JP6465997B2 - グルコネートリプレッサー変異体、これを含むｌ−リシンを生産する微生物及びこれを利用したｌ−リシン生産方法 - Google Patents
グルコネートリプレッサー変異体、これを含むｌ−リシンを生産する微生物及びこれを利用したｌ−リシン生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6465997B2 JP6465997B2 JP2017555259A JP2017555259A JP6465997B2 JP 6465997 B2 JP6465997 B2 JP 6465997B2 JP 2017555259 A JP2017555259 A JP 2017555259A JP 2017555259 A JP2017555259 A JP 2017555259A JP 6465997 B2 JP6465997 B2 JP 6465997B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lysine
- microorganism
- producing
- gntr1
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims description 144
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 title claims description 76
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 title claims description 68
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 37
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 title claims description 36
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 title claims description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 23
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 17
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 42
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 27
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 24
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 5
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 5
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 150000008545 L-lysines Chemical class 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 3
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- NNIFTGRSDICEMZ-GDVGLLTNSA-N (2s)-2,6-diamino-4-methylhexanoic acid Chemical compound NCCC(C)C[C@H](N)C(O)=O NNIFTGRSDICEMZ-GDVGLLTNSA-N 0.000 description 1
- NZWPVDFOIUKVSJ-YFKPBYRVSA-N (2s)-2,6-diamino-n-hydroxyhexanamide Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NO NZWPVDFOIUKVSJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MJPCOTCPKZTNHX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,1-dinitroguanidine Chemical compound CN=C(N)N([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O MJPCOTCPKZTNHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDXGCVGKTPQXFA-UHFFFAOYSA-N 3-chloroazepan-2-one Chemical compound ClC1CCCCNC1=O NDXGCVGKTPQXFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108700016171 Aspartate ammonia-lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010014468 Dihydrodipicolinate Reductase Proteins 0.000 description 1
- 108010013195 E coli gluconate permease Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010021382 Gluconokinase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102220466851 HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 4 chain_V59A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101100063932 Micromonospora echinospora gacH gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100024009 Probable gluconokinase Human genes 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 101150016365 gntK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150092851 gntP gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 102220209296 rs760271693 Human genes 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
- C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
- C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
- C07C229/26—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having more than one amino group bound to the carbon skeleton, e.g. lysine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、新規グルコネートリプレッサー変異体、それを含む微生物、及びそれを利用したＬ-リシン生産方法に関する。
アミノ酸など有用産物の大量生産のためにコリネバクテリウム菌株で糖の流入とペントースリン酸化経路の調節は非常に重要である（非特許文献１）。
グルコネートリプレッサー（Gluconate repressor、GntR）は、糖流入及びペントースリン酸化経路を介して炭素の流れを調節する重要な調節タンパク質であって、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株には、２つのグルコネートリプレッサー（ＧｎｔＲ１及びＧｎｔＲ２）が知られている。 ＧｎｔＲ１及びＧｎｔＲ２はグルコネート（gluconate）代謝に関連するグルコネートパーミアーゼ（gluconate permease、gntP）、グルコネートキナーゼ（gluconate kinase、gntK）、６-ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase、gnd ）を暗号化する遺伝子の発現を強く抑制し、ペントースリン酸化経路の主要な遺伝子であるｔｋｔ-ｔａｌ-ｚｗｆ-ｏｐｃＡ-ｄｅｖＢオペロンの発現を弱く抑制する役割をする。一方、コリネバクテリウム菌株の主要な糖流入代謝経路であるホスホトランスフェラーゼシステム（Phospho-Transferase System、PTS）のブドウ糖特異的トランスポーター酵素II（glucose-specific transpoter enzyme II、ptsG）及び原糖特異的トランスポーター酵素II（sucrose-specific transpoter enzyme II、ptsS）を暗号化する遺伝子の発現を促進し、糖流入に関しても重要に関与する（非特許文献２）。
Handbook of Corynebacterium glutamicum. 2005. 215-240
Julia Frunzke, Verena Engels, Sonja Hasenbein, Cornelia Gatgens and Michael Bott, Molecular Microbiology (2008) 67(2), 305-322
Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40
J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388
本発明者らはＬ-リシン生産性に有効な効果を与える遺伝子を発掘しようと鋭意努力した結果、新規変異型グルコネートリプレッサー１（Gluconate repressor、ＧｎｔＲ１）を開発し、それを含むＬ-リシンを生産する微生物の場合、野生型グルコネートリプレッサー１を含む微生物に比べて、糖の消費速度及びＬ-リシン生産性の向上が確認されることにより、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、グルコネートリプレッサータンパク質の新規な変異体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体を発現する、Ｌ-リシンを生産する微生物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、（ａ）前記Ｌ-リシンを生産する微生物を培地で培養する段階;及び（ｂ）前記（ａ）段階で培養された微生物または培養培地からＬ-リシンを回収する段階を含む、Ｌ-リシンを生産する方法を提供することにある。
本発明に係るグルコネートリプレッサー変異体を含むＬ-リシンを生産する微生物は、前記変異体を含まない微生物に比べて、向上された糖の消費速度を示し、Ｌ-リシンの効果的な生産をもたらすことができる。特に、Ｌ-リシンは、動物飼料の必須アミノ酸で産業的に大量生産が要求されるところ、本発明に基づいて、高効率でＬ-リシンを生産すると、飼料製造のコストの削減効果も得ることができる。
本発明を具現する一つの様態は、グルコネートリプレッサータンパク質の新規な変異体を提供する。
本発明における用語、「グルコネートリプレッサータンパク質」は、グルコネート代謝または糖流入などに関与する調節タンパク質を意味する。前記グルコネートリプレッサータンパク質は、特にこれに限定されないが、コリネバクテリウム属微生物、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のグルコネートリプレッサータンパク質であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＧｎｔＲ１タンパク質であってもよいが、これらに限定されない。前記グルコネートリプレッサータンパク質は、その例として、配列番号４のアミノ酸配列を有するＧｎｔＲ１であってもよいが、これらに限定されない。例えば、前記グルコネートリプレッサータンパク質は配列番号４のアミノ酸配列及びこれと８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。また、前記配列番号４のアミノ酸配列を有するグルコネートリプレッサータンパク質は、配列番号３の塩基配列を有するｇｎｔＲ１遺伝子によりコードされるものであってもよいが、これらに限定されない。例えば、前記配列番号３の塩基配列及びこれと８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有する塩基配列であってよい。
本願における用語、「相同性」は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分（moiety）間の同一性のパーセントをいう。一つの部分から他の一つの部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定されうる。例えば、相同性は、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを利用して二つのポリヌクレオチド分子または二つのポリペプチド分子間の配列情報を直接に整列して決定されてもよい。前記コンピュータプログラムはＢＬＡＳＴ(NCBI), ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ (CLC bio), ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ(DNASTAR Inc)などであってもよい。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定された二本鎖を形成する条件下で、ポリヌクレオチドを混成化した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより分解させて、分解された断片のサイズを決定することにより、決定してもよい。
前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体は、配列番号４のアミノ酸配列から１０２番目のアミノ酸であるアルギニン（arginine、R）がアルギニン以外のアミノ酸に置換されたポリペプチドであってもよい。具体的には、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体は、１０２番目の位置のアルギニンがシステイン（cysteine、C）に置換されて、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
これらのグルコネートリプレッサータンパク質の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドだけでなく、これと８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有する変異体であって、実質的に配列番号１で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と同一であるか、相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明のもう一つの様態は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
前記グルコネートリプレッサータンパク質及びその変異体については、前記で説明した通りである。
具体的に、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドだけでなく、８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであってもよい。前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドは、その例として、配列番号２の塩基配列を有してもよいが、これに限定されるものではない。
本発明における用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体が共有結合により長く鎖状に繋がったヌクレオチドの重合体であって、一般的に一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。前記ポリヌクレオチドは、遺伝暗号の 縮退性（genetic code degeneracy）に起因して、同一のアミノ酸配列をコードする、多様なヌクレオチド配列を有することができる。また、宿主細胞の種類に応じて発現を最適化するために、コドン最適化された配列を有することができる。
本発明における用語、「ベクター」は、宿主細胞へのポリヌクレオチドのクローニング及び/または転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは他のＤＮＡ断片が結合して、結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（replicon）であってもよい。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自家ユニットとして機能する、即ち、自らの調節により複製可能である任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウィルス）をいう。本発明において、ベクターは宿主の中で複製可能であるものであれば、特に限定されず、当業界に公知の任意のベクターを用いてもよい。前記組換えベクターの製作に使用されるベクターは、天然状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウィルス、及びバクテリアファージであってもよい。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用してもよく、プラスミドベクターとしてｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用してもよい。 使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知された発現ベクターを使用してもよい。具体的には、ｐＤＺ（特許文献１;本願発明の全体として引用されて含まれる。）が使用されてもよいが、これに限定されない。
本発明では、「形質転換」は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることができるようにすることであり、形質転換された前記ポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現することができれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものであれ、制限なく含まれてもよい。
前記ポリヌクレオチドは、 自体的に発現されるに必要なすべての要素を含むポリ構造体である、発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されうる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体または発現カセットの形態として宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよいが、これに制限されない。
本発明のもう一つの様態は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体を発現する、Ｌ-リシンを生産する微生物である。
前記グルコネートリプレッサータンパク質及びその変異体については、前記で説明した通りである。
本発明における用語、「Ｌ-リシン」は、塩基性α-アミノ酸の一つであって、体内で合成されない必須アミノ酸であり、化学式は[ＮＨ２(ＣＨ２)４ＣＨ(ＮＨ２)ＣＯＯＨ]であるＬ-アミノ酸の一種を意味する。Ｌ-リシンは、オキサロ酢酸からリシン生合成経路を介して生合成され、ＮＡＤＰＨ依存性還元酵素がリシン生合成のための中間過程を触媒する。１分子のＬ-リシン生合成過程で３分子のＮＡＤＰＨが糖酵素によって直接的に消費され、１分子のＮＡＤＰＨが間接的に利用される。
前記微生物は、突然変異によって前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体を含むか、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されたものであってもよい。
前記微生物は、当該グルコネートリプレッサータンパク質の変異体の活性を有するタンパク質を含むか、当該タンパク質が発現できるように形質転換されるものであれば、原核微生物及び真核微生物いずれのものであっても含まれてもよい。例えば、 エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、エンテロバクテリア（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、 ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が含まれてもよい。具体的には、コリネバクテリウム属に属する微生物であり、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよいが、これに限定されない。
本発明のグルコネートリプレッサータンパク質の変異体タンパク質が、Ｌ-リシンを生産する微生物に含まれる場合、野生型グルコネートリプレッサータンパク質を含む微生物に比べて糖を効果的に消費してＬ-リシンの生産能を高めることができる。
前記Ｌ-リシンを生産する微生物は、Ｌ-リシン生産能を有するものであれば、微生物の種類に制限なく含まれ、天然型菌株及び組換え菌株の形態をすべて含む。
Ｌ-リシン生産能を有し得るコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ-リシン類似体に耐性を持つ変異株になることもある。Ｌ-リシン類似体は、コリネ微生物の生育を阻害するが、これらの阻害は、Ｌ-リシンが培地に共存するときには、完全にまたは部分的に解除される。Ｌ-リシン類似体の例としては、オキサＬ-リシン、Ｌ-リシンヒドロキサメート、Ｓ-（２-アミノエチル）-Ｌ-システイン（ＡＥＣ）、γ-メチルＬ-リシン、α-クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＬ-リシン類似体に対して耐性を有する変異株は、コリネバクテリウム属微生物に通常の人工変異処理で処理することにより得ることができるが、これに限定されない。これに対する非限定的な例として、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（特許文献２、特許文献３）、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１００１、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（特許文献４）が含まれるが、これに限定されない。
また、Ｌ-リシン生産能を有し得るコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ-リシン生合成関連タンパク質の活性が非変異菌株に比べて強化されるように変形されたものであってもよい。即ち、Ｌ-リシン生合成関連遺伝子１種以上の発現を向上させる場合を挙げることができる。これらの発現向上は、遺伝子増幅、プロモーターまたは開始コドンのような配列の交替あるいは変形、発現が向上されるように変異導入などでなされることがあるが、これに限定されない。これに対する非限定的な例として、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献３）が含まれるが、これに限定されない。
また、Ｌ−リシン生合成関連遺伝子の例としては、Ｌ−リシン生合成経路上に位置する遺伝子を挙げることができ、具体的に ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（ｄａｐＡ）、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｙｓＡ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）、 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）、アスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（Ｐｙｃ）を挙げることができるが、これらに限定されない。また、ペントースリン酸経路上に存在するトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）などを挙げることができるが、これに限定されない。
一方、前記Ｌ−リシン生産能を有することができるコリネバクテリウム属微生物はＬ−リシン生産と関連された当業界に公知された変異を含むようにして、Ｌ−リシン生産能を現すことができるが、これに制限されない。
本発明のもう一つの様態は、（ａ）前記Ｌ-リシンを生産する微生物を培地で培養する段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階で培養された微生物または培養培地からＬ-リシンを回収する段階を含む、Ｌ-リシンを生産する方法である。
前記Ｌ-リシン、及びそれを製造する微生物については、前記で説明した通りである。
本願における用語、「培養」は、前記微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は、当業界で知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。具体的な培養温度、培養時間及び培地のｐＨなどの条件は、当業者の一般的な知識または従来の公知の方法によって行うことができ、これにより適切に調節されてもよい。具体的には、これらの公知の培養方法は、文献[Chmiel; Bioprozesstechnik 1 Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)、及びStorhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)]に詳細に記述されている。また、培養方法には回分式培養（batch culture）、連続式培養（cintinuous culture）及び流加式培養（fed-batch culture）が含まれてもよく、具体的には、バッチ工程または注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）において連続式で培養してもよいが、これに限定されるものではない。
培養に使用される培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。前記培地で用いられる炭素源としては、ブドウ糖、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸などが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。これら物質は、個別または混合物として用いられてもよく、これに限定されない。用いられてもよい窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆、小麦、及び尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムなどが含まれてもよく、窒素源も個別または混合物として用いられてもよく、これに限定されない。用いられてもよいリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩などが含まれてもよく、これに限定されない。また、培養培地は成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加してもよいが、これに限定されない。
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方法で添加して、培養物のｐＨを調整してもよい。培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制してもよい。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４０℃、具体的には、３０℃〜３５℃、または、これらに限定されるものではない。 培養期間は、所望の有用物質の生成量を得るまで継続されてもよく、具体的には１０〜１００時間であってもよい。Ｌ−リシン酸は、培養培地中に排出されるか、微生物中に含まれてもよい。
また、本願のＬ−リシンを生産する方法には、培養された微生物または培養培地からＬ−リシンを回収する方法は、当業界に広く知られている。前記Ｌ−リシンの回収方法には、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されてもよいが、これらの例に限定されるものではない。
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：変異型コリネバクテリウム・グルタミカムゲノミック（genomic）ＤＮＡライブラリ製作
本実施例では、Ｌ-リシン生産能及び生産性に有効な効果を与える遺伝子及び変異を発掘するためにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株にＮ-メチル-Ｎ-ニトロ-Ｎ-ニトログアニジン（ＮＴＧ）による人工突然変異を誘導した後、通常の公知の抽出法によってゲノミックＤＮＡを抽出した。用意されたＤＮＡに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを処理して、１〜３ｋｂの部分切片を獲得した。前記切片を制限酵素ＢａｍＨＩ末端を有する大腸菌及びコリネバクテリウムの形質転換用のシャトルベクターｐＥＣＣＧ１２２に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ/Ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲ（配列番号５及び６のプライマーを使用）を介して前記切片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、これらをすべて混合培養し、通常の公知であるプラスミド抽出法によってプラスミドを抽出した。
配列番号５ : ＴＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＴＣＧＧＴＴＴＡＴ
配列番号６ : ＣＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ
実施例２：人工変異ライブラリの導入及びＬ-リシン生産能の向上菌株選別
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０８８１と公開されたが、ブダペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐと寄託番号を与えられた、特許文献２）菌株を親菌株にして、前記製作されたベクターを形質転換して、下記の複合平板培地に塗抹した。
<複合平板培地>
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４５ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１０ｇ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ 、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、寒天２０ｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水1Ｌ基準）
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４５ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１０ｇ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ 、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、寒天２０ｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水1Ｌ基準）
確保された約１０，０００個のコロニーをそれぞれ３００μｌの選別培地に接種して、９６ディープウェルプレート（deep well plate）で３２℃、１０００ｒｐｍで約１６時間培養した。培養中に生産されたＬ-リシンの生産量を分析するためにニンヒドリン方法を用いた（非特許文献４）。培養が完了した後、培養上清液１０μｌとニンヒドリン反応溶液１９０μｌ（６３％グリセロール、２７％ニンヒドリン溶液）を６５℃で３０分間反応させた後、波長５７０ｎｍで分光光度計で吸光度を測定し、対照区（ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｐＥＣＣＧ１２２）の吸光度と比較して、類似または増加された吸光度を示す変異菌株２４８種を選別した。前記条件の培養時、対照区菌株は、１〜２ｇ/Ｌの残留糖が残っているため、対照区に比べ糖の消費速度が速くなったり、リシン生産能が増加された菌株を選別することができた。
<選別培地（pH8.0）>
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム （ammonium sulfate）５．５ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４０．８ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１６．４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ （蒸留水１Ｌ基準）
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム （ammonium sulfate）５．５ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４０．８ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１６．４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ （蒸留水１Ｌ基準）
また、選別された２４８種の菌株を対象に、前記の方法を繰り返して行い、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｐＥＣＣＧ１２２菌株に比べて、Ｌ-リシン生産能が１０％以上向上された上位２９種の変異菌株を選別した。
実施例３：人工変異選別株のＬ-リシン生産能及び糖消費速度の分析
前記実施例２で選別した２９種の菌株のＬ-リシン生産能と糖消費速度を下記の方法で培養して分析した。
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバブルフラスコに各菌株を接種して、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバブルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＨＰＬＣを利用して、Ｌ-リシンの濃度を分析し、菌株の糖の消費速度及び生産性を測定するために時間帯別、培養液中の残留糖濃度を測定した。
<種培地（ｐＨ ７．０）>
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ （蒸留水１Ｌ基準）
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ （蒸留水１Ｌ基準）
<生産培地（ｐＨ ７．０）>
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。
２９種の変異菌株の中で対照区に比べてＬ-リシン濃度は同等レベル以上であり、糖の消費速度及び生産性が向上された３種の菌株を選別して、前記培養及び分析を繰り返し行い、分析された結果は、表１のようである。
前記３つの菌株は対照区と同等レベル以上のＬ-リシンを生産したが、単位時間当たりの糖の消費速度が対照区より向上されて発酵生産性が改善されたことを確認できた。選抜された変異株の中、生産性が最も有意に向上された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０を最終選別し、糖の消費速度及び生産性増加を誘発した根本的な遺伝子レベルでの塩基配列の突然変異を探索するためにプラスミドを抽出した。その後、配列番号５及び６のプライマーを用いて塩基配列を分析した。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０由来のプラスミドは、ＮＣｇｌ２４４０遺伝子ＯＲＦ開始コドンの上流約４５０ｂｐ地点から終止コドンの下流約３５０ｂｐ付近までが含まれていた。また、米国国立衛生研究所の遺伝子銀行（NIH GenBank）を基にした遺伝子の塩基配列分析を通じて、遺伝子がグルコネートリプレッサーのいずれか一つであるｇｎｔＲ１であることを確認し、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０菌株に導入されたｇｎｔＲ１変異は３０４番目の塩基配列がＣからＴに置換されて１０２番目のアミノ酸がアルギニンからシステインに突然変異されたことを確認した。
即ち、配列番号4のアミノ酸配列を有するｇｎｔＲ１の１０２番目のアミノ酸であるアルギニンがシステインに置換されたことを確認した。
実施例４：ｇｎｔＲ１変異をＬ-リシン生産株の染色体に導入するためのベクター製作
前記実施例３で確認されたｇｎｔＲ１変異適用効果を確認するために、これを染色体上に導入することができるベクターを製作した。
報告された塩基配列に基づいて、５’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を挿入したプライマー（配列番号７）と３’末端にＳａｌＩ制限酵素部位を挿入したプライマー（配列番号８）を合成した。このプライマー対を用いて、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０のプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ｇｎｔＲ１遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で４０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
配列番号 ７： ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣ
配列番号 ８：ＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧ
ＰＣＲで増幅された遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで処理して、それぞれのＤＮＡ切片を獲得した後、これを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ末端を有する染色体導入用ｐＤＺベクター（特許文献１）に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ/Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。 ＰＣＲを使用して目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常の公知のプラスミド抽出法を利用して、プラスミドを獲得し、このプラスミドのｇｎｔＲ１に挿入された変異に基づいてｐＤＺ-ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。
実施例５：Ｌ-リシン生産株であるＫＣＣＭ１１０１６ＰにｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の製作及び生産性の比較
前記実施例４で製造した新規変異導入ベクターを２段階相同染色体組換えによってＬ-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換させた。その後、染色体上のｇｎｔＲ１変異が導入された菌株を塩基配列分析により選別し、前記ｇｎｔＲ１変異が導入された菌株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ :: ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。
実施例３と同様の方法で培養して、そこからＬ-リシン濃度および残留糖濃度を測定した。また、原糖における培養効果も確認するために、ブドウ糖の生産培地の代わりに原糖生産培地を用いて同様の方法で分析した（表２）。
<原糖生産培地（ｐＨ７．０）>
原糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ 、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１基準）。
原糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ 、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１基準）。
その結果、単位時間当たりの糖の消費速度はブドウ糖及び原糖培地で対照区であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べＫＣＣＭ１１０１６Ｐ::ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）はＬ-リシン生産能には影響を与えずに、糖消費速度が増加したことを確認した。また、ブドウ糖及び原糖をすべて消費した時点を確認した結果、対照区は７２時間、６８時間に完全に消費してＬ-リシンをそれぞれ４３．５ｇ/Ｌ、４７．０ｇ/Ｌ生産しており、ｇｎｔＲ１変異導入株は６０時間、５８時間にＬ-リシンをそれぞれ４３．９ｇ/Ｌ、４７．４ｇ/Ｌ生産した。即ち、ｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の場合には、時間当たりのＬ-リシンの生産性がブドウ糖、原糖においてそれぞれ２１％、１８％増加していることを確認した（表３）。
前記の結果は、ｇｎｔＲ１変異の導入が同等レベルのＬ-リシン生産能を有しながらも、ブドウ糖及び原糖消費速度に効果的であることが分かった。すなわち、本発明のｇｎｔＲ１変異を導入した場合、Ｌ-リシン発酵生産性が改善される効果の優秀性を示唆するものである。そこで、本発明者らは、前記糖消費速度及び生産性が向上された菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ :: ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）をコリネバクテリウム・グルタミカム「ＣＡ０１-２２９３」と命名し、２０１４年１２月５日付けでブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１６２８Ｐを与えられた。
実施例６：Ｌ-リシン生産株であるＫＣＣＭ１１３４７ＰにｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の製作及び生産性の比較
コリネバクテリウム・グルタミカムに属する他の菌株においての効果も確認するために、前記実施例５と同様の方法でＬ-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０７５０と公開されたがブダペスト条約の下、国際寄託機関に再寄託されて、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐを与えられた、特許文献４）にｇｎｔＲ１変異が導入された菌株を製作し、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ :: ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。前記実施例５と同様の方法で製作された菌株を培養して、リシン生産能と残留糖を比較した（表４）。
その結果、前記実施例５と同様にｇｎｔＲ１変異導入株は対照区に比べてブドウ糖、原糖の両方で糖の消費速度が増加したことを確認した。また、ブドウ糖及び原糖をすべて消費した時点を確認した結果、対照区は７２時間、６９時間に糖を完全に消費し、Ｌ-リシンをそれぞれ３８．６ｇ/Ｌ、４１．３ｇ/Ｌ生産しており、ｇｎｔＲ１変異導入株は６１時間、５８時間にＬ-リシンを３８．７ｇ/Ｌ、４１．４ｇ/Ｌ生産した。即ち、ｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の場合、時間当たりのＬ-リシンの生産性がブドウ糖、原糖においてそれぞれ１８％、１９％増加することを確認した（表５）。
実施例７：Ｌ-リシン生産株であるＣＪ３ＰにｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の製作及び生産性比較
コリネバクテリウム・グルタミカムに属する別の菌株での効果も確認するために、前記実施例５と同様の方法でＬ-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献３）にｇｎｔＲ１変異が導入された菌株を製作し、ＣＪ３Ｐ:: ＧｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。ＣＪ３Ｐ菌株は、公知の技術を基に、野生株に３種の変異（ｐｙｃ（Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒ）、ｈｏｍ（Ｖａｌ５９Ａｌａ）、ｌｙｓＣ（Ｔｈｒ３１１Ｉｌｅ））を導入し、Ｌ-リシン生産能を有することになるコリネバクテリウム・グルタミカム菌株である。前記実施例５と同様の方法で製作された菌株を培養して、リシン生産能と時間帯別の培養液中の残留糖濃度を測定した（表６）。
その結果、前記実施例５、６と同様にｇｎｔＲ１変異導入する対照区に比べてブドウ糖及び原糖の両方で糖の消費速度が増加したことを確認した。また、ブドウ糖及び原糖をすべて消費した時点を確認した結果、対照区はブドウ糖と原糖をそれぞれ48時間、42時間に完全に消費してＬ-リシンをそれぞれ８．２、８．８ｇ/Ｌ生産しており、ＧｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）を導入菌株は４２時間、３８時間にＬ-リシンをそれぞれ８．４、９．０ｇ/Ｌ生産した、すなわち、ＧｎｔＲ１変異を導入した菌株の場合には、時間当たりのＬ-リシンの生産性が１７％、１３％増加していることを確認した（表７）。
したがって、前記の結果からコリネバクテリウム属由来のリシン生産菌株のｇｎｔＲ１変異の導入時、糖消費速度の増加によるリシン生産性向上に効果があることを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (7)
- 配列番号１のアミノ酸配列を含む、グルコネートリプレッサー活性を有するポリペプチド。
- 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列を含むものである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項１に記載のポリペプチドを発現する、Ｌ-リシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項５に記載のＬ-リシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
- （ａ）請求項５または６に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；
及び
（ｂ）前記（ａ）段階で培養された微生物または培養培地からＬ-リシンを回収する段階を含む、Ｌ-リシンを生産する方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150055495A KR101640711B1 (ko) | 2015-04-20 | 2015-04-20 | 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
| KR10-2015-0055495 | 2015-04-20 | ||
| PCT/KR2016/002480 WO2016171392A1 (ko) | 2015-04-20 | 2016-03-11 | 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2018512877A JP2018512877A (ja) | 2018-05-24 |
| JP6465997B2 true JP6465997B2 (ja) | 2019-02-06 |
Family
ID=56616452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017555259A Active JP6465997B2 (ja) | 2015-04-20 | 2016-03-11 | グルコネートリプレッサー変異体、これを含むｌ−リシンを生産する微生物及びこれを利用したｌ−リシン生産方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10253339B2 (ja) |
| EP (1) | EP3287469B1 (ja) |
| JP (1) | JP6465997B2 (ja) |
| KR (1) | KR101640711B1 (ja) |
| CN (1) | CN107849094B (ja) |
| BR (1) | BR112017022528A2 (ja) |
| DK (1) | DK3287469T3 (ja) |
| ES (1) | ES2745561T3 (ja) |
| HU (1) | HUE045394T2 (ja) |
| MY (1) | MY176584A (ja) |
| PL (1) | PL3287469T3 (ja) |
| RU (1) | RU2681475C1 (ja) |
| WO (1) | WO2016171392A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540261B (zh) * | 2020-11-24 | 2024-02-02 | 北京化工大学 | 一种产氨基己二酸的基因工程菌 |
| WO2023041425A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Evonik Operations Gmbh | Method for the fermentative production of l-lysine using c. glutamicum strains expressing modified gluconate repressor proteins gntr1 and gntr2 |
| KR20230053351A (ko) * | 2021-10-14 | 2023-04-21 | 대상 주식회사 | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 |
| CN115490761B (zh) * | 2021-11-01 | 2023-06-09 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 基于赖氨酸外排蛋白构建的重组微生物及生产赖氨酸的方法 |
| KR20230161245A (ko) * | 2022-05-18 | 2023-11-27 | 씨제이제일제당 (주) | 글루코네이트 리프레서 단백질 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
| KR20230161244A (ko) * | 2022-05-18 | 2023-11-27 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 글루타메이트 글루코네이트 리프레서 변이체 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산 방법 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3008549B2 (ja) * | 1991-03-06 | 2000-02-14 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
| KR0159812B1 (ko) | 1995-12-20 | 1998-11-16 | 손경식 | 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법 |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
| DE10154245A1 (de) | 2001-11-05 | 2003-06-05 | Basf Ag | Gene die für regulatorische Proteine codieren |
| EP1362866A1 (en) | 2002-05-16 | 2003-11-19 | Basf Aktiengesellschaft | Use of the repressor glxR for the synthesis of lysine in Corynebacterium glutamicum |
| EP2066782A4 (en) | 2006-09-15 | 2010-02-03 | Cj Cheiljedang Corp | CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH |
| KR101269810B1 (ko) * | 2010-07-15 | 2013-05-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ－라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법 |
-
2015
- 2015-04-20 KR KR1020150055495A patent/KR101640711B1/ko active IP Right Review Request
-
2016
- 2016-03-11 US US15/568,385 patent/US10253339B2/en active Active
- 2016-03-11 WO PCT/KR2016/002480 patent/WO2016171392A1/ko active Application Filing
- 2016-03-11 MY MYPI2017703961A patent/MY176584A/en unknown
- 2016-03-11 PL PL16783326T patent/PL3287469T3/pl unknown
- 2016-03-11 CN CN201680035755.2A patent/CN107849094B/zh active Active
- 2016-03-11 DK DK16783326T patent/DK3287469T3/da active
- 2016-03-11 HU HUE16783326A patent/HUE045394T2/hu unknown
- 2016-03-11 EP EP16783326.8A patent/EP3287469B1/en active Active
- 2016-03-11 JP JP2017555259A patent/JP6465997B2/ja active Active
- 2016-03-11 RU RU2017138267A patent/RU2681475C1/ru active
- 2016-03-11 BR BR112017022528-0A patent/BR112017022528A2/pt unknown
- 2016-03-11 ES ES16783326T patent/ES2745561T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20180100173A1 (en) | 2018-04-12 |
| RU2681475C1 (ru) | 2019-03-06 |
| KR101640711B1 (ko) | 2016-07-19 |
| HUE045394T2 (hu) | 2019-12-30 |
| PL3287469T3 (pl) | 2020-06-15 |
| ES2745561T3 (es) | 2020-03-02 |
| US10253339B2 (en) | 2019-04-09 |
| WO2016171392A1 (ko) | 2016-10-27 |
| DK3287469T3 (da) | 2019-11-04 |
| BR112017022528A2 (pt) | 2019-02-19 |
| CN107849094B (zh) | 2020-01-14 |
| EP3287469A1 (en) | 2018-02-28 |
| MY176584A (en) | 2020-08-17 |
| EP3287469B1 (en) | 2019-08-07 |
| CN107849094A (zh) | 2018-03-27 |
| JP2018512877A (ja) | 2018-05-24 |
| EP3287469A4 (en) | 2018-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6465997B2 (ja) | グルコネートリプレッサー変異体、これを含むｌ−リシンを生産する微生物及びこれを利用したｌ−リシン生産方法 | |
| JP5396403B2 (ja) | 改良されたプロモーターおよびこれを用いたｌ−リシンの生産方法 | |
| JP6625133B2 (ja) | ピルビン酸デヒドロゲナーゼ変異体、それを含む微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸生産方法 | |
| JP6476212B2 (ja) | Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属の微生物及びそれを用いたｌ−アルギニンの製造方法 | |
| JP6297134B2 (ja) | プトレシン生産性を有する微生物及びそれを用いたプトレシン生産方法 | |
| JP6750005B2 (ja) | Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法 | |
| KR20130082124A (ko) | 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법 | |
| CN114729012A (zh) | L-苏氨酸输出蛋白变体和使用其生产l-苏氨酸的方法 | |
| JP2019030316A (ja) | Ｌ−リシン生産能を有する微生物及びそれを用いたｌ−リシンの生産方法 | |
| JP2018523496A (ja) | Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたｌ−リジン生産方法 | |
| KR101564753B1 (ko) | 코리네형 세균 유래의 치환된 개시코돈을 포함하는 재조합 벡터, 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 아미노산의 생산방법 | |
| JP5814459B2 (ja) | エシェリキア属菌株に由来するフルクトキナーゼ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム属菌株、及び該菌株を用いてｌ−アミノ酸を生産する方法。 | |
| AU2020356063A1 (en) | Modified polypeptide of dihydrodipicolinate reductase, and method for producing L-threonine by using same | |
| TWI650416B (zh) | 用於製造二胺之微生物及使用該微生物製造二胺之方法 | |
| JP2024503049A (ja) | ＧｌｘＲ蛋白質変異体またはこれを利用したスレオニン生産方法 | |
| JP2023506053A (ja) | クエン酸シンターゼの活性が弱化した新規な変異型ポリペプチド及びそれを用いたｌ－アミノ酸生産方法 | |
| CN114630903A (zh) | 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽及使用其生产l-苏氨酸的方法 | |
| JP2024515389A (ja) | Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシンの生産方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171020 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171020 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180904 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181203 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181218 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190108 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6465997 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |