核酸、ビタ
ミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁体等の生理活性
物質の生合成経路、分解経路およびその調節機構は生物
種により異なる。その相違を利用して、異種由来のそれ
らの生合成関連遺伝子を導入することで、それら生理活
性物質の生産性を高めることが可能である。例えば、植
物種子における必須アミノ酸の一つリジンの含有量は、
細菌由来の生合成酵素遺伝子の導入により増大すること
が報告されている（WO93/19190）。また、大腸菌由来の
アルギニン生合成遺伝子をCorynebacterium glutamicum
に導入すると、アルギニンの過剰生産が起こることが報
告されている（特公平5-23750）。

【０１６３】それらの生理活性物質の生産のための本発
明の形質転換体の培養は、上記本発明のポリペプチド生
産のための形質転換体の培養方法と同じ方法で行うこと
ができる。培養物からの該生理活性物質の採取も、イオ
ン交換樹脂法、沈殿法、その他公知の方法の組み合わせ
で行うことができる。

【０１６４】公知の方法とは、例えば宿主生物がバクテ
リアの場合、エレクトロポレーション、カルシウムトラ
ンスフェクション、プロトプラスト法、ウィルスを経る
方法等であり、真核生物の場合はマイクロインジェクシ
ョン、リン酸カルシウムトランスフェクション、陽性荷
電脂質仲介法やウィルスを用いる方法等をあげることが
できる〔モレキュラー・クローニング第２版、および、
Spectorら、Cells/ alaboratory manual，Cold Spring
Harbor Laboratory Press、1998）〕。宿主生物とは、
原核生物、下等真核生物（たとえば酵母）、または高等
真核生物（例えばほ乳類動物）、であり、それら生物か
ら単離された細胞を含む。組換えポリヌクレオチド断片
の宿主細胞内での存在形態としては、宿主染色体にイン
テグレートされてもよいし、染色体外で独立の複製単位
を有する因子（例えばプラスミド）に組み込まれた形で
もよい。これらの形質転換体は、本発明のCorynebacter
ium glutamicumのゲノムのＯＲＦによりコードされるポ
リペプチドの他、本発明のポリヌクレオチドおよびその
断片を生産するために用いることができる。あるいは、
本発明のＥＭＦの制御下で任意のポリペプチドを生産す
るため等に用いることができる。

【０１６５】１１．本発明のポリペプチドを認識する抗
体の調製本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片
ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明のポリペプチ
ドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として
用いることにより、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体等、本発明のポリペプチドを認識する抗体を作製
することができる。

【０１６６】（１）ポリクローナル抗体の作製本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片
ポリペプチドの精製標品、あるいは本発明のポリペプチ
ドの一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として
用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を
作製することができる。投与する動物として、ウサギ、
ヤギ、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリ等を用い
ることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり50〜
100μgが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチド
をスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyan
in）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合
させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプ
チドは、ペプチド合成機で合成することができる。

【０１６７】該抗原の投与は、例えば、1回目の投与の
後1〜2週間おきに3〜10回行う。各投与後、3〜7日目に
眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反
応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA
法）：医学書院刊（1976年）、Antibodies-A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕等
で確認する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分
な抗体価を示した免疫された非ヒト哺乳動物より血清を
取得し、該血清を分離、精製することによりポリクロー
ナル抗体を取得することができる。

【０１６８】分離、精製する方法としては、遠心分離、
40〜50％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸
沈殿〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, (1988)〕、またはＤＥＡＥ−セフ
ァロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡま
たはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロ
マトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する
方法があげられる。

【０１６９】（２）モノクローナル抗体の作製 (a)抗体産生細胞の調製免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプ
チドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを
抗体産生細胞の供給源として供する。該抗体価を示した
ラットに抗原物質を最終投与した後3〜7日目に、脾臓を
摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、1,200rpmで5分間遠心分離
した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をト
リス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜
２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で3回洗
浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。

【０１７０】(b)骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した
株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マ
ウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(以下、P
3-U1と略す)〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 8
1, 1 (1978)、Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、
SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276, 269 (1978)〕、P3-X6
3-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)〕、P3
-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いる
ことができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培
地〔1.5mmol/l グルタミン、5×10^-5mol/l ２−メルカ
プトエタノール、10μg/ml ジェンタマイシンおよび10%
牛胎児血清(FCS:CSL社製)となるようRPMI-1640培地に
添加した培地（以下、正常培地という）に、更に８−ア
ザグアニンを15μg/ml加えた培地〕で継代するが、細胞
融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞
を2×10⁷個以上用いる。

【０１７１】(c)ハイブリドーマの作製 (a)で取得した抗体産生細胞と(b)で取得した骨髄腫細胞
をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（1.83g リン酸二ナトリウ
ム、0.21g リン酸一カリウム、7.65g 食塩、蒸留水１リ
ットル、pH7.2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:
骨髄腫細胞=５〜１０：１になるよう混合し、1,200rpm
で5分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画
分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、
37℃で、10⁸抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライ
コール-1000 (PEG-1000) 2g、MEM 2mlおよびジメチルス
ルホキシド(DMSO)0.7mlを混合した溶液を0.2〜1ml添加
し、更に1〜2分間毎にMEM培地1〜2mlを数回添加する。
添加後、MEM培地を加えて全量が５０ｍｌになるように
調製する。該調製液を900rpmで5分間遠心分離後、上清
を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐ
した後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやか
にＨＡＴ培地〔10^-4mol/l ヒポキサンチン、1.5×10^-5m
ol/l チミジンおよび4×10^-7mol/l アミノプテリンとな
るように正常培地に添加した培地〕100ml中に懸濁す
る。

【０１７２】該懸濁液を96穴培養用プレートに100μl/
穴ずつ分注し、5% ＣＯ₂インキュベーター中、37℃で7
〜14日間培養する。培養後、培養上清の一部をとりアン
チボディイズ〔Antibodies, A Laboratorymanual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988)〕等に
述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペ
プチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイ
ブリドーマを選択する。酵素免疫測定法の具体例とし
て、以下の方法をあげることができる。

【０１７３】免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプ
チドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコート
し、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の(ｄ)で得ら
れる精製抗体を第一抗体として反応させ、更に第二抗体
としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化
合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブ
リン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行
い、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本
発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマと
して選択する。

【０１７４】該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法に
よりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、HT培地
（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目
は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認め
られたものを本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ株として選択する。

【０１７５】(d)モノクローナル抗体の調製プリスタン処理〔2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン
（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する〕し
た8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(c)で取得
した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマ細胞5〜20×10⁶細胞/匹を腹腔内に注射す
る。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹
水癌化したマウスから腹水を採取し、3,000rpmで5分間
遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポ
リクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナ
ル抗体を精製、取得することができる。抗体のサブクラ
スの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキッ
トまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを
用いて行う。ポリペプチド量は、ローリー法あるいは28
0nmでの吸光度より算出する。上記で取得される抗体は
本発明の抗体である。

【０１７６】該抗体は、抗体を用いた通常のアッセイ、
即ち、ラジオイムノアッセイ（RIA）、競合的結合アッ
セイ、免疫組織化学染色法（ABC法、CSA法など）、免役
沈降法、ウェスタンブロット分析、ELISAアッセイ等に
用いることができる〔An Introduction to Radioimmuno
assay and Related Techniques, エルセビア・サイエン
ス出版社（1986）、Techniques in Immunocytochemistr
y, アカデミック・プレス第１巻(1982), 第2巻（198
3）,第3巻(1985)、Practice and Theory of Enzyme Imm
unoassays, エルセビア・サイエンス出版社(1985)、酵
素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊（1976年）、Ant
ibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory (1988)、単クローン抗体実験マニュアル（講
談社サイエンティフィック）（1987）、続生化学実験講
座５, 免役生化学研究法（東京化学同人）（1986）〕。

【０１７７】本発明の抗体はそのまま、あるいは標識し
て用いることができる。標識としては、ラジオアイソト
ープ、アフィニティー標識（ビオチン、アビジンな
ど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカ
リホスファターゼなど）、蛍光標識（FITCまたはローダ
ミンなど）、常磁性原子を用いた標識をあげることがで
きる〔J. Histochem. Cytochem., 18, 315 (1970）, Me
th. Enzym.,62, 308 (1979), Immunol., 109, 129 (197
2), J. Immunol. Meth., 13, 215 (1979)〕。

【０１７８】標記アッセイ法、後述のポリペプチドアレ
イあるいはプロテオーム解析法により、該抗体あるいは
該標識抗体を用い、コリネ型細菌における本発明のポリ
ペプチドの発現、該発現の変動、該ポリペプチドの構造
変化の有無、コリネ型細菌以外の生物における本発明の
ポリペプチドに相応するポリペプチドの存在の有無を解
析することができる。また、本発明の抗体を用いたイム
ノアフィニティクロマトグラフにより、該抗体の認識す
るポリペプチドを精製することができる。

【０１７９】１２．ポリペプチドアレイの作製および利
用（１）ポリペプチドアレイの作製上記１０．で取得される本発明のポリペプチド、または
上記１１．で取得される本発明の抗体を用いて、ポリペ
プチドアレイを作製することができる。本発明のポリペ
プチドアレイとは、プロテインチップと呼ばれるものを
含み、本発明のポリペプチドまたは抗体を固体支持体の
表面に複数固着させたものをいう。

【０１８０】固体支持体としては、ポリカーボネートの
ようなプラスチック、ポリアクリルアミドのようなアク
リル樹脂、アガロースおよびセファロースのような複合
炭水化物、シリカもしくはシリカベースの材料、カーボ
ン、金属、無機ガラス、ラテックスビーズ等を用いるこ
とができる。本発明のポリペプチド、または抗体を、Bi
otechniques, 27, 1258-61 (1999)、Molecular medicin
e Today, 5, 326-7 (1999)、Handbook of Experimental
Immunology 4^th edition Blackwell Scientific Publi
cations chapter10 (1986)、Meth. Enzym., 34, (197
4)、Advances in Experimental Medicine and Biology,
42 (1974)、US4,681,870、US4,282,287、US4,762,881、
等に記載の方法に準じて、固体支持体表面へ固着するこ
とができる。固体支持体へ本発明のポリペプチド、また
は抗体を高密度に固着することにより、後述の解析を効
率よく実施することが可能であるが、必ずしも高密度で
ある必要はない。

【０１８１】（２）ポリペプチドアレイの利用上記（１）で作製された本発明のポリペプチドを固着し
たポリペプチドアレイを用いると、アレイに固着された
本発明のポリペプチドと結合し、相互作用するポリペプ
チドまたは化合物を同定することができる。即ち、本発
明のポリペプチドについて、下記（i）〜（iv）の工程
を実施することにより、該ポリペプチドと結合し、相互
作用するポリペプチドまたは化合物を探索することがで
きる。

【０１８２】（i）上記（１）の方法で本発明のポリペ
プチドが固着したポリペプチドアレイを作製する工程（ii）該ポリペプチドアレイ上に固定化された本発明の
ポリペプチドと、任意の第２ポリペプチドまたは化合物
の少なくとも一つとをインキュベートする工程 (iii)アレイ上に固定化されたポリペプチドと第２ポリ
ペプチドまたは化合物の少なくとも一つとで形成された
結合体を、例えば、第２ポリペプチドまたは化合物の少
なくとも一つと結合した標識、あるいは該結合体とまた
は不結合物質が除去された後の該結合体の成分と特異的
に結合する標識を用いて検出する検出工程（iv）該検出結果を解析する解析工程

【０１８３】本発明のポリペプチドが固着したポリペプ
チドアレイとして、具体的には、配列番号3502〜7001か
ら選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、該ポリ
ペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基
が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ該ポリペプチドの活性と実質的に同一の活
性を有するポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸配
列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、
かつ該ポリペプチドの活性と実質的に同一の活性を有す
るポリペプチド、該ポリペプチドの部分断片ポリペプチ
ド、および/または該ポリペプチドの一部のアミノ酸配
列を有するペプチドを、１以上固体支持体に固着したポ
リペプチドアレイをあげることができる。

【０１８４】また、上記（１）で作製された本発明の抗
体を固着したポリペプチドアレイを用いると、コリネ型
細菌のポリペプチドの発現量の解析を行うことが可能と
なる。即ち、コリネ型細菌の変異株由来遺伝子につい
て、下記（i）〜（iv）の工程を実施することにより、
該遺伝子の発現量を解析することができる。（i）上記（１）の方法でポリペプチドアレイを作製す
る工程（ii）該ポリペプチド（第１抗体）アレイととコリネ型
細菌由来のポリペプチドとをインキュベートする工程（iii）アレイ上に固定化された抗体と結合したポリペ
プチドを、標識した本発明の第２抗体を用いて検出する
検出工程 (iv)該検出結果を解析する解析工程

【０１８５】本発明の抗体が固着したポリペプチドアレ
イとして、具体的には、配列番号3502〜7001から選ばれ
るアミノ酸配列を有するポリペプチド、該ポリペプチド
のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、
置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、
かつ該ポリペプチドの活性と実質的に同一の活性を有す
るポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸配列と60％
以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該ポリ
ペプチドの活性と実質的に同一の活性を有するポリペプ
チド、該ポリペプチドの部分断片ポリペプチド、および
/または該ポリペプチドの一部のアミノ酸配列を有する
ペプチドを認識する抗体を、1以上固体支持体に固着し
たポリペプチドアレイをあげることができる。

【０１８６】また、コリネ型細菌由来のポリペプチドと
して、培養経時に応じて取得されたポリペプチドを用い
ることにより、特定のポリペプチドの発現変動を追跡す
ることができる。該変動を把握することにより、培養条
件を最適化することが可能となる。コリネ型細菌の変異
株由来のポリペプチドを用いた場合には、変異ポリペプ
チドを検出することができる。

【０１８７】１３．プロテオーム解析による変異株にお
ける有用変異の同定通常、プロテオームはポリペプチドを２次元電気泳動で
分離し、分離されたポリペプチドを酵素消化後、質量分
析計(ＭＳ)とデータベース検索を用いて、該ポリペプチ
ドを同定する方法を指す。２次元電気泳動とは、原理の
異なる２種類の電気泳動を組み合わせて行う電気泳動法
のことである。例えば、１次泳動をポリペプチドの分子
量で分離し、次いでゲルを90度または、180度回転さ
せ、等電点で２次泳動し、分離することによりさまざま
な分離パターンを実現させることができる（JIS K 3600
2474）。

【０１８８】データベース検索には、上記２．および
８．で作製された本発明のポリペプチドのアミノ酸配列
情報、および本発明の記録媒体を利用することができ
る。コリネ型細菌および該微生物の変異株をそれぞれプ
ロテオーム解析することにより、両者間で変動の認めら
れたポリペプチドを同定することが可能である。コリネ
型細菌の野生型株と目的産物の生産性が向上した生産菌
株をそれぞれプロテオーム解析することにより、目的産
物の生産能力の向上を目的とした育種に有用な変異蛋白
質や発現量が変動した蛋白質を効率良く同定できる。具
体的には、Corynebacterium glutamicumにおいては、野
生型株とリジン工程菌株をそれぞれプロテオーム解析す
ることにより、野生型株に比べてリジン工程菌株で増大
するスポットを見出し、データベース検索することによ
り、リジンの生産性の向上に応じて、生産量が増大する
ポリペプチドを同定することができる。例えば、野生型
株とリジン工程菌株のプロテオーム解析により、配列番
号3785で示されるアミノ酸配列を有するカタラーゼの生
産量が、リジン生産菌変異株において増加していること
を見出すことができる。

【０１８９】また、本発明のコリネゲノムの塩基配列情
報、アミノ酸配列情報および該配列が記録された記録媒
体を用い、発現レベルの高い蛋白質をプロテオーム解析
により同定することにより、該蛋白質をコードする遺伝
子の塩基配列とその上流域の塩基配列も同時に検索する
ことが可能となり、高発現プロモーターとしての機能を
有する塩基配列を効率的に選択することができる。ま
た、プロテオーム解析においては、変動するスポットが
修飾を受けた蛋白質に由来することがあるが、本発明の
コリネゲノムの塩基配列情報、アミノ酸配列情報および
該配列が記録された記録媒体を用いた検索により、修飾
を受けた蛋白質を効率良く同定することができる。

【０１９０】更に、同定された該蛋白質に関わる塩基配
列（プロモーター、ＯＲＦ等の塩基配列）を本発明のコ
リネゲノムの塩基配列情報、アミノ酸配列情報および該
配列が記録された記録媒体を用いて検索し、見出された
塩基配列を基に設計したプライマーを使用することによ
り、容易に有用変異株の有する有用変異点を特定するこ
とができる。該変異点が特定されることにより、容易に
該有用変異あるいは該有用変異から導かれる有用変異を
有する、産業上有用な変異株を育種することができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明の内容がこれら
に限定されるものではない。

【０１９１】

【実施例】実施例１ Corynebacterium glutamicumのゲ
ノムの全塩基配列の決定Corynebacterium glutamicumのゲノムの全塩基配列の決
定は全ゲノムショットガン法〔Science, 269, 496-512
(1995)〕を基本とした。この方法では、ゲノムライブラ
リーを作成し、その末端配列をランダムに決定し、その
配列をコンピューター上で連結し、全ゲノムを覆ってい
った。具体的には以下のように行った。

【０１９２】（１）Corynebacterium glutamicum ATCC1
3032株のゲノムＤＮＡの調製Corynebacterium glutamicum ATCC13032株を1％グリシ
ンを含むBY培地（7g/l肉エキス、10g/l ペプトン、3g/l
塩化ナトリウム、5g/l 酵母エキス、pH7.2）50mlで30
℃にて終夜培養し、遠心分離により菌体を回収した。Ｓ
ＴＥバッファー（10.3％スクロース、25mmol/l Tris塩
酸塩、25mmol/l EDTA、pH8.0）で菌体を洗浄した後、10
mg/mlのリゾチームを含むSTEバッファー10mlに懸濁し、
37℃で1時間緩やかに振とうした。10% SDSを2ml添加し
て溶菌させ、65℃で10分間保持したのち、常温まで冷却
した。10mlのTris中和フェノールを加え、室温で30分間
緩やかに振とうした後、遠心分離（15,000×ｇ、20分
間、20℃）を行った。水層を分取し、同様の操作でフェ
ノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出（２回）
を行った後、水層に1/10量の3mol/l酢酸ナトリウム溶液
（pH5.2）、２倍量のイソプロパノールを加え、緩やか
に混和し、ゲノムＤＮＡを沈殿させた。再びゲノムＤＮ
Ａを0.02mg/mlのＲＮａｓｅを含むTEバッファー（10mmo
l/l Tris塩酸塩、1mmol/l EDTA、pH8.0）3mlに溶解し、
37℃にて45分間保持した後、上記と同様にフェノール抽
出、フェノール/クロロホルム抽出、クロロホルム抽出
を行った。イソプロパノール沈殿を行い、生じたゲノム
ＤＮＡ沈殿を70％エタノールで３回洗浄した後、風乾
し、1.25mlのTEバッファーに溶解して、ゲノムＤＮＡ溶
液（濃度0.1mg/ml）を得た。

【０１９３】（２）ショットガンライブラリーの作製調製したCorynebacterium glutamicum ATCC13032株ゲノ
ムDNA 0.01mgを、全量0.4mlになるようにTEバッファー
を加え、ソニケーター（yamato powersonic model 50）
で、出力20で連続5秒間処理し、1〜10 kbの断片に分断
した。ＤＮＡブランティングキット (DNA Blunting ki
t、宝酒造社製)を用いて、ゲノム断片の末端を平滑化し
たのち、6％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
画した。1〜2 kbのゲノム断片をゲルから切り出し、0.3
mlのMG溶出バッファー（0.5mol/l 酢酸アンモニウム、1
0mmol/l 酢酸マグネシウム、1mmol/l EDTA、0.1％ SD
S）を加え、37℃で終夜振とうしてＤＮＡを溶出した。
ＤＮＡ溶出液をフェノール/クロロホルム処理後、エタ
ノール沈殿しゲノムライブラリーインサートを得た。Ｔ
４リガーゼ (宝酒造社製)を用いて、インサート全量とp
UC18 SmaI/BAP(Amersham Pharmacia Biotech社製) 500n
gとを16℃で、40時間ライゲーションした。

【０１９４】ライゲーション反応物をエタノール沈殿
し、0.01mlのTEバッファーに溶解した。大腸菌ELECTRO
MAX DH10B（Life Technologies社製）0.04mlに対して0.
001mlのライゲーション溶液を、添付実験書に示された
条件で、エレクトロポレーションにより導入した。これ
を0.1mg/ml アンピシリン、0.1mg/ml X-gal、1mmol/lイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）
を含むLB平板培地〔寒天を1.6％含むLB培地（10g/l バ
クトトリプトン、5g/l 酵母エキス、10g/l 塩化ナトリ
ウム、pH7.0）〕に塗布し、37℃終夜培養した。

【０１９５】該平板培地上に形成されたコロニーより得
られた形質転換体を、0.1mg/ml アンピシリンを含むＬ
Ｂ培地0.05mlを添加した96穴タイタープレート中で、37
℃終夜静置培養した後、20％グリセロールを含むＬＢ培
地を0.05ml加え、攪拌してグリセロールストックとして
用いた。

【０１９６】（３）コスミドライブラリーの作成Corynebacterium glutamicum ATCC13032株ゲノムＤＮＡ
約0.1mgをSau3AI（宝酒造社製)で部分消化し、10％およ
び40％スクロースバッファー（1mol/l NaCl、20mmol/l
Tris塩酸塩、5mmol/l ＥＤＴＡ、10％又は40％スクロー
ス、pH8.0）を用いて作製した10〜40％ショ糖密度勾配
を用いて、超遠心分離（26,000rpm、18時間、20℃）を
行った。遠心分離後1mlずつチューブに分取し、アガロ
ースゲル電気泳動で各画分のＤＮＡ断片長を確認した
後、40kbのＤＮＡ断片を多く含む画分をエタノール沈殿
した。

【０１９７】このＤＮＡ断片をsuperCos1(Stratagene社
製)のBamHI部位に、添付実験手順書に従い連結した。連結
産物は、Gigapack III Gold Packaging Extract（Strata
gene社製）を用いて、添付実験手順書に従い、大腸菌XL
1-BlueMR（Stratagene社製）株に導入した。これをアン
ピシリン0.1mg/mlを含むLB平板培地に塗布し、37℃で終
夜培養し、コロニーを単離した。得られたコロニーは、
96穴タイタープレートでアンピシリン0.1mg/mlを含むＬ
Ｂ培地各ウェル0.05mlで37℃終夜静置培養した後、20％
グリセロールを含むＬＢ培地を0.05ml加え、攪拌してグ
リセロールストックとした。

【０１９８】（４）塩基配列の決定（４−１）鋳型の調製Corynebacterium glutamicum ATCC13032株ゲノムの全塩
基配列を全ゲノムショットガン法を基本にして決定し
た。該方法で用いた鋳型は上記（２）で調製したライブ
ラリーよりＰＣＲ法を用いて調製した。具体的には、ア
ンピシリン0.1mg/mlを含むＬＢ培地をウェルあたり0.08
mlずつ分注した96穴タイタ−プレートに全ゲノムショッ
トガンライブラリー由来クローンをレプリケーター（GE
NETIX社製）で植菌し、37℃で終夜静置培養を行った。
該培養液を、ＰＣＲ用反応液［TaKaRa Ex Taq（宝酒造
社製）］を0.025mlずつ分注した96穴リアクションプレ
ート（PE Biosystems社製）に、コピープレート（トッ
ケン社製）を用いて移し、GeneAmp PCR System 9700 (P
E Biosystems社製)を用い、牧野らのプロトコール〔DNA
Research, 5, 1-9 (1998)〕に従いＰＣＲを行い、挿入
断片の増幅を行った。

【０１９９】ＰＣＲ産物精製用キット（Amersham Pharm
acia Biotech社製）により余剰プライマーおよびヌクレ
オチドの除去を行い、これをシーケンス反応の鋳型とし
て用いた。一部の塩基配列決定は２本鎖ＤＮＡプラスミ
ドを鋳型にして行った。鋳型として用いる２本鎖ＤＮＡ
プラスミドは以下の方法で取得した。アンピシリン0.05
mg/mlを含む2×YT培地（16g/l バクトトリプトン、10g/
l 酵母エキス、5g/l 塩化ナトリウム、pH7.0）を1.5ml
ずつ分注した24穴または96穴プレートの各ウェルに、全
ゲノムショットガンライブラリー由来クローンを植菌
し、37℃で終夜振とう培養を行った。

【０２００】該培養液より、プラスミド自動調製機KURA
BO PI-50（倉敷紡績社製）またはマルチスクリーン(Mil
lipore社製)を用い、倉敷紡績社もしくはMillipore社の
プロトコールに従って、２本鎖ＤＮＡプラスミドを調製
した。マルチスクリーンを用いた２本鎖ＤＮＡプラスミ
ドの精製には、ベックマンコールター社のバイオメック
2000等を用いた。得られた２本鎖ＤＮＡプラスミドを0.
1mg/ml程度になるように水に溶解し、シーケンシング用
の鋳型として用いた。

【０２０１】（４−２）シーケンス反応 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction Kit（PE Biosystems社製）溶液６μｌに対
し、M13順方向(M13-21)プライマー又はM13逆方向(M13RE
V)プライマー〔DNA Research, 5, 1-9 (1998)〕、およ
び上記（４−１）で調製した鋳型（ＰＣＲ産物又はプラ
スミド）を混ぜ10μlのシーケンス反応液とした。プラ
イマーおよび鋳型の量は各々1.6pmoleおよび50〜200ng
である。該反応液を用い、GeneAmp PCR System 9700 (P
E Biosystems社製)で45サイクルのダイターミネーター
シーケンス反応を行った。サイクルパラメーターはABIP
RISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reac
tion Kitに付属するマニュアルに従った。サンプルの精
製はMultiScreen HV plate（Millipore社製）を用い、M
illipore社のマニュアルに従って行った。精製された反
応物はエタノール沈殿、乾燥の後、−30℃の暗所で保存
した。

【０２０２】ABI PRISM 377 DNA Sequencer およびABI
PRISM 3700 DNA Analyser（いずれもPE Biosystems社
製）を用い、付属のマニュアルに従い、該乾燥反応物を
分析した。377 DNA Sequencerで得られた約42,000配列
と3700 DNA Analyserで得られた約8,000反応の合計約5
0,000配列のデータは、サーバー（アルファサーバー410
0；COMPAQ社製）へ転送し保存した。約50,000配列分の
データは、ゲノムサイズの約6倍に相当した。

【０２０３】（５）アセンブリ全ての作業はＵＮＩＸプラットフォームに基づき行い、
解析結果の出力はXウィンドウシステムを用いマッキン
トッシュプラットフォームで行った。ベースコールをph
red(The University of Washington)で、ベクター配列
の除去をSPS Cross Match(Southwest Parallel Softwar
e社製)で行い、アセンブリをphrap(The University of
Washington)の高速版であるSPS Phrap(Southwest Paral
lel Software社製)で行った。アセンブリの結果得られ
るコンティグはグラフィカルエディターconsed（The Un
iversity of Washington）を用いて解析した。ベースコ
ールからアセンブリまでの一連の作業はconsedに付属す
るスクリプトphredPhrapを利用することで一括して行っ
た。

【０２０４】（６）ギャップ部分の塩基配列決定（３）で構築したコスミドライブラリー中の各コスミド
を（４−１）に記載した２本鎖ＤＮＡプラスミド調製と
同様な方法で調製した。このコスミドの挿入断片末端部
の塩基配列をABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequ
encing Ready Reaction Kit（PE Biosystems社製)を用
いて、付属するマニュアルに従って決定した。

【０２０５】コスミド約800クローンの挿入断片の両末
端のシーケンシングを行い、その配列と一致する（５）
で得られたショットガンシーケンシング由来コンティグ
中の塩基配列を検索した。この作業により各コスミドク
ローンと各コンティグの連鎖関係を解明し、相互整列化
を行った。また、この結果をCorynebacterium glutamic
um ATCC13032株のフィジカルマップ〔Mol. Gen. Gene
t., 252, 255-265 (1996)〕と対応させることにより、
コスミドとコンティグのマッピングを行った。

【０２０６】また、コンティグではカバーされない領域
（ギャップ部）の配列は、以下の方法で決定した。コン
ティグの末端に位置する配列を含むクローンを選抜し
た。これらの中から、挿入断片の片側の末端のみの配列
しか決定されていない約1,000クローンを選抜して、挿
入断片の逆末端の配列を決定した。引き続き、2つのコ
ンティグに、挿入断片のそれぞれの末端の配列が含まれ
るような全ゲノム由来ショットガンライブラリークロー
ンまたはコスミドクローンを同定し、該クローンの挿入
断片の全塩基配列を決定することにより、このギャップ
部分の塩基配列を決定した。ギャップ部分をカバーする
ショットガンライブラリークローンもしくはコスミドク
ローンがない場合には、そのコンティグ末端の配列に相
補するプライマーを作成し、ＰＣＲによってギャップ領
域のＤＮＡ断片を増幅し、これを鋳型としたプライマー
ウォーキング法、もしくは増幅したＰＣＲ断片から調製
したショットガンクローンの配列を決定するショットガ
ン法によりシーケンシングを行い、該領域の塩基配列を
決定した。

【０２０７】配列精度の低い領域については、consed(T
he University of Washington) のAUTOFINISH機能とNAV
IGATING機能を利用してプライマーを合成し、プライマ
ーウォーキング法により配列決定を行い配列精度を高め
た。このようにして決定したCorynebacterium glutamic
um ATCC13032株ゲノムの全塩基配列を配列番号１に示
す。

【０２０８】（７）ＯＲＦの同定と機能推定配列番号１に示される塩基配列中のＯＲＦの同定は、以
下のように実施した。まず、ＵＮＩＸプラットフォーム
上にてＯＲＦ同定ソフトウェアGlimmer、GeneMark、お
よびGeneMark.hmmを用いて、ソフトウェアに付属するマ
ニュアルに従って、ＯＲＦ領域の推定を行った。それら
の結果をもとに、配列番号１に示される塩基配列中のＯ
ＲＦを同定した。ＯＲＦの機能推定は、同定されたＯＲ
Ｆの塩基配列をGeneBankデータベース由来の蛋白質コー
ド領域からなるデータベースであるSwiss-Prot、PIR、Ge
nPept等のアミノ酸データベースに対して、相同性検索
ソフトウェアFrameSearch（Compugen社製）を用いた相
同性検索することにより、または、同定されたＯＲＦの
アミノ酸配列をGeneBankデータベース由来の蛋白質コー
ド領域からなるデータベースであるSwiss-Prot、PIR、Ge
nPept等のアミノ酸データベースに対して、相同性検索
ソフトウェアBLASTを用いて相同性検索することにより
行った。このようにして決定したＯＲＦの塩基配列を配
列番号2〜3501に、また当該ＯＲＦにコードされるアミ
ノ酸配列を配列番号3502〜7001に示す。

【０２０９】ここで、ATG以外の塩基配列TTG、TGT、GGT
等も、Metをコードする開始コドンとされる場合があ
る。相同性検索ソフトウェアFrameSearch（Compugen
社）によるアミノ酸翻訳配列での相同性検索の結果、該
ＯＲＦ配列と最も相同性が高いと判定される配列の上記
データベースにおける登録番号およびその配列の遺伝子
名、その遺伝子の機能、並びに該公知のアミノ酸翻訳配
列との比較において見出された一致長とその同一性およ
び類似性を第1-1〜第1-180表に示した。更に当該位置
を、任意のＯＲＦの塩基配列と配列番号１の塩基配列と
のアラインメントを取ることにより確認した。ＯＲＦ以
外の塩基配列（例えばリボソームＲＮＡ遺伝子やトラン
スファーＲＮＡ遺伝子、ＩＳ配列等）についても、同様
にゲノム上の位置決定をした。Corynebacterium glutam
icum ATCC13032株の代表的な遺伝子のゲノム上の位置を
図１に示した。

【０２１０】

【表１】

【０２１１】

【表２】

【０２１２】

【表３】

【０２１３】

【表４】

【０２１４】

【表５】

【０２１５】

【表６】

【０２１６】

【表７】

【０２１７】

【表８】

【０２１８】

【表９】

【０２１９】

【表１０】

【０２２０】

【表１１】

【０２２１】

【表１２】

【０２２２】

【表１３】

【０２２３】

【表１４】

【０２２４】

【表１５】

【０２２５】

【表１６】

【０２２６】

【表１７】

【０２２７】

【表１８】

【０２２８】

【表１９】

【０２２９】

【表２０】

【０２３０】

【表２１】

【０２３１】

【表２２】

【０２３２】

【表２３】

【０２３３】

【表２４】

【０２３４】

【表２５】

【０２３５】

【表２６】

【０２３６】

【表２７】

【０２３７】

【表２８】

【０２３８】

【表２９】

【０２３９】

【表３０】

【０２４０】

【表３１】

【０２４１】

【表３２】

【０２４２】

【表３３】

【０２４３】

【表３４】

【０２４４】

【表３５】

【０２４５】

【表３６】

【０２４６】

【表３７】

【０２４７】

【表３８】

【０２４８】

【表３９】

【０２４９】

【表４０】

【０２５０】

【表４１】

【０２５１】

【表４２】

【０２５２】

【表４３】

【０２５３】

【表４４】

【０２５４】

【表４５】

【０２５５】

【表４６】

【０２５６】

【表４７】

【０２５７】

【表４８】

【０２５８】

【表４９】

【０２５９】

【表５０】

【０２６０】

【表５１】

【０２６１】

【表５２】

【０２６２】

【表５３】

【０２６３】

【表５４】

【０２６４】

【表５５】

【０２６５】

【表５６】

【０２６６】

【表５７】

【０２６７】

【表５８】

【０２６８】

【表５９】

【０２６９】

【表６０】

【０２７０】

【表６１】

【０２７１】

【表６２】

【０２７２】

【表６３】

【０２７３】

【表６４】

【０２７４】

【表６５】

【０２７５】

【表６６】

【０２７６】

【表６７】

【０２７７】

【表６８】

【０２７８】

【表６９】

【０２７９】

【表７０】

【０２８０】

【表７１】

【０２８１】

【表７２】

【０２８２】

【表７３】

【０２８３】

【表７４】

【０２８４】

【表７５】

【０２８５】

【表７６】

【０２８６】

【表７７】

【０２８７】

【表７８】

【０２８８】

【表７９】

【０２８９】

【表８０】

【０２９０】

【表８１】

【０２９１】

【表８２】

【０２９２】

【表８３】

【０２９３】

【表８４】

【０２９４】

【表８５】

【０２９５】

【表８６】

【０２９６】

【表８７】

【０２９７】

【表８８】

【０２９８】

【表８９】

【０２９９】

【表９０】

【０３００】

【表９１】

【０３０１】

【表９２】

【０３０２】

【表９３】

【０３０３】

【表９４】

【０３０４】

【表９５】

【０３０５】

【表９６】

【０３０６】

【表９７】

【０３０７】

【表９８】

【０３０８】

【表９９】

【０３０９】

【表１００】

【０３１０】

【表１０１】

【０３１１】

【表１０２】

【０３１２】

【表１０３】

【０３１３】

【表１０４】

【０３１４】

【表１０５】

【０３１５】

【表１０６】

【０３１６】

【表１０７】

【０３１７】

【表１０８】

【０３１８】

【表１０９】

【０３１９】

【表１１０】

【０３２０】

【表１１１】

【０３２１】

【表１１２】

【０３２２】

【表１１３】

【０３２３】

【表１１４】

【０３２４】

【表１１５】

【０３２５】

【表１１６】

【０３２６】

【表１１７】

【０３２７】

【表１１８】

【０３２８】

【表１１９】

【０３２９】

【表１２０】

【０３３０】

【表１２１】

【０３３１】

【表１２２】

【０３３２】

【表１２３】

【０３３３】

【表１２４】

【０３３４】

【表１２５】

【０３３５】

【表１２６】

【０３３６】

【表１２７】

【０３３７】

【表１２８】

【０３３８】

【表１２９】

【０３３９】

【表１３０】

【０３４０】

【表１３１】

【０３４１】

【表１３２】

【０３４２】

【表１３３】

【０３４３】

【表１３４】

【０３４４】

【表１３５】

【０３４５】実施例２有効変異点の解明（１）リジン生産菌B-6株と野生型株ATCC13032の遺伝
子塩基配列比較による変異点の同定Corynebacterium glutamicum B-6株〔（S-(２-アミノエ
チル)-システイン（AEC）、リファンピシン、ストレプ
トマイシン、および６-アザウラシルに耐性を有する〕
は、野生型株ATCC13032から突然変異剤のＮ−メチル−
Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(NTG)によるラン
ダム変異と選択を多段階にわたり繰り返すことによって
変異育種されたリジン生産変異株である〔Appl Microbi
ol Biotechnol, 32, 269-273 (1989)〕。まず、リジン
生産に関連すると考えられるB-6株由来の遺伝子につい
て、塩基配列を前述と同様な方法によって決定した。リ
ジン生産関連遺伝子には、リジン排出系遺伝子であるly
sEおよびlysG、リジン生合成系遺伝子であるddh、dap
A、hom、およびlysC（各々、ジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼ、ジヒドロピコリン酸シンターゼ、ホモセリ
ンデヒドロゲナーゼ、およびアスパルトキナーゼをコー
ド）、そして糖代謝系遺伝子であるpycおよびzwf（各
々、ピルビン酸カルボキシラーゼ、グルコース-６-リン
酸デヒドロゲナーゼをコード）の遺伝子が含まれてい
る。これら生産菌由来の遺伝子の塩基配列を、配列番号
1〜3501で示されたATCC13032株ゲノムの対応する塩基配
列と比較解析した。その結果、多数の遺伝子に変異点が
見出された。例えば、lysE、lysG、ddh、dapAなどには
変異点は見出されなかったが、hom、lysC、pyc、zwfな
どにはアミノ酸置換変異が見出された。それらの変異点
の中から、既知の生化学的あるいは遺伝学的情報に基づ
いて、生産に寄与していると予想される変異点を抽出し
た。このようにして抽出した変異点の内、hom内変異Val
59Alaおよびpyc内変異Pro458Serについて、それら変異
が有効変異であるか否かの評価を以下のように行った。

【０３４６】（２） hom内変異Val59Alaおよびpyc内変
異Pro458Serの評価ホモセリンの要求性または部分要求性をもたらすhomの
変異は、野生型株にリジンの生産を付与することは公知
である（アミノ酸発酵、相田浩ら編、学会出版センタ
ー）。しかし、hom内変異Val59Alaとリジン生産との関
連についてはこれまで知見がない。hom内変異Val59Ala
が有効変異か否かは、野生型株に該変異を導入し、得ら
れた菌株のリジン生産能を調べることにより明らかにす
ることができる。一方、pyc内変異Pro458Serが有効か否
かを調べるには、リジン生合成経路の代謝調節が解除さ
れており、かつ該pyc変異を有していないリジン生産菌
株に該変異を導入して、得られた菌株のリジン生産性を
親株と比較することにより明らかにすることができる。
そのようなリジン生産菌として、No.58株（FERM BP-713
4）を選択した。以上に基づき、hom内変異Val59Alaおよ
びpyc内変異Pro458Serを遺伝子置換法を用いて、それぞ
れ、Corynebacterium glutamicumの野生型株 ATCC13032
およびリジン生産菌No.58株に導入することを試みるこ
ととし、そのための遺伝子置換用プラスミドベクターpC
ES30を以下のように作製した。

【０３４７】カナマイシン耐性遺伝子を有し、コリネ型
細菌で自律複製可能なプラスミドベクターpCE53〔Mol.
Gen. Genet., 196, 175-178 (1984)〕および枯草菌のレ
バンシュクラーゼ遺伝子（sacB）を含むプラスミドpMOB
3（ATCC 77282）〔MolecularMicrobiology, 6, 1195-12
04 (1992)〕を各々PstIで切断した。次いで、アガロー
スゲル電気泳動後、pCE53断片およびsacBを含む2.6 kb
のＤＮＡ断片をそれぞれGENECLEAN Kit(BIO 101社製)を
用いて抽出精製した。pCE53断片と該2.6 kbのＤＮＡ断
片とをライゲーションキットver.2（宝酒造社製）を用
いて連結し、ATCC13032株に電気穿孔法〔FEMS Microbio
logy Letters, 65, 299 (1989)〕により導入し、25μg/
mlのカナマイシンを含むBYG寒天培地〔10g グルコー
ス、20g ペプトン（極東製薬工業社製）、5g 酵母エキ
ス（Difco社製）、16g バクトアガー（Difco社製）を水
1Lに含みpH7.2に調整した培地〕上にて30℃で2日間培養
し、カナマイシン耐性になった形質転換株を取得した。
得られた形質転換株からアルカリＳＤＳ法により抽出し
たプラスミドは、制限酵素による切断解析の結果、pCE5
3のPstI部位に該2.6 kbのＤＮＡ断片が挿入された構造
を有していることを確認した。該プラスミドをpCES30と
命名した。

【０３４８】次に、変異点を有する2種の遺伝子、homお
よびpycをＰＣＲ法にて増幅し、ＴＡクローニング法
（バイオ実験イラストレイテッドvol.3）により、pCES3
0に挿入した。具体的には、pCES30をBamHI（宝酒造社
製）で切断後、アガロース電気泳動し、GENECLEAN Kit
(BIO 101社製)を用いて抽出精製した。得られたpCES30
断片の両末端をＤＮＡブランティングキット（DNA Blun
ting Kit、宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールに
従って、平滑化した。平滑化したpCES30断片をフェノー
ル・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮し
た後、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Roche diagnosti
cs社製）、ｄＴＴＰ存在下で70℃、2時間反応させ、
３’末端にチミン（Ｔ）を1塩基を付加して、pCES30の
Ｔベクターを調製した。

【０３４９】一方、リジン生産菌B-6株より染色体ＤＮ
Ａを斎藤らの方法〔Biochimica et Biophysica Acta, 7
2, 619 (1963)〕により調製し、これを鋳型として、変
異型hom遺伝子の場合は配列番号7002および7003で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとし
て、一方、変異型pyc遺伝子の場合は配列番号7004およ
び7005で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマー
セットとして、それぞれPfu turbo DNAポリメラーゼ（S
tratagene社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。得られ
たＰＣＲ産物をアガロース電気泳動した後、GENECLEAN
Kit(BIO 101社製)を用いて抽出精製した。次いで、この
ＰＣＲ産物をＴａｑポリメラーゼ（Roche diagostics
社製）、ｄＡＴＰ存在下で72℃、10分間反応させ、３’
末端にアデニン（Ａ）を１塩基付加した。

【０３５０】上記のpCES30のＴベクター断片とＡ塩基を
付加したＰＣＲ産物の変異型hom遺伝子（1.7 kb）また
は変異型pyc遺伝子（3.6 kb）をフェノール・クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈殿により濃縮後、ライゲーシ
ョンキットver.2を用いて連結した。該連結物をATCC130
32株に電気穿孔法により導入し、25μg/mlのカナマイシ
ンを含むBYG寒天培地上にて30℃で2日間培養し、カナマ
イシン耐性になった形質転換株を取得した。得られた形
質転換株を25μg/mlのカナマイシンを含むBYG液体培地
にて終夜培養し、培養液からアルカリＳＤＳ法によりプ
ラスミドを抽出した。該プラスミドは、制限酵素による
切断解析の結果、pCES30に該1.7 kbまたは該3.6 kbのＤ
ＮＡ断片が挿入された構造を有していることを確認し
た。このようにして作製したプラスミドをそれぞれ、pC
hom59、pCpyc458と命名した。

【０３５１】遺伝子置換法による野生型株ATCC13032お
よびリジン生産菌No.58株への両変異の導入は次のよう
な方法で行った。すなわち、ATCC13032株およびNo.58株
にそれぞれ、pChom59およびpCpyc458を導入後、池田ら
の方法〔Microbiology、144、1863 (1998)〕を用いて該
プラスミドが相同組み換えで染色体ＤＮＡ中に組み込ま
れた株を選択した。次いで、pCES30にコードされる枯草
菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利
用した選択法〔J. of Bacteriol., 174, 5462 (1992)〕
により２度目の相同組み換えが行われた株を選択し、該
選択株の中からATCC13032株およびNo.58株が従来保有し
ていた野生型のhomおよびpyc遺伝子が変異型のhomおよ
びpyc遺伝子にそれぞれ置換された株を単離した。以下
に、その具体的方法を示す。

【０３５２】プラスミドpChom59またはpCpyc458を保有
する該形質転換株の各１株を選択し、該菌株を20μg/ml
のカナマイシンを含むBYG培地中で培養し、電気穿孔法
によりpCG11（特公平6-91827）の導入操作を行った。ｐ
CG11は、スペクチノマイシン耐性遺伝子、およびpCE53
と同じ複製起点を有するプラスミドベクターである。pC
G11の導入操作後、該菌株を20μg/mlのカナマイシンお
よび100μg/mlのスペクチノマイシンを含むBYG寒天培地
上にて30℃で2日間培養し、カナマイシンおよびスペク
チノマイシンに耐性になった形質転換株を各々得た。こ
れらの形質転換株の各１株の染色体を、池田らの報告
〔Microbiology, 144, 1863 (1998)〕に従ってサザンブ
ロットハイブリダイゼーションにより調べた。その結
果、pChom59またはpCpyc458がCampbellタイプの相同組
み換えにより染色体に組み込まれていることが確かめら
れた。このような株では、野生型および変異型のhomま
たはpyc遺伝子が染色体上に近接して存在しており、そ
の間で２回目の相同組み換えが起こりやすくなってい
る。

【０３５３】該形質転換株（一回組換え体）の各々をSu
c寒天培地〔ショ糖 100g、肉エキス7g、ペプトン 10g、
塩化ナトリウム 3g、酵母エキス（Difco社製）5g、バク
トアガー（Difco社製）18gを水1Lに含みpH7.2に調整し
た培地〕上に塗布し、30℃で１日間培養して生育するコ
ロニーをそれぞれ選択した。sacB遺伝子が存在する株
は、ショ糖を自殺基質に転換するので、この培地では生
育できない〔J. Bacteriol., 174, 5462(1992)〕。これ
に対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型の
homまたはpyc遺伝子間での２回目の相同組み換えにより
sacB遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培
地で生育することができる。この相同組み換えの際に
は、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、
sacBとともに欠失する。このとき野生型がsacBとともに
欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったこと
になる。

【０３５４】このようにしてそれぞれ得られた２回組換
え体の染色体ＤＮＡを上記、斎藤らの方法により調製
し、hom遺伝子の場合は配列番号7002および7003で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとし
て、一方pyc遺伝子の場合は配列番号7004および7005で
表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットと
して、Pfu turbo ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社
製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。これ
らのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組
み換え体のhomまたはpyc遺伝子が野生型か変異型かを判
定した。その結果、HD-1およびNo.58pycと命名した2回
組換え体は、それぞれ変異型のhom遺伝子およびpyc遺伝
子を有する目的の菌株であることが確認された。

【０３５５】（３）HD-1株およびNo.58pyc株のリジン生
産試験取得したHD-1株（ATCC13032株にhom遺伝子内変異Val59A
laを導入した菌株）およびNo.58pyc株（No.58株にpyc遺
伝子内変異Pro458Serを導入した菌株）を、それぞれ、A
TCC13032株、No.58株をコントロールにして５リットル
ジャーファーメンターによる培養試験を行い、リジンの
生産性を調べた。

【０３５６】BYG寒天培地上で30℃で24時間培養した各
菌株を、種培地〔スクロース 50g、コーンスティープリ
カー 40g、硫酸アンモニウム 8.3g、尿素 1g、リン酸二
水素カリウム 2g、硫酸マグネシウム７水和物 0.83g、
硫酸鉄７水和物 10mg、硫酸銅５水和物 1mg、硫酸亜鉛
７水和物 10mg、β-アラニン 10mg、ニコチン酸 5mg、
チアミン塩酸塩 1.5mg、ビオチン 0.5mgを水1Lに含みpH
7.2に調整し、炭酸カルシウムを30g加えた培地〕250ml
を含む2リットルバッフル付き三角フラスコに植菌して3
0℃で12時間から16時間培養した。この種培養液全量を
本培養培地（グルコース 60g、コーンスティープリカー
20g、塩化アンモニウム 25g、リン酸二水素カリウム
2.5g、硫酸マグネシウム７水和物 0.75g、硫酸鉄７水和
物 50mg、硫酸マンガン５水和物 13mg、塩化カルシウム
２水和物 50mg、硫酸銅５水和物 6.3mg、硫酸亜鉛７水
和物 1.3mg、塩化ニッケル６水和物 5mg、塩化コバルト
６水和物 1.3mg、モリブデン酸アンモニウム４水和物
1.3mg、ニコチン酸 14mg、β-アラニン 23mg、チアミン
塩酸塩 7mg、ビオチン 0.42mgを水1Lに含む培地）1,400
mlを含む5リットルジャーファーメンターに植菌し、32
℃、1vvm、800rpm条件下で、pH7.0にアンモニア水で調
整しながら培養した。培地中のグルコースが消費された
時点でグルコース・フィード液（グルコース 400g、塩
化アンモニウム 45gを水1Lに含む培地）を連続的に添加
した。該フィード液の添加は、溶在酸素濃度が0.5〜3pp
mの範囲に維持されるように流加速度を調整しながら行
い、培養時間が２９時間に達したところで培養を終了し
た。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中の
L-リジン塩酸塩の蓄積量を高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）により定量した。結果を第２表に示す。

【０３５７】

【表１３６】

【０３５８】第２表から明らかなように、hom内変異Val
59Alaまたはpyc内変異Pro458Serの導入により、リジン
生産性の付与あるいは向上が認められことから、両変異
はいずれもリジン生産に関わる有効変異であることが解
明された。Corynebacteriumglutamicumの野生型株ATCC1
3032に、hom遺伝子内変異Val59Alaとpyc遺伝子内変異Pr
o458Serを、lysC遺伝子内変異Thr331Ileと共に導入した
菌株AHP-3は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所〔日本国茨城県つくば市日本国茨城県つくば市東１丁
目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）〕に、平成１
２年１２月５日付けで、受託番号FERM BP−7382として
寄託されている。

【０３５９】実施例３ゲノム情報に基づくリジン生産
菌の再構築Corynebacterium glutamicumの野生型株ATCC13032からN
TGによるランダム変異と選択を多段階にわたり繰り返す
ことによって変異育種されたリジン生産変異株B-6〔App
l. Microbiol. Biotechnol, 32, 269-273 (1989)〕は、
グルコースを炭素源とする32℃のジャー培養で著量のリ
ジン塩酸塩を生産するが、発酵時間が長いため、時間当
たりの生産性は2.1g/l/hに満たない。B-6株に導入され
ている推定300以上の変異点の中から、リジンの生産に
寄与する有効変異のみを野生型株ATCC13032に再構成す
る育種を試みた。

【０３６０】（１） B-6株とATCC13032株の遺伝子塩基
配列比較による変異点の同定と有効変異の特定前項で述べたように、B-6株由来の遺伝子の塩基配列
を、配列番号１〜3501で示されたATCC13032株ゲノムの
対応する塩基配列と比較解析することにより、B-6株の
染色体に蓄積された多数の変異点を同定した。これらの
中から、前項で述べた方法により、リジン生産に関わる有
効変異として、hom内変異Val59Ala、lysC内変異Thr311I
le、pyc内変異Pro458Ser、およびzwf内変異Ala213Thrを
特定した。これら４種の変異を野生型株に再構成して工
業的に優れたリジン生産菌を再構築する育種を以下に示
すような手順で実施した。

【０３６１】（２）変異型遺伝子を有する遺伝子置換
用プラスミドの作製変異型hom遺伝子を有する遺伝子置換用プラスミドpChom
59、および変異型pyc遺伝子を有する遺伝子置換用プラ
スミドpCpyc458は、実施例２（２）で既に作製済みであ
る。変異型のlysCおよびzwfを有する遺伝子置換用プラ
スミドは、次のようにして作製した。変異点を有するly
sCおよびzwfをＰＣＲ法にて増幅し、実施例２（２）に
記載のＴＡクローニング法（バイオ実験イラストレイテ
ッドＶｏｌ．３）により、遺伝子置換用プラスミドベク
ターpCES30に挿入した。

【０３６２】一方、リジン生産変異株B-6より染色体Ｄ
ＮＡを斎藤らの方法〔Biochimica etBiophysica Acta,
72, 619 (1963)〕により調製し、これを鋳型として、変
異型lysC遺伝子の場合は配列番号7006および7007で表さ
れる塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとし
て、一方、変異型zwf遺伝子の場合は配列番号7008およ
び7009で表される塩基配列を有するＤＮＡをプライマー
セットとして、それぞれPfu turbo ＤＮＡポリメラーゼ
（Stratagene社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。得ら
れたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動した後、GENECLEA
N Kit(BIO 101社製)を用いて抽出精製した。次いで、こ
のＰＣＲ産物をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Roche d
iagnostics社製）、ｄＡＴＰ存在下で72℃、10分間反応
させ、３’末端にアデニン（Ａ）を１塩基付加した。

【０３６３】上記のpCES30のＴベクター断片とＡ塩基を
付加したＰＣＲ産物の変異型lysC遺伝子（1.5 kb）また
は変異型zwf遺伝子（2.3 kb）をフェノール・クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈殿により濃縮後、ライゲーシ
ョンキットver2を用いて連結した。該連結物をATCC1303
2株に電気穿孔法により導入し、25μg/mlのカナマイシ
ンを含むBYG寒天培地上にて30℃で2日間培養し、カナマ
イシン耐性になった形質転換株を取得した。得られた形
質転換株を25μg/mlのカナマイシンを含むBYG液体培地
にて終夜培養し、培養液からアルカリＳＤＳ法によりプ
ラスミドを抽出した。該プラスミドは、制限酵素による
切断解析の結果、pCES30に該1.5 kbまたは該2.3 kbのＤ
ＮＡ断片が挿入された構造を有していることを確認し
た。このようにして作製したプラスミドをそれぞれ、pC
lysC311、pCzwf213と命名した。

【０３６４】（３）１点変異株HD-1へのlysC内変異Th
r311Ileの導入既に、実施例２（２）で野生型株ATCC13032にhom内変異
Val59Alaを導入した１点変異株HD-1を取得しているの
で、実施例２（２）で述べた遺伝子置換法により、上記
（２）で作製したpClysC311を用いてHD-1株にlysC内変
異Thr311Ileを導入した。このようにして得た菌株の染
色体ＤＮＡを用い、配列番号7006および7007で表される
塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして、実
施例２（２）と同様な方法によりＰＣＲを行った。これ
らのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定した結果、
AHD-2と命名した株は、変異型のhom遺伝子に加えて変異
型のlysC遺伝子を有する２点変異株であることが確認さ
れた。

【０３６５】（４）２点変異株AHD-2へのpyc内変異Pr
o458Serの導入実施例２（２）で述べた遺伝子置換法により、実施例
２（２）で作製したpCpyc458を用いてAHD-2株にpyc内変
異Pro458Serを導入した。このようにして得た菌株の染
色体ＤＮＡを用い、配列番号7004および7005で表される
塩基配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして、実
施例２（２）と同様な方法によりＰＣＲを行った。これ
らのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定した結果、
AHP-3と命名した株は、変異型のhom遺伝子およびlysC遺
伝子に加えて変異型のpyc遺伝子を有する３点変異株で
あることが確認された。

【０３６６】（５）３点変異株AHP-3へのzwf内変異Al
a213Thrの導入実施例２（２）で述べた遺伝子置換法により、上記
（２）で作製したpCzwf213を用いてAHP-3株にzwf内変異
Ala213Thrを導入した。このようにして得た菌株の染色体
ＤＮＡを用い、配列番号7008および7009で表される塩基
配列を有するＤＮＡをプライマーセットとして、実施例
２（２）と同様な方法によりＰＣＲを行った。これらの
ＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定した結果、APZ-
4と命名した株は、変異型のhom遺伝子、lysC遺伝子、py
c遺伝子に加えて変異型のzwf遺伝子を有する４点変異株
であることが確認された。

【０３６７】（６） HD-1株、AHD-2株、AHP-3株、およ
びAPZ-4株のリジン生産試験以上のようにして取得したHD-1株、AHD-2株、AHP-3株、
およびAPZ-4株について、実施例２（３）と同様な方法
で５リットルジャーファーメンターによる培養試験を行
った結果を第３表に示す。

【０３６８】

【表１３７】

【０３６９】ランダム変異と選択により変異育種された
リジン生産変異株B-6の生産性は2.1g/l/hに満たないの
で、3.0g/l/hという高い生産性を与えるAPZ-4株は工業
的に明らかに有利である。この生産性は、野生型株が元
来有している高い生育能と糖消費能がAPZ-4株に反映さ
れて達成されたものである。

【０３７０】（７）APZ-4株による高温条件でのリジン
発酵野生型株に４つの有効変異を導入することによって再構
築されたAPZ-4株について、培養温度を40℃で行う以外
は全て実施例２（３）と同様な方法で5リットルジャー
ファーメンターによる培養試験を行った結果を第４表に
示す。

【０３７１】

【表１３８】

【０３７２】第４表から明らかなように、40℃の高温培
養においても32℃の場合と同様なリジン塩酸塩力価と生
産性が得られた。変異育種されたリジン生産変異株B-6
では34℃を超える温度では、生育とリジンの生産性が低
下するためリジン発酵を行うことができなかったが、AP
Z-4株では40℃の高温でもリジン発酵を行うことができ
るので、冷却の負担を大幅に軽減でき、工業的に有利で
ある。この高温でのリジン発酵の成立は、野生型株が元
来有している高温適応性がAPZ-4株に反映されて達成さ
れたものである。

【０３７３】以上示したリジン生産菌の再構築から例証
されるように、本発明は、従来の変異育種の欠点を排除
して工業的に有利な菌株を取得する上で、有効でかつ新
規な育種法を提供する。この有効変異を再構成して生産
菌を再構築する方法論は、本発明で開示したゲノムの塩
基配列情報を利用することによって効率的に実施できる
アプローチであり、その有効性は、本発明により初めて
見出されたものである。

【０３７４】実施例４ＤＮＡマイクロアレイの作製お
よび利用Corynebacterium glutamicum ATCC13032株の全塩基配列
からソフトウェアを用いて予測したＯＲＦの塩基配列情
報をもとにしてＤＮＡマイクロアレイを作製し、培養時
の炭素源により発現変動する遺伝子の探索を実施した。（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製Corynebacterium glutamicum ATCC13032株より、斎藤ら
の方法〔Biochemica et Biophysica Acta, 72, 619 (19
63)〕により染色体ＤＮＡを調製した。Corynebacterium
glutamicum ATCC13032株の全ゲノム塩基配列をもとに
ソフトウェアにより予測された第1表に示すＯＲＦから
任意に選んだ配列番号207、3433、281、3435、3439、76
5、3445、1226、1229、3448、3451、3453、3455、174
3、3470、2132、3476、3477、3485、3488、3489、349
4、3496、および3497で表される塩基配列を有する24個
の遺伝子と内部標準用のウサギグロビン遺伝子の塩基配
列〔GenBankアクセッションナンハ゛ー；V00882〕をもとにして、該遺
伝子の塩基配列を標的とする配列番号7010〜7059に示し
たＰＣＲ増幅のためのオリゴＤＮＡプライマーを常法に
より合成した。

【０３７５】ＰＣＲに用いたオリゴＤＮＡプライマー
は、・配列番号207で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7010および7011で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3433で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7012および7013で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号281で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7014および7015で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3435で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7016および7017で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3439で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7018および7019で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号765で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7020および7021で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3445で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7022および7023で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号1226で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7024および7025で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号1229で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7026および7027で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3448で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7028および7029で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3451で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7030および7031で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、

【０３７６】・配列番号3453で表される塩基配列を有す
るＤＮＡの増幅には、配列番号7032および7033で表され
る塩基配列を有するＤＮＡを、・配列番号3455で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7034および7035で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号1743で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7036および7037で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3470で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7038および7039で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号2132で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7040および7041で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3476で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7042および7043で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3477で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7044および7045で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3485で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7046および7047で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3488で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7048および7049で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3489で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7050および7051で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3494で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7052および7053で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3496で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7054および7055で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・配列番号3497で表される塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7056および7057で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、・ウサギグロビン遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの増
幅には、配列番号7058および7059で表される塩基配列を
有するＤＮＡを、それぞれプライマーセットとして用い
た。

【０３７７】ＰＣＲ反応はサーマルサイクラー（GeneAm
p PCR system 9600、Perkin elmer社製）、Takara EX-T
aq(宝酒造社製)、染色体ＤＮＡ 100ng、およびTakara E
X-Taq試薬添付のバッファーを用いて、95℃で15秒間、6
8℃で3分間のサイクルを30回行った。ウサギグロビン遺
伝子に関してはウサギグロビンｍＲＮＡ（ライフテクノ
ロジーズ社製）から逆転写酵素RAV-2（宝酒造社製）を
使い、使用説明書に従って合成した一本鎖ｃＤＮＡを鋳
型ＤＮＡとした。増幅したそれぞれの遺伝子のＰＣＲ産
物をアガロースゲル電気泳動し、QIAquick Gel Extract
ion Kit (QIAGEN社製)を用いて抽出、精製した。精製し
たＰＣＲ産物はエタノール沈殿により濃縮し、200ng/μ
lに調製した。スライドグラス上へのスポッティングに
はGTMASS SYSTEM（日本レーザー電子社製）を使用説明
書に従って使用し、各ＰＣＲ産物についてそれぞれ２連
でＭＡＳコート付きスライドガラス（松浪硝子社製）上
にスポッティングした。

【０３７８】（２）蛍光標識ｃＤＮＡの合成 ATCC13032株をBY寒天培地〔ペプトン（極東製薬工業社
製） 20g、酵母エキス（Difco社製）5g、バクトアガー
（Difco社製）16gを水1Lに含みpH7.2に調整された培
地〕に塗布し、30℃で2日間培養した。これを更にBY液
体培地5mlに植菌し、30℃で終夜培養した。次にこれを
グルコース 110mmol/lまたは酢酸アンモニウム200mmol/
lをふくむ最少培地（硫酸アンモニウム 5g、尿素 5g、
リン酸二水素一カリウム 0.5g、リン酸一水素二カリウ
ム 0.5g、モルフォリノプロパンスルフォン酸 20.9g、
硫酸マグネシウム７水和物 0.25g、塩化カルシウム２水
和物 10mg、硫酸マンガン１水和物 10mg、硫酸第一鉄７
水和物 10mg、硫酸亜鉛７水和物 1mg、硫酸銅 0.2mg、
ビオチン 0.2mgを水1Lに含み、pH6.5に調整された培
地）30mlに植菌し、660nmでの吸光度が1.0になるまで三
角フラスコにて30℃で培養した。4℃、5,000rpm、10分
間の遠心分離によって菌体を調製後、得られた菌体から
ベルマンらの方法〔Molecular Microbiology 6,317-326
(1992)〕により全ＲＮＡを調製した。ＤＮＡの混入を排
除するためにＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）で37℃で30分
間処理し、更にQiagen RNeasy Mini Kit （QIAGEN社
製）を使い、使用説明書に従い精製した。得られた全Ｒ
ＮＡ30μgの溶液にウサギグロビンｍＲＮＡ（50ng/μ
l、ライフテックオリエンタル社製）を0.6μl、ランダ
ム6merプライマー（500ng/μl、宝酒造社製）を1μl加
え、65℃で１０分間変性させた後、氷上で急冷した。こ
れにSuperScript II（ライフテクノロジーズ社製)添付
バッファー 6μl、0.1mol/l DTT 3μl、dNTPs（25mmol/
l dATP, 25mmol/l dCTP, 25mmol/l dGTP, 10mmol/l dTT
P） 1.5μl、Cy-dUTP(NEN社製)1.5μl、SuperScript II
2μlを加え、25℃で10分間保持した後、42℃で110分間
保持した。炭素源としてグルコースを使用した菌体から
抽出したＲＮＡはCy5-dUTPで、酢酸アンモニウムを使っ
た菌体から抽出したＲＮＡはCy3-dUTPで標識した。蛍光
標識反応後、1mol/l水酸化ナトリウム・20mmol/l EDTA
溶液を1.5μl、10％ SDS溶液を3.0μl加え、65℃で10分
間保温し、ＲＮＡを分解した。標識後の２つのｃＤＮＡ
溶液を混合し、Qiagen PCR purification Kit（QIAGEN
社製）を使い、使用説明書に従って精製し、10μlに調
製した。

【０３７９】（３）ハイブリダイゼーション UltraHyb（Ambion社製)110μlと蛍光標識したｃＤＮＡ
溶液10μlを混合し、GeneTAC Hybridization Station
(Genomic Solutions社製)を用いて使用説明書に従って
ハイブリダイゼーションとその後のスライドグラスの洗
浄まで行った。ハイブリダイゼーションは50℃、洗浄は
25℃で行った。

【０３８０】（４）蛍光分析蛍光標識したｃＤＮＡをハイブリダイズさせたＤＮＡマ
イクロアレイについてScanArray4000（GSI Lumonics社
製）を用いて蛍光量を測定した。第５表に各遺伝子のＣ
ｙ３、Ｃｙ５のシグナル強度を内部標準のウサギグロビ
ン遺伝子の値により補正した数値とＣｙ３／Ｃｙ５の比
を示す。

【０３８１】

【表１３９】

【０３８２】Ｃｙ３のシグナルが顕著に強い配列番号34
88、および3489に関してソフトウェアから予測されたＯ
ＲＦの機能情報を検索したところ、配列番号3488はマレ
イン酸シンターゼ遺伝子、配列番号3489はイソクエン酸
リアーゼ遺伝子であった。これらの遺伝子はCorynebact
erium glutamicumにおいて酢酸により転写誘導される事
が報告されている〔Archives of Microbiology 168,262
-269 (1997)〕。

【０３８３】以上のようにCorynebacterium glutamicum
ATCC13032株の全ゲノム塩基配列からソフトウェアによ
り予測されたＯＲＦの塩基配列情報をもとに適切なオリ
ゴＤＮＡプライマーを合成し、Corynebacterium glutam
icumのゲノムＤＮＡを鋳型にして該遺伝子の塩基配列を
ＰＣＲ反応により増幅し、ＤＮＡマイクロアレイを作
製、利用する事で、発現が変動している遺伝子を見つけ
出す事ができた。本実施例では24個の遺伝子についてＤ
ＮＡマイクロアレイを用いて発現量の解析が可能である
ことを示した。一方、現在のＤＮＡマイクロアレイ技術
では一度に数千種類の遺伝子のプローブを載せたＤＮＡ
マイクロアレイの作製も可能である。したがって、本発
明により明らかにしたCorynebacterium glutamicum ATC
C13032株の全ゲノム塩基配列をもとにソフトウェアによ
り予測された全てのＯＲＦの遺伝子プローブを載せたＤ
ＮＡマイクロアレイを作製し、それを用いて、Coryneba
cterium glutamicumの全遺伝子レベルでの発現プロファ
イルを解析することも可能であることが示された。

【０３８４】実施例５ Corynebacterium glutamicumゲ
ノム配列を用いたホモローグ検索（１）アデノシン・デアミナーゼ（Adenosine deaminas
e）の検索 Swiss-protデータベースより、アデノシン・デアミナー
ゼ（Adenosine Deaminase；EC3.5.4.4）としての機能が
確認されている蛋白質のアミノ酸配列としてEscherichi
a coli アデノシン・デアミナーゼの配列（ADD#ECOLI）
を入手した。このアミノ酸配列の全長をクエリーとし
て、Corynebacterium glutamicumのゲノム配列からなる
塩基配列データベースに対して、またはゲノム配列から
予測したＯＲＦ領域のアミノ酸配列からなるデータベー
スに対して、FASTAプログラム〔Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 85, 2444-2448 (1988)〕を用いて相同性検索を行っ
た。E-valueが1e^-10以下であることをもって有為な相同
性を有すると判定した。その結果、Corynebacterium gl
utamicumのゲノム配列からなる塩基配列データベースま
たはゲノム配列から予測したＯＲＦ領域のアミノ酸配列
からなるデータベース内には、Escherichia coli アデ
ノシン・デアミナーゼに有為な相同性を示す配列は見出
されなかった。このことから、Corynebacterium glutam
icumにはアデノシン・デアミナーゼ活性を有するＯＲＦ
が存在せず、アデノシンからイノシンへの変換活性が存
在しないことが推定された。

【０３８５】（２）グリシン・クリーベージ（Glycine
cleavage）酵素の検索 Swiss-protデータベースよりグリシン・クリーベージ酵
素（Glycine cleavage酵素；EC2.1.2.10）としての機能
が確認されている蛋白質のアミノ酸配列としてEscheric
hia coliグリシン・クリーベージ酵素のコンポーネン
トであるグリシン・ディカルボキシラーゼ（glycine de
carboxylase）、アミノメチルトランスフェラーゼ（ami
nomethyltransferase）およびアミノメチル（aminometh
yl）基キャリアの各配列（GCSP#ECOLI、GCST#ECOLIおよ
びGCSH#ECOLI）を入手した。これらのアミノ酸配列の全
長をクエリーとして、Corynebacterium glutamicumのゲ
ノム配列からなる塩基配列データベースに対して、また
はゲノム配列から予測したＯＲＦ領域のアミノ酸配列か
らなるデータベースに対して、FASTAプログラムを用い
て相同性検索を行った。E-valueが1e^-10以下であること
をもって有為な相同性を有すると判定した。その結果、
Corynebacterium glutamicumのゲノム配列からなる塩基
配列データベースまたはゲノム配列から予測したＯＲＦ
領域のアミノ酸配列からなるデータベース内には、Esch
erichia coli グリシン・クリーベージ酵素のコンポー
ネントであるグリシン・ディカルボキシラーゼ、アミノ
メチルトランスフェラーゼまたはアミノメチル基キャリ
アに有為な相同性を示す配列は見出されなかった。この
ことから、Corynebacterium glutamicumにはグリシン・
ディカルボキシラーゼ、アミノメチルトランスフェラー
ゼおよびアミノメチル基キャリアの各活性を有するＯＲ
Ｆが存在せず、グリシン・クリーベージ酵素活性は存在
しないことが推定された。

【０３８６】（３）ＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehy
drogenase）の検索 Swiss-protデータベースより、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ
（IMP dehydrogenase；EC1.1.1.205）としての機能が確
認されている蛋白質のアミノ酸配列としてEscherichia
coli ＩＭＰデヒドロゲナーゼの配列（IMDH#ECOLI）を
入手した。このアミノ酸配列の全長をクエリーとして、
Corynebacteriumglutamicumのゲノム配列からなる塩基
配列データベースに対して、またはゲノム配列から予測
したＯＲＦ領域のアミノ酸配列からなるデータベースに
対して、ＦＡＳＴＡプログラムを用いて相同性検索を行
った。E-valueが1e^-10以下であることをもって有為な相
同性を有すると判定した。その結果、Corynebacterium
glutamicumのゲノム配列からなる塩基配列データベース
またはゲノム配列から予測したＯＲＦ領域のアミノ酸配
列からなるデータベース内から、配列番号１で表される
塩基配列において、塩基配列番号615336-616853の領域
に存在するＯＲＦ（または配列番号672で表される塩基
配列を有するＯＲＦ）、塩基配列番号616973-618094の
領域に存在するＯＲＦ（または配列番号674で表される
塩基配列を有するＯＲＦ）の２つのＯＲＦのよってコー
ドされるアミノ酸配列に、大腸菌ＩＭＰデヒドロゲナー
ゼのＯＲＦとの有為な相同性が見出された。これらのＯ
ＲＦにコードされるアミノ酸配列と他の生物種のＩＭＰ
デヒドロゲナーゼとの類似性をより詳細に調べるため
に、これらのアミノ酸配列をクエリーとして、GenBank
（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)nr-aaデータベース
（GenBankCDSの翻訳産物、PDBデータベース、Swiss-Pro
tデータベース、PIRデータベース、PRFデータベースに
登録されているものから、重複を除いて作成されたアミ
ノ酸配列データベース）に対して、BLASTプログラムを
用いて検索を行った。その結果、これら２つのアミノ酸
配列のいずれも、他生物種のＩＭＰデヒドロゲナーゼに
対して有為な相同性を示し、かつ他蛋白質のアミノ酸配
列との相同性と比較して明らかにＩＭＰデヒドロゲナー
ゼに対する相同性が高かったことから、これら２つのＯ
ＲＦがコードするアミノ酸配列を有する蛋白質はＩＭＰ
デヒドロゲナーゼとして機能していると推定された。こ
れらのことから、Corynebacterium glutamicumにはＩＭ
Ｐデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＯ
ＲＦが２つ存在することが推定された。

【０３８７】実施例６ Corynebacterium glutamicum菌
体由来蛋白質のプロテオーム解析（１）Corynebacterium glutamicum ATCC13032株、FERM
BP-7134株、FERM BP-158株の菌体由来蛋白質の調製Corynebacterium glutamicum ATCC13032株（野生型
株）、FERM BP-7134株（Corynebacterium glutamicumの
リジン生産株）、およびFERM BP-158株（Corynebacteri
um glutamicumのリジン高生産株）を、実施例２（３）
の方法に準じて５リットルジャーファーメンターによる
培養試験を行った結果を第６表に示す。

【０３８８】

【表１４０】

【０３８９】培養後、遠心分離により菌体をそれぞれ回
収した。これら菌体をTris-HClバッファー〔10mmol/l T
ris-HCl pH6.5、1.6mg/ml プロテアーゼ・インヒビター
（COMPLETE;Boehringer Mannheim社製）〕で3回洗浄
し、洗浄菌体を取得した。該洗浄菌体は-80℃で凍結保
存可能であった。該凍結保存菌体は使用前に融解し、洗
浄菌体として用いた。上記洗浄菌体を、破砕バッファー
〔10mmol/l Tris-HCl pH7.4、5mmol/l 塩化マグネシウ
ム、50mg/l RNase、1.6mg/ml プロテアーゼ・インヒビ
ター(COMPLETE;Boehringer Mannheim社製)〕に懸濁し、
ブラウン製破砕装置を用いて冷却しながら菌体を破砕し
た。得られた破砕液に50mg/lとなるようにDNaseを添加
し、氷中で10分間放置した後、遠心分離（5,000×g、15
分間、4℃）により、未破壊菌体を沈殿区分として除去
し、上清画分を回収した。

【０３９０】該上清画分に9mol/lになるように尿素を添
加し、等量のリシスバッファー〔9.5mol/l尿素、2％NP-
40、2％アンフォライン、5％メルカプトエタノール、1.
6mg/ml プロテアーゼ・インヒビター(COMPLETE;Boehrin
ger Mannheim社製)〕を加えて室温で十分撹拌し、溶解
させた。溶解後、12,000×gで15分間遠心分離し、上清
画分を分取した。該上清画分に80％飽和になるように硫
酸アンモニウムを添加し、十分に撹拌し、溶解させた。
溶解後、遠心分離（16,000×g、20分間、4℃）し、沈殿
画分を回収した。該沈殿画分を再度リシスバッファーに
溶解し蛋白質試料として以後の実験に用いた。該蛋白質
試料の蛋白質濃度は、ブラッドフォードの蛋白定量法に
準じた方法により求めた。

【０３９１】（２）２次元電気泳動法による蛋白質の分
離等電点電気泳動法を用い１次元目の電気泳動を以下のよ
うに行った。成形済みの乾燥型ＩＰＧストリップゲル
（pH4-7、13cm；Immobiline DryStrips；Amersham Phar
macia Biotech社製）をMultiphor IIあるいはIPGphor
（Amersham Pharmacia Biotech社製）電気泳動装置にセ
ットし、膨潤液（8mol/l 尿素、0.5％トリトンX-100、
0.6％ジチオスレイトール、0.5％アンフォラインpH3-
10）を充填して、12時間〜16時間静置してゲルを膨潤さ
せた。上記で調製した蛋白質試料をサンプル溶液（9mol
/l 尿素、2％ CHAPS、1％ジチオスレイトール、2％ア
ンフォラインpH3-10）に溶解した後、蛋白量として約10
0〜500μgを分取し、膨潤したＩＰＧストリップゲルに
添加した。

【０３９２】等電点電気泳動は、20℃の定温調節下、下
記四段階の条件で行った。第一段階：0〜500Vのグラジェントモードで１時間第二段階：500〜1000Vのグラジェントモードで１時間第三段階：1000V〜8000Vのグラジエントモードで４時間第四段階：8000Vの定電圧で１時間

【０３９３】等電点電気泳動後、ＩＰＧストリップゲル
をホルダーから取り出し、平衡化バッファーＡ液（50mm
ol/l Tris-HCl pH6.8、30％グリセロール、1％ SDS、
0.25％ジチオスレイトール）に15分間、平衡化バッフ
ァーＢ液（50mmol/l Tris-HClpH6.8、6mol/l 尿素、30
％グリセロール、1％ SDS、0.45％ヨードアセトアミ
ド）に１５分間浸して十分にゲルを平衡化した。平衡化
後、ＩＰＧストリップゲルをＳＤＳ泳動用バッファー
（1.4％グリシン、0.1％ SDS、0.3％ Tris-HCl pH8.
5）で軽くリンスし、分子量による２次元目の電気泳動
を下記のように行い、蛋白質を分離した。

【０３９４】即ち、電気泳動装置にセットした14％ポリ
アクリルアミド・スラブゲル（14％ポリアクリルアミ
ド、0.37％ビスアクリルアミド、37.5mmol/l Tris-HCl
pH8.8、0.1％ SDS、0.1％ TEMED、0.1％過硫酸アンモ
ニウム）上に、上記ＩＰＧストリップゲルを密着するよ
うに載せ、30mAの定電流下、20℃で3時間電気泳動し、
蛋白質を分離した。

【０３９５】（３）蛋白質スポットの検出２次元目の電気泳動が終了したスラブゲルを用い、Gorg
らの方法〔Electrophoresis, 9, 531-546 (1988)〕に準
じてクマジー染色を行った。即ち、２５℃で約３時間振
とうしながらスラブゲルを染色し、過剰な染色を脱色液
で脱色後、十分に蒸留水で洗浄した。結果を図２に示し
た。ATCC13032株（図２のＡ）、FERM BP-7134株（図２
のＢ）およびFERM BP-158株（図２のＣ）の菌体由来蛋
白質は分離され、スポットとして検出することができた。

【０３９６】（４）検出した蛋白質スポットのインジェ
ル・ダイジェスション（in-gel digestion）検出したスポットをゲルから切り出してシリコナイズド
チューブに移し、100mmol/l重炭酸アンモニウム：アセ
トニトリル（1:1,v/v）液を400μl加えて一晩振とう
後、そのまま凍結乾燥を行った。乾燥した該ゲルに、10
μlのリシルエンドペプチダーゼ（LysC）液（WAKO社
製；100ng/μlの濃度になるように、0.1％ SDS含有50mm
ol/l重炭酸アンモニウム液で調製）を添加し、0℃で45
分間膨張させた後、37℃で16時間放置した。LysC液を除
去後、抽出液（60％アセトニトリルと5％ギ酸混合液）
を20μl添加し、室温で５分間超音波処理し、ゲルを破
砕した。破砕後、遠心分離（12,000rpm、５分間、室
温）により抽出液を回収した。この操作を２回繰り返し
すべての抽出液を回収した。真空遠心を行い、該回収液
の液量が半分以下になるまで濃縮した。該濃縮液に0.1
％のトリフルオロ酢酸を20μl加えて充分撹拌後、ZipTi
p（Millipore社製）を用いて脱塩処理した。ZipTipの担
体に吸着させた蛋白質は、５μｌのアルファ−シアノ−
4ハイドロキシシンナミック酸（α-cyano-4-hydroxycin
namic acid）を用いて溶出させ、解析用サンプル液とし
た。

【０３９７】（５）Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization Time Of Flight Mass Spectrometer（MALD
I-TOFMS）による蛋白質スポットの質量分析及びアミノ
酸配列分析解析用サンプル液と質量校正用ペプチド混合物液（300n
mol/l Angiotensin II、300nmol/l Neurotensin、150nm
ol/l ACTHclip 18-39、2.3μmol/l Bovin insulin B ch
ain）を等量混合後、該混合液1μlをステンレス製のプ
ローブにスポットし、自然乾燥により結晶化した。測定
用機種として、REFLEX MALDI-TOF質量分析計（Bruker社
製）をN2レーザー（337nm）と組み合わせて使用した。
ＰＭＦ（Peptide-mass finger printing）による解析
は、加速電圧１9.0 kV、検出器電圧1.50kV、リフレクタ
ーモードの条件下で、30回測定した結果の積算スペクト
ルを用いて行った。質量の校正には内部標準法を用い
た。ＰＳＤ（post-source decay）による解析は、加速
電圧27.5 kVで反射電圧と検出器電圧を順次変えて得ら
れた積算スペクトルを用いて行った。上記解析により、
蛋白質スポットに由来する消化後のペプチド断片の質量
およびアミノ酸配列を決定した。

【０３９８】（６）蛋白質スポットの同定上記（５）で得られた蛋白質スポットに由来する消化後
のペプチド断片のアミノ酸配列情報から、実施例１で構
築した、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株のゲ
ノム配列データベースより、該蛋白質に相応するＯＲＦ
を検索し、該蛋白質を同定した。蛋白質の同定には、イ
ントラネット版のprotein prospectorのMS-Fitプログラ
ムとMS-Tagプログラムを用いた。

【０３９９】（ａ）高発現蛋白質をコードする遺伝子の
検索と同定図２のＡに示された、ＣＢＢ染色により発現量の高いと
認められた、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株
の菌体由来の蛋白質において、スポット−１、スポット
−２、スポット−３、スポット−４、スポット−５に対
応する蛋白質について上記方法でこれら蛋白質を同定し
た。その結果、スポット−１は配列番号4585で表される
アミノ酸配列を有する蛋白質であるエノラーゼ（enolas
e）、スポット−２は配列番号5254で表されるアミノ酸
配列を有する蛋白質であるホスホグリセレート・キナー
ゼ（phosphoglycerate kinase）、スポット−３は配列
番号5255で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である
グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナ
ーゼ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、
スポット−４は配列番号6543で表されるアミノ酸配列を
有する蛋白質であるフルクトース・ビス-ホスフェート
・アルドラーゼ（fructose bis-phosphate aldolas
e）、スポット−５は配列番号5252で表されるアミノ酸
配列を有する蛋白質であるトリオース・ホスフェート・
イソメラーゼ（triose phosphate isomerase）であっ
た。

【０４００】これら公知の蛋白質をコードする遺伝子
は、それぞれスポット−１の蛋白質をコードする配列番
号１０８５記載の塩基配列を有する遺伝子、スポット−
２の蛋白質をコードする配列番号１７５４記載の塩基配
列を有する遺伝子、スポット−３の蛋白質をコードする
配列番号１７７５記載の塩基配列を有する遺伝子、スポ
ット−４の蛋白質をコードする配列番号３０４３記載の
塩基配列を有する遺伝子、スポット−５の蛋白質をコー
ドする配列番号１７５２記載の塩基配列を有する遺伝子
であり、微生物生命を維持するのに重要な中央代謝経路
の遺伝子であり、特にスポット−２、スポット−３、ス
ポット−５の蛋白質をコードする３遺伝子はオペロンを
形成し、その上流域には高発現プロモーターがコードさ
れていることが示唆されている〔J. of Bacteriol., 17
4, 6067-6086 (1992)〕。また、上記と同様の手法を用
いて、図２のスポット-９に相応する蛋白質を同定した
ところ、該スポットは、配列番号6937で表されるアミノ
酸配列を有する蛋白質であるエロンゲーションファクタ
ー Tuであり、該蛋白質は配列番号3437で表される塩基
配列を有するＤＮＡにコードされていることが判明し
た。これらの結果より、実施例１で構築したCorynebact
erium glutamicumのゲノム配列データベースを用い、発
現レベルの高い蛋白質をプロテオーム解析により同定す
ることにより、該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列
とその上流域の塩基配列も同時に検索することが可能と
なり、高発現プロモーターとしての機能を有する塩基配
列を効率的に選択することが可能であることが示され
た。

【０４０１】（ｂ）修飾蛋白質の検索と同定図２のＢに示された、Corynebacterium glutamicum FER
M BP-7134株の菌体由来蛋白質の内、スポット−６、ス
ポット−７、スポット−８を上記と同様の方法で同定し
た結果、３スポットは、全て配列番号3785で表されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質であるカタラーゼ（catalas
e）であった。即ち、等電点における移動度が異なるス
ポットとして検出されたスポット−６、スポット−７、
スポット−８は、全て同一の配列番号285で表される塩
基配列からなるカタラーゼ遺伝子に由来する産物である
と考えられた。よって、Corynebacterium glutamicum F
ERM BP-7134株由来のカタラーゼは、翻訳後に修飾を受
けていたことが示された。この結果より、実施例１で構
築したCorynebacterium glutamicumのゲノム配列データ
ベースを用い、プロテオーム解析することにより、種々
の異なる修飾を受けた蛋白質を効率良く検索できること
が確認できた。

【０４０２】（ｃ）リジン生産性に有効な発現蛋白質の
検索と同定図２のＡ（ATCC13032株：野生株）、図２のＢ（FERM BP
-7134株：リジン生産株）および図２のＣ（FERM BP-158
株：リジン高生産株）において、上記で同定されたスポ
ット−８に相応するカタラーゼと、スポットー９に相応
するエロンゲーションファクター Tuは、リジン生産能
が高い菌株ほど発現レベルが高くなっていることが分か
った。この結果より、実施例１で構築したCorynebacter
ium glutamicumのゲノム配列データベースを用い、プロ
テオーム解析することにより、目的産物の生産能力の強
化を目的とした育種において、有望な変異蛋白質を効率
的に検索しかつ同定できることが分かった。

【０４０３】さらに、同定された該蛋白質に関わる塩基
配列（プロモーター、ＯＲＦ等の塩基配列）を上記デー
タベースより検索し、該配列を基に設計したプライマー
を使用することにより、容易に有用変異株の有する有用
変異点を特定することができる。該変異点が特定される
ことにより、容易に該有用変異あるいは該有用変異から
導かれる有用変異を有する、産業上有用な変異株を育種
することができる。

【０４０４】

【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌由来のポリ
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、該ポリヌクレ
オチドおよび/またはオリゴヌクレオチドを固着したオ
リゴヌクレオチドアレイ、ポリヌクレオチドにコードさ
れるポリペプチド、該ポリペプチドを認識する抗体、該
ポリペプチドおよび/または該抗体を固着したポリペプ
チドアレイ、該ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チドの塩基配列並びに該ポリペプチドのアミノ酸配列を
記録したコンピュータで読みとり可能な記録媒体および
該記録媒体を用いるコンピュータを用いたシステムを提
供することができる。

【０４０５】

【配列フリーテキスト】

配列番号7002−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7003−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7004−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7005−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7006−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7007−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7008−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7009−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7010−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7011−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7012−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7013−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7014−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7015−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7016−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7017−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7018−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7019−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7020−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7021−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7022−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7023−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7024−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7025−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7026−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7027−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7028−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7029−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7030−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7031−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7032−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7033−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7034−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7035−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7036−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7037−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7038−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7039−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7040−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7041−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7042−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7043−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7044−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7045−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7046−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7047−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7048−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7049−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7050−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7051−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7052−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7053−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7054−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7055−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7056−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7057−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7058−人工配列の説明：合成ＤＮＡ配列番号7059−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

【０４０６】

【配列表】

配列表は公開・登録公報長大データＣＤ−ＲＯＭ「１４
（２００２）−００１（００２）」を参照

【図面の簡単な説明】

【図１】は、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株
のゲノム上の代表的な遺伝子の位置を示したマップを示
した図である。

【図２】は、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株
（Ａ）、FERM BP-7134株（Ｂ）およびFERM BP-158株
（Ｃ）由来の蛋白質を用いたプロテオーム解析の結果を
示す電気泳動図である。

【図３】は、本発明のシステムを用いた例のフローチャ
ートである。

【図４】は、本発明のシステムを用いた例のフローチャ
ートである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｍ 1/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｂ０６４Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｂ０６５ 1/19 9/00 ４Ｈ０４５ 1/21 9/02 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/40 9/00 13/04 9/02 13/08 ＡＣ１２Ｐ 7/40 19/00 13/04 19/34 Ａ 13/08 21/02 Ｃ 19/00 Ｃ１２Ｑ 1/37 19/34 1/68 Ａ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＣ１２Ｑ 1/37 33/566 1/68 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/53 33/68 33/566 37/00 １０３ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/68 (Ｃ１２Ｎ 1/21 37/00 １０３Ｃ１２Ｒ 1:15） // Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15）Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 13/08 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:15） 15/00 Ｆ公開・登録公報長大データＣＤ−ＲＯＭ 14(2002)−001(002） (72)発明者安藤聖子東京都町田市旭町３丁目６番６号協和醗酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者林幹朗東京都町田市旭町３丁目６番６号協和醗酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者落合恵子東京都町田市旭町３丁目６番６号協和醗酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者横井治彦東京都町田市旭町３丁目６番６号協和醗酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者立石直子東京都町田市旭町３丁目６番６号協和醗酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者妹尾彰宏東京都町田市旭町３丁目６番６号協和醗酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者池田正人東京都町田市旭町３丁目６番６号協和醗酵工業株式会社東京研究所内 (72)発明者尾崎明夫山口県防府市協和町１番１号協和醗酵工業株式会社技術研究所内Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA34 AA35 BB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA35 DA36 FB01 FB02 FB04 FB07 FB15 JA01 JA07 4B024 AA03 AA11 BA07 BA71 CA03 CA09 DA06 HA01 HA14 HA15 HA19 4B029 AA07 AA23 BB02 CC11 FA12 4B050 CC03 DD02 LL03 LL05 4B063 QA08 QQ12 QQ13 QQ42 QR32 QR38 QS25 QS34 QS38 4B064 AD01 AE03 AE25 AF01 AF27 AG01 AH02 CA02 CA19 CC24 4B065 AA22Y AA24Y AA26Y AA32Y AB01 BA01 BA16 CA10 CA17 CA19 CA23 CA28 4H045 AA10 AA11 AA20 BA09 CA11 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】［１］コリネ型細菌の変異株由来の遺伝
子の変異点の同定、［２］コリネ型細菌由来の遺伝子の
発現量を測定、［３］コリネ型細菌由来の遺伝子の発現
プロファイルの解析、［４］コリネ型細菌由来の遺伝子
の発現パターンを分析、または［５］被検遺伝子と相同
な遺伝子をコリネ型細菌で検索するための、下記（ａ）
〜（ｄ）の工程を有する方法；（ａ）配列番号1〜3501のいずれかに示される塩基配列
からなる第１のポリヌクレオチド類、該ポリヌクレオチ
ドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第
２のポリヌクレオチド類、または第１または第２のポリ
ヌクレオチド類の連続する少なくとも10〜200塩基配列
からなる第３のポリヌクレオチド類からなる群から選ば
れる2種類以上のポリヌクレオチドを固体支持体に固着
し、ポリヌクレオチドアレイを作製する工程、（ｂ）該
ポリヌクレオチドアレイに固着されたポリヌクレオチド
と、コリネ型細菌由来の標識化ポリヌクレオチド、コリ
ネ型細菌の変異株由来の標識化ポリヌクレオチドまたは
被検標識化ポリヌクレオチドの少なくとも一つとをハイ
ブリダイズ条件下でインキュベートする工程、（ｃ）ハ
イブリダイゼーションを検出する検出工程、および
（ｄ）ハイブリダイゼーション結果を解析する解析工
程。
【請求項２】コリネ型細菌が、Corynebacterium属、B
revibacterium属、またはMicrobacterium属に属する微
生物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】 Corynebacterium属に属する微生物がCor
ynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoacid
ophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Coryneba
cterium callunae、Corynebacterium herculis、Coryne
bacterium lili ｕｍ、Corynebacterium melassecola、C
orynebacterium thermoaminogenes、およびCorynebacte
rium ammoniagenesから選ばれる微生物である、請求項
２記載の方法。
【請求項４】コリネ型細菌由来の該ポリヌクレオチ
ド、コリネ型細菌の変異株由来の該ポリヌクレオチドま
たは該被検ポリヌクレオチドが、アミノ酸、核酸、ビタ
ミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁体から選ばれる
少なくとも一種の生合成に関わる遺伝子である請求項１
記載の方法。
【請求項５】該被検ポリヌクレオチドがEscherichia
coli由来である、請求項１記載の方法。
【請求項６】配列番号1〜3501のいずれかに示される
塩基配列からなる第１のポリヌクレオチド類、該第１の
ポリヌクレオチド類とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズする第２のポリヌクレオチド類、または第１
または第２のポリヌクレオチド類の連続する少なくとも
10〜200塩基配列からなる第３のポリヌクレオチド類か
らなる群の中から選ばれる２種類以上のポリヌクレオチ
ドを、固体支持体に固着したポリヌクレオチドアレイ。
【請求項７】配列番号1に示される塩基配列からなる
ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドと80％以上
の相同性を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】配列番号2〜3431のいずれかに示される
塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレ
オチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るポリヌクレオチド。
【請求項９】配列番号3502〜6931のいずれかに示され
るアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドまたは該ポリヌクレチドとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１０】配列番号1に示される塩基配列を有す
るポリヌクレオチドにおいて、配列番号2〜3431から選
ばれる塩基配列を有するポリヌクレオチドの５’上流ま
たは３’下流に位置し、該ポリヌクレオチドの発現を調
節する活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１１】請求項７〜１０のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドが有する塩基配列中の連続する少な
くとも10〜200塩基からなる配列を有するポリヌクレオ
チドまたは該ポリヌクレオチドと相補的な配列を有する
ポリヌクレオチド。
【請求項１２】請求項８〜１１のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドを含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１３】請求項８〜１１のいずれか１項に記載
のポリヌクレオチドまたは請求項１２記載の組換え体Ｄ
ＮＡを含む形質転換体。
【請求項１４】請求項１３記載の形質転換体を培地に
培養し、培養物中に請求項８または９に記載のポリヌク
レオチドにコードされるポリペプチドを生成蓄積させ、
該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とす
る該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１５】請求項１３記載の形質転換体を培地に
培養し、培養物中にアミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有
機酸、およびそれらの類縁体から選ばれる少なくとも一
種を生成蓄積させ、該培養物からアミノ酸、核酸、ビタ
ミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁体から選ばれる
少なくとも一種を採取することを特徴とするアミノ酸、
核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁体か
ら選ばれる少なくとも一種の製造法。
【請求項１６】配列番号2〜3431から選ばれる塩基配
列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチ
ド。
【請求項１７】配列番号3502〜6931から選ばれるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１８】請求項１６または１７記載のポリペプ
チドのアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠
失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加
されていない該ポリペプチドの有する活性と実質的に同
一の活性を有するポリペプチド。
【請求項１９】請求項１６または１７記載のポリペプ
チドのアミノ酸配列と60％以上の相同性を有するアミノ
酸配列を含み、かつ該ポリペプチドの有する活性と実質
的に同一の活性を有するポリペプチド。
【請求項２０】請求項１６〜１９のいずれか1項に記
載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項２１】請求項１６〜１９に記載のポリペプチ
ドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドから選
ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペプチドを１種
類以上、個体支持体に固着したポリペプチドアレイ。
【請求項２２】請求項１６〜１９に記載のポリペプチ
ドおよび該ポリペプチドの部分断片ポリペプチドから選
ばれるポリペプチドまたは部分断片ポリペプチドを認識
する抗体を１種類以上、個体支持体に固着したポリペプ
チドアレイ。
【請求項２３】コリネ型細菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の手
段を備えることを特徴とするコンピュータを用いたシス
テム； (i)配列番号1〜3501から選ばれる1以上の塩基配列情
報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
するための入力手段、(ii)入力された情報を少なくとも
一時的に記録するためのデータ記録手段、(iii)該デー
タ記録手段により記録された、配列番号1〜3501から選
ばれる１以上の塩基配列情報と標的配列または標的構造
モチーフ情報とを比較し、標的配列または標的構造モチ
ーフ情報と一致または類似する塩基配列情報を検索また
は解析するコンパレータ手段、および(iv)該コンパレー
タ手段により得られた検索または解析結果を表示するた
めの出力手段。
【請求項２４】コリネ型細菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の工
程を含むことを特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号1〜3501から選ばれる1以上の塩基配列情
報、および標的配列または標的構造モチーフ情報を入力
する工程、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に記
録する工程、(iii)配列番号1〜3501から選ばれる１以上
の塩基配列情報と標的配列または標的構造モチーフ情報
とを比較する工程、および(iv)標的配列または標的構造
モチーフ情報と一致または類似する塩基配列情報を検索
または解析する工程。
【請求項２５】コリネ型細菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の手
段を備えることを特徴とするコンピュータを用いたシス
テム； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
を入力するための入力手段、(ii)入力された情報を少な
くとも一時的に記録するためのデータ記録手段、(iii)
該データ記録手段により記録された、配列番号3502〜70
01から選ばれる１以上のアミノ酸配列情報と標的配列ま
たは標的構造モチーフ情報とを比較し、標的配列または
標的構造モチーフ情報と一致または類似するアミノ酸配
列情報を検索または解析するコンパレータ手段、および
(iv)該コンパレータ手段により得られた検索または解析
結果を表示するための出力手段。
【請求項２６】コリネ型細菌由来の標的配列または標
的構造モチーフを同定するための、下記(i)〜(iv)の工
程を含有することを特徴とするコンピュータを用いた方
法； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報、および標的配列または標的構造モチーフ情報
を入力するための入力する工程、(ii)入力された情報を
少なくとも一時的に記録する工程、(iii)該データ記録
手段により記録された、配列番号3502〜7001から選ばれ
る１以上のアミノ酸配列情報と標的配列または標的構造
モチーフ情報とを比較する工程、および(iv)標的配列ま
たは標的構造モチーフ情報と一致または類似するアミノ
酸配列情報を検索または解析する工程。
【請求項２７】コリネ型細菌由来の標的塩基配列を有
するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの機
能を決定するための、下記(i)〜(iv)の手段を備えるこ
とを特徴とするコンピュータを用いたシステム； (i)配列番号2〜3501から選ばれる１以上の塩基配列情報
および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
報、並びに標的塩基配列情報を入力するための入力手
段、(ii)入力された情報を少なくとも一時的に記録する
ためのデータ記録手段、(iii)該データ記録手段により
記録された、配列番号2〜3501から選ばれる1以上の塩基
配列情報と標的塩基配列情報とを比較し、配列番号2〜3
501から選ばれる1以上の塩基配列を有するポリヌクレオ
チドと一致または類似する標的塩基配列を有するポリヌ
クレオチドがコードするポリペプチドの機能を決定する
コンパレータ手段、および(iv)該コンパレータ手段によ
り得られた機能を表示するための出力手段。
【請求項２８】コリネ型細菌由来の標的塩基配列を有
するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの機
能を決定するための、下記(i)〜(iv)の工程を含むこと
を特徴とするコンピュータを用いた方法； (i)配列番号2〜3501から選ばれる１以上の塩基配列情報
および該塩基配列がコードするポリペプチドの機能情
報、並びに標的塩基配列情報を入力する工程、(ii)入力
された情報を少なくとも一時的に記録する工程、(iii)
該データ記録手段により記録された、配列番号2〜3501
から選ばれる1以上の塩基配列情報と標的塩基配列情報
とを比較する工程、(iv)配列番号2〜3501から選ばれる1
以上のアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドと一致ま
たは類似する標的塩基配列を有するポリヌクレオチドが
コードするポリペプチドの機能を決定する工程。
【請求項２９】コリネ型細菌由来の標的アミノ酸配列
を有するポリペプチドの機能を決定するための、下記
(i)〜(iv)の手段を備えることを特徴とするコンピュー
タを用いたシステム； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
ミノ酸配列情報を入力するための入力手段、(ii)入力さ
れた情報を少なくとも一時的に記録するためのデータ記
録手段、(iii)該データ記録手段により記録された、配
列番号3502〜7001から選ばれる1以上のアミノ酸配列情
報と標的アミノ酸配列情報とを比較し、配列番号3502〜
7001から選ばれる1以上のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドと一致または類似する標的アミノ酸配列を有する
ポリペプチドの機能を決定するコンパレータ手段、およ
び(iv)該コンパレータ手段により得られた機能を表示す
るための出力手段。
【請求項３０】コリネ型細菌由来の標的アミノ酸配列
を有するポリペプチドの機能を決定するための、下記
(i)〜(iv)の工程を含むコンピュータを用いた方法； (i)配列番号3502〜7001から選ばれる１以上のアミノ酸
配列情報および該配列に基づく機能情報、並びに標的ア
ミノ酸配列情報を入力する工程、(ii)入力された情報を
少なくとも一時的に記録する工程、(iii)該データ記録
手段により記録された、配列番号3502〜7001から選ばれ
る1以上のアミノ酸配列情報と標的アミノ酸配列情報と
を比較する工程、および(iv)配列番号3502〜7001から選
ばれる1以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドと一
致または類似する標的アミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの機能を決定する工程。
【請求項３１】コリネ型細菌が、Corynebacterium
属、Brevibacterium属、またはMicrobacterium属に属す
る微生物である、請求項２３、２５、２７および２９の
いずれか１項に記載のシステム。
【請求項３２】コリネ型細菌が、Corynebacterium
属、Brevibacterium属、またはMicrobacterium属に属す
る微生物である、請求項２４、２６、２８および３０の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】 Corynebacterium属に属する微生物がC
orynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoac
idophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Coryne
bacterium callunae、Corynebacterium herculis、Cory
nebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、C
orynebacterium thermoaminogenes、およびCorynebacte
rium ammoniagenesから選ばれる微生物である、請求項
３１項記載のシステム。
【請求項３４】 Corynebacterium属に属する微生物がC
orynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoac
idophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Coryne
bacterium callunae、Corynebacterium herculis、Cory
nebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、C
orynebacterium thermoaminogenes、およびCorynebacte
rium ammoniagenesから選ばれる微生物である、請求項
３２項記載の方法。
【請求項３５】配列番号1〜3501から選ばれる1以上の
塩基配列情報または該配列に基づく機能情報を記録した
コンピューターで読み取り可能な記録媒体であって、請
求項２３または２７記載のシステムまたは請求項２４ま
たは２８記載の方法に用いることのできる記録媒体また
は記憶装置。
【請求項３６】配列番号3502〜7001から選ばれる1以
上のアミノ酸配列情報または該配列に基づく機能情報を
記録したコンピューターで読み取り可能な記録媒体であ
って、請求項２５または２９記載のシステムまたは請求
項２６または３０記載の方法に用いることのできる記録
媒体または記憶装置。
【請求項３７】コンピューターで読み取り可能な媒体
が、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディス
ク、磁気テープ、ランダムアクセスメモリ(RAM)、読み
出し専用メモリ(ROM)、磁気光学ディスク(MO)、CD-RO
M、CD-R、CD-RW、DVD-ROM、DVD-RAMおよびDVD-RWからな
る群から選ばれる請求項３５または３６記載のコンピュ
ーターで読み取り可能な記録媒体または記憶装置。
【請求項３８】コリネ型細菌由来のホモセリンデヒド
ロゲナーゼにおいて、N末端から59番目のVal残基が他の
アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するホモセ
リンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３９】配列番号6952記載のアミノ酸配列の59
番目のVal残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ
酸配列を有するポリペプチド。
【請求項４０】ポリペプチドが、59番目のVal残基がA
la残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
である、請求項３８または３９記載のポリペプチド。
【請求項４１】コリネ型細菌由来のピルビン酸カルボ
キシラーゼにおいて、N末端から458番目のPro残基が他
のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するピル
ビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４２】配列番号4265記載のアミノ酸配列の45
8番目のPro残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ
酸配列を有するポリペプチド。
【請求項４３】ポリペプチドが、458番目のPro残基が
Ser残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドである、請求項４１または４２記載のポリペプチド。
【請求項４４】ポリペプチドが、Corynebacterium gl
utamicum由来のポリペプチドである、請求項３８〜４３
のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】請求項３８〜４４のいずれか１項に記
載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４６】請求項４５に記載のＤＮＡを含む組換
え体ＤＮＡ。
【請求項４７】請求項４６に記載の組換え体ＤＮＡを
含む形質転換体。
【請求項４８】請求項４５に記載のＤＮＡが染色体に
組み込まれた形質転換体。
【請求項４９】形質転換体が、コリネ型細菌である、
請求項４７または４８記載の形質転換体。
【請求項５０】コリネ型細菌が、Corynebacterium gl
utamicumである、請求項４９記載の形質転換体。
【請求項５１】請求項４７〜５０のいずれか１項に記
載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にＬ−リジン
を生成蓄積させ、該培養物からＬ−リジンを採取するこ
とを特徴とする、Ｌ−リジンの製造法。
【請求項５２】配列番号1〜3431に示される塩基配列
情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有するコリネ型
細菌の育種方法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発
酵法により生産できるように変異育種された、コリネ型
細菌由来の生産菌株のゲノムまたは遺伝子の塩基配列
と、配列番号1〜3431内の対応する塩基配列とを比較す
る工程、(ii)(i)で得られた比較の結果より、上記生産
菌株に存在する変異点を同定する工程、(iii)(ii)の工
程で同定した変異点を、該変異を有しないコリネ型細菌
に導入する工程、および(iv)(iii)の工程で得られたコ
リネ型細菌の、(i)で選ばれた化合物の発酵法による生
産性を調べる工程。
【請求項５３】遺伝子が、生合成経路あるいはシグナ
ル伝達経路上の酵素をコードする遺伝子である、請求項
５２記載の育種方法。
【請求項５４】変異点が生産性を向上または安定化さ
せる有効変異に関わる変異点である、請求項５２記載の
育種方法。
【請求項５５】配列番号1〜3431に示される塩基配列
情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有するコリネ型
細菌の育種方法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発
酵法により生産できるように変異育種された、コリネ型
細菌由来の生産菌株のゲノムまたは遺伝子の塩基配列
と、配列番号1〜3431内の対応する塩基配列とを比較す
る工程、(ii)(i)で得られた比較の結果より、上記生産
菌株に存在する変異点を同定する工程、(iii)(ii)の工
程で同定した変異点を、該変異を有するコリネ型細菌か
ら除去する工程、および(iv)(iii)の工程で得られたコ
リネ型細菌の、(i)で選ばれた化合物の発酵法による生
産性を調べる工程。
【請求項５６】遺伝子が、生合成経路あるいはシグナ
ル伝達経路上の酵素をコードする遺伝子である、請求項
５５記載の育種方法。
【請求項５７】変異点が、生産性を低下あるいは不安
定にさせる変異に関わる変異点である、請求項５５記載
の育種方法。
【請求項５８】配列番号2〜3431に示される塩基配列
情報を用いた、下記(i)〜(iv)の工程を有するコリネ型
細菌の育種方法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物の生
合成に関与するアイソザイムを配列番号2〜3431に示さ
れる塩基配列情報に基づき同定する工程、(ii)（i）の
工程で同定したアイソザイムを同じ活性を有するアイソ
ザイムに分類する工程、(iii)同じ活性を有するアイソ
ザイムコードしている全ての遺伝子を一括して変異させ
る工程、および(iv)(iii)の工程で得られた遺伝子を用
いて形質転換したコリネ型細菌の、(i)で選ばれた化合
物の発酵法による生産性を調べる工程。
【請求項５９】配列番号2〜3431に示される塩基配列
情報を用いた、下記(i)〜(v)の工程を有するコリネ型細
菌の育種方法； (i)配列番号2〜3431で示されるオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）の機能情報を整理する工程 (ii)公知の生合成経路あるいはシグナル伝達経路上の酵
素に、該整理されたＯＲＦを対応させる工程 (iii)コリネ型細菌において知られている生合成経路あ
るいはシグナル伝達経路に関する情報と組み合わせ、不
明であったコリネ型細菌における生合成経路およびシグ
ナル伝達経路を解明する工程、 (iv)(iii)の工程で解明された経路と所望の有用生産物
の生合成経路とを比較する工程、および (v)(iv)の工程で所望の有用生産物の生合成に重要と判
断される経路を強化するために、または(iv)の工程で所
望の有用生産物の生合成には重要ではない経路を弱める
ために、配列番号2〜3431に示される塩基配列情報に基
づき遺伝子工学的手法によりコリネ型細菌を変異させる
工程。
【請求項６０】請求項５２〜５９のいずれか１項に記
載の育種方法により得られるコリネ型細菌。
【請求項６１】コリネ型細菌が、Corynebacterium
属、Brevibacterium属、またはMicrobacterium属に属す
る微生物である、請求項６０記載のコリネ型細菌。
【請求項６２】 Corynebacterium属に属する微生物がC
orynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoac
idophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Coryne
bacterium callunae、Corynebacterium herculis、Cory
nebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、C
orynebacterium thermoaminogenes、およびCorynebacte
rium ammoniagenesから選ばれる微生物である、請求項
６１項記載のコリネ型細菌。
【請求項６３】請求項６０〜６２のいずれか１項に記
載のコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中にアミノ
酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそれらの類縁
体から選ばれる少なくとも一種の化合物を生成蓄積さ
せ、該培養物から該化合物を採取することを特徴とする
該化合物の製造法。
【請求項６４】化合物がＬ−リジンである請求項６３
記載の製造方法。
【請求項６５】プロテオーム解析に基づく、下記(i)
〜（vi）工程を有する有用変異に関わる蛋白質の同定方
法； (i)アミノ酸、核酸、ビタミン、糖、有機酸、およびそ
れらの類縁体から選ばれる少なくとも一種の化合物を発
酵法により生産できるように変異育種された、コリネ型
細菌由来の生産菌株および該生産菌株の親株の菌体より
それぞれ菌体由来の蛋白質を調製する工程、(ii)(i)の
工程で調製した蛋白質を２次元電気泳動法により分離す
る工程、(iii)分離された蛋白質を検出し、生産菌株由
来の蛋白質と親株由来の蛋白質の各発現量を比較する工
程、(iv)比較の結果、異なる発現量を示す蛋白質をペプ
チダーゼで処理し、ペプチド断片を抽出する工程、(v)
(iv)の工程で得られたペプチド断片のアミノ酸配列を解
析する工程、および(vi)(v)の工程で得られたアミノ酸
配列と配列番号3502〜7001に記載のアミノ酸配列とを比
較し、該アミノ酸配列を有する蛋白質を同定する工程。
【請求項６６】コリネ型細菌が、Corynebacterium
属、Brevibacterium属、またはMicrobacterium属に属す
る微生物である、請求項６５記載の同定方法。
【請求項６７】 Corynebacterium属に属する微生物がC
orynebacterium glutamicum、Corynebacterium acetoac
idophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Coryne
bacterium callunae、Corynebacterium herculis、Cory
nebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、C
orynebacterium thermoaminogenes、およびCorynebacte
rium ammoniagenesから選ばれる微生物である、請求項
６６項記載の同定方法。
【請求項６８】 Corynebacterium glutamicum AHP-3
(FERM BP-7382)。