JP5945336B2

JP5945336B2 - キシロース利用能が付与されたコリネバクテリウム属微生物、及びそれを用いたｌ−リジンの生産方法

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Publication number: JP5945336B2
Application number: JP2014552129A
Authority: JP
Inventors: ヨンラー，ソ; フー，ラン; ギョムキム，チャン; ホリー，カン; オクムーン，ジュン; ハンリー，キョン; ソクサン，ジン; ジュンキム，ヒュン
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2016-07-05
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: PL2803722T3; JP2015503359A; BR112014017088B1; US9399784B2; WO2013105802A3; ES2654809T3; RU2584593C2; MY164858A; CN108467848A; KR101592140B1; RU2014130234A; CN104245921A; KR20150046778A; EP2803722A4; EP2803722A2; US9200300B2; CN104245921B; DK2803722T3; US20140377816A1; US20160040200A1

Description

本発明は、キシロース利用能が付与されたコリネバクテリウム属微生物、及びそれを用いたＬ−リジンの生産方法に関する。

産業用微生物は、炭素源としてグルコース、フルクトース、スクロースなどの六炭糖を用いている。この炭素源を得るために主に農作物を供給原料として用いているが、そのコストは高く、食品として用いるほうが金銭的価値がある。近年、伝統的な供給原料である農作物の代わりに、農業残留物、廃紙、産業廃棄物などを含むセルロース系バイオマス（cellulosic biomass）が安価で供給量が豊富であるという利点を有する理想的な発酵用糖原料として注目されている。

その中でもキシロースは、自然界で２番目に豊富な木質炭水化物であり、セルロース系バイオマスの代表的物質となっており、これを用いて産業用微生物から有用な物質を生産する方法が用いられている。例えば、グルコース及びキシロースを含む五炭糖の混合物を含有する培地において、キシロースの配糖体であるキシロシドを加水分解する酵素（キシロシダーゼ）をコードするｘｙｌＡＢＦＧＨＲ遺伝子群の発現量が増加するように変異したエシェリキア属菌株を培養し、前記培地からＬ−アミノ酸を回収する、Ｌ−アミノ酸の生産方法が知られている（日本登録特許第４６６５５６７号明細書）。

一方、コリネフォルム細菌の１つであるコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、様々なＬ−アミノ酸の生産に活用されるグラム陽性菌株として知られている。前述したように、キシロースは自然界で２番目に豊富な木質炭水化物であるので、これを用いてコリネバクテリウムグルタミカムからＬ−リジンのようなＬ−アミノ酸を生産することができるなら、より経済的にＬ−アミノ酸を生産することができるものと予想されている。しかし、前記五炭糖の一種であるキシロースの代謝経路上の重要な遺伝子がコリネバクテリウムグルタミカムに含まれていないので、キシロースを用いてコリネバクテリウムグルタミカムからＬ−アミノ酸を生産できないという問題がある。これを解決するために、コリネバクテリウムグルタミカムに大腸菌由来のキシロースイソメラーゼ（xylose isomerase, XylA）及びキシルロキナーゼ（xylulokinase, XylB）を導入してキシロース利用能を付与した報告がある（Kawaguchi et al.,AEM 72: 3418-3428, 2006）。

本発明者らは、より経済的にＬ−アミノ酸を生産するために鋭意努力した結果、エルビニアカロトボーラ（Erwinia carotovora）由来のＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする遺伝子をコリネバクテリウムグルタミカムに導入すると、当該変異株がキシロースを用いてＬ−リジンを生産することができるだけでなく、報告されている大腸菌由来のＸｙｌＡ及びＸｙｌＢが導入されたコリネフォルム微生物よりキシロース利用能が向上することを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、キシロースを用いてＬ−リジンを生産する変異型コリネバクテリウム属微生物を提供することである。

また、本発明の目的は、前記変異型コリネバクテリウム属微生物を用いてＬ−リジンを生産する方法を提供することである。

本発明のキシロースを利用してＬ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物を用いると、自然界で２番目に豊富な木質炭水化物であるキシロースを用いてＬ−リジンを生産することができるので、Ｌ−リジンの効率的かつ経済的な生産に広く活用することができる。

本発明の発現ベクターｐＥＣＣＧ１２２−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）の開裂地図である。培地に含まれる各炭素源に応じた親菌株と発現ベクターが導入された形質転換体の増殖特性を示すグラフである。培地に含まれる各炭素源に応じた親菌株とｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が染色体上に挿入された形質転換体の増殖特性を示すグラフである。

本発明の一態様は、エルビニアカロトボーラ由来のキシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼの活性が導入されたことを特徴とする、キシロースを用いてＬ−リジンを生産する変異型コリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明における用語「キシロースイソメラーゼ（xylose isomerase, XylA）」とは、キシロースからキシルロースへの異性化反応を触媒するキシロース代謝経路に関与する酵素を意味し、本発明の目的上、エルビニアカロトボーラ由来の酵素である。

前記ＸｙｌＡは、エルビニアカロトボーラ由来のキシロースイソメラーゼであって、上記酵素の活性がないコリネバクテリウム属微生物に上記酵素の活性がエルビニアカロトボーラ由来のキシルロキナーゼ酵素活性と共に導入されてキシロース利用能を付与することのできる配列であれば限定されるものではない。また、エルビニアカロトボーラ由来でなくても、前記配列と同等の活性を有する配列であれば、本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。

例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１のアミノ酸配列の保存配列を含み、少なくとも１つの位置で１個又は複数個（タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＸｙｌＡの活性を保持又は強化できるものであれば、配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位などには前記ＸｙｌＡの活性を有する微生物から天然に生じる突然変異配列又は人為的な変異配列を含んでもよい。

本発明における用語「相同性」とは、異なる２つのアミノ酸配列又は塩基配列間の同一性を意味し、スコア（score）、同一性（identity）、類似性（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算するＢＬＡＳＴ２．０を用いる、当業者に周知の方法で決定されるものであるが、特にこれらに限定されるものではない。

本発明における用語「キシルロキナーゼ」とは、キシルロースからキシルロース−５−リン酸を生成する反応を触媒するキシロース代謝経路に関与する酵素を意味し、本発明の目的上、エルビニアカロトボーラ由来の酵素である。

前記ＸｙｌＢは、エルビニアカロトボーラ由来のキシルロキナーゼであって、上記酵素の活性がないコリネバクテリウム属微生物に上記酵素の活性がエルビニアカロトボーラ由来のキシロースイソメラーゼ酵素活性と共に導入されてキシロース利用能を付与することのできる配列であれば限定されるものではない。また、エルビニアカロトボーラ由来でなくても、前記配列と同等の活性を有する配列であれば、本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。

例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２のアミノ酸配列の保存配列を含み、少なくとも１つの位置で１個又は複数個（タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体的には２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列を含んでもよく、前記ＸｙｌＢの活性を保持又は強化できるものであれば、配列番号２のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位などには前記ＸｙｌＢの活性を有する微生物で天然に生じる突然変異配列又は人為的な変異配列を含んでもよい。

本発明における用語「キシロースイソメラーゼ（xylose isomerase, XylA）をコードする遺伝子」とは、前述したＸｙｌＡをコードするポリヌクレオチドを意味する。

前記遺伝子は、配列番号３の塩基配列を含むか、配列番号３の塩基配列に由来するプローブ（probe）と「ストリンジェントな条件」でハイブリダイズできる塩基配列を含むか、又は前記配列番号３の塩基配列の少なくとも１つの位置で１つ又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含んでもよく、活性が保持又は強化されたＸｙｌＡを発現させることのできるものであれば、配列番号３の塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有する塩基配列を含んでもよく、宿主細胞で使用しやすいコドンに置換された塩基配列を含んでもよく、Ｎ末端又はＣ末端が延長又は削除されてもよく、発現量の調節のために開始コドンを変更することができるので、特にこれらに限定されるものではない。

本発明における用語「キシルロキナーゼ（xylulokinase, XylB）をコードする遺伝子」とは、前述したＸｙｌＢをコードするポリヌクレオチドを意味する。

前記遺伝子は、配列番号４の塩基配列を含むか、配列番号４の塩基配列に由来するプローブと「ストリンジェントな条件」でハイブリダイズできる塩基配列を含むか、又は前記配列番号４の塩基配列の少なくとも１つの位置で１つ又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含んでもよく、活性が保持又は強化されたＸｙｌＢを発現させることのできるものであれば、配列番号４の塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有する塩基配列を含んでもよく、宿主細胞で使用しやすいコドンに置換された塩基配列を含んでもよく、Ｎ末端又はＣ末端が延長又は削除されてもよく、発現量の調節のために開始コドンを変更することができるので、特にこれらに限定されるものではない。

本発明における用語「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味し、例えば６５℃のハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ（０．１５ＭＮａＣｌ／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０），０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ，０．０２％ポリビニルピロリドン，０．０２％牛血清アルブミン，０．５％ＳＤＳ，２ｍＭＥＤＴＡ，２．５ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．０）におけるハイブリダイゼーションなどであり、具体的な事項は当業界で公知である（Molecular Cloning(A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)又はCurrent Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley＆Sons, Inc., New York)）。

前述したように、コリネバクテリウム属微生物にＸｙｌＡ及びＸｙｌＢの活性を導入することは当該分野で周知の様々な方法で行うことができ、例えばＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクター系に導入して微生物に導入する方法、ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターが変異したＸｙｌＡ及びＸｙｌＢを導入する方法、ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする塩基配列の変異体を導入する方法などを用いることができ、より好ましくは、前記ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする塩基配列を導入する場合は、その発現を調節するためのプロモーターとしてコリネバクテリウムアンモニアゲネス由来のｐｃｊ７プロモーター（韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報）を用いることができる。本発明の一実施例においては、発現ベクターの導入、又は染色体への挿入などの方法で親菌株に存在しなかった前記外来遺伝子の活性が示されたので、キシロース利用能を有することが確認された。

本発明における用語「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ生産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、好適な宿主内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。

本発明において用いられるベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。

本発明において使用可能なベクターが特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

また、本発明において用いられるベクターは、宿主細胞に挿入されて前記遺伝子を染色体内に挿入することにより、前記遺伝子が発現するように宿主細胞を形質転換することのできるベクターであってもよく、好ましくは、大腸菌とコリネフォルム細菌の両方で自己複製可能なシャトルベクターｐＥＣＣＧ１２２ベクター（韓国登録特許第１０−００５７６８４号公報）が例として挙げられるが、特にこれに限定されるものではない。

本発明における用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現するようにする一連の作業を意味する。前記宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであればいかなる形態でもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自己発現するのに必要な全ての要素（前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータ、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、翻訳終結シグナルなど）を含む構造体である発現カセットの形態で宿主細胞に導入することができるが、前記発現カセットは自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。

前記宿主細胞は、Ｌ−リジンを生産するものであれば、原核微生物のいずれのものも含まれる。例えば、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属微生物が宿主細胞として用いられる。好ましくは、コリネバクテリウム属に属する微生物であり、より好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカムであってもよい。本発明の一実施例においては、前記キシロース利用能がない様々なコリネバクテリウム属微生物、すなわちＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ、ＫＦＣＣ１０７５０、ＣＪ３Ｐに前記エルビニアカロトボーラ由来のＸｌｙＡ及びＸｌｙＢを導入すると、キシロース利用能が付与され、その結果キシロースを炭素源として用いてＬ−リジンなどのＬ−アミノ酸を生産することが確認された（表１〜６）。

Ｌ−リジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株であってもよい。Ｌ−リジンアナログはコリネフォルム微生物の生育を阻害するが、このような阻害はＬ−リジンが培地に共存する場合は完全に又は部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサＬ−リジン、Ｌ−リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルＬ−リジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このようなＬ−リジンアナログに対して耐性を有する変異株は、コリネフォルム微生物に通常の人工変異処理を施すことにより得ることができる。また、Ｌ−リジン生産菌を誘導するための遺伝子操作を行う場合は、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の少なくとも１種の発現を向上させることにより、目的とするものを得ることができる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（ｄａｐＡ）、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｙｓＡ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）及びアスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明における用語「Ｌ−リジン」とは、塩基性α−アミノ酸の１つであり、体内で合成されない必須アミノ酸であり、化学式がＮＨ_２（ＣＨ_２）_４ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨである、Ｌ−アミノ酸の一種を意味し、前記Ｌ−リジンは、オキサロ酢酸からＬ−リジン生合成経路により生合成され、ＮＡＤＰＨ依存性還元酵素がＬ−リジン生合成の中間過程を触媒する。１分子のＬ−リジン生合成過程において、３分子のＮＡＤＰＨが糖酵素により直接消費し、１分子のＮＡＤＰＨが間接的に用いられる。

本発明における用語「Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物」とは、宿主細胞にコリネバクテリウム属微生物には存在しないキシロース代謝に関与する酵素をコードする遺伝子が導入され、キシロースからＬ−リジンを生産するように変異したコリネバクテリウム属微生物を意味し、前記コリネバクテリウム属微生物は、特にこれに限定されるものではないが、コリネバクテリウムグルタミカムであってもよく、前記キシロース代謝に関与する酵素は、特にこれに限定されるものではないが、ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢであってもよい。

ここで、前記宿主細胞は、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の少なくとも１種の発現が向上したコリネバクテリウム属微生物が好ましく、前記Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子は、特にこれらに限定されるものではないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（ｄａｐＡ）、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｙｓＡ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）、アスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）などであってもよい。

また、前記宿主細胞は、Ｌ−リジンアナログに対して耐性を有する変異株であってもよく、前記変異株は、コリネバクテリウム属微生物を突然変異させることにより得ることができる。前記Ｌ−リジンアナログはコリネフォルム微生物の生育を阻害するが、このような阻害はＬ−リジンが培地に共存する場合は完全に又は部分的に解除される。前記Ｌ−リジンアナログは、特にこれらに限定されるものではないが、好ましくは、オキサＬ−リジン、Ｌ−リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルＬ−リジン、α−クロロカプロラクタムなどであってもよい。

一方、本発明においては、Ｌ−リジン生産量をさらに増加させるために、Ｌ−リジンの生合成に関する公知の酵素の活性をさらに調節することができる。好ましくは、本発明においては、さらにアスパラギン酸塩セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロピコリン酸リダクターゼ及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性を調節するために、上記酵素をコードするａｓｄ、ｄａｐＢ及びｄｄｈ遺伝子を過剰発現させてＬ−リジン生産量を増大させることができる。

本発明の一実施例によれば、本発明者らはコリネバクテリウム属微生物への導入に適したＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする遺伝子として、エルビニアカロトボーラ（Erwinia carotovora SCRI1043）由来のＥＣＡ００９７（ｘｙｌＡ）（配列番号１）及びＥＣＡ００９６（ｘｙｌＢ）（配列番号２）を選定し（実施例１）、前記選定したｘｙｌＡ及びｘｙｌＢをコードする遺伝子をクローニングしてｘｙｌＡとｘｙｌＢ（以下、ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ））が同時に発現する発現ベクターｐＥＣＣＧ１２２−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡ−ｘｙｌＢ（以下、ｐＥＣＣＧ１２２−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ））を作製した。前記発現ベクターをコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（上記微生物は、ＫＦＣＣ１０８８１の番号で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐの番号が与えられた。韓国登録特許第１０−０１５９８１２号公報、韓国登録特許第１０−０３９７３２２号公報）に導入することにより、ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が過剰発現する形質転換体を作製し、作製した前記形質転換体は、キシロースを炭素源として用いて増殖できることが確認され（図２）、グルコースもしくはキシロースを単独で又はグルコースとキシロースを同時に用いてＬ−リジンを生産できることが確認された（表１）。また、ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を染色体上で発現させるために、染色体挿入用組換えベクターであるｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を作製し、これをＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、その後２次交差過程を経て染色体上でトランスポゾン遺伝子の内部に、ｐｃｊ７プロモーターに作動可能に連結されたｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を有する形質転換体であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を作製した。そして、前記形質転換体は、キシロースを炭素源として用いて増殖できることが確認され（図３）、グルコースもしくはキシロースを単独で又はグルコースとキシロースを同時に用いてＬ−リジンを生産できることが確認された（表２）。また、既に報告されている大腸菌由来のｘｙｌＡＢ（以下、ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ））の導入によるキシロース利用能増加効果と、本発明のエルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）の導入によるキシロース利用能増加効果を比較するために、ＫＣＣＭ１１０１６ＰにｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）を導入した菌株（ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ））を作製し、前記ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）とキシロース利用能及びＬ−リジン生産特性を比較した結果、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）に比べて、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）のキシロース消費速度が大幅に増加したので、Ｌ−リジンの発酵生産性が改善されたことが確認された（表３）。さらに、様々なコリネバクテリウム属微生物においても同じ結果が得られるかを確認するために、ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）をＬ−リジン生産菌株であるＫＣＣＭ１０７７０Ｐに導入することにより、形質転換体ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を作製し、前記形質転換体は、グルコースもしくはキシロースを単独で又はグルコースとキシロースを同時に用いてＬ−リジンを生産できることが確認された（表４）。さらに、前記ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を他のＬ−リジン生産菌株であるＫＦＣＣ１０７５０（上記微生物は、ＫＦＣＣ１０７５０の番号で公開されたが、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１３４７Ｐの番号が与えられた。韓国登録特許第１０−００７３６１０号公報）に導入することにより、形質転換体ＫＦＣＣ１０７５０−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を作製し、前記形質転換体は、グルコースもしくはキシロースを単独で又はグルコースとキシロースを同時に用いて−リジンを生産できることが確認された（表５）。さらに、前記ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）をさらに他のＬ−リジン生産菌株であるＣＪ３Ｐに導入することにより、形質転換体ＣＪ３P−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を作製した。前記形質転換体は、グルコースもしくはキシロースを単独で又はグルコースとキシロースを同時に用いてＬ−リジンを生産できることが確認された（表６）。

よって、本発明者らは、培地内のキシロースを用いて増殖できるだけでなく、培地内のキシロース及びグルコースを用いてＬ−リジンを作製できることが確認された前記形質転換体を「ＣＡ０１−２１９５」と命名し、ブダペスト条約に基づいてソウル市西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に２０１１年１２月２９日付けで受託番号ＫＣＣＭ１１２４２Ｐとして寄託した。すなわち、前記寄託は、ブダペスト条約に基づいて国際寄託機関に寄託されたものである。

本発明の他の態様は、（ｉ）炭素源としてキシロースを含む培養培地において、本発明の前記キシロースを用いてＬ−リジンを生産する変異型コリネバクテリウム属微生物を培養して培養物を得る工程と、（ｉｉ）前記培養物からＬ−リジンを回収する工程とを含むＬ−リジンを生産する方法を提供する。

本発明における用語「培養」とは、微生物を人工的に調節した好適な環境条件で生育させることを意味する。本発明において、コリネバクテリウム属微生物を培養する方法は、当業界で周知の方法を用いて行うことができる。具体的には、前記培養は、バッチプロセス又は流加もしくは反復流加プロセス（fed batch or repeated fed batch process）で連続して培養することができるが、これらに限定されるものではない。

培養に用いられる培地は、好適な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地内において、好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節して好適な方法で特定菌株の要件を満たすものでなければならない。コリネバクテリア菌株の培養培地は公知である（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981）。用いることのできる炭素源としては、グルコース及びキシロースの混合糖を主な炭素源として用い、それ以外にもスクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのような油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセリン、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンのようなアミノ酸及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。前記培地には、リン源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及びそれらに相当するナトリウム含有塩が含まれる。用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられる。また、無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン及びカルシウムなどを用いることができる。最後に、前記物質以外にも、アミノ酸及びミンのような物質を用いることができる。

また、培養培地に好適な前駆体を用いることができる。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方法により回分式、流加式又は連続式で添加することができるが、特にこれらに限定されるものではない。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩化合物、又はリン酸、硫酸のような酸化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調節することができる。

さらに、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、通常２７℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３５℃である。培養は、Ｌ−リジンの最大の生成量が得られるまで続ける。これらの目的は通常１０〜１００時間で達成される。Ｌ−リジンは、培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれている。

さらに、培養物からＬ−リジンを回収する工程は、当業界で公知の方法により行うことができる。具体的には、公知のＬ−リジン回収方法として、特にこれらに限定されるものではないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性及びサイズ排除）などの方法を用いることが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

外来遺伝子の選定
エルビニアカロトボーラ（Erwinia carotovoraSCRI1043）由来のＥＣＡ００９７（ｘｙｌＡ）（アミノ酸：配列番号１，核酸：配列番号３）及びＥＣＡ００９６（ｘｙｌＢ）（アミノ酸：配列番号２，核酸：配列番号４）をキシロース生産能が付与された変異型コリネバクテリウム属微生物を作製するための外来遺伝子に選定した。

エルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ発現ベクターの作製
実施例１で選定したエルビニアカロトボーラ由来のＸｙｌＡとＸｙｌＢをコードする遺伝子は並んで連結されている。米国国立保健研究所のジェンバンク（NIH GenBank）からｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）及び周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＢＸ９５０８５１）を取得し、取得した塩基配列に基づいてエルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を増幅するためのプライマーを合成した。

配列番号５：５’−ＡＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＣＴＡＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＴＣ−３’
配列番号６：５’−ＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＧＴ−３’

ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）断片を取得するために、エルビニアカロトボーラＳＣＲＩ１０４３菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼにはＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭハイファイＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社）を用いた。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、２８４４ｂｐのｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）（配列番号１７）を含む３１２２ｂｐの遺伝子断片が得られた（配列番号１８）。コリネバクテリウムアンモニアゲネス由来のｐｃｊ７プロモーター（ＫＲ０６２００９２）を取得するために、コリネバクテリウムアンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＲ０６２００９２）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼにはＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭハイファイＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社）を用いた。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、３１８ｂｐのポリヌクレオチドが得られた（配列番号１４）。

配列番号１５：５’−ＡＡＴＣＴＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡ−３’
配列番号１６：５’−ＡＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧ−３’

大腸菌−コリネバクテリウムシャトルベクターｐＥＣＣＧ１２２に制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩを用いてｐｃｊ７をクローニングし、その後ＮｄｅＩとＳｐｅＩを用いてｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）をクローニングすることにより、ｐＥＣＣＧ１２２−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）ベクターを得た（図１）。図１は本発明の発現ベクターｐＥＣＣＧ１２２−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）の開裂地図である。

エルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢが導入されたＬ−リジン生産菌株の開発及びキシロース利用能の確認
実施例２で得られた各発現ベクターｐＥＣＣＧ１２２−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）をコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（韓国登録特許第１０−０１５９８１２号公報、韓国登録特許第１０−０３９７３２２号公報）に導入することにより、ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が発現する形質転換体であるコリネバクテリウムグルタミカムＣＡ０１−２１９５を作製した。

ＫＣＣＭ１１０１６ＰとＣＡ０１−２１９５のキシロース利用能を比較するために、グルコース又はキシロースを炭素源として含む種培地で培養して前記菌株の増殖特性を比較し、グルコース又はキシロースを炭素源として含む生産培地で培養してＬ−リジン生産特性を比較した。

まず、増殖特性を比較するために、２５ｍｌの種培地［炭素源（グルコース又はキシロース）１０ｇ／ｌ，ペプトン１０ｇ／ｌ，酵母抽出物１０ｇ／ｌ，尿素５ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４４ｇ／ｌ，Ｋ_２ＨＰＯ_４８ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ／ｌ，ビオチン１００μｇ／ｌ，チアミンＨＣｌ１ｍｇ／ｌ，ｐＨ７．０］に菌株をそれぞれ接種して３０℃で３２時間培養し、各時間における培養物の吸光度（ＯＤ６００）を測定して比較した（図２）。図２は培地に含まれる各炭素源におけるＫＣＣＭ１１０１６ＰとＣＡ０１−２１９５の増殖特性を示すグラフであり、（◆）はグルコースを含む培地で培養されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐを示し、（■）はキシロースを含む培地で培養されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐを示し、（▲）はグルコースを含む培地で培養されたＣＡ０１−２１９５を示し、（×）はキシロースを含む培地で培養されたＣＡ０１−２１９５を示す。

図２に示すように、グルコースを炭素源として用いた種培地においては、ＫＣＣＭ１１０１６ＰとＣＡ０１−２１９５の増殖特性に差はないが、キシロースを炭素源として用いた種培地においては、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐはほとんど増殖しなかったのに対して、ＣＡ０１−２１９５は所定レベルに増殖したことが確認された。よって、前記ＣＡ０１−２１９５は、培地に含まれるキシロースを単一炭素源として用いて増殖できることが分かった。

次に、前記ＫＣＣＭ１１０１６ＰとＣＡ０１−２１９５のＬ−リジン生産特性を比較するために、２４ｍｌの生産培地［炭素源，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４０ｇ／ｌ，大豆タンパク質２．５ｇ／ｌ，コーンスティープソリッド５ｇ／ｌ，尿素３ｇ／ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４１ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ／ｌ，ビオチン１００μｇ／ｌ，チアミン塩酸塩１ｍｇ／ｌ，ＣａＣＯ_３３０ｇ／ｌ，ｐＨ７．０］に種培養液１ｍｌをそれぞれ接種し、３５℃及び２００ｒｐｍの条件で７２時間培養した。ここで、前記炭素源は、グルコース１００ｇ／ｌ、グルコース５０ｇ／ｌ＋キシロース５０ｇ／ｌ、及びグルコース７０ｇ／ｌ＋キシロース３０ｇ／ｌに設定した。次に、各培養物に含まれるＬ−リジンの濃度、残存キシロース濃度、及び残存グルコース濃度をそれぞれ測定して比較した（表１）。

表１に示すように、キシロースが含まれない培地（グルコース１００ｇ／ｌ）を用いた場合は、親菌株とＣＡ０１−２１９５から生産されたＬ−リジンの濃度が同等であることが確認された。しかし、キシロースを含む培地（グルコース５０ｇ／ｌ＋キシロース５０ｇ／ｌ、及びグルコース７０ｇ／ｌ＋キシロース３０ｇ／ｌ）を用いた場合は、親菌株はキシロースを消費せず、グルコースのみ消費してＬ−リジンを生産したのに対して、ＣＡ０１−２１９５はグルコースとキシロースの両方を消費してＬ−リジンを生産した。

このような結果は、キシロースを用いることができないコリネバクテリウム属微生物にエルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢを導入すると、キシロースを全て消費できることを示唆するものである。

エルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ染色体挿入用組換えベクター（ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ））及び大腸菌由来のｘｙｌＡＢ染色体挿入用組換えベクター（ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ））の作製
前記発現ベクターｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を染色体上で発現させるために、染色体挿入用組換えベクターｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を作製した。ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）断片を取得するために、実施例２で得られたｐＥＣＣＧ１２２−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を鋳型とし、配列番号７及び８を合成してＰＣＲを行った。ポリメラーゼにはＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭハイファイＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社）を用いた。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、３４４０ｂｐの遺伝子断片が得られた（配列番号９）。その結果、３４４０ｂｐのｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）と制限酵素ＳｐｅＩで処理されたｐＤＺＴｎベクター（韓国登録特許第１０−１１２６０４１号公報）にＢＤＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎｋｉｔを用いてクローニングすることにより、最終的にｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）組換えベクターが得られた。

配列番号７：５’−ＧＡＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡ−３’
配列番号８：５’−ＧＡＴＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡ−３’

次に、大腸菌由来のｘｙｌＡＢ（以下、ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ））を染色体上で発現させるために、染色体挿入用組換えベクターｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）を作製した。ｐｃｊ７プロモーターを取得するために、実施例２で得られたｐｃｊ７断片を鋳型とし、配列番号７及び１０を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼにはＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭハイファイＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社）を用いた。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、３１８ｂｐの遺伝子断片が得られた。ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）断片を取得するために、大腸菌Ｋ１２染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１２を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼにはＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭハイファイＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社）を用いた。ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、３１４５ｂｐのｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）断片が得られた（配列番号１３）。その結果、３１８ｂｐのｐｃｊ７部位と３１４５ｂｐのｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）の増幅された産物を制限酵素ＳｐｅＩで処理されたｐＤＺＴｎベクターにＢＤＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎｋｉｔを用いてクローニングすることにより、最終的にｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）組換えベクターが得られた。

配列番号１０：５’−ＴＣＡＡＡＡＴＡＧＧＣＴＴＧＣＡＴＧＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＴＴＧ−３’
配列番号１１：５’−ＣＡＡＣＧＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＴＡＴＴＴＴＧＡＣ−３’
配列番号１２：５’−ＧＡＴＧＴＣＧＧＧＣＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＧＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＧＣＣＡ−３’

エルビニア由来のｘｙｌＡＢ挿入Ｌ−リジン生産菌株の開発及びキシロース利用能の確認
前記作製したｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）ベクターをＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、その後２次交差過程を経て染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に、１コピーのｐｃｊ７プロモーターに置換されたｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が導入された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を得た。

ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）とＫＣＣＭ１１０１６Ｐのキシロース利用能を比較するために、実施例３と同様の方法で、グルコース又はキシロースを炭素源として含む種培地で培養して増殖特性を比較し、グルコース又はキシロースを炭素源として含む生産培地で培養してＬ−リジン生産特性を比較した。

図３は培地に含まれる各炭素源における菌株の増殖特性を示すグラフであり、（◆）はグルコースを含む培地で培養されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐを示し、（■）はキシロースを含む培地で培養されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐを示し、（▲）はグルコースを含む培地で培養されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を示し、（×）はキシロースを含む培地で培養されたＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を示す。グルコースを炭素源として用いた種培地においては、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）とＫＣＣＭ１１０１６Ｐの増殖特性に差はないが、キシロースを炭素源として用いた種培地においては、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐはほとんど増殖しなかったのに対して、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）は所定レベルに増殖したことが確認された。よって、前記ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が染色体上に挿入された場合も、培地に含まれるキシロースを用いて増殖できることが分かった。

次に、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）とＫＣＣＭ１１０１６ＰのＬ−リジン生産特性を測定して比較した（表２）。

表２に示すように、キシロースが含まれない培地（グルコース１００ｇ／ｌ）を用いた場合は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）とＫＣＣＭ１１０１６Ｐから生産されたＬ−リジンの濃度が同等であることが確認された。しかし、キシロースを含む培地（グルコース５０ｇ／ｌ＋キシロース５０ｇ／ｌ、及びグルコース７０ｇ／ｌ＋キシロース３０ｇ／ｌ）を用いた場合は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株はグルコースのみ消費したのに対して、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）はグルコースとキシロースの両方を消費してＬ−リジンを生産した。

大腸菌由来のｘｙｌＡＢ挿入Ｌ−リジン生産菌株の作製、及びＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）菌株とのキシロース利用能の比較
既に報告されている大腸菌由来のｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）の導入によるキシロース利用能増加効果と、本発明のエルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）の導入によるキシロース利用能増加効果を比較するために、ＫＣＣＭ１１０１６ＰにｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）を導入した菌株を作製し、前記作製したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）とキシロース利用能とＬ−リジン生産特性を比較した。

ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）が導入された菌株を作製するために、実施例４で作製したｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）組換えベクターをＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でトランスポゾン遺伝子の内部に、ｐｃｊ７プロモーターに作動可能に連結されたｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）が導入された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）を得た。

ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）とＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）のキシロース利用能を比較するために、実施例３と同様の方法で、グルコース５０ｇ／ｌ＋キシロース５０ｇ／ｌを炭素源として含む生産培地で培養してＬ−リジン生産特性を比較し、キシロース利用能を確認するために、１５時間後の培養液中の残存キシロース濃度を測定した（表３）。

表３に示すように、前記両菌株は同レベルのＬ−リジンを生産したが、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）のキシロース消費速度のほうがＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）のキシロース消費速度より速かったので、発酵生産性が改善されたことが確認された。すなわち、これらの結果は、従来の大腸菌由来のｘｙｌＡＢ（Ｅｃ）を導入した場合より、本発明のエルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を導入した場合のほうが、Ｌ−リジンの発酵生産性の改善効果に優れることを示唆するものである。

エルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ挿入ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ由来菌株の開発及びキシロース利用能の確認
前記ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ以外の他のＬ−リジン生産菌株においてもｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）の導入により同じ効果が得られるかを確認するために、ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）をＬ−リジン生産菌株であるブダペスト条約上の寄託機関に寄託されたＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報）に導入した。電気パルス法を用いて導入し、その後２次交差過程を経て染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に、１コピーのｐｃｊ７プロモーターに置換されたｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が導入された菌株を得て、コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）と命名した。

実施例３と同様の方法で、前記作製したコリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐと発明菌株コリネバクテリウムグルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）のキシロース利用能及びＬ−リジン生産量を測定した（表４）。

表４に示すように、Ｌ−リジン生産菌株ＫＣＣＭ１０７７０ＰにｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を導入すると、キシロースを全く用いることができない親菌株とは異なり、キシロースを完全に消費し、Ｌ−リジン生産も増加することが確認された。

これらの結果は、特定寄託番号で特定されているコリネバクテリウム属微生物でない様々なコリネバクテリウム属微生物にエルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢを導入すると、キシロースを炭素源として完全に消費してＬ−リジンなどのアミノ酸を効率的に生産することを裏付けるものである。

エルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ挿入ＫＦＣＣ１０７５０由来菌株の開発及びキシロース利用能の確認
前記ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ以外の他のＬ−リジン生産菌株においてもｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）の導入により同じ効果が得られるかを確認するために、ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）をＬ−リジン生産菌株であるＫＦＣＣ１０７５０（韓国登録特許第１０−００７３６１０号公報）に導入した。電気パルス法を用いて導入し、その後２次交差過程を経て染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に、１コピーのｐｃｊ７プロモーターに置換されたｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が導入された菌株を得て、これをコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０７５０−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）と命名した。

実施例３と同様の方法で、前記作製したコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０７５０と発明菌株コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０７５０−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）のキシロース利用能及びＬ−リジン生産量を測定した（表５）。

表５に示すように、Ｌ−リジン生産菌株ＫＦＣＣ１０７５０にｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を導入すると、キシロースを全く用いることができない親菌株とは異なり、キシロースを完全に消費し、Ｌ−リジン生産も増加することが確認された。

エルビニアカロトボーラ由来のｘｙｌＡＢ挿入ＣＪ３Ｐ由来菌株の開発及びキシロース利用能の確認
前記ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ以外の他のＬ−リジン生産菌株においてもｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）の導入により同じ効果が得られるかを確認するために、ｐＤＺＴｎ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）をＬ−リジン生産菌株であるＣＪ３Ｐに導入した。ＣＪ３Ｐ菌株は、Ｂｉｎｄｅｒらにより報告された技術（Genome Biology 2102, 13: R40）に基づいて、野生株において遺伝子３種ｐｙｃ、ｈｏｍ、ｌｙｓＣにそれぞれＰ４５８Ｓ、Ｖ５９Ａ、Ｔ３１１Ｉ変異を導入してＬ−リジン生産能を付与したコリネバクテリウムグルタミカム菌株である。電気パルス法を用いて導入し、その後２次交差過程を経て染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に、１コピーのｐｃｊ７プロモーターに置換されたｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が導入された菌株を得て、コリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）と命名した。

実施例３と同様の方法で、前記作製したコリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐと発明菌株コリネバクテリウムグルタミカムＣＪ３Ｐ−ｐｃｊ７−ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）のキシロース利用能及びＬ−リジン生産量を測定した（表６）。

表６に示すように、Ｌ−リジン生産菌株ＣＪ３Ｐ菌株にｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）を導入すると、キシロースを全く用いることができない親菌株とは異なり、キシロースを完全に消費し、Ｌ−リジン生産も増加することが確認された。

よって、これらの結果から、前記ｘｙｌＡＢ（Ｅｒ）が発現するコリネバクテリウム属微生物は、培地内のキシロースを用いて増殖するだけでなく、培地内のキシロース及びグルコースを用いてＬ−リジンを生産することが分かる。

Claims

エルビニアカロトボーラ（Erwinia carotovora）由来のキシロースイソメラーゼ（xylose isomerase, XylA）及びキシルロキナーゼ（xylulokinase, XylB）を発現する、キシロースを用いてＬ−リジンを生産することができる変異型コリネバクテリウム属微生物。
前記ＸｙｌＡが配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ＸｙｌＢが配列番号２のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の微生物。
前記ＸｙｌＡが配列番号３のポリヌクレオチド配列によりコードされ、前記ＸｙｌＢが配列番号４のポリヌクレオチド配列によりコードされる請求項１に記載の微生物。
前記微生物がコリネバクテリウムグルタミカムである請求項１に記載の微生物。
ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクター系に導入して前記微生物に導入する方法、ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入したＸｙｌＡ及びＸｙｌＢを導入するか、プロモーターが変異したＸｙｌＡ及びＸｙｌＢを導入する方法、又はＸｙｌＡ及びＸｙｌＢをコードする塩基配列の変異体を導入する方法により、前記ＸｙｌＡ及びＸｙｌＢを発現するように変異されたものである、請求項１に記載の微生物。
（ｉ）炭素源としてキシロースを含む培養培地において、請求項１〜５のいずれかに記載のキシロースを用いてＬ−リジンを生産する変異型コリネバクテリウム属微生物を培養して培養物を得る工程と、
（ｉｉ）前記培養物からＬ−リジンを回収する工程とを含むＬ−リジンを生産する方法。