KR101269810B1

KR101269810B1 - Ｌ－라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법

Info

Publication number: KR101269810B1
Application number: KR1020110065694A
Authority: KR
Inventors: 임상조; 문준옥; 김형준; 장재우; 조재용
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2011-07-01
Publication date: 2013-05-30
Also published as: US20130102037A1; DK2430152T3; CN102741393B; CN102741393A; JP5682072B2; PL2430152T3; KR20120007965A; BRPI1106092A2; ES2603128T3; JP2012530515A

Abstract

본 발명은 Ｌ－라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 Ｌ－라이신 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 글루코네이트 키나아제 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-라이신 생산 미생물, 상기 L-라이신 생산 미생물을 제조하는 방법 및 상기 미생물을 배양하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ－라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 Ｌ－라이신 생산방법{A microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same}

L-라이신은 옥살아세트산으로부터 라이신 생합성 경로를 통해 생합성 되는데, 당 생합성 경로를 구성하는 효소들 중 각각 asd 유전자, dapB 유전자 및 ddh 유전자에 의해 코딩된 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제, 디히드로피콜리네이트 리덕타제 및 디아미노피멜레이트 디히드로게나제는 NADPH 의존성 환원효소로서 라이신 생합성을 위한 중간과정을 촉매한다. 즉, 1 분자의 L-라이신 생합성 과정에서 3 분자의 NADPH가 당 효소들에 의해 직접적으로 소모되며, 1 분자의 NADPH가 간접적으로 이용되는데, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 내에서 이러한 NADPH의 재생과 L-라이신 생합성간의 직접적인 연관관계는 종래의 문헌들에 의해서 이미 보고된 바 있다(Wittmann and Heinzle, Microbiol 68:5843-5849, 2002; Marx et al., J Biotechnol 104:185-197, 2003; Ohnishi et al., Microbiol Lett 242:265-274, 2005).

코리네박테리움에서 NADPH의 주요 생성경로는 TCA 회로와 오탄당 인산화 경로(pentose phosphate pathway)인데 L-라이신 생산시 주된 환원력 공급은 오탄당 인산화 경로에서의 산화과정에 의해 이루어지는 편이 바람직하다. TCA 회로는 1 사이클 당 1 분자의 NADPH와 2 분자의 CO₂를 배출시키는 반면, 오탄당 인산화 경로는 2 사이클 당 2 분자의 NADPH와 1 분자의 CO₂를 배출시키므로 탄소대사 효율 측면에서 보다 경제적이라 할 수 있다. 즉, L-라이신 생산 균주의 수율이 높아질수록 더불어 NADPH에 대한 요구도도 증가하게 되며, 이에 따라 오탄당 인산화 경로에 대한 의존도가 높아지게 되는 것이다.

L-라이신을 생산하는 동안 상기 오탄당 인산화 경로를 촉매하는 효소는 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) 및 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제(6-phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD)가 보고되었다(Marx et al., Biotechnol Bioeng 56:168-180, 1997; Wittmann and Heinzle, Microbiol 68:5843-5849, 2002).

또한, 코리네박테리움 L-아미노산 생산 균주의 오탄당 인산화 경로에서의 NADPH 생성 관련 유전자 발현 강화 또는 돌연변이 효소를 이용한 L-아미노산 생산능 증가 효과가 보고된 바 있었다. 예를 들면, J. Becker 등은 L-라이신 생산 코리네박테리움 글루타미쿰에서 G6PDH를 코딩하는 zwf 유전자의 프로모터 교체를 통한 발현 강화시 라이신 생산량이 증가됨을 보고하였으며(J. Becker et al., J Biotechnol 132: 99-109, 2007), 유럽등록특허 제1302537호에는 변이형 6PGD 를 암호화하는 유전자가 도입된 L-아미노산 생산 코리네박테리아를 배양하여 L-아미노산을 생산하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 코리네박테리움 내재적 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase, GntK) 활성 약화를 통해 오탄당 인산화 경로에서의 NADPH 생합성이 증가된 코리네박테리아 속 미생물에 대하여는 개시된 바 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 L-라이신을 고효율, 고수율로 수득하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, L-라이신의 생합성 경로로 최대의 카본 플럭스를 유지하기 위해서는 오탄당 인산화 경로로의 탄소 흐름의 전환에 따른 NADPH가 충분하게 공급되어야 한다는 생각에서, 산화적 오탄당 인산화 경로의 대사적 활성을 유전적으로 변형시켜 NADPH의 생산을 증가시킴으로써 결과적으로 L-라이신의 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK) 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-라이신 생산 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 1) 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK)를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부 서열이 변이되어 활성이 약화된 GntK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 2) 숙주세포에 도입되어 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계; 3) 상기 수득한 재조합 벡터를 L-라이신을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입하여 상동 재조합체를 수득하는 단계; 및 4) 상기 상동 재조합체 중에서 GntK의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는 상기 L-라이신 생산 미생물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 1) 상기 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 2) 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK) 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 L-라이신 생산 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "L-라이신"이란 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며, 화학식은 NH₂(CH₂)₄CH(NH₂)COOH인 L-아미노산의 일종을 의미한다. L-라이신은 옥살아세트산으로부터 라이신 생합성 경로를 통해 생합성되며, NADPH 의존성 환원효소가 라이신 생합성을 위한 중간과정을 촉매한다. 1 분자의 L-라이신 생합성 과정에서 3 분자의 NADPH가 당 효소들에 의해 직접적으로 소모되며, 1 분자의 NADPH가 간접적으로 이용된다.

본 발명에서 용어, "글루코네이트 키나아제(gluconate kinase, GntK)"란 미생물의 오탄당 인산화 경로의 산화과정 중간체인 6-포스포글루콘산의 생합성을 위한 GntK 경로에 관여하는 효소를 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물은 오탄당 인산화 경로의 산화과정의 중간체인 6-포스포글루콘산의 생합성에 있어 2 가지 대사경로, 즉 G6PDH 경로 및 GntK 경로를 지니고 있으며(도 1), 이것은 코리네박테리움 속 미생물이 GntK 경로를 통해 글루코오스의 일부를 분해할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명자들은 상기 GntK 경로의 차단을 통하여 6-포스포글루콘산으로의 탄소흐름을 차단함으로써 오탄당 인산화 경로의 산화과정으로 더 많은 탄소흐름이 진행되어, 6-포스포글루코네이트 디하드로게나제(6PGD)의 활성이 특이적으로 증가함으로써 NADPH 재생량이 증가할 것으로 예측하고, 이를 통하여 결과적으로 L-라이신의 생산량이 증가할 수 있는 메커니즘을 제안하였다. 이에, 미생물 내에서 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성을 갖는 것으로 추정되는 효소의 활성을 약화시키고자 하였다.

바람직하게, 본 발명에서 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성을 갖는 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 NCgl2399 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 NCgl2905 일 수 있다.

본 발명에서 용어, "내재적 활성"이란 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 미생물이 천연적으로 가지고 있는 GntK의 활성 상태를 의미한다.

본 발명에서 “내재적 활성 약화”는 내재적 단백질을 코딩하는 염기서열이 포함된 미생물의 염색체상에서 상기 염기서열 전체 또는 일부의 결실, 상기 염기서열 일부의 치환 또는 상기 염기서열 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 돌연변이 시킴으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 내재적 단백질을 코딩하는 염기서열의 발현조절서열 전체 또는 일부의 결실, 일부의 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되어 발현유도활성이 저하 또는 파괴됨으로써 내재적 활성이 약화될 수 있다. 상기 발현조절서열은 염색체상의 염기서열의 상부 또는 하부에 위치할 수 있으며, 바람직하게는 프로모터, 인핸서 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자의 염색체 내로의 돌연변이는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서 "GntK 활성이 내재적 활성에 비해 약화" 되었다는 것은, 유전자의 결손 또는 돌연변이에 의해 GntK가 정상적으로 작용하지 않아 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 GntK 활성이 약해진 상태를 의미한다. 본 발명의 일예에서는 도 2 또는 도 3의 개열지도를 갖는 재조합 벡터를 도입시킴으로써 GntK 활성이 파괴되어 라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

이때, 서로 다른 염기서열로부터 발현되는 서로 다른 아미노산 서열을 갖지만 글루코네이트 키나아제로서의 동일한 활성을 갖는 단백질의 유전자가 염색체상에 두 개 이상 존재하는 경우, 상기 한 개 또는 두 개 이상의 유전자 전체 또는 일부의 결실, 일부의 치환 또는 삽입에 의하여 GntK 활성을 천연 상태의 활성보다 약화시킬 수 있다. 또한, 상기 한 개 또는 두 개 이상의 유전자 발현조절서열 전체 또는 일부의 결실, 일부의 치환 또는 삽입을 통하여 당 유전자가 돌연변이 되어 그 산물인 단백질의 활성이 저하 또는 파괴됨으로써 GntK 내재적 활성이 약화될 수 있다.

바람직하게는 NCgl2399 또는 NCgl2905를 암호화하는 유전자, 보다 바람직하게는 NCgl2399를 암호화하는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 유전자 또는 NCgl2905를 암호화하는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 유전자, 또는 상기 유전자 모두가 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되거나 이의 발현 조절 서열이 돌연변이 되어, GntK가 정상적으로 작용하지 않아 천연 상태의 GntK 활성이 약해진 상태를 의미한다.

본 발명에서는 글루코네이트 키나아제를 코딩하는 유전자의 일부를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 내재적 글루코네이트 키나아제 유전자를 결손 또는 돌연변이시킴으로써 글루코네이트 키나아제 내재적 활성이 약화된 미생물을 제조할 수 있다. 상기 유전자의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

이러한 관점에서, 본 발명은 1) 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK)를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부 서열이 변이되어 활성이 약화된 GntK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계; 2) 숙주세포에 도입되어 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계; 3) 상기 수득한 재조합 벡터를 L-라이신을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입하여 상동 재조합체를 수득하는 단계; 및 4) 상기 상동 재조합체 중에서 GntK의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 L-라이신 생산 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 숙주세포의 염색체와 따로 복제될 수 없는 벡터로서, 유전자 삽입물이 상기 숙주세포의 염색체상의 특정 유전자와 상동 재조합될 수 있는 필수적인 구성요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 구체적으로 항생제 내성 유전자와 레반수크라아제(levansucrase, sacB) 유전자와 같은 선발유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서는 도 2 또는 도 3의 개열지도로 표시되는 재조합 벡터를 사용할 수 있다.

상기 재조합 벡터를 도입하는 모균주로는 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물이라면 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속 미생물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum)　ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 수탁번호 KFCC10881인 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881이 사용되었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결손(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pDZ 벡터(한국등록특허 제0924065호에 공지)를 이용함으로써 상기 유전자들의 결손을 수행하였다. 즉, 상기 pDZ 벡터에 각각 NCgl2399 또는 NCgl2905를 암호화하는 유전자들의 일부분이 삽입된 재조합 벡터를 제작한 후, 당업계에 알려진 임의의 방법으로 상기 재조합 벡터를 미생물에 형질전환 및 염색체 내 상동 재조합시킴으로써, 글루코네이트 키나아제 활성이 약화된 L-라이신 생산용 코리네박테리움 속 미생물을 제작할 수 있었다.

본 발명에서는 pDZ 벡터에서 NCgl2399를 암호화하는 유전자의 일부를 포함하는 pDZ 유도체를 제조하여 pDZ-ΔNCgl2399로 명명하였으며, 이를 형질전환시켜 NCgl2399를 암호화하는 유전자가 파괴된 재조합 균주를 KFCC10881-ΔNCgl2399로 명명하였다. 또한, pDZ 벡터에서 NCgl2905를 암호화하는 유전자의 일부를 포함하는 pDZ 유도체를 제조하여 pDZ-ΔNCgl2905로 명명하였으며, 이를 형질전환시켜 NCg12905를 암호화하는 유전자가 파괴된 재조합 균주를 KFCC10881-ΔNCgl2905로 명명하였다. 나아가, 상기 KFCC10881-ΔNCgl2399를 대상으로 재조합 플라스미드 pDZ-ΔNCgl2905를 형질전환시켜 NCgl2399 및 NCgl2905를 암호화하는 유전자가 동시에 결손된 균주를 제작하고, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0892라 명명하였으며, 상기 CA01-0892 균주를 2010년 6월 24일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 11085P를 부여받았다.

나아가, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 내 글루코네이트 키나아제 활성과 NADPH 농도 측정한 결과, NCgl2399 유전자가 결손된 균주, 및 NCgl2399 및 NCgl2905 유전자가 동시에 결손된 균주는 세포 내 GntK의 활성이 모균주 대비 감소하였고, NADPH 농도 및 6PGD 활성은 증가하였다(표 2). 결과적으로, 상기 제작된 결손 균주들은 라이신 생산량이 모균주 대비 증가하였다(표 3).

상기의 결과는 글루코네이트 키나아제 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시킴으로써 6PGD의 활성을 증가시킬 수 있으며, 6PGD의 활성 증가에 의하여 NADPH 생산을 증가시킴으로써, 결과적으로 L-라이신을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 의미한다. 또한, 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자가 2 이상인 경우, 두 개 이상의 상기 유전자를 결실시킴으로써 보다 우수한 L-라이신 생산능을 얻을 수 있음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 L-라이신 생산 미생물은 L-라이신의 고효율 및 고수율 생산을 위하여 유용하게 사용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 본 발명의 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 2) 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리아를 이용하여 L-라이신을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양물로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 L-아미노산 생산용 코리네박테리움의 세포 내 NADPH 공급량을 증가시킴으로써, 결과적으로 생합성 과정에서 NADPH를 필요로 하는 L-아미노산, 특히 L-라이신 생산량을 고효율 및 고수율로 증가시키는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰의 오탄당 인산화 경로 대사과정의 개략도이다.
도 2는 코리네박테리움 염색체 내 NCgl2399 유전자의 마커-프리 결손용 벡터 pDZ-ΔNCgl2399를 나타내는 도이다.
도 3은 코리네박테리움 염색체 내 NCgl2905 유전자의 마커-프리 결손용 벡터 pDZ-ΔNCgl2905를 나타내는 도이다.

이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 부위-특이적 유전자가 결손된 변이주의 제작

본 발명의 재조합 균주 KFCC10881-ΔNCgl2399와 KFCC10881-ΔNCgl2905를 제조하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 우선, NCgl2399 또는 NCgl2905의 불활성화 단편을 제작하기 위해, 미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)을 근거로 하여 NCgl2399(서열번호 1) 및 NCgl2905(서열번호 2)의 서열을 확보하였으며, 이를 바탕으로 각각 프라이머 2399F1, 2399F2, 2399R1, 2399R2, 2905F1, 2905F2, 2905R1, 2905R2를 제작하였다(표 1). 표 1은 본 발명에 사용된 프라이머들의 염기서열 및 서열번호를 나타낸다. 밑줄 친 서열은 제한효소에 대한 인식부위를 나타낸다.

프라이머	염기서열	서열번호
2399F1	gctctagaCCCCAGAACATGCTGACG (XbaI)	5
2399R1	ggggtaccCGCTGCTAGGGCTTTACC (KpnI)	6
2399F2	ggggtaccGGAACCGTCTTCGTCCACC (KpnI)	7
2399R2	gctctagaGTCACCGCTGGTACATCC (XbaI)	8
2905F1	gctctagaCATTGGAGCATCCGTAGC (XbaI)	9
2905R1	tcccccgggGCCTTCACCATCGACCAA (SmaI)	10
2905F2	tcccccgggGTTCCCGAACAGATCCCC (SmaI)	11
2905R2	gctctagaCGCTCTGACCTGCCTAAC (XbaI)	12

부위-특이적 유전자 결실(site specific gene disruption)을 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ를 사용하여 수행하였으며, 유전자가 파괴된 변이주(gene-disrupted mutant strain)를 만들기 위하여 NCgl2399와 NCgl2905의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 결실된 pDZ 유도체를 만들었다. 상기 pDZ 유도체는 pDZ-ΔNCgl2399(도 2)와 pDZ-ΔNCgl2905(도 3)이다. pDZ-ΔNCgl2399는 2,267 bp짜리 NCgl2399의 XbaI 말단을 포함하는 것으로, NCgl2399의 KpnI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 NCgl2399 내부적 유전자 소실은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2399F1-2399R1 프라이머(서열번호 5 및 6)와 2399F2-2399R2 프라이머(서열번호 7 및 8) 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.

pDZ-ΔNCgl2905는 2,819 bp짜리 NCgl2905의 XbaI 말단을 포함하는 것으로, NCgl2905의 SmaI 절편의 내부적 유전자 소실을 포함한다. 상기 NCgl2905 내부적 유전자 소실은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 2905F1-2905R1 프라이머(서열번호 9 및 10)와 2905F2-2905R2 프라이머(서열번호 11 및 12) 쌍으로 교차 PCR을 하여 생성된 것이다.

상기 재조합 플라스미드를 야생의 코리네박테리움 글루타미쿰에 전기천공법으로 형질전환시키고(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999), 상기 플라스미드는 1차 재조합(교차)에 의해 염색체에 도입되었다. 그 후, 10%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합(교차)을 통해 염색체로부터 플라스미드를 절제(excision)하였다.

상기 2차 재조합이 완료된 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주들을 대상으로 각 유전자 특이적 프라이머(gene-specific primer) 쌍인 2399F1-2399R2(서열번호 5 및 8) 및 2905F1-2905R2(서열번호 9 및 12)를 사용한 다이아그너스틱 PCR(diagnostic PCR)을 통해 각각 NCgl2399 및 NCgl2905 유전자의 결실을 확인하였고, 본 재조합 균주들은 각각 KFCC10881-ΔNCgl2399 및 KFCC10881-ΔNCgl2905라 명명하였다. 상기 NCgl2399 및 NCgl2905의 개방해독틀 DNA 서열의 Genbank accession number는 NC_003450이다.

실시예 2: NCgl2399 및 NCgl2905 유전자가 동시에 결손된 변이주의 제작

상기 NCgl2399 및 NCgl2905 유전자가 동시에 결손된 재조합 균주를 제작하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 재조합 균주 KFCC10881-ΔNCgl2399를 대상으로 재조합 플라스미드 pDZ-ΔNCgl2905를 전기천공법으로 형질전환시킨 후, 역시 상기와 같은 방법으로 NCgl2399 및 NCgl2905 동시 결손 균주를 제작하였다. 본 재조합 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0892라 명명하였고, 2010년 6월 24일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 11085P를 부여받았다.

실시예 3: 세포 내 GntK 와 6 PGD 의 활성 및 NADPH 의 농도 분석

상기 실시예 1과 2에서 제작된 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-ΔNCgl2399, KFCC-10881-ΔNCgl2905 및 CA01-0892(KFCC-10881-ΔNCgl2399ΔNCgl2905)의 세포 내 글루코네이트 키나아제(GntK) 활성 및 NADPH 농도를 아래와 같은 방법으로 분석하였다.

하기의 복합배지 25 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC-10881과 상기 3종의 재조합 균주들을 각각 접종하고, 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하면서 지수 성장기(exponetial phase)의 균체들을 원심분리법을 사용하여 수확한 다음 100 mM Tris/HCl buffer(pH 7.5)로 현탁하였다. 수확한 균체들로부터 세포 추출물을 얻기 위하여 유리 비드(glass bead)를 사용하여 세포벽을 파괴한 후 원심분리한 상등액을 확보하였다.

< 복합배지 ( pH 7.0)>

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

효소활성 분석을 위한 추출물 중의 전체 단백질 양의 측정은 브래드포드법에 의해 결정하였다. 6PGD 활성은 340 nm에서 NADPH 분광학적 형성을 통해 측정하였다(Frunzke et al., Mol Microbiol 67:305-322, 2008). GntK 활성은 6PGD의 coupled enzymatic assay로 측정하였다(Frunzke et al., Mol Microbiol 67:305-322, 2008). NADPH의 농도는 EnzyChrom^TMNADP⁺/NADPH 분석 키트를 사용한 enzymatic cycling reaction으로 결정하였다(BioAssay Systems, CA, USA).

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, NCgl2399 유전자가 결손된 재조합 균주인 KFCC-10881-ΔNCgl2399는 세포 내 GntK(EC:2.7.1.12)의 특이적 활성이 모균주 (KFCC10881) 대비 약 58.7% 감소하였으나, 6PGD 활성은 2.4배 가량 증가한 것으로 나타났다. 나아가, NCgl2399 및 NCgl2905 유전자가 동시에 결손된 CA01-0892는 GntK 활성이 모균주 대비 약 78.3% 감소하였으나, 6PGD 활성은 5.1배 가량 증가한 것으로 나타났다(표 2).

한편, 상기 효소활성 변화의 결과로서 CA01-0892의 세포 내 NADPH 농도는 최대 170% 까지 증가하였음을 확인하였다. 상기의 값은 적어도 3개의 독립적인 배양에서 얻어진 결과를 기초로 한 평균값을 나타내며, 모든 경우에 있어서 표준편차가 10% 이하였다. 상기의 결과는 글루코네이트 키나아제 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시킴으로써 6PGD의 활성을 증가시킬 수 있으며, 6PGD의 활성 증가에 의하여 NADPH 생산을 증가시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 4: NCgl2399 및 NCgl2905 유전자 결손 균주에서의 라이신 생산

상기 실시예 1과 2에서 제작된 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881-ΔNCgl2399, KFCC-10881-ΔNCgl2905 및 CA01-0892(KFCC-10881-ΔNCgl2399ΔNCgl2905)를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종 배지 25 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC-10881과 상기 3종의 재조합 균주들을 각각 접종하고, 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 하기의 생산 배지 24 ㎖를 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 배양된 1 ㎖의 종 배양액을 각각 접종하고, 30℃에서 120시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.

< 종배지 ( pH 7.0)>

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

< 생산배지 ( pH 7.0)>

원당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준).

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881과 KFCC-10881-ΔNCgl2399, KFCC-10881-ΔNCgl2905 및 CA01-0892(KFCC-10881-ΔNCgl2399ΔNCgl2905)에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도를 표 3에 나타내었다.

표 3에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KFCC-10881로부터 ΔNCgl2399 유전자 또는 ΔNCgl2905 유전자가 결손된 경우 라이신 생산이 각각 5.9% 및 8.0% 가량 증가하였다. 나아가, ΔNCgl2399 유전자와 ΔNCgl2905 유전자가 동시에 결손된 CA01-0892 균주의 경우에는 라이신 생산량이 더욱 증가하여 모균주 대비 약 13.1% 가량 증가하였다(표 3). 상기의 결과는 글루코네이트 키나아제 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시킴으로써 6PGD의 활성을 증가시킬 수 있으며, 6PGD의 활성 증가에 의하여 NADPH 생산을 증가시킴으로써 결과적으로 L-라이신을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 의미한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11085P

20100624

서열목록 전자파일 첨부

Claims

글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK) 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된, L-라이신 생산 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물.
제1항에 있어서, 상기 글루코네이트 키나아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
삭제
제1항에 있어서, 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자가 염기서열 전체 또는 일부의 결실, 일부의 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되어 상기 단백질의 내재적 활성이 약화된 것인 미생물.
제1항에 있어서, 글루코네이트 키나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 염기서열의 발현조절서열 전체 또는 일부의 결실, 일부의 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이되어 상기 단백질의 내재적 활성이 약화된 것인 미생물.
제1항에 있어서, 글루코네이트 키나아제 활성을 갖지만 염기서열 차이에 의해 아미노산 서열이 다른 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자가 두 개 이상인 경우, 한 개 또는 두 개 이상의 유전자의 전체 또는 일부의 결실, 치환 또는 삽입에 의하여; 또는 상기 한 개 또는 두 개 이상의 유전자의 발현조절서열이 전체 또는 일부가 결실, 일부가 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되어 상기 단백질의 내재적 활성이 약화된 것인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881을 모균주로 하는 것인 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 수탁번호 KCCM 11085P로 표시되는 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0892인 것인 미생물.
1) 글루코네이트 키나아제(gluconate kinase; GntK)를 코딩하는 유전자의 전체 또는 일부 서열이 변이되어 활성이 약화된 GntK를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하는 단계;
2) 숙주세포에 도입되어 염색체상에서 상동 재조합을 수행할 수 있는 벡터에 상기 수득한 폴리뉴클레오티드 단편을 도입하여 재조합 벡터를 수득하는 단계;
3) 상기 수득한 재조합 벡터를 L-라이신을 생산할 수 있는 숙주세포에 도입하여 상동 재조합체를 수득하는 단계; 및
4) 상기 상동 재조합체 중에서 GntK의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 L-라이신 생산 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물의 제조방법.
1) 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계: 및
2) 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산방법.