JP2018528771A - L−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたl−リジン生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
培地に使用可能な糖源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、麦芽糖、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、及び酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別にあるいは混合物の形態で使用できるが、本発明は、これらに限定されるものではない。
実施例1:トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリの作製
リジン生産能が増加された菌株を得るために下記の方法によりベクターライブラリを作製した。
ブドウ糖10g、ペプトン10g、牛肉抽出物5g、酵母抽出物5g、脳心臓浸出液(Brain Heart Infusion)18.5g、生理的食塩水(NaCl)2.5g、尿素2g、ソルビトール91g、寒天20g(蒸留水1リットル基準)
前記実施例1で確保された約20,000個のコロニーをそれぞれ300μLの下記の選別培地に接種して96ディープウェルプレート(96−deep well plate)で32℃、1000rpmで約24時間培養した。
ブドウ糖10g、硫酸アンモニウム(ammonium sulfate)5.5g、MgSO4・7H2O 1.2g、KH2PO4 0.8g、K2HPO4 16.4g、ビオチン100μg、チアミンHCL 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル基準)
前記実施例2で選別された10種の突然変異株を対象としてL−リジン生産能が再現性よく増加された菌株を最終選別するために、下記の培地を用いたフラスコ培養を実施した。培養が完了した後、HPLCを用いて培養液内のL−リジン濃度を分析し、各突然変異株のL−リジン生産濃度を表1に示した。
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸溜水1リットル基準)
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形粉(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4・H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g(蒸溜水1リットル基準)。
本実施例では、前記実施例3で最終選別された変異体株を対象としてトランスポゾンのランダムな挿入により欠損した遺伝子を同定した。
プライマー2(配列番号4):CTACCCTGTGGAACACCTACATCT
コリネバクテリウム属菌株の染色体上で前記実施例4で確認された配列番号2のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることができる組換えベクターを作製するために、前記遺伝子の欠損のための断片を作製するためにプライマー3〜6を合成し、それを表2に示した。
前記実施例5で作製した組換えプラスミドpDZ−△MT8EHを、染色体上における相同組換えによって、L−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pに形質転換させた(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541−545,1999)。
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、KH2PO4 4g、 K2HPO4 8g、MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミンHCL1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル基準)
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形粉(corn steep solids)5g、尿素3g、KH2PO4 1g、MgSO4・H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g(蒸溜水1リットル基準)。
L−リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミクムに属する菌株においても上述した効果と同様の効果が得られるかを確認するために、前記実施例6と同様の方法でL−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11347P(上記微生物は、KFCC10750の番号で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてKCCM11347Pの番号が与えられた。韓国登録特許第10−0073610号公報)を対象として、配列番号2のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株を作製してKCCM11347P−MT8EHと命名した。
Claims (4)
- 配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質が不活性化された、L−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記タンパク質は、配列番号2の塩基配列を有する遺伝子によってコードされる、請求項1に記載のL−リジン生産能を有する コリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項1に記載のL−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 請求項1乃至3のいずれか一項による微生物を培地で培養するステップと;
前記微生物または培地からL−リジンを回収するステップと;を含む、
L−リシンを生産する方法。
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