KR102112240B1

KR102112240B1 - 알파-글루코시다제의 활성이 강화된 l-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법

Info

Publication number: KR102112240B1
Application number: KR1020180116540A
Authority: KR
Inventors: 김경림; 변효정; 이광우; 김형준; 신용욱; 이정기
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-05-18
Also published as: ZA202101456B; MX2021002814A; AU2019349396A1; AU2019349396B2; WO2020067618A1; IL281567A; PH12021550347A1; EP3656863A9; CN111247250A; CN111247250B; US11293014B2; JP7286758B2; BR112019019867B1; CL2021000629A1; EP3656863A4; RU2732338C1; BR112019019867A2; KR20200036647A; WO2020067618A8; PE20210686A1

Abstract

본원은 α-글루코시다제 (α-Glucosidase)의 활성이 강화된 L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것이다. 본원의 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 α-글루코시다제 활성이 강화되어, L-아미노산 생산 수율이 향상된 것이므로, 상기 미생물은 L-아미노산 생산 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

알파-글루코시다제의 활성이 강화된 L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법 {A microorganism producing L-amino acids with enhanced alpha-glucosidase activity and a method for producing L-amino acids using the same}

본원은 α-글루코시다제 (α-Glucosidase)의 활성이 강화된 L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 동물사료, 의약품 및 화장품 산업 등에 사용되고 있으며, 주로 코리네박테리움 속 균주나 에세케리키아 속 균주를 이용한 발효에 의해 생산되고 있다. L-아미노산의 생산을 위하여, 고효율 생산균주 및 발효공정기술 개발과 같은 다양한 연구들이 수행되고 있다. 구체적으로, L-아미노산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다 (대한민국 등록특허 제10-0838038호).

한편, 미생물의 목적 산물 생산능을 증가시키기 위하여 당 이용능을 증가시키기 위한 여러 연구가 진행되었고, 이와 함께 효율적인 배지 구성 및 미생물 생장을 고려한 요구가 지속적으로 있어왔다. 예를 들어, ascB 또는 chbF 유전자의 과발현을 통해 셀로바이오스의 이용률이 증가되고 셀로바이오스 및 자일로스, 만노스, 갈락토스와 같은 기타 당을 동시에 이용할 수 있는 변이 미생물을 제조하고, 이를 이용해 바이오 연료를 생산하는 기술이 보고된바 있다 (대한민국 등록특허 제10-1484108호). 그러나 미생물의 당 이용능과 L-아미노산 생산성의 연관성에 대해서는 지속적인 연구가 필요하다.

이에, 본 발명자들은 이소말토스, 말토스를 분해하는 것으로 공지된 α-글루코시다제를 코리네박테리움속 균주에 도입해본 결과, 놀랍게도 배지 내 이소말토스 및 말토스를 첨가하지 않아도 목적 산물인 L-아미노산의 수율이 향상되는 효과를 확인하여 본원을 완성하였다.

본원의 하나의 목적은, α-글루코시다제의 활성이 강화된 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물을 제공하는 것이다.

본원의 다른 하나의 목적은, 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 배지 또는 미생물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본원의 하나의 양태는, α-글루코시다제의 활성이 강화된 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .) 미생물이다. 본원의 코리네박테리움 속 미생물은 α-글루코시다제의 활성이 강화됨으로써, L-아미노산 생산능이 향상된 것이다. 따라서 본원의 코리네박테리움 속 미생물은 L-아미노산 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

본원에서 용어, "α-글루코시다제 (α-glucosidase)"는, 당을 글루코스로 분해하는 글루코시다제의 일종으로, 특히, α(1→4) 결합을 분해하는 특성을 지닌 효소를 말한다. 본원에서 α-글루코시다제는 aglA 유전자에 의해 코딩되는 α-글루코시다제 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 글루코시다제에 상응하는 활성을 가지면서 코리네박테리움 속 미생물에서 그 활성이 강화됨으로써 L-아미노산의 생산능을 향상시킬 수 있는 것이라면, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 상기 aglA 유전자에 의해 코딩되는 α-글루코시다제 활성을 갖는 단백질은 이소말토즈 또는 말토즈 분해 활성을 갖는 것으로 공지되어 있으며(Glycobiology. 2010 Nov;20(11)), 상기 α-글루코시다제에 대한 정보는 공지된 데이터베이스 (예컨대, NCBI, UniProt 등)를 통해 당업자가 쉽게 얻을 수 있다. 본원에서 α-글루코시다제는 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis), 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora), 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-글루코시다제일 수 있으며, 구체적으로는 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis) 유래의 α-글루코시다제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 일례로 제시한 상기 비피도박테리움 아돌레센티스 유래 α-글루코시다제는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 유래 α-글루코시다제는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-글루코시다제는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 본원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 예를 들어, 상기 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다. 또한, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 해당 서열번호의 아미노산 서열과 80 %이상, 구체적으로는 90 % 이상, 더 구체적으로는 95 % 이상, 보다 더 구체적으로는 99 % 이상의 상동성 (homology) 또는 동일성 (identity)을 갖는 아미노산 서열도 본원의 범주 내에 포함될 수 있다.

예를 들어, 본원에서의 α-글루코시다제 활성을 갖는 단백질은 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis) 유래의 α-글루코시다제의 아미노산 서열 (서열번호 1), 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 유래의 α-글루코시다제의 아미노산 서열 (서열번호 28), 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-글루코시다제의 아미노산 서열 (서열번호 29)을 포함하는 단백질일 수 있다. 본원의 α-글루코시다제는 α-글루코시다제로서 상응하는 효능을 나타내고, 코리네박테리움 속 미생물에서 그 활성이 강화됨으로써 L-아미노산의 생산능을 향상시킨 단백질이라면 본원의 α-글루코시다제의 활성을 갖는 단백질에 포함됨은 자명하다. 구체적으로, 본원의 α-글루코시다제는, α-글루코시다제의 활성을 나타내고, 코리네박테리움 속 미생물에서 그 활성이 강화됨으로써 L-아미노산의 생산능을 향상시키는 한, 상기 서열번호 1, 서열번호 28, 또는 서열번호 29의 아미노산 서열과 80 % 이상, 구체적으로는 90 % 이상, 더 구체적으로는 95 % 이상, 보다 더 구체적으로는 99 % 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열도 본원의 범주 내에 포함될 수 있다.

본원에서 용어, "상동성 (homology) 또는 동일성 (identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 또한, 상기 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 %를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치 (Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다 (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스 (동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성 (relevance)을 나타낸다.

본원에서 용어 "보존적 치환 (conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이형은 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 (amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다

또한, 상기 α-글루코시다제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 α-글루코시다제의 활성을 나타내고, 코리네박테리움 속 미생물에서 그 활성이 강화됨으로써 L-아미노산의 생산능을 향상시키는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들면, 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis) 유래의 α-글루코시다제 (서열번호 1), 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) 유래의 α-글루코시다제 (서열번호 28), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-글루코시다제 (서열번호 29)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면 서열번호 2의 염기 서열, 서열번호 30의 염기 서열, 서열번호 31의 염기 서열을 가질 수 있으나, 상기 염기 서열은 코돈의 축퇴성으로 인하여 코딩영역에 변형이 이루어질 수 있고, 또한 상기 염기 서열을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 80 %, 90 %, 95 % 또는 99 % 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 실질적으로 상기 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리뉴클레오티드 서열도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 본원의 α-글루코시다제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 80 % 이상, 구체적으로는 90 % 이상, 보다 구체적으로는 95 % 이상, 더욱 구체적으로는 97 % 이상, 특히 구체적으로는 99 % 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60 ℃, 1 Х SSC, 0.1 % SDS, 구체적으로는 60 ℃, 0.1 Х SSC, 0.1 % SDS, 보다 구체적으로는 68 ℃, 0.1 Х SSC, 0.1 % SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1 회, 구체적으로는 2 회 내지 3 회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드의 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

본원에서 용어, "활성의 강화"는 본래 미생물이 천연의 상태, 또는 변이 전 상태에서 나타내는 단백질의 활성, 즉 내재적 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 증가된 것을 의미하며, 특정 단백질의 활성을 가지지 않는 미생물에 그 단백질을 도입하여 이의 활성을 부여하는 활성의 도입 역시 포함하는 개념이다. 상기 "내재적 활성"은 본래 미생물이 천연의 상태, 또는 비변이 상태에서 나타내는 단백질의 활성 상태를 의미한다.

구체적으로 상기 "활성의 강화"는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 단백질 자체의 활성이 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로 인한 내재적 유전자 증폭, 외부로부터의 유전자 도입, 프로모터 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 발현 조절 서열을 변형하는 방법, 상기 폴리펩타이드 활성이 증가되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 대체하거나 상기 폴리펩타이드의 활성이 강화되도록 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 염색체상의 유전자에 변이를 유도시켜 염색체 상의 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 변형하는 방법, 외부로부터 유전자를 도입하거나 염색체로 유전자를 삽입하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으며, 상기 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 유전자의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입되는 것일 수 있다. 또는, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포의 염색체 내에 도입되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본원의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하여 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다

본원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 또는 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 신호 펩타이드 (signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 본원에서 용어 "신호 펩타이드"는 목적 단백질을 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 단백질을 말하며, 이는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 융합된 상태로 또는 분리된 상태로 발현되어 작용할 수 있다. 본원에서 신호 펩타이드는 목적 단백질의 기능을 유지한 채 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 한, 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에서 신호 펩타이드의 일 예시로 제시한 CgR0949, NCgl2101, CgR1834 및 ST2 (각각 서열번호 14 내지 17)가 사용될 수 있고, 더 나아가 당업자는 공지된 적절한 신호 펩타이드를 선택하여 α-글루코시다제의 분비 발현 목적으로 사용할 수 있다.

본원에서 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 또는 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 구체적으로는 강력한 프로모터로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 프로모터가 연결될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 공지된 강력한 프로모터의 예로 cj1 내지 cj7 프로모터 (대한민국 등록특허공보 제0620092호), spl1,7 또는 13 프로모터 (대한민국 등록특허 공보 제1783170호), PgapA 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있다.

아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체에 의하여 수행될 수 있다. 그러나 이에 제한 되는 것은 아니다.

이와 같은 단백질 활성의 강화는, 상응하는 단백질의 활성이 없던 것이 나타나거나, 또는 이의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 1 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % 또는 500 %, 최대 1000 % 또는 2000 %까지 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 코리네박테리움 속 미생물은 상술한 바와 같이 α-글루코시다제의 활성이 강화됨으로써 L-아미노산 생산능이 향상될 수 있다. 따라서 본원의 코리네박테리움 속 미생물은 L-아미노산 생산 용도로 사용될 수 있다.

본원에서 용어, "L-아미노산"은 일반적으로 아미노기와 카르복시기가 동일한 탄소 원자에 결합되어 있는 생물의 몸을 구성하는 단백질의 기본 구성단위를 의미한다. 상기 L-아미노산은 예를 들어, L-알라닌, L-알지닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-쓰레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 L-아미노산은 예를 들어, 미생물의 생합성 경로 중 L-아스파르트산 유래 L-아미노산일수 있으며, L-아스파르트산을 기질 또는 중간체로 활용하여 생합성되는 L-아미노산일 수 있다. 상기 L-아스파르트산 유래 L-아미노산은, 보다 구체적인 예로서 L-라이신, L-쓰레오닌 및 L-이소류신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에서 "L-아미노산을 생산하는 미생물"은 배지 중의 탄소원으로부터 L-아미노산을 생산하여 축적시킬 수 있는 미생물일 수 있다. 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터 (Enterbacter) 속, 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있다. 보다 구체적으로는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 본원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더욱 구체적으로 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본원의 α-글루코시다제의 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물은, 상기 단백질의 활성이 강화되기 전의 미생물, 즉 비변형 미생물에 비해 높은 L-아미노산 생산 수율로 L-아미노산을 생산할 수 있다.

본원의 다른 하나의 양태는, 상기 α-글루코시다제의 활성이 강화된 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 배지 또는 미생물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법이다.

α-글루코시다제의 활성이 강화된 미생물 및 L-아미노산에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에서 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지에 포함되는 탄소원으로서 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀과 같은 유기 질소원, 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 그러나 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배지에 포함되는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배지에는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함될 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입할 수 있고, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위하여 기체를 주입하지 않거나 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 25 내지 40 ℃, 구체적으로는 27 내지 35 ℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 지속될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.

본원은 상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산을 추가로 회수 및 정제할 수 있으며, 그 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 목적하는 L-아미노산을 회수할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양된 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아미노산을 회수할 수 있다.

본원의 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 α-글루코시다제 활성이 강화되어, L-아미노산 생산 수율이 향상된 것이다. 따라서 상기 미생물은 L-아미노산 생산 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 α-글루코시다제 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.

이하 본원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본원의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: α- 글루코시다제 (α- glucosidase ) 유전자 도입용 벡터 제작

α-글루코시다제인 aglA 유전자의 효과를 확인하기 위해, 예시적으로 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis) 유래 aglA 유전자 (서열번호 2)를 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주의 염색체 상에 삽입하기 위한 벡터를 제작하였다. 코리네박테리움 클루타미쿰 유래의 PgapA 프로모터를 증폭하기 위해 PgapA 프로모터 5'말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 3) 및 3'말단에 NdeⅠ 제한효소 부위가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 4)를 합성하였다. 그 결과 5'말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위와 3'말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 포함하는 PgapA 프로모터 DNA 단편을 각각 획득하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 변성 후, 94 ℃ 30 초 변성, 56 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 30 초 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.

PgapA 프로모터 증폭용 프라이머

정방향: 5'-TCAGAATTCTTGGGATTACCATTGAAGCC-3' (서열번호 3)

역방향: 5'-TCACATATGGTGTCTCCTCTAAAGATTGT-3' (서열번호 4)

보고된 염기 서열에 근거하여 비피도박테리움 아돌레센티스 유래 aglA 유전자의 ORF를 증폭하기 위해 개시코돈 위치에 NdeⅠ 제한효소 부위와 단백질 분비 목적의 신호 펩타이드 (signal peptide)가 삽입되도록 고안한 프라이머 (서열번호 5 내지 서열번호 8)와 종결코돈 하단에 SpeⅠ 제한효소 부위가 포함되도록 고안한 프라이머 (서열번호 9)를 합성하였다.

신호 펩타이드는 예시적으로 AglA 효소가 세포 밖으로 잘 나가도록 도와주는 단백질로 4 종 (각각 서열번호 14 내지 17)을 택하여 실험하였다. 상기 프라이머 서열 및 신호 펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같다 (표 1).

aglA ORF 증폭용 프라이머		SP1 포함 정방향	5'-TCACAT ATG caaataaaccgccgaggcttcttaaaagccaccgcaggacttgccactatcggcgctgccagcatgtttatgccaaaggccaacgcccttggagcaACGAATTTCAATCGTTCCA-3' (서열번호 5)
		SP2 포함 정방향	5'-TCACAT ATG CATTCAAAGGAAGAGTTAACAGTGCGTAAAGGAATTTCCCGCGTCCTCTCGGTAGCGGTTGCTAGTTCAATCGGATTCGGAACTGTACTGACAGGCACCGGCATCGCAGCAGCTCAAGACACGAATTTCAATCGTTCCA-3' (서열번호 6)
		SP3 포함 정방향	5'-TCACAT ATG CGTAAGTTCCGCAATACTGCAATCGCACTGGTTTCAGCTGCTGCTATCTCCCTCGGTGGAGTTACTGCTGCAACCGCTCAGGAAGCTACGAATTTCAATCGTTCCA-3' (서열번호 7)
		SP4 포함 정방향	5'-TCACAT ATG AAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTACGCTACGAATTTCAATCGTTCCA-3' (서열번호 8)
		역방향	5'-TCAACTAGT TCAGAGCTGAATCACGACTC-3' (서열번호 9)
mall ORF 증폭용 프라이머		SP3 포함 정방향	5'-TCACAT ATG CGTAAGTTCCGCAATACTGCAATCGCACTGGTTTCAGCTGCTGCTATCTCCCTCGGTGGAGTTACTGCTGCAACCGCTCAGGAAGCTTCAGGCATCAAACTTTCTTC-3' (서열번호 10)
mall ORF 증폭용 프라이머		역방향	5'-TCAACTAGT TCAATTTAGCCTATAGATAC-3' (서열번호 11)
Ima1 ORF 증폭용 프라이머		SP3 포함 정방향	5'-TCACAT ATG CGTAAGTTCCGCAATACTGCAATCGCACTGGTTTCAGCTGCTGCTATCTCCCTCGGTGGAGTTACTGCTGCAACCGCTCAGGAAGCTACTATTTCTTCTGCACATCC-3' (서열번호 12)
Ima1 ORF 증폭용 프라이머		역방향	5'-TCAACTAGT TCATTCGCTGATATATATTCTT-3' (서열번호 13)
신호펩타이드	SP1	CgR0949	MQINRRGFLKATAGLATIGAASMFMPKANALGA (서열번호 14)
	SP2	NCgl2101	MHSKEELTVRKGISRVLSVAVASSIGFGTVLTGTGIAAAQD (서열번호 15)
	SP3	CgR1834	MRKFRNTAIALVSAAAISLGGVTAATAQEA (서열번호 16)
	SP4	ST2	MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA (서열번호 17)

비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis)의 유전체 DNA를 주형으로 하여 5'말단에 NdeⅠ 제한효소 부위 및 각각의 신호 펩타이드와 3'말단에 SpeⅠ 제한효소 부위를 포함하는 aglA ORF 단편을 획득하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 변성 후, 94 ℃ 30 초 변성, 56 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.

상기 4 개의 PCR 증폭 산물을 각각 양 말단에 포함하는 제한효소로 처리한 후, pDZ 벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호)를 제한효소 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 처리하여 얻은 DNA 절편과 연결하여 pDZ-PgapA-SP1-aglA(B.al), pDZ-PgapA-SP2-aglA(B.al), pDZ-PgapA-SP3-aglA(B.al) 및 pDZ-PgapA-SP4-aglA(B.al) 벡터를 제작하였다.

또한, 또 다른 α-글루코시다제의 활성을 강화한 미생물을 제조하기 위하여, 다음의 균주 유래 α-글루코시다제 유전자를 확보하였다. 구체적으로는 어위니아 아밀로보라 (Erwinia amylovora) CFBP1430의 EAMY_1858 (malL) 유전체와 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 IMA1 유전체 DNA를 주형으로 하여 5'말단에 NdeⅠ 제한효소 부위 및 각각의 신호 펩타이드와 3'말단에 SpeⅠ 제한효소 부위를 포함하는 mall, Ima1 ORF 단편을 획득하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5 분간 변성 후, 94 ℃ 30 초 변성, 56 ℃ 30 초 어닐링, 72 ℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다.

상기 2 개의 PCR 증폭 산물을 각각 양 말단에 포함하는 제한효소로 처리한 후, pDZ 벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호)를 제한효소 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 처리하여 얻은 DNA 절편과 연결하여 pDZ-PgapA-SP3-malL (E.am), pDZ-PgapA-SP3-Ima1 (S.ce) 벡터를 제작하였다.

실시예 2: α- 글루코시다제를 도입한 미생물의 제작

α-글루코시다제를 코딩하고있는 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 벡터 6 종을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 라이신 생산주인 KCCM11016P (상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받음, 대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 전기펄스법 (Van der Rest et al., Appl. Microbiol . Biotechnol . 52:541-545, 1999)으로 형질전환하여 상동염색체 재조합에 의해 각 유전자가 도입된 콜로니를 선별하였다. PCR 방법으로 콜로니를 선별하기 위해 서열번호 18 및 19의 프라이머를 사용하였다.

aglA 유전자 도입 확인용 프라이머

정방향: 5'-GACCATTTATTCGCAACTGTG-3' (서열번호 18)

역방향: 5'-TCTGCAAGGCGTTCGGAATT-3' (서열번호 19)

상기 형질전환된 균주를 각각 KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al) KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP3-malL(E.am), 및 KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1(S.ce)라고 명명하였다.

실시예 3: α- 글루코시다제를 도입한 라이신 생산 미생물의 단백질 발현 확인

모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P을 대조군으로 사용하고 상기 실시예 2에서 제작한 KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al) KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP3-malL(E.am), 및 KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1(S.ce) 6 종을 하기 실시예 4에 나타낸 방법으로 배양한 후, 고속 원심분리하여 상등액을 었었다. 얻어진 상등액의 일부를 이용하여 SDS-PAGE 방법에 의해 배양배지 내 α-글루코시다제 효소의 발현을 측정하였다. 그 결과 70 Kda 위치에 발현된 단백질을 확인할 수 있었다 (도 1).

실시예 4: α- 글루코시다제를 도입한 라이신 생산 미생물의 L-아미노산 생산능 평가

모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P을 대조군으로 사용하고 상기 실시예 2에서 제작한 KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA(B.al), KCCM11016P::PgapA-SP3-malL(E.am), 및 KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1(S.ce) 6 종을 아래의 방법으로 일정시간 배양한 후 라이신 농도를 측정하였고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32 ℃에서 72 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 배양 종료 후 HPLC (Waters 2478)에 의해 L-라이신의 농도를 측정하였다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민·HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민·HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1 리터 기준)

strain	No.	라이신 농도 (g/L)	라이신 평균 농도 (g/L)
KCCM11016P	1	36.6	36.8
	2	36.4
	3	37.5
KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA(B.al)	1	40.0	39.1
	2	38.5
	3	38.9
KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al)	1	39.0	38.7
	2	38.4
	3	38.7
KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al)	1	39.8	40.4
	2	41.9
	3	39.5
KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA(B.al)	1	39.3	38.8
	2	38.5
	3	38.6
KCCM11016P::PgapA-SP3-malL(E.am)	1	38.1	38.4
	2	38.5
	3	38.6
KCCM11016P::PgapA-SP3-ima1(S.ce)	1	37.9	38.0
	2	38.1
	3	38.1

상기 결과로부터 α-글루코시다제 발현능이 도입된 라이신 생산 균주 6 종 모두 대조군 대비 라이신 생산능이 증가함을 알 수 있었다. 특히 KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA(B.al)의 경우, 가장 높은 생산능 증가율을 보였다. 미생물의 배양에 있어서, 생합성 경로가 아닌 다른 유전자의 활성 조절로 인하여 라이신의 생산능이 최소 3.2 % 내지 최대 9.7 %로 증가하는 것은 매우 의미있는 결과이다. 또한, α-글루코시다제가 기질로 활용할 것으로 예상된 이소말토스, 말토스를 배지내 첨가하지 않아도 L-아미노산 생산능이 증가됨을 확인함에 따라, 상기 본원의 α-글루코시다제 활성을 증가시킴으로써 L-아미노산 생산능을 높이는 효과를 확인하였다. 또한 상기 결과로부터 당업자의 선택에 의해 적절한 시그널 펩타이드를 사용하는 경우 보다 높은 증가율을 보일 것으로 예상된다.

상기 제조된 KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA(B.al)는 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-7523으로 명명되어, 2018년 03월 05일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12228P를 부여받았다.

실시예 5: α- 글루코시다제가 도입된 CJ3P 균주 제작 및 라이신 생산능 분석

L-라이신을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 3 종의 변이 [pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)]를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40) 균주를 대상으로, 실시예 2와 같은 방법으로 PgapA-SP3-aglA(B.al)를 도입하여, α-글루코시다제가 도입된 균주를 제작하였다. 상기 제작된 균주는 CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)으로 명명하였다. 대조군인 CJ3P 균주와 CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)를 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하고 라이신 생산능을 분석하여 하기 표 3에 나타내었다.

라이신 생산능 분석

strain	No.	라이신 농도 (g/L)	라이신 평균 농도 (g/L)
CJ3P	1	8.0	8.0
	2	7.6
	3	8.4
CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)	1	8.6	8.7
	2	8.3
	3	9.1

라이신 농도 분석결과, α-글루코시다제가 도입된 균주에서 라이신 수율이 증가되는 것을 확인하였다. 이 또한, 미생물의 배양에 있어서, 생합성 경로가 아닌 다른 유전자의 활성 조절로 인하여 라이신의 생산능이 8.8 % 증가하는 것은 매우 의미있는 결과이다. 또한, 당업자의 선택에 의해 적절한 시그널 펩타이드를 사용하는 경우 보다 높은 증가율을 보일 것으로 예상된다.

실시예 6: α- 글루코시다제가 도입된 쓰레오닌 생산 균주 제작 및 쓰레오닌 생산능 분석

α-글루코시다제 도입에 의한 L-쓰레오닌 생산능 변화를 명확히 확인하기 위하여, L-쓰레오닌, L-이소류신 생합성 경로의 공통적 중간체인 호모세린 (homoserine)을 생산하는 호모세린 디하이드로게나제 (homoserin dehydrogenase)를 암호화하는 유전자에 변이를 도입하여 강화하였다. 구체적으로, 실시예 5에서 사용된 CJ3P:: PgapA-SP3-aglA(B.al) 균주에 기 공지된 hom(G378E) 변이 (R. Winkels, S. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620, 1996)가 도입된 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 CJ3P에 hom(G378E) 변이만 도입된 균주도 제작하였다. 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작되었다.

hom(G378E)를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 먼저, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 hom 유전자의 1131 ~ 1134 번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 600 bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 XbaI 인식 부위를 삽입한 프라이머 (서열번호 20 및 21)를 합성하였다. 또한 hom 유전자의 염기 서열을 치환하기 위한 프라이머 (서열번호 22 및 23)를 합성하였다. pDZ-hom(G378E) 플라스미드는 hom 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들 (각 600 bp)이 pDZ 벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 연결된 형태로 제작되었다.

XbaI 인식부위 삽입용 프라이머

5' 단편 : 5'- TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC -3' (서열번호 20)

3' 단편: 5'- GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA -3' (서열번호 21)

hom 유전자 치환용 프라이머

5'- GCCAAAACCTCCACGCGATC -3' (서열번호 22)

5'- ATCGCGTGGAGGTTTTGGCT -3' (서열번호 23)

야생형 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편이 프라이머 (서열번호 20 및 22)를 이용한 PCR을 통해 제작되었다. PCR 조건은 94 ℃에서 2 분간 변성 후, 94 ℃ 1 분 변성, 56 ℃ 1 분 어닐링, 72 ℃ 40 초 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 10 분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 hom 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편이 프라이머 (서열번호 21 및 23)를 이용한 PCR을 통해 제작되었다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 XbaI으로 처리한 후, 65 ℃에서 20 분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α 에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 서열번호 20 및 21의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 통해 플라스미드를 획득하여 hom(G378E)의 염기치환변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-hom(G378E)를 제작하였다.

그 다음, 상기 제작된 pDZ-hom(G378E) 벡터를 CJ3P 및 CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al) 균주에 상기 실시예 2와 같은 방법으로 도입함으로써, CJ3P::hom(G378E)과 CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E) 균주를 획득하였다. 획득한 2 종의 균주를 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하고 쓰레오닌 생산농도를 분석하여 하기 표 4에 나타내었다.

쓰레오닌 생산농도

strain	No.	Thr 농도 (g/L)	Thr 평균 농도 (g/L)
CJ3P::hom(G378E)	1	1.1	1.23
	2	1.5
	3	1.1
CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E)	1	1.4	1.60
	2	1.8
	3	1.6

쓰레오닌 농도 분석결과, α-글루코시다제가 도입된 균주에서 쓰레오닌 농도가 증가되는 것을 확인하였다. 미생물의 배양에 있어서, 생합성 경로가 아닌 다른 유전자의 활성 조절로 인하여 쓰레오닌의 생산능이 30 % 증가하는 것은 매우 의미있는 결과이다. 또한, 당업자의 선택에 의해 적절한 시그널 펩타이드를 사용하는 경우 보다 높은 증가율을 보일 것으로 예상된다.

실시예 7: α- 글루코시다제가 도입된 이소류신 생산 균주 제작 및 이소류신 생산능 분석

α-글루코시다제 도입이 L-이소류신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 기 공지된 쓰레오닌 디하이드라타제 (L-threonine dehydratase)를 암호화하는 유전자에 변이를 도입하여 강화하였다. 구체적으로, 상기 실시예 6에서 사용된 CJ3P:: PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E) 균주에 기 공지된 ilvA(V323A) 변이 (S. Morbach et al., Appl. Enviro. Microbiol., 62(12): 4345-4351, 1996)가 도입된 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 CJ3P::hom(G378E)에 ilvA(V323A) 변이만 도입된 균주도 제작하였다. 변이도입을 위한 재조합벡터는 아래와 같은 방법으로 제작되었다.

ilvA(V323A)를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 먼저, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 hom 유전자의 966 ~ 969번째 위치에서 앞뒤로 각각 약 600 bp 떨어진 위치에 5' 단편 및 3' 단편에 제한효소 XbaI 인식 부위를 삽입한 프라이머 (서열번호 24 및 25)를 합성하였다. 또한 ilvA 유전자의 염기 서열을 치환하기 위한 프라이머 (서열번호 26 및 27)를 합성하였다. pDZ-ilvA(V323A) 플라스미드는 ilvA 유전자의 5' 및 3' 말단에 위치한 DNA 단편들 (각 600 bp)이 pDZ 벡터 (대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 연결된 형태로 제작되었다.

XbaI 인식부위 삽입용 프라이머

5' 단편 : 5'- ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG -3' (서열번호 24)

3' 단편: 5'- ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC -3' (서열번호 25)

ilvA 유전자 치환용 프라이머

5'- ACACCACGGCAGAACCAGGTGCAAAGGACA -3' (서열번호 26)

5'- CTGGTTCTGCCGTGGTGTGCATCATCTCTG -3' (서열번호 27)

야생형 균주의 염색체를 주형으로 5' 말단 유전자 단편이 프라이머 (서열번호 24 및 26)를 이용한 PCR을 통해 제작되었다. PCR 조건은 94 ℃에서 2 분간 변성 후, 94 ℃ 1 분 변성, 56 ℃ 1 분 어닐링, 72 ℃ 40 초 중합을 30 회 반복한 후, 72 ℃에서 10 분간 중합반응을 수행하였다. 동일한 방법으로 ilvA 유전자의 3' 말단에 위치한 유전자 단편이 프라이머 (서열번호 25 및 27)를 이용한 PCR을 통해 제작되었다. 증폭된 DNA 단편을 Quiagen사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제한 후, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 XbaI으로 처리한 후, 65 ℃에서 20 분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편을 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하였다. 서열번호 24 및 25의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 통해 플라스미드를 획득하여 ilvA(V323A)변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-ilvA(V323A)를 제작하였다.

그 다음, 상기 제작된 pDZ-ilvA(V323A) 벡터를 CJ3P::hom(G378E) 및 CJ3P:: PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E) 균주에 실시예 2와 같은 방법으로 도입하여, CJ3P::hom(G378E)-ilvA(V323A)과 CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E)-ilvA(V323A)를 획득하였다. 획득한 2 종의 균주를 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 배양하였고, 이소류신 생산농도를 분석하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

이소류신 생산농도

strain	No.	Ile 농도 (g/L)	Ile 평균 농도 (g/L)
CJ3P::hom(G378E)-ilvA(V323A)	1	0.12	0.10
	2	0.10
	3	0.09
CJ3P::PgapA-SP3-aglA(B.al)-hom(G378E)-ilvA(V323A)	1	0.15	0.13
	2	0.11
	3	0.13

표 5의 결과와 같이, α-글루코시다제가 도입된 균주에서 이소류신 농도가 증가되는 것을 확인하였다. 미생물의 배양에 있어서, 생합성 경로가 아닌 다른 유전자의 활성 조절로 인하여 이소류신의 생산능이 30 % 증가하는 것은 매우 의미있는 결과이다. 또한, 당업자의 선택에 의해 적절한 시그널 펩타이드를 사용하는 경우 보다 높은 증가율을 보일 것으로 예상된다.

이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12228P

20180305

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism producing L-amino acids with enhanced alpha-glucosidase activity and a method for producing L-amino acids using the same <130> P18-009-CJ <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 606 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA from Bifidobacterium adolescentis <400> 1 Met Thr Asn Phe Asn Arg Ser Thr Leu Ser Asp Thr Val Arg Ser Asn 1 5 10 15 Gly Ala Thr Pro Asn Pro Trp Trp Ala Asn Ala Val Val Tyr Gln Ile 20 25 30 Tyr Pro Arg Ser Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu 35 40 45 Lys Gly Ile Thr Ser Arg Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Leu Gly Val Asp 50 55 60 Val Leu Trp Leu Ser Pro Val Phe Lys Ser Pro Gln Asp Asp Asn Gly 65 70 75 80 Tyr Asp Ile Ser Asp Tyr Gln Asp Ile Asp Pro Leu Phe Gly Thr Met 85 90 95 Ala Asp Met Asp Glu Leu Leu Ala Glu Ala His Lys Arg Gly Leu Lys 100 105 110 Val Ile Met Asp Leu Val Val Asn His Thr Ser Asp Glu His Ala Trp 115 120 125 Phe Gln Ala Ser Arg Asp Lys Asn Asp Pro His Ala Asp Trp Tyr Trp 130 135 140 Trp Arg Pro Ala Lys Pro Gly His Glu Pro Gly Thr Pro Gly Ala Glu 145 150 155 160 Pro Asn Gln Trp Gly Ser Tyr Phe Gly Gly Ser Ala Trp Glu Tyr Asp 165 170 175 Pro Lys Arg Gly Glu Tyr Phe Phe His Gln Tyr Ser Lys Lys Gln Pro 180 185 190 Asp Leu Asn Trp Glu Asn Pro Glu Val Arg Lys Ala Val Tyr Lys Met 195 200 205 Met Asn Trp Trp Met Asp Arg Gly Ile Asp Gly Phe Arg Met Asp Val 210 215 220 Ile Thr Gln Ile Ser Lys Val Ile Asp Lys Asn Gly Lys Leu Pro Gly 225 230 235 240 Glu Ala Gly Ser Glu Ile Ala Asp Asn Pro Val Gly Glu Glu Gly Tyr 245 250 255 Ser Ser Pro Tyr Pro Phe Cys Ser Asp Gly Pro Arg Ile Asp Glu Phe 260 265 270 Leu Ala Glu Met Arg Arg Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Gly Tyr Met 275 280 285 Asn Val Gly Glu Ala Pro Gly Ile Thr Pro Ala Arg Asn Glu His Val 290 295 300 Thr Asp Pro Ala Asn Lys Glu Leu Asp Met Leu Phe Leu Phe Asp His 305 310 315 320 Val Gly Ile Asp Gln Glu Gly Ser Lys Trp Asn Thr Val Pro Phe Glu 325 330 335 Val Lys Asn Leu Arg Asp Arg Met Thr Glu Gln Gln Glu Ala Val Arg 340 345 350 Lys Ala Gly Trp Ala Ser Leu Phe Phe Cys Asn His Asp Gln Pro Arg 355 360 365 Val Val Ser Arg Trp Gly Asn Asp Ser Asp Arg Asp Ser Arg Glu Leu 370 375 380 Ser Ala Lys Ala Phe Gly Met Val Leu His Met His Arg Gly Thr Pro 385 390 395 400 Tyr Ile Tyr Glu Gly Glu Glu Leu Gly Met Thr Asn Ala His Phe Thr 405 410 415 Lys Leu Glu Gln Tyr Arg Asp Leu Glu Ala Leu Asn Gly Tyr Arg Gln 420 425 430 Arg Val Glu Glu Ala Lys Cys Gln Ser Ser Glu Ser Met Met Ala Ala 435 440 445 Leu Ala Leu Ile Gly Arg Asp Asn Ala Arg Thr Pro Met Gln Trp Asp 450 455 460 Ala Ser Lys Tyr Ala Gly Phe Thr Pro Ala Asp Ala Ala Ala Glu Pro 465 470 475 480 Trp Ile Ser Val Asn Pro Asn His Val Glu Ile Asn Ala Ala Glu Glu 485 490 495 Phe Asp Asp Pro Asp Ser Val Tyr Thr Phe Tyr Lys Lys Leu Ile Ala 500 505 510 Met Arg His Asn Ser Ala Thr Ile Ser Thr Gly Glu Trp His Leu Leu 515 520 525 Ala Ala Asp Ser Asp Gln Val Tyr Ala Phe Thr Arg Thr Asn Gly Asp 530 535 540 Asp Thr Ile Leu Val Val Val Asn Leu Thr Asp Arg Ser Ala Ala Leu 545 550 555 560 Pro Ser Asp Val Ala Glu Leu Leu Ser Asp Gly Val Ser Asp Pro Gln 565 570 575 Val Leu Leu Ser Thr Tyr Asp Ala Met His Ser Val Lys Ser Ile Ala 580 585 590 Arg Gly Glu Leu Ala Arg Trp Glu Gly Val Val Ile Gln Leu 595 600 605 <210> 2 <211> 1821 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA from Bifidobacterium adolescentis <400> 2 atgacgaatt tcaatcgttc cactctttct gacaccgtcc gttcgaatgg cgccaccccg 60 aatccgtggt gggcgaacgc ggtggtctac cagatctatc cccgttcctt ccaggattcc 120 aatggcgatg gcatcggcga tctgaagggc atcaccagcc ggctcgacta tctcgcagat 180 ctcggcgtgg acgtgctatg gctgtccccg gtcttcaagt ccccgcagga cgacaacggc 240 tacgacatct ccgactacca ggacatcgat ccgctgttcg gcacaatggc cgatatggac 300 gagctgcttg ccgaagcgca caagcgcggc ctgaaggtca tcatggacct ggtcgtgaac 360 cacacgtccg acgagcatgc ctggttccag gcttcccgcg acaagaacga tcctcatgcg 420 gattggtatt ggtggcgtcc ggccaagccg ggccatgagc cgggcacgcc cggtgccgag 480 ccgaaccagt ggggctccta tttcggcggc tccgcatggg agtacgatcc gaagcgcggt 540 gaatacttct ttcaccagta ttccaagaag cagcccgacc tcaactggga gaatcccgag 600 gtgcgcaagg ccgtctacaa gatgatgaac tggtggatgg atcgcggcat cgacggcttc 660 cgcatggacg tgatcaccca gatttccaag gtcatcgaca agaacggcaa gttgccgggg 720 gaggcaggat ccgaaatcgc cgataatccg gttggagagg aaggttattc cagcccgtat 780 ccgttctgct ccgacggccc gcgcatcgac gagttcctcg ccgaaatgcg ccgtgaggta 840 ttcgaaggcc gtgaaggcta catgaatgtc ggcgaggctc cgggcatcac cccggcccgt 900 aacgagcacg tcaccgatcc ggccaacaag gaacttgaca tgctattcct gtttgaccat 960 gtcggcatcg accaggaagg ctccaagtgg aataccgtgc cgttcgaggt caaaaacctg 1020 cgcgaccgta tgaccgagca gcaggaggcc gtgaggaagg ccggttgggc cagcctgttc 1080 ttctgcaatc atgaccagcc gcgcgtggtc tcccgttggg gcaacgactc cgaccgcgat 1140 tcgcgcgaac tgagcgccaa ggcgttcggc atggtgctgc acatgcaccg cggcaccccg 1200 tacatttacg aaggcgagga actgggtatg accaacgccc acttcaccaa gctggaacaa 1260 taccgcgatc tggaagccct caacggctat cgccagcgcg tggaggaagc caagtgccag 1320 tcgtccgaat ccatgatggc cgccctcgcc ctcatcggcc gcgacaacgc gcgcaccccc 1380 atgcagtggg acgcctccaa gtatgccggt ttcaccccgg cggacgcggc agccgaaccg 1440 tggatcagcg tcaacccgaa tcatgtggaa atcaacgcgg ccgaggaatt cgacgatccg 1500 gattccgtgt acacgttcta caagaagctc atcgccatgc ggcacaacag cgccaccatc 1560 tccactggcg aatggcatct gctcgccgcc gacagcgatc aggtgtatgc tttcacgcgc 1620 accaatggcg acgacacgat tcttgtcgtg gtcaacctca ccgacaggtc cgcggcgctg 1680 ccttcggacg tggcggagct gctttccgac ggcgtgtccg atccgcaagt actgctcagc 1740 acctatgatg ctatgcatag tgttaaatcg atcgctcgtg gcgagctcgc tcgctgggag 1800 ggagtcgtga ttcagctctg a 1821 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgapA-F <400> 3 tcagaattct tgggattacc attgaagcc 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PgapA-R <400> 4 tcacatatgg tgtctcctct aaagattgt 29 <210> 5 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA ORF SP1-F for amplification <400> 5 tcacatatgc aaataaaccg ccgaggcttc ttaaaagcca ccgcaggact tgccactatc 60 ggcgctgcca gcatgtttat gccaaaggcc aacgcccttg gagcaacgaa tttcaatcgt 120 tcca 124 <210> 6 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA ORF SP2-F for amplification <400> 6 tcacatatgc attcaaagga agagttaaca gtgcgtaaag gaatttcccg cgtcctctcg 60 gtagcggttg ctagttcaat cggattcgga actgtactga caggcaccgg catcgcagca 120 gctcaagaca cgaatttcaa tcgttcca 148 <210> 7 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA ORF SP3-F for amplification <400> 7 tcacatatgc gtaagttccg caatactgca atcgcactgg tttcagctgc tgctatctcc 60 ctcggtggag ttactgctgc aaccgctcag gaagctacga atttcaatcg ttcca 115 <210> 8 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA ORF SP4-F for amplification <400> 8 tcacatatga aaaagaatat cgcatttctt cttgcatcta tgttcgtttt ttctattgct 60 acaaacgcgt acgctacgaa tttcaatcgt tcca 94 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA ORF-R for amplification <400> 9 tcaactagtt cagagctgaa tcacgactc 29 <210> 10 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mall ORF SP3-F for amplification <400> 10 tcacatatgc gtaagttccg caatactgca atcgcactgg tttcagctgc tgctatctcc 60 ctcggtggag ttactgctgc aaccgctcag gaagcttcag gcatcaaact ttcttc 116 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mall ORF-R for amplification <400> 11 tcaactagtt caatttagcc tatagatac 29 <210> 12 <211> 116 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ima1 ORF SP3-F for amplification <400> 12 tcacatatgc gtaagttccg caatactgca atcgcactgg tttcagctgc tgctatctcc 60 ctcggtggag ttactgctgc aaccgctcag gaagctacta tttcttctgc acatcc 116 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ima1 ORF-R for amplification <400> 13 tcaactagtt cattcgctga tatatattct t 31 <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP1 (CgR0949) <400> 14 Met Gln Ile Asn Arg Arg Gly Phe Leu Lys Ala Thr Ala Gly Leu Ala 1 5 10 15 Thr Ile Gly Ala Ala Ser Met Phe Met Pro Lys Ala Asn Ala Leu Gly 20 25 30 Ala <210> 15 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP2 (NCgl2101) <400> 15 Met His Ser Lys Glu Glu Leu Thr Val Arg Lys Gly Ile Ser Arg Val 1 5 10 15 Leu Ser Val Ala Val Ala Ser Ser Ile Gly Phe Gly Thr Val Leu Thr 20 25 30 Gly Thr Gly Ile Ala Ala Ala Gln Asp 35 40 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP3 (CgR1834) <400> 16 Met Arg Lys Phe Arg Asn Thr Ala Ile Ala Leu Val Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ile Ser Leu Gly Gly Val Thr Ala Ala Thr Ala Gln Glu Ala 20 25 30 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP4 (ST2) <400> 17 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA-F for confirmation <400> 18 gaccatttat tcgcaactgt g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA-R for confirmation <400> 19 tctgcaaggc gttcggaatt 20 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-F for insertion <400> 20 tcctctagac tggtcgcctg atgttctac 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-R for insertion <400> 21 gactctagat tagtcccttt cgaggcgga 29 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom-F for substitution <400> 22 gccaaaacct ccacgcgatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hom-R for substitution <400> 23 atcgcgtgga ggttttggct 20 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-F for insertion (2) <400> 24 acggatccca gactccaaag caaaagcg 28 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI-R for insertion (2) <400> 25 acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvA-F for substitution <400> 26 acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvA-R for substitution <400> 27 ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg 30 <210> 28 <211> 599 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA from Erwinia amylovora <400> 28 Met Ser Gly Ile Lys Leu Ser Ser Val Met Ala Leu Phe Phe Ala Pro 1 5 10 15 Phe Leu Ala Val Ser Ser Gly Gln Val Leu Ala Gly Lys Thr Asp Ile 20 25 30 Ala Thr Thr Gln Val Val His Lys Ser Asp Asp Phe Pro Ala Trp Trp 35 40 45 Lys Gln Ala Val Phe Tyr Gln Val Tyr Pro Arg Ser Phe Lys Asp Thr 50 55 60 Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Ile Lys Gly Ile Ile Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Tyr Leu Asn Asn Leu Gly Val Asp Ala Ile Trp Ile Asn Pro His Tyr 85 90 95 Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gly Tyr Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Lys 100 105 110 Ile Met Lys Glu Tyr Gly Thr Met Glu Asp Phe Asp Arg Leu Ile Ala 115 120 125 Glu Met Asn Lys Arg Asn Met Arg Leu Met Ile Asp Ile Val Ile Asn 130 135 140 His Thr Ser Asp Gln His Arg Trp Phe Val Gln Ser Lys Ser Ser Lys 145 150 155 160 Asp Asn Pro Tyr Arg Glu Tyr Tyr Phe Trp Arg Asp Gly Lys Asn Gly 165 170 175 Gln Pro Pro Asn Asn Tyr Pro Ser Phe Phe Gly Gly Ser Ala Trp Glu 180 185 190 Lys Glu Asp His Ser Gly Gln Tyr Tyr Leu His Tyr Phe Ala Lys Gln 195 200 205 Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lys Val Arg Glu Asp Leu Tyr 210 215 220 Ala Met Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lys Gly Val Ala Gly Leu Arg Phe 225 230 235 240 Asp Thr Val Ala Thr Tyr Ala Lys Ile Pro Asn Phe Pro Asp Leu Thr 245 250 255 Pro Ser Gln Arg Gln Asn Phe Ala Arg Thr Tyr Thr Glu Gly Pro Ser 260 265 270 Ile His Arg Tyr Ile Lys Glu Met Asn Arg Gln Val Phe Ser His Tyr 275 280 285 Asn Ile Ala Thr Ala Gly Glu Ile Phe Gly Val Pro Leu Glu Lys Ser 290 295 300 Ile Asn Tyr Phe Asp Arg Arg Arg Asn Glu Leu Asn Ile Ala Phe Thr 305 310 315 320 Phe Asp Leu Ile Arg Leu Asp Arg Asn Val Glu Glu Arg Trp Arg Glu 325 330 335 Lys Ala Trp Ser Leu Val Asp Phe Arg Gln Thr Ile Gly Lys Val Asp 340 345 350 Arg Ala Ala Gly Lys Tyr Gly Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His 355 360 365 Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His Phe Gly Asp Asp Arg Pro Gln Trp 370 375 380 Arg Gln Ala Ser Ala Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ile Thr Gln Arg 385 390 395 400 Ala Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly Ser Glu Leu Gly Met Thr Asn Tyr 405 410 415 Pro Phe Lys Thr Ile Ala Asp Phe Asp Asp Ile Glu Val Lys Gly Phe 420 425 430 Trp Gln Asp Tyr Val Ser Ser Gly Arg Val Asp Pro Glu Asp Phe Met 435 440 445 Arg Asn Val Arg Leu Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln 450 455 460 Trp Asp Glu Ser Ala His Ala Gly Phe Thr Ser Gly Thr Pro Trp Phe 465 470 475 480 Lys Val Asn Pro Asn Tyr Lys Leu Ile Asn Ala Ser Asp Gln Met Lys 485 490 495 Asp Ser Asp Ser Val Phe Asn Tyr Tyr Arg Lys Leu Ile Arg Leu Arg 500 505 510 His Ala Ile Pro Ala Leu Thr Tyr Gly Glu Tyr Lys Asp Leu Asp Pro 515 520 525 Tyr Asn Asp Thr Val Tyr Ala Phe Thr Arg Thr His Gly Asp Lys Arg 530 535 540 Tyr Leu Val Val Ile Asn Phe Lys Glu Asn Lys Val Asn Tyr Arg Leu 545 550 555 560 Pro Gly Gln Leu Ser Ile Arg Gln Thr Leu Ser Glu Ser Ser Ala Ser 565 570 575 Gln Arg Val Ala Asp Asn Ala His Glu Leu Leu Leu Gln Pro Trp Gln 580 585 590 Ser Gly Ile Tyr Arg Leu Asn 595 <210> 29 <211> 589 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA from Saccharomyces cerevisiae <400> 29 Met Thr Ile Ser Ser Ala His Pro Glu Thr Glu Pro Lys Trp Trp Lys 1 5 10 15 Glu Ala Thr Phe Tyr Gln Ile Tyr Pro Ala Ser Phe Lys Asp Ser Asn 20 25 30 Asp Asp Gly Trp Gly Asp Met Lys Gly Ile Ala Ser Lys Leu Glu Tyr 35 40 45 Ile Lys Glu Leu Gly Ala Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Phe Tyr Asp 50 55 60 Ser Pro Gln Asp Asp Met Gly Tyr Asp Ile Ala Asn Tyr Glu Lys Val 65 70 75 80 Trp Pro Thr Tyr Gly Thr Asn Glu Asp Cys Phe Ala Leu Ile Glu Lys 85 90 95 Thr His Lys Leu Gly Met Lys Phe Ile Thr Asp Leu Val Ile Asn His 100 105 110 Cys Ser Ser Glu His Glu Trp Phe Lys Glu Ser Arg Ser Ser Lys Thr 115 120 125 Asn Pro Lys Arg Asp Trp Phe Phe Trp Arg Pro Pro Lys Gly Tyr Asp 130 135 140 Ala Glu Gly Lys Pro Ile Pro Pro Asn Asn Trp Lys Ser Tyr Phe Gly 145 150 155 160 Gly Ser Ala Trp Thr Phe Asp Glu Lys Thr Gln Glu Phe Tyr Leu Arg 165 170 175 Leu Phe Cys Ser Thr Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Glu Asp Cys 180 185 190 Arg Lys Ala Ile Tyr Glu Ser Ala Val Gly Tyr Trp Leu Asp His Gly 195 200 205 Val Asp Gly Phe Arg Ile Asp Val Gly Ser Leu Tyr Ser Lys Val Val 210 215 220 Gly Leu Pro Asp Ala Pro Val Val Asp Lys Asn Ser Thr Trp Gln Ser 225 230 235 240 Ser Asp Pro Tyr Thr Leu Asn Gly Pro Arg Ile His Glu Phe His Gln 245 250 255 Glu Met Asn Gln Phe Ile Arg Asn Arg Val Lys Asp Gly Arg Glu Ile 260 265 270 Met Thr Val Gly Glu Met Gln His Ala Ser Asp Glu Thr Lys Arg Leu 275 280 285 Tyr Thr Ser Ala Ser Arg His Glu Leu Ser Glu Leu Phe Asn Phe Ser 290 295 300 His Thr Asp Val Gly Thr Ser Pro Leu Phe Arg Tyr Asn Leu Val Pro 305 310 315 320 Phe Glu Leu Lys Asp Trp Lys Ile Ala Leu Ala Glu Leu Phe Arg Tyr 325 330 335 Ile Asn Gly Thr Asp Cys Trp Ser Thr Ile Tyr Leu Glu Asn His Asp 340 345 350 Gln Pro Arg Ser Ile Thr Arg Phe Gly Asp Asp Ser Pro Lys Asn Arg 355 360 365 Val Ile Ser Gly Lys Leu Leu Ser Val Leu Leu Ser Ala Leu Thr Gly 370 375 380 Thr Leu Tyr Val Tyr Gln Gly Gln Glu Leu Gly Gln Ile Asn Phe Lys 385 390 395 400 Asn Trp Pro Val Glu Lys Tyr Glu Asp Val Glu Ile Arg Asn Asn Tyr 405 410 415 Asn Ala Ile Lys Glu Glu His Gly Glu Asn Ser Glu Glu Met Lys Lys 420 425 430 Phe Leu Glu Ala Ile Ala Leu Ile Ser Arg Asp His Ala Arg Thr Pro 435 440 445 Met Gln Trp Ser Arg Glu Glu Pro Asn Ala Gly Phe Ser Gly Pro Ser 450 455 460 Ala Lys Pro Trp Phe Tyr Leu Asn Asp Ser Phe Arg Glu Gly Ile Asn 465 470 475 480 Val Glu Asp Glu Ile Lys Asp Pro Asn Ser Val Leu Asn Phe Trp Lys 485 490 495 Glu Ala Leu Lys Phe Arg Lys Ala His Lys Asp Ile Thr Val Tyr Gly 500 505 510 Tyr Asp Phe Glu Phe Ile Asp Leu Asp Asn Lys Lys Leu Phe Ser Phe 515 520 525 Thr Lys Lys Tyr Asn Asn Lys Thr Leu Phe Ala Ala Leu Asn Phe Ser 530 535 540 Ser Asp Ala Thr Asp Phe Lys Ile Pro Asn Asp Asp Ser Ser Phe Lys 545 550 555 560 Leu Glu Phe Gly Asn Tyr Pro Lys Lys Glu Val Asp Ala Ser Ser Arg 565 570 575 Thr Leu Lys Pro Trp Glu Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Glu 580 585 <210> 30 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA from Erwinia amylovora <400> 30 atgtcaggca tcaaactttc ttcagtcatg gcactcttct tcgccccatt tcttgctgtt 60 agttcaggtc aggtgctcgc aggaaagacg gatatcgcta ccacccaagt ggtgcataag 120 tccgatgact tcccggcatg gtggaagcaa gcggtgtttt accaggttta tccacgcagc 180 ttcaaagaca cgaacggtga tggtattggt gacattaagg gaatcatcga gaagctcgat 240 taccttaaca accttggcgt agatgcgatt tggattaacc cacactacga tagcccaaat 300 actgacaacg gctacgatat tcgtgattac cgcaagatca tgaaagagta cggaaccatg 360 gaagatttcg atcgtttgat cgcagaaatg aataagcgta acatgcgcct catgatcgac 420 atcgttatca accacacttc tgaccagcac cgctggttcg tgcagagcaa gtcgtctaag 480 gataacccgt atcgcgaata ctacttttgg cgcgatggaa agaacggcca accacctaac 540 aactatccgt ccttcttcgg tggttctgcg tgggaaaaag aggaccattc cgggcagtat 600 tatctacatt acttcgctaa acaacagcca gacctgaatt gggataaccc taaggttcgc 660 gaagatttgt acgcgatgct ccggttctgg ctcgacaaag gcgtcgctgg actgcggttc 720 gacaccgtag ccacctacgc taagatcccg aacttccctg acctcacgcc ctcgcaacga 780 cagaattttg cccgaactta taccgaaggt cccagtattc atcggtacat caaagaaatg 840 aacaggcaag tgttttctca ctacaatatc gctacagctg gggagatctt cggcgtcccg 900 ctggaaaagt cgattaacta tttcgaccgt cgacgcaatg aacttaacat tgcatttaca 960 tttgatctga ttcgtttgga tcgtaatgtc gaggaacgct ggcgtgaaaa agcctggtcc 1020 ctggttgatt ttcgccagac gatcggcaag gtagatcgtg cagccggaaa atacggctgg 1080 aacgcattct ttttggacaa ccacgacaac ccacgagctg tctcccactt cggcgatgac 1140 cggcctcaat ggcgccaggc gtctgcaaag gccctggcca ccctgattat cacccagagg 1200 gcgaccccgt ttatctacca gggctccgag ctgggcatga ctaattaccc tttcaagact 1260 atcgcggatt tcgatgacat tgaagtgaag ggtttttggc aggattatgt gagcagcggt 1320 cgagttgacc cagaggattt catgcgcaac gttcgtctaa ccagtcgcga caactcccgc 1380 acacccttcc aatgggacga atcggcccat gctggcttca cctccggcac gccctggttt 1440 aaggtgaacc ctaactataa gctcatcaat gcgtccgatc agatgaagga ttcagattcc 1500 gttttcaact actaccgcaa actcatccgc cttcgccacg ctattcctgc gttgacctac 1560 ggggagtata aagatctgga tccatacaat gacaccgtct acgcatttac ccgcacccac 1620 ggtgacaagc gatacctggt cgtgatcaac tttaaagaga acaaagtcaa ctatcgtttg 1680 cccggtcagc ttagcattcg ccagactctg tccgagtcat cggcatccca acgtgtagcc 1740 gacaatgctc acgagttgct cctgcaacca tggcaatccg gtatctatag gctaaattga 1800 1800 <210> 31 <211> 1770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aglA from Saccharomyces cerevisiae <400> 31 atgactattt cttctgcaca tccagagaca gaaccaaagt ggtggaaaga ggccacgttc 60 tatcaaattt acccagcaag tttcaaagac tctaatgacg atggctgggg tgacatgaaa 120 gggattgcct ccaagctgga gtacatcaaa gagcttggtg ccgatgccat ttggatctca 180 ccattctacg actcgccaca agatgatatg ggttacgata ttgccaacta cgaaaaggtc 240 tggccaacat atggtacgaa tgaagactgc tttgccttga tcgaaaagac acataagctt 300 ggtatgaaat ttatcaccga cttggtcatc aatcactgtt ccagcgaaca tgaatggttc 360 aaagagagca gatcctcgaa gactaatcca aagcgtgact ggttcttctg gagacctcct 420 aaaggttatg acgccgaagg caagccaatt cctccaaaca attggaaatc ctattttggt 480 ggttccgcat ggaccttcga tgaaaagaca caagaattct acttgcgttt gttttgctcc 540 actcaacctg atttgaattg ggagaatgaa gactgtagaa aggcaatcta cgaaagtgcc 600 gttggatact ggttagacca tggtgtagac ggctttagaa ttgatgtcgg aagtttgtac 660 tccaaagttg taggtttacc agatgctcct gttgttgaca aaaactcgac ttggcaatcc 720 agtgatccat acacattgaa tggaccacgt attcacgagt tccatcaaga aatgaatcaa 780 ttcatcagaa acagagtgaa ggatggcagg gagattatga cagttggtga aatgcaacat 840 gcctccgacg aaactaagag actttatacg agtgcttcaa gacacgaact tagtgagtta 900 tttaactttt cccacactga tgtggggact tcacctttgt tccgttacaa cttggtccca 960 tttgaactga aggattggaa gattgccctt gctgagctgt tcaggtacat taatggtaca 1020 gattgttggt caacaatcta tctggaaaat cacgaccaac ctcgttcaat tacgagattt 1080 ggtgacgatt ctcccaagaa ccgtgttatt tctggtaagt tactctctgt gttgctaagt 1140 gccttgaccg gtactctata tgtgtatcag ggacaagagc ttggccaaat caatttcaag 1200 aactggcctg ttgaaaagta cgaggatgtc gaaatcagaa acaactacaa tgccattaaa 1260 gaagagcatg gggaaaactc agaggagatg aaaaagtttt tagaagccat tgcccttatc 1320 tccagggacc atgctagaac acctatgcaa tggtctcgtg aggagccaaa tgctggtttt 1380 tctggtccta gtgctaaacc atggttttac ttgaacgact ctttcagaga aggcattaac 1440 gtcgaagatg aaatcaagga tcccaactcg gttttgaact tctggaagga ggccttgaag 1500 tttagaaagg cgcataaaga cattactgtg tacggatacg atttcgagtt tattgattta 1560 gacaataaga agttgtttag cttcacaaag aagtacaaca ataaaacatt gtttgcggct 1620 ttgaacttta gctctgatgc gacagatttc aagattccaa atgatgattc atcgttcaag 1680 ttagagtttg gaaactatcc aaagaaggag gtagatgcct cttccagaac attgaagcca 1740 tgggaaggaa gaatatatat cagcgaatga 1770

Claims

비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis) 유래 aglA 단백질의 활성이 강화된, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium) 미생물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 aglA 단백질은 서열번호 2의 aglA 유전자에 의해 코딩되는, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 aglA 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질인, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신, L-쓰레오닌 및 L-이소류신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 미생물.
제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis) 유래 aglA 단백질의 활성이 강화된 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium ) 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 배지 또는 미생물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 aglA 단백질은 서열번호 2의 aglA 유전자에 의해 코딩되는, L-아미노산의 생산 방법.
제7항에 있어서, 상기 aglA 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질인, L-아미노산의 생산 방법.
제7항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신, L-쓰레오닌 및 L-이소류신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, L-아미노산의 생산 방법.