BR112019019867A2

BR112019019867A2 - Micro-organismo para produzir l-aminoácido com atividade aprimorada de a-glucosidase e método para produzir l-aminoácido com o uso do mesmo

Info

Publication number: BR112019019867A2
Application number: BR112019019867-9A
Authority: BR
Inventors: Kyungrim KIM; Hyo Jeong BYUN; Kwang woo Lee; Hyung Joon Kim; Yong Uk Shin
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2021-04-13
Also published as: CN111247250B; JP7286758B2; IL281567A; CL2021000629A1; BR112019019867B1; KR102112240B1; CN111247250A; EP3656863A1; EP3656863A4; KR20200036647A; US20210017510A1; JP2021534765A; WO2020067618A1; AU2019349396A1; WO2020067618A8; MX2021002814A; RU2732338C1; US11293014B2; PE20210686A1; EP3656863A9

Abstract

micro-organismo para produzir l-aminoácido com atividade aprimorada de (alfa)-glucosidase e método para produzir l-aminoácido com o uso do mesmo. a presente revelação refere-se a um micro-organismo para a produção de um l-aminoácido com atividade aprimorada de (alfa)-glucosidase e a um método para produzir um l-aminoácido com o uso do mesmo. de acordo com a presente revelação, o micro-organismo do gênero corynebacterium que produz um l-aminoácido aprimorou a atividade da (alfa)-glucosidase, melhorando assim o rendimento da produção de l-aminoácidos. portanto, o micro-organismo pode ser muito útil para a produção de l-aminoácidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “MICRO- ORGANISMO PARA PRODUZIR L-AMINOÁCIDO COM ATIVIDADE APRIMORADA DE α-GLUCOSIDASE E MÉTODO PARA PRODUZIR L- AMINOÁCIDO COM O USO DO MESMO”

CAMPO DA TÉCNICA

[0001] A presente revelação refere-se a um micro- organismo para a produção de um L-aminoácido com atividade aprimorada de α-glucosidase e a um método para produzir um L-aminoácido com o uso do mesmo.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0002] Os L-aminoácidos têm sido usados nas indústrias de ração animal, medicamentos e cosméticos, e são produzidos principalmente por fermentação usando o gênero Corynebacterium ou o gênero Escherichia. Para a produção de L-aminoácidos, vários estudos como o desenvolvimento de cepas de produção altamente eficientes e tecnologias de processos de fermentação foram realizados. Especificamente, métodos de abordagem específicos do material alvo, como aumento da expressão de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de L-aminoácidos ou remoção de genes desnecessários para a biossíntese, foram principalmente usados (registro de patente n° KR 10- 0838038).

[0003] Enquanto isso, vários estudos para aumentar a disponibilidade de açúcar foram conduzidos para aumentar a produtividade da substância-alvo de um micro-organismo e, ao mesmo tempo, houve uma demanda contínua por considerar uma composição eficiente do meio e um crescimento microbiano.

Por exemplo, uma tecnologia tem sido relatada para a preparação de um micro-organismo mutante com capacidade de aumentar a disponibilidade de celobiose através de sobre- expressão de AscB ou gene chbF e com o uso de celobiose e outros açúcares, como xilose, manose e galactose, ao mesmo tempo, e a produção de biocombustíveis com o uso do mesmo (registro de patente nº KR 10-1484108). No entanto, há necessidade de estudos continuados sobre a correlação entre a disponibilidade de açúcar e a produtividade de L- aminoácidos do micro-organismo.

REVELAÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[0004] Os presentes inventores verificaram surpreendentemente um efeito de aumentar o rendimento de um L-aminoácido como substância-alvo sem adicionar isomaltose e maltose como resultado da introdução de α-glucosidase, que se sabe decompor isomaltose e maltose, em uma cepa do gênero Corynebacterium, completando assim a presente revelação.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[0005] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um L-aminoácido com atividade aprimorada da α-glucosidase.

[0006] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir um L-aminoácido que compreende cultivar micro-organismo em um meio; e coletar um L-aminoácido do meio de cultura ou micro-organismo.

[0007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para aprimorar a produção de um L- aminoácido, incluindo o aumento da expressão de α- glucosidase em um micro-organismo.

[0008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um uso de α-glucosidase para aumentar a produção de um L-aminoácido.

EFEITOS VANTAJOSOS

[0009] De acordo com a presente revelação, o micro- organismo do gênero Corynebacterium que produz um L- aminoácido aprimorou a atividade da α-glucosidase, melhorando assim o rendimento da produção de L-aminoácidos.

Portanto, o micro-organismo pode ser muito útil para a produção de L-aminoácidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Figura 1 ilustra um resultado de SDS-PAGE da confirmação da expressão de α-glucosidase em cepas de Corynebacterium glutamicum.

MELHOR MODO PARA A INVENÇÃO

[0011] Especificamente, a presente revelação será descrita a seguir. Enquanto isso, cada descrição e modalidade revelada na presente revelação também pode ser aplicada uma à outra descrição e modalidade. Ou seja, todas as combinações dos vários componentes revelados na presente revelação pertencem ao escopo da presente revelação. Além disso, a descrição específica descrita abaixo pode não limitar o escopo da presente revelação.

[0012] Para atingir os objetivos, um aspecto da presente revelação é um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um L-aminoácido com atividade aprimorada da α-glucosidase. O micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação aprimorou a atividade da α-glucosidase para aumentar a produtividade do L- aminoácido. Por conseguinte, o micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação pode ser muito útil para a produção de L-aminoácido.

[0013] Na presente revelação, o termo “α- glucosidase” é um tipo de glucosidase para decompor açúcar em glucoses e se refere a uma enzima que tem uma característica de decompor uma ligação α (1→4). Na presente revelação, a α-glucosidase pode ser uma proteína com atividade da α-glucosidase codificada por um gene aglA, mas desde que a α-glucosidase tenha atividade correspondente à glucosidase, que é aprimorada no micro-organismo do gênero Corynebacterium para aumentar a produtividade de um L- aminoácido, seu tipo não é particularmente limitado. Sabe-

se que a proteína que tem a atividade da α-glucosidase codificada pelo gene aglA tem atividade de decomposição de isomaltose ou maltose (Glicobiologia. novembro de 2010;

20(11)), e as informações sobre a α-glucosidase podem ser facilmente obtidas por aqueles versados na técnica através de um banco de dados conhecido (por exemplo, NCBI, UniProt,

etc.). Na presente revelação, a α-glucosidase pode ser α-

glucosidase derivada de Bifidobacterium adolescentis,

Erwinia amylovora ou Saccharomyces cerevisiae e,

particularmente, α-glucosidase derivada de Bifidobacterium adolescentis, mas não está limitada a isso.

A α-glucosidase derivada de Bifidobacterium adolescentis descrita como um exemplo da presente revelação não está limitada a isso, mas pode ser uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. A α-glucosidase derivada de

Erwinia amylovora não está limitada a isso, mas pode ser uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 28. A α-glucosidase derivada de Saccharomyces cerevisiae não está limitada a isso, mas pode ser uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 29. A proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 pode ser usada em uma combinação de uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 1 e uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0014] Além disso, mesmo se uma ‘proteína ou polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos listada com um número de sequência específico’ for revelada na presente revelação, se uma proteína tiver uma atividade igual ou equivalente à do polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do número de sequência correspondente, é aparente que proteínas com uma sequência de aminoácidos que é parcialmente deletada, modificada,

substituída, substituída conservativamente ou adicionada também são incluídas no escopo da presente revelação.

Por exemplo, se a proteína tiver uma atividade igual ou equivalente à do polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do número de sequência correspondente, é evidente que a adição de uma sequência que não modifica uma função da proteína antes e depois a sequência de aminoácidos,

mutação que ocorre naturalmente, mutação silenciosa da mesma ou substituição conservadora não são excluídas e a adição ou mutação da sequência é incluída no escopo da presente revelação.

Além disso, se a proteína tiver uma atividade igual ou equivalente à do polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos do número de sequência correspondente, uma sequência de aminoácidos possuindo homologia ou identidade de 80% ou mais, particularmente 90%

ou mais, mais particularmente 95% ou mais e muito mais particularmente 99% ou mais com a sequência de aminoácidos do número de sequência correspondente podem ser incluídos no escopo da presente revelação.

[0015] Por exemplo, a proteína com atividade de α- glucosidase na presente revelação pode ser uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de α- glucosidase derivada de Bifidobacterium adolescentis, uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 28) de α-glucosidase derivada de Erwinia amylovora ou uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) de α-glucosidase derivada de Saccharomyces cerevisiae. Se a α-glucosidase da presente revelação for uma proteína que tem um efeito correspondente à α-glucosidase e aprimora a atividade no micro-organismo do gênero Corynebacterium para aumentar a produtividade de um L- aminoácido, é aparente que a α-glucosidase é incluído em uma proteína com atividade de α-glucosidase na presente revelação. Particularmente, desde que a α-glucosidase da presente revelação tenha a atividade de α-glucosidase e aprimore a atividade no micro-organismo do gênero Corynebacterium para aumentar a produtividade de um L- aminoácido, uma sequência de aminoácidos com homologia ou identidade de 80% ou mais, particularmente 90% ou mais, mais particularmente 95% ou mais e muito mais particularmente 99% ou mais com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29 pode ser incluído no escopo da presente revelação.

[0016] Na presente revelação, o termo “homologia ou identidade” significa um grau associado a duas sequências de aminoácidos ou sequências de base fornecidas e pode ser representado como uma porcentagem. Além disso, a homologia e a identidade podem frequentemente ser usadas de forma intercambiável.

[0017] A homologia ou identidade do polinucleotídeo ou polipeptídeo conservado é determinada por um algoritmo de matriz padrão e uma penalidade de intervalo padrão estabelecida por um programa usado pode ser usada em conjunto. Substancialmente, uma sequência homóloga ou idêntica pode ser geralmente hibridizada sob condições moderadas ou altamente rigorosas de acordo com pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de toda a sequência ou de todo o comprimento. No polinucleotídeo hibridizado, também é considerado um polinucleotídeo que compreende um códon degenerado em vez de um códon.

[0018] Se quaisquer dois polinucleotídeos ou polipeptídeos têm homologia, similaridade ou identidade podem ser determinados com o uso de um algoritmo de computador conhecido como o programa “FASTA” com o uso de um parâmetro padrão, por exemplo, em Pearson et al. (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85]: 2444. Como alternativa, conforme realizado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,

Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 e 277) (versão 5.0.0 ou versão subsequente), a homologia, similaridade ou identidade podem ser determinadas com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48: 443 a 453) (incluindo o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S. ][F.,] [ET AL, J. MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a homologia, similaridade ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW do National Center for Biotech Information Database.

[0019] A homologia, similaridade ou identidade do polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ser determinada pela comparação de informações de sequência com o uso de um programa de computador GAP, por exemplo, Needleman et al.

(1970), J. Mol Biol. 48:443. Em resumo, o programa GAP é definido como um valor obtido dividindo o número de símbolos arranjados similares (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número inteiro de símbolos na menor das duas sequências.

O parâmetro padrão para o programa GAP pode incluir (1) uma matriz de comparação numérica unária (contendo valores de 1 para identidade e 0 para não-identidade) e uma matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids

Res. 14:6745, como revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, Fundação Nacional de Pesquisa Biomédica, páginas 353 a 358 (1979) (alternativamente, uma matriz de substituição de EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4. 4)); (2) penalidade de 3,0 para cada intervalo e penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (alternativamente, penalidade de abertura do intervalo 10, penalidade de extensão do intervalo 0,5); e (3) não penalidade para um intervalo terminal. Por conseguinte, o termo “homologia” ou “identidade” usado na presente revelação representa relevância entre sequências.

[0020] Na presente revelação, o termo “substituição conservadora” significa substituir um aminoácido por outro aminoácido com uma propriedade estrutural e/ou química similar. A variação pode ter, por exemplo, uma ou mais substituições conservadoras enquanto ainda tem uma ou mais atividades biológicas. Essa substituição de aminoácidos pode geralmente ocorrer com base na polaridade, carga, solubilidade e similaridade na natureza hidrofóbica, hidrofóbica e/ou anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano.

[0021] Além disso, a sequência polinucleotídica que codifica a α-glucosidase pode ser uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína que tem atividade da α-glucosidase e tem atividade aprimorada no micro- organismo do gênero Corynebacterium para aumentar a produtividade de um L-aminoácido. Por exemplo, a sequência polinucleotídica que codifica a α-glucosidase pode ser um polinucleotídeo que codifica α-glucosidase derivada de Bifidobacterium adolescentis (SEQ ID NO: 1), α-glucosidase derivada de Erwinia amylovora (SEQ ID NO: 28) e α-glucosidase derivada de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 29). Por exemplo, a sequência polinucleotídica pode ter uma sequência-base da SEQ ID NO: 2, uma sequência-base da SEQ ID NO: 30 e uma sequência-base da SEQ ID NO: 31, mas a sequência- base pode ser modificada em uma região de codificação devido à degeneração do códon. Além disso, várias modificações podem ser realizadas na região de codificação em um intervalo sem alterar a sequência de aminoácidos, considerando um códon preferencial em um organismo para expressar a sequência de bases. A sequência polinucleotídica pode ser um polinucleotídeo incluindo uma sequência polinucleotídica que codifica a proteína ou uma sequência polinucleotídica com homologia ou identidade de 80%, 90%, 95% ou 99% com a mesma.

Além disso, se a sequência polinucleotídica é uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína que tem homologia ou identidade e tem um efeito substancialmente idêntico ou correspondente à proteína, é evidente que uma sequência polinucleotídica parcialmente deletada, modificada, substituída ou adicionada é incluída no escopo da presente revelação.

[0022] Alternativamente, uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, uma sequência que codifica uma proteína com atividade de α-glucosidase da presente revelação por hibridização com uma sequência complementar para a totalidade ou parte da sequência polinucleotídica sob condições rigorosas podem ser incluídas sem limitação. As “condições rigorosas” significam condições que permitem hibridização específica entre polinucleotídeos. Essas condições são especificamente reveladas na literatura (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989). Por exemplo, condições de hibridização de genes com alta homologia, isto é, genes com homologia de 80% ou mais, particularmente 90% ou mais, mais particularmente 95% ou mais e muito mais particularmente 97% ou mais, e especificamente particularmente 99% ou mais e não genes de hibridização com baixa homologia ou condições de lavagem da hibridização geral Southern, cuja lavagem é realizada uma vez, particularmente 2 a 3 vezes na concentração de sal e temperatura correspondentes a 60 °C,

1 × SSC, SDS a 0,1%, particularmente 60 °C, 0,1 × SSC, SDS a 0,1% e, mais particularmente 68 °C, 0,1 × SSC, SDS a 0,1%

podem ser incluídos.

A hibridização requer que dois polinucleotídeos tenham uma sequência complementar, mesmo que a incompatibilidade entre as bases seja possível de acordo com o grau rigoroso de hibridização.

O termo

“complementar” é usado para descrever uma relação entre bases de polinucleotídeos que podem ser hibridizados.

Por exemplo,

para o DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina.

Por conseguinte, a presente revelação pode incluir segmentos nucleotídicos isolados complementares à sequência geral, bem como uma sequência nucleotídica substancialmente similar.

Especificamente, os polinucleotídeos que têm homologia usam uma condição de hibridização que inclui a hibridização a um valor Tm de 55

°C e podem ser detectados com o uso de as condições acima mencionadas.

Além disso, o valor de Tm pode ser de 60 °C, 63

°C ou 65 °C, mas não está limitado a isso e pode ser adequadamente ajustado pelos versados na técnica, de acordo com uma finalidade da mesma.

Um grau rigoroso adequado para hibridar os polinucleotídeos depende do comprimento e do grau complementar do polinucleotídeo e as variáveis são bem conhecidas na técnica (consultar Sambrook et al., Supra, 9.

50-9.51, 11.7-11.80).

[0023] Na presente revelação, o termo “aprimoramento da atividade” significa que a atividade é aumentada quando um micro-organismo original é comparado com a atividade de uma proteína em um estado natural ou pré-mutante, ou seja, atividade endógena e é um conceito incluindo a introdução de atividade que fornece atividade da mesma introduzindo a proteína em um micro-organismo sem a atividade de uma proteína específica. A “atividade endógena” significa um estado ativo de uma proteína mostrada em um estado natural ou não mutante do micro-organismo original.

[0024] Particularmente, o “aprimoramento da atividade” não é particularmente limitado, mas pode incluir o aprimoramento da atividade por um aumento da atividade gênica endógena, amplificação endógena de genes devido a fatores internos ou externos, introdução de genes externos, substituição ou modificação de promotores, e um aumento na atividade enzimática por mutação, bem como derivar um efeito além de sua função original, aprimorando a atividade da própria proteína. Por exemplo, o “aprimoramento da atividade” pode ser realizado por um aumento no número de cópias em células de genes que codificam a proteína, um método para modificar uma sequência reguladora da expressão de genes que codifica o polipeptídeo, um método para modificar genes que codificam o polipeptídeo em um cromossomo substituindo genes que codificam o polipeptídeo no cromossomo por genes mutantes para aprimorar a atividade do polipeptídeo ou induzindo uma mutação nos genes de um cromossomo que codifica o polipeptídeo para aprimorar a atividade do polipeptídeo e um método para introduzir genes de fora ou inserir genes no cromossomo, mas não se limita a esses métodos.

[0025] O aumento no número de cópias dos genes não é especificamente limitado, mas pode ser realizado para estar operacionalmente ligado a um vetor ou para ser inserido em um cromossomo em uma célula hospedeira. Especificamente, o vetor que está operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que codifica a proteína da presente revelação e replicado e funcionando independentemente do hospedeiro pode ser introduzido na célula hospedeira. Alternativamente, o vetor que está operacionalmente ligado ao polinucleotídeo para inserir o polinucleotídeo no cromossomo na célula hospedeira pode ser introduzido no cromossomo da célula hospedeira. A inserção no cromossomo do polinucleotídeo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga. Uma vez que o vetor da presente revelação pode ser inserido no cromossomo pela recombinação homóloga, o vetor pode ainda incluir um marcador de seleção para confirmar a inserção do cromossomo. O marcador de seleção seleciona células transformadas pelo vetor para confirmar a inserção de um polinucleotídeo alvo, e marcadores podem ser usados para fornecer fenótipos seletivos, como resistência a drogas, auxotrofia, resistência a drogas citotóxicas ou a expressão de proteínas de superfície, mas não estão limitadas a elas. Em um ambiente tratado com um agente seletivo, uma vez que apenas as células que expressam o marcador de seleção sobrevivem ou representam diferentes fenótipos de expressão, as células transformadas podem ser selecionadas.

[0026] O termo “vetor” na presente revelação se refere a uma construção de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica um peptídeo-alvo que está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora de expressão adequada para expressar a proteína-alvo em um hospedeiro adequado. A sequência reguladora da expressão inclui um promotor com capacidade de iniciar a transcrição, qualquer sequência do operador para regular tal transcrição, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo de mRNA adequado e uma sequência para regular a terminação da transcrição e tradução, mas não está limitada a isso. O vetor pode ser transformado em uma célula hospedeira apropriada e, em seguida, pode ser replicado ou funcionar, independentemente de um genoma hospedeiro ou integrado ao próprio genoma. O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de vetores a serem geralmente usados podem incluir plasmídeos nativos ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como o vetor fágico ou o vetor cosmídeo, pWE15, M13 lMBL3, lMBL4, lIXII, lASHII, lAPII, lt10, lt11, Charon4A, Charon21A e similares podem ser usados e como o vetor plasmídeo, com base em pDZ, em pBR, em pUC, em pBluescriptII, em pGEM, em pTZ, em pCL e em pET pode ser usado.

[0027] Além disso, o vetor pode compreender uma sequência polinucleotídica que codifica um peptídeo sinal.

Na presente revelação, o termo “peptídeo sinal” se refere a uma proteína na qual a proteína-alvo pode ser secretada para fora das células e pode ser aplicada para ser expressa em um estado integrado ou separado com os genes que codificam a proteína-alvo. Desde que o peptídeo sinal na presente revelação possa ser secretado para fora das células enquanto mantém a função da proteína-alvo, o seu tipo não é particularmente limitado. Por exemplo, na presente revelação, CgR0949, NCgl2101, CgR1834 e ST2 (SEQ ID NO: 14 a 17, respectivamente) podem ser usados como exemplos do peptídeo sinal. Além disso, um peptídeo sinal apropriado conhecido é selecionado pelos versados na técnica para serem usados na expressão de secreção de α-glucosidase.

[0028] Na presente revelação, o termo

“transformação” se refere à introdução de um vetor incluindo um polinucleotídeo que codifica uma proteína-alvo em uma célula hospedeira de tal maneira que a proteína codificada pelo polinucleotídeo é expressa na célula hospedeira.

Desde que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, todos os polinucleotídeos transformados são incluídos independentemente de o polinucleotídeo transformado ser inserido e localizado em um cromossomo da célula hospedeira ou localizado fora do cromossomo.

Além disso, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo.

O polinucleotídeo pode ser introduzido de qualquer forma, desde que o polinucleotídeo possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso.

Por exemplo,

o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma estrutura genômica, incluindo todos os elementos necessários para a autoexpressão.

O cassete de expressão pode geralmente incluir um promotor que está operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, um sinal de terminação de transcrição, um sítio de ligação ao ribossomo e um sinal de terminação de tradução.

O cassete de expressão pode ser um vetor de expressão autorreplicável.

Além disso, o polinucleotídeo também pode ser introduzido na célula hospedeira como está e operacionalmente ligado a uma sequência necessária para a expressão na célula hospedeira.

[0029] Além disso, o termo “operacionalmente ligado” acima significa que a sequência do gene está funcionalmente ligada a uma sequência do promotor, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o peptídeo-alvo da presente revelação.

[0030] Em seguida, a modificação da sequência reguladora da expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo não é particularmente limitada a isso, mas pode ser realizada induzindo uma mutação na sequência por exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora ou uma combinação das mesmas de um núcleo sequência de ácido para aprimorar ainda mais a atividade da sequência reguladora da expressão ou pode ser realizada por substituição por uma sequência de ácido nucleico com atividade mais forte. Especificamente, a modificação pode ser realizada por substituição por um forte promotor. A sequência reguladora da expressão não está particularmente limitada à mesma, mas pode incluir um promotor, uma sequência do operador, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossomo, uma sequência que regula a terminação da transcrição e tradução e similares.

[0031] Em vez de um promotor original, um promotor forte pode ser ligado à porção superior da unidade de expressão de polinucleotídeo, mas não está limitado a isso.

Exemplos de promotores fortes conhecidos podem incluir os promotores cj1 a cj7 (registro de patente coreana no 0620092), um promotor spl1, 7 ou 13 (registro de patente coreana no 1783170), um promotor PgapA, um promotor lac, um promotor trp, um promotor trc, promotor tac, promotor PR de fago l, promotor PL e promotor tet.

[0032] Além disso, a modificação da sequência polinucleotídica no cromossomo não é particularmente limitada a isso, mas pode ser realizada induzindo uma mutação na sequência reguladora da expressão por exclusão, inserção, substituição não conservadora ou conservadora ou uma combinação das mesmas de um sequência de ácidos nucleicos para aprimorar ainda mais a atividade da sequência polinucleotídica ou pode ser realizada por substituição por uma sequência polinucleotídica aumentada com atividade mais forte. No entanto, não está limitado a isso.

[0033] No aprimoramento da atividade da proteína, não há atividade de uma proteína correspondente, ou a atividade ou concentração da mesma pode geralmente ser aumentada para 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200 %, 300%, 400% ou 500%, até 1.000% ou 2.000% com base na atividade ou concentração em uma proteína do tipo selvagem ou em uma cepa inicial de micro-organismos, mas não se limita a isso.

[0034] O micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação aprimorou a atividade da α-glucosidase para aumentar a produtividade do L-aminoácido como descrito acima. Por conseguinte, o micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação pode ser usado para a produção de L-aminoácido.

[0035] O termo “L-aminoácido” na presente revelação significa uma unidade constituinte básica de uma proteína que forma o corpo de um organismo vivo no qual um grupo amino e um grupo carboxila estão ligados ao mesmo átomo de carbono.

O L-aminoácido pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em, por exemplo, L-alanina, L-arginina, L- asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L- glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina.

Além disso, o L-aminoácido pode ser, por exemplo, um L- aminoácido derivado do ácido aspártico em uma via de biossíntese do micro-organismo e pode ser um L-aminoácido biossintetizado usando o ácido L-aspártico como substrato ou intermediário. O L-aminoácido derivado do ácido aspártico pode ser pelo menos um selecionado do grupo que consiste em L-lisina, L-treonina e L-isoleucina como um exemplo mais detalhado, mas não limitado a isso.

[0036] Na presente revelação, o “micro-organismo que produz um L-aminoácido” pode ser um micro-organismo com capacidade de produzir e acumular um L-aminoácido a partir de fontes de carbono em um meio. O tipo de micro-organismo que produz um L-aminoácido não é particularmente limitado, mas pode ser micro-organismo pertencente ao gênero Enterobacter, ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Pseudomonas, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium, e o gênero Brevibacterium. Mais especificamente, o micro-organismo pode ser um micro-organismo pertencente ao gênero Corynebacterium. O “gênero Corynebacterium” na presente revelação pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens e similares, mas não é necessariamente limitado a isso. Mais especificamente, o micro-organismo que produz o L-aminoácido pode ser Corynebacterium glutamicum, mas não está limitado a isso.

[0037] O micro-organismo do gênero Corynebacterium com atividade aprimorada de α-glucosidase pode produzir um L-aminoácido com maior rendimento de produção de L- aminoácido do que um micro-organismo antes que a atividade da proteína seja aprimorada, ou seja, um micro-organismo não modificado.

[0038] Outro aspecto da presente revelação é um método para a produção de um L-aminoácido, que compreende a cultura de um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um L-aminoácido com atividade aprimorada da α- glucosidase.

[0039] O método para produzir um L-aminoácido pode ainda incluir a coleta de um L-aminoácido a partir do meio ou micro-organismo cultivado.

[0040] O micro-organismo com atividade aprimorada de α-glucosidase e L-aminoácido é como descrito acima.

[0041] Na presente revelação, o termo “cultura” significa cultivar o micro-organismo sob uma condição de ambiente adequadamente regulada. O processo de cultura da presente revelação pode ser realizado sob condições adequadas de meio e cultura que são conhecidas na técnica.

O processo de cultura pode ser facilmente ajustado e usado pelos versados na técnica de acordo com uma cepa selecionada.

Especificamente, a cultura pode ser descontínua, contínua e descontínua, mas não está limitada a isso.

[0042] Uma fonte de carbono incluída no meio pode incluir açúcares e carboidratos, como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de mamona e óleo de coco; ácidos gordos como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; álcoois como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos como ácido acético. Estes materiais podem ser usados individualmente ou como uma mistura, mas não estão limitados a eles. Uma fonte de nitrogênio incluída no meio pode incluir fontes de nitrogênio orgânico, como peptona, extrato de levedura, molho, extrato de malte, sedimento de milho e soja; e fontes de nitrogênio inorgânico, como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio, e essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em combinação. No entanto, as fontes não estão limitadas a isso. Uma fonte de fósforo incluída no meio pode incluir di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico e sais contendo sódio correspondentes, mas não está limitada a isso. Além disso, no meio, sais metálicos como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro podem ser incluídos e aminoácidos, vitaminas e precursores adequados podem ser incluídos. Esses meios ou precursores podem ser adicionados à cultura em uma forma descontínua ou contínua, mas não estão limitados a isso.

[0043] Durante a cultura, um composto como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico é adicionado à cultura por um método adequado para ajustar o pH da cultura. Além disso, durante a cultura, a produção de espuma pode ser inibida com o uso de um agente antiespumante, como um éster policlínico de ácido graxo.

Além disso, oxigênio ou gases que contêm oxigênio podem ser injetados na cultura para manter um estado aeróbico da cultura, e os gases não podem ser injetados, ou nitrogênio, hidrogênio ou gás carbônico podem ser injetados para manter estados anaeróbicos e microaeróbicos. A temperatura da cultura pode ser geralmente de 25 °C e 40 °C e particularmente de 27 °C a 35 °C. O período de cultura pode durar até que seja obtida uma saída desejada de materiais úteis e pode ser particularmente de 10 a 100 horas. No entanto, a presente revelação não está limitada a isso.

[0044] De acordo com a presente revelação, é possível coletar e/ou purificar adicionalmente um L-aminoácido produzido na etapa de cultura e coletar um L-aminoácido desejado do meio com o uso de um método adequado conhecido na técnica de acordo com um método de cultura, por exemplo, um método de cultura descontínua, contínua ou descontínua, mas a presente revelação não está limitada a isso. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização e HPLC podem ser usados, e é possível coletar um L-aminoácido desejado de um meio ou micro- organismo cultivado com o uso de um método adequado conhecido na técnica.

[0045] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para aumentar a produção de um L- aminoácido, incluindo aprimorar a atividade da α-glucosidase em um micro-organismo.

[0046] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um uso de α-glucosidase para aumentar a produção de um L-aminoácido.

[0047] O “aumento da produção de um L-aminoácido” pode significar que a produtividade do L-aminoácido é aumentada para produzir um L-aminoácido com um rendimento de produção de L-aminoácido mais alto do que um micro-organismo antes que a atividade da proteína seja aprimorada, ou seja, um micro-organismo não modificado.

MODO PARA A INVENÇÃO

[0048] A seguir, a presente revelação será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses exemplos são apenas ilustrativos da presente revelação e o escopo da presente revelação não se limita a esses exemplos.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DO VETOR PARA A INTRODUÇÃO DO GENE DA α-GLUCOSIDASE

[0049] Para confirmar um efeito do gene aglA da α- glucosidase, por exemplo, foi preparado um vetor para inserir o gene aglA derivado de Bifidobacterium adolescentis (SEQ ID NO: 2) em um cromossomo de uma cepa de Corynebacterium glutamicum. A fim de amplificar um promotor PgapA derivado de Corynebacterium glutamicum, um promotor (SEQ ID NO: 3) projetado para inserir um sítio de enzima de restrição EcoRI em um terminal 5’ do promotor PgapA e um primer (SEQ ID NO: 4) projetado para inserir um sítio de enzima de restrição NdeI em um terminal 3’ foram sintetizados. Como resultado, foram obtidos fragmentos de DNA do promotor PgapA, incluindo o sítio de enzima de restrição EcoRI no terminal 5’ e o sítio de enzima de restrição NdeI no terminal 3’. Em uma condição de PCR, após desnaturação a 94 °C por 5 minutos, desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 56 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 30 segundos foram repetidas 30 vezes e, em seguida, polimerização foi realizado a 72 °C por 7 minutos.

INICIADOR PARA AMPLIFICAÇÃO DO PROMOTOR PgapA Foward: 5’-TCA GAATTC TTGGGATTACCATTGAAGCC-3’ (SEQ ID NO: 3) Backward: 5’-TCA CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGT-3’ (SEQ ID NO: 4)

[0050] A fim de amplificar a ORF do gene aglA derivado de Bifidobacterium adolescentis com base em uma sequência de bases relatada, primers (SEQ ID NO: 5 a 8) projetados para inserir um sítio de enzima de restrição NdeI e um peptídeo sinal para secreção de proteína na posição do códon de iniciação e um primer (SEQ ID NO: 9) projetado para que um sítio de enzima de restrição SpeI seja incluído no fundo de um códon de terminação foi sintetizado.

[0051] O peptídeo sinal é uma proteína que ajuda, por exemplo, uma enzima AglA a ser liberada fora das células, e quatro tipos (SEQ ID NO: 14 a 17) foram selecionados e testados. As sequências de primers e sequências de aminoácidos do peptídeo sinal são as seguintes (Tabela 1).

[TABELA 1] 5’- TCACATATGcaaataaaccgccgaggcttcttaaa Incluindo agccaccgcaggacttgccactatcggcgctgcca SP1 gcatgtttatgccaaaggccaacgcccttggagca Forward ACGAATTTCAATCGTTCCA-3’ (SEQ ID NO: 5) 5’-

TCACATATGCATTCAAAGGAAGAGTTAACAGTGCG Incluindo

TAAAGGAATTTCCCGCGTCCTCTCGGTAGCGGTTG SP2

CTAGTTCAATCGGATTCGGAACTGTACTGACAGGC Primer para Forward

ACCGGCATCGCAGCAGCTCAAGACACGAATTTCAA amplificar TCGTTCCA-3’ (SEQ ID NO: 6) aglA ORF 5’- Incluindo TCACATATGCGTAAGTTCCGCAATACTGCAATCGC SP3 ACTGGTTTCAGCTGCTGCTATCTCCCTCGGTGGAG Forward TTACTGCTGCAACCGCTCAGGAAGCTACGAATTTC AATCGTTCCA-3’ (SEQ ID NO: 7) 5’- Incluindo TCACATATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGC SP4 ATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGT Forward ACGCTACGAATTTCAATCGTTCCA-3’ (SEQ ID NO: 8)

5’-TCAACTAGTTCAGAGCTGAATCACGACTC-3’ Backward (SEQ ID NO: 9) 5’- Incluindo TCACATATGCGTAAGTTCCGCAATACTGCAATCGC Primer para SP3 ACTGGTTTCAGCTGCTGCTATCTCCCTCGGTGGAG amplificar Forward TTACTGCTGCAACCGCTCAGGAAGCTTCAGGCATC malL ORF AAACTTTCTTC-3’ (SEQ ID NO: 10) 5’-TCAACTAGTTCAATTTAGCCTATAGATAC-3’ Backward (SEQ ID NO: 11) 5’- Incluindo TCACATATGCGTAAGTTCCGCAATACTGCAATCGC Primer para SP3 ACTGGTTTCAGCTGCTGCTATCTCCCTCGGTGGAG amplificar Forward TTACTGCTGCAACCGCTCAGGAAGCTACTATTTCT Ima1 ORF TCTGCACATCC-3’ (SEQ ID NO: 12) 5’-TCAACTAGTTCATTCGCTGATATATATTCTT- Backward 3’ (SEQ ID NO: 13)

MQINRRGFLKATAGLATIGAASMFMPKANALGA SP1 CgR0949 (SEQ ID NO: 14) Peptídeo MHSKEELTVRKGISRVLSVAVASSIGFGTVLTGTG SP2 NCgl2101 Sinal IAAAQD (SEQ ID NO: 15) S MRKFRNTAIALVSAAAISLGGVTAATAQEA (SEQ CgR1834 P3 ID NO: 16)

S MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA (SEQ ID NO: ST2 P4 17)

[0052] Um fragmento aglA ORF incluindo um sítio de enzima de restrição NdeI e cada peptídeo sinal no terminal 5’ e um sítio de enzima de restrição SpeI no terminal 3’ foram obtidos usando DNA genômico de Bifidobacterium adolescentis como modelo. Em uma condição de PCR, após desnaturação a 94 °C por 5 minutos, desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 56 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 2 minutos foram repetidas 30 vezes e, em seguida, polimerização foi realizada a 72 °C por 7 minutos.

[0053] Após os quatro produtos de amplificação por PCR terem sido tratados com enzimas de restrição incluídas em ambas as extremidades, um vetor pDZ (registro de patente nº KR 10-0924065) foi tratado com as enzimas de restrição EcoRI e SalI para serem ligadas ao fragmento de DNA obtido para preparar vetores pDZ-PgapA -SP1-aglA (B. al), pDZ- PgapA-SP2-aglA (B. al), pDZ-PgapA-SP3-aglA (B. al) e pDZ- PgapA-SP4-aglA (B. al).

[0054] Além disso, a fim de preparar outro micro- organismo com atividade aprimorada da α-glucosidase, os seguintes genes de α-glucosidase derivados da cepa foram protegidos. Particularmente, fragmentos de ORF malL e Ima1, incluindo um sítio de enzima de restrição NdeI e cada peptídeo sinal no terminal 5’ e um sítio de enzima de restrição SpeI no terminal 3’, foram obtidos usando o genoma EAMY_1858 (malL) do genoma Erwinia amylovora CFBP1430 e IMA1 DNA de Saccharomyces cerevisiae como modelos. Em uma condição de PCR, após desnaturação a 94 °C por 5 minutos, desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 56 °C por 30 segundos e polimerização a 72 °C por 2 minutos foram repetidas 30 vezes e, em seguida, polimerização foi realizado a 72 °C por 7 minutos.

[0055] Após os dois produtos de amplificação por PCR terem sido tratados com as enzimas de restrição incluídas em ambas as extremidades, um vetor pDZ (registro de patente nº KR 10-0924065) foi tratado com as enzimas de restrição EcoRI e SalI para ser ligado aos fragmentos de DNA obtidos para preparar pDZ-PgapA Vetores -SP3-malL (E. am) e pDZ-PgapA- SP3-Ima1 (S. ce).

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS QUE INTRODUZEM α-GLUCOSIDASE

[0056] A fim de introduzir um gene que codifica α- glucosidase em uma cepa de Corynebacterium glutamicum, 6 vetores preparados no Exemplo 1 foram transformados em uma cepa produtora de lisina de Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (o micro-organismo foi publicado como KFCC10881 e depois depositado novamente na Autoridade Depositária Internacional). nos termos do Tratado de Budapeste, para receber o número de depósito KCCM11016P, no Registro de Patente nº KR 10-0159812) por um método de pulso elétrico (Van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 541 a 545, 1999) e colônias nas quais cada gene foi introduzido por recombinação cromossômica homóloga foram rastreadas.

Para rastrear as colônias por um método de PCR, primers de SEQ ID NO: 18 e 19 foram usados.

PRIMER PARA IDENTIFICAR TRANSFERÊNCIA DE GENES aglA Foward: 5’-GACCATTTATTCGCAACTGTG-3’ (SEQ ID NO: 18) Backward: 5’-TCTGCAAGGCGTTCGGAATT-3’ (SEQ ID NO. 19)

[0057] As cepas transformadas foram denominadas KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA-SP2- aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA-SP3-aglA (B. al) KCCM11016P::PgapA -SP4-aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA-SP3- malL (E. am) e KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1 (S. ce).

EXEMPLO 3: CONFIRMAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA DE MICRO- ORGANISMOS PRODUTORES DE LISINA QUE INTRODUZEM α-GLUCOSIDASE

[0058] Usou-se como grupo de controle uma cepa parental Corynebacterium glutamicum KCCM11016P e 6 tipos de KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA-SP2- aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA- SP3-aglA (B. al) KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA-SP3- malL (E. am) e KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1 (S. ce) preparados no Exemplo 2 foram cultivados por um método ilustrado no Exemplo 4 a seguir e depois centrifugados em alta velocidade para obter um sobrenadante. A expressão de uma enzima α- glucosidase em um meio de cultura foi medida por um método SDS-PAGE com o uso de uma parte do sobrenadante obtido. Como resultado, uma proteína expressa na posição de 70 kDa foi confirmada (Figura 1).

EXEMPLO 4: AVALIAÇÃO DA PRODUTIVIDADE DE L-AMINOÁCIDOS DE MICRO-ORGANISMOS PRODUTORES DE LISINA QUE INTRODUZEM α-

GLUCOSIDASE

[0059] Usou-se como grupo de controle uma cepa parental Corynebacterium glutamicum KCCM11016P e 6 tipos de KCCM11016P::PgapA-SP1-aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA-SP2- aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA- SP3-aglA (B. al) KCCM11016P::PgapA-SP4-aglA (B. al), KCCM11016P::PgapA-SP3- malL (E. am) e KCCM11016P::PgapA-SP3-Ima1 (S. ce) preparadas no Exemplo 2 foram cultivadas por meio do método a seguir por um tempo predeterminado, e então uma concentração de lisina foi medida. Os resultados foram ilustrados na Tabela

2. Primeiro, cada cepa foi inoculada em um balão de defletor de canto de 250 ml contendo um meio de semente de 25 ml e cultivada com agitação a 30 °C por 20 horas a 200 rpm.

Posteriormente, inoculou-se 1 ml de uma solução de cultura de sementes em um balão de defletor de canto de 250 ml contendo 24 ml de um meio de produção e cultivou-se a cultura a 32 °C por 72 horas a 200 rpm. As composições do meio de semente e do meio de produção foram as seguintes. Após o término da cultura, uma concentração de L-lisina foi medida por HPLC (Waters 2478).

< MEIO DE SEMENTE (PH 7,0)>

[0060] 20 g de glicose, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 100 µg de biotina, 1.000 µg de HCl de tiamina, 2.000 µg de pantotenato de cálcio e 2.000 µg de nicotina (com base em 1 l de água destilada) < MEIO DE PRODUÇÃO (PH 7,0)>

[0061] 100 g de glicose, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de milho sólidos íngremes, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4 7H2O, 100 µg de biotina,

1.000 µg de HCl de tiamina, 2.000 µg de pantotenato de cálcio, 3.000 µg de nicotinamida e 30 g de CaCO3 (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 2] Concentração Concentração Cepa N° de lisina média de (g/l) lisina (g/l) 1 36,6 KCCM11016P 36,8 2 36,4

3 37,5

1 40,0 KCCM11016P::PgapA-SP1- 2 38,5 39,1 aglA (B. al) 3 38,9

1 39,0 KCCM11016P::PgapA-SP2- 2 38,4 38,7 aglA (B. al) 3 38,7

1 39,8 KCCM11016P::PgapA-SP3- 2 41,9 40,4 aglA (B. al) 3 39,5

1 39,3 KCCM11016P::PgapA-SP4- 2 38,5 38,8 aglA (B. al) 3 38,6

1 38,1 KCCM11016P::PgapA-SP3- 2 38,5 38,4 malL (E. am) 3 38,6

1 37,9 KCCM11016P::PgapA-SP3- 2 38,1 38,0 ima1 (S. ce) 3 38,1

[0062] A partir dos resultados, foi possível observar que, nos seis tipos de cepas produtoras de lisina, com a introdução da capacidade de expressão da α-glucosidase, a produtividade da lisina foi aumentada em comparação com um grupo de controle. Em particular, em KCCM11016P::PgapA-SP3- aglA (B. al), foi mostrado o maior aumento de produtividade.

Na cultura do micro-organismo, é um resultado muito significativo que a produtividade da lisina tenha aumentado em pelo menos 3,2% e até 9,7% devido à regulação da atividade de outros genes além das vias de biossíntese. Além disso, os efeitos do aprimoramento da produtividade de L-aminoácidos, aumentando a atividade da α-glucosidase na presente revelação, foram verificados confirmando que a produtividade de L-aminoácidos foi aumentada sem a adição de isomaltose e maltose no meio, que se espera que sejam usadas como substrato pela α-glucosidase. A partir dos resultados, no caso de usar peptídeos de sinal apropriados por seleção dos versados na técnica, espera-se que seja mostrada uma taxa de aumento mais alta.

[0063] O KCCM11016P::PgapA-SP2-aglA (B. al) foi chamado Corynebacterium glutamicum CA01-7523 e depositado no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM) como uma Autoridade Depositária Internacional sob o Tratado de Budapeste em 5 de março de 2018, para receber o número de acesso KCCM12228P.

EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DA CEPA CJ3P INTRODUZIDA COM α-

GLUCOSIDASE E ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DE LISINA

[0064] A fim de confirmar se o mesmo efeito seria mostrado mesmo em outra cepa de Corynebacterium glutamicum que produz L-lisina, PgapA-SP3-aglA (B. al) foi introduzida em um cepa CJ3P de Corynebacterium glutamicum (Binder et al.

Genome Biology 2012, 13:R40) com produtividade de L-lisina da mesma maneira que no Exemplo 2, introduzindo 3 tipos de variantes [pyc (P458S), hom (V59A), lysC (T311I)] a um cepa de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 para preparar uma cepa introduzido com α-glicosidase. A cepa preparada foi denominada CJ3P::PgapA-SP3-aglA (B. al). A cepa CJ3P como um grupo de controle e a CJ3P::PgapA-SP3-aglA (B. al) foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 4, e a produtividade de lisina foi analisada e ilustrada na Tabela 3 abaixo.

[TABELA 3]

ANÁLISE DE PRODUTIVIDADE DE LISINA Concentração Concentração de Cepa N° média de lisina lisina (g/l) (g/l) 1 8,0 CJ3P 8,0 2 7,6

3 8,4 1 8,6 CJ3P::PgapA- SP3-aglA 2 8,3, 8,7 (B,al) 3 9,1

[0065] A partir do resultado da análise da concentração de lisina, foi confirmado que o rendimento de lisina foi aumentado na cepa introduzida com α-glucosidase.

Além disso, na cultura de micro-organismos, é um resultado muito significativo que a produtividade da lisina tenha aumentado em 8,8% devido à regulação da atividade de outros genes além das vias de biossíntese. Além disso, no caso de usar peptídeos de sinal apropriados por seleção dos versados na técnica, espera-se que uma taxa de aumento mais alta seja mostrada.

EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DA CEPA PRODUTORA DE TREONINA INTRODUZIDA COM α-GLUCOSIDASE E ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DA

TREONINA

[0066] Para confirmar claramente uma alteração na produtividade da L-treonina através da introdução de α- glucosidase, uma variante foi introduzida em um gene que codifica a homoserina desidrogenase produtora de homoserina, que é um intermediário comum das vias de biossíntese da L- treonina e L-isoleucina, e aprimorado. Especificamente, uma variante hom (G378E) conhecida (R. Winkels, S. et al., Appl.

Microbiol. Biotechnol. 45, 612 a 620, 1996) foi introduzida na cepa CJ3P::PgapA-SP3-aglA (B. al) usada no Exemplo 5 para preparar uma cepa. Além disso, foi preparada uma cepa na qual a variante hom (G378E) foi introduzida no controle CJ3P.

Um vetor recombinante para introdução de variantes foi preparado por meio do método a seguir.

[0067] Para preparar um vetor introduzido com hom (G378E), primeiro sintetizaram-se os primers (SEQ ID NO: 20 e 21), nos quais um sítio de reconhecimento da enzima de restrição XbaI foi inserido em um fragmento 5’ e um fragmento 3’ em posições sobre 600 pb a montante e a jusante das posições 1131 a 1134 do gene hom usando DNA genômico extraído de uma cepa de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como modelo. Além disso, foram sintetizados primers (SEQ ID NO: 22 e 23) para substituir uma sequência de bases do gene hom. Um plasmídeo pDZ-hom (G378E) foi preparado para que fragmentos de DNA (600 pb cada) localizados nas extremidades 5’ e 3’ do gene hom fossem ligados ao vetor pDZ (Registro de Patente nº KR 10-0924065).

PRIMER PARA INSERIR SÍTIO DE RECONHECIMENTO Xbal Fragmento 5’ : 5’- TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC -3’ (SEQ ID NO: 20) Fragmento 3’ : 5’- GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA -3’ (SEQ ID NO: 21)

PRIMER PARA SUBSTITUIR GENE hom 5’- GCCAAAACCTCCACGCGATC -3’ (SEQ ID NO: 22) 5’- ATCGCGTGGAGGTTTTGGCT -3’ (SEQ ID NO: 23)

[0068] Um fragmento de gene terminal 5’ foi preparado através de PCR com o uso de primers (SEQ ID NO: 20 e 22) com o uso de um cromossomo de uma cepa de tipo selvagem como modelo. Em uma condição de PCR, após desnaturação a 94 °C por 2 minutos, desnaturação a 94 °C por 1 minuto, recozimento a 56 °C por 1 minuto e polimerização a 72 °C por 40 segundos foram repetidas 30 vezes e, em seguida, polimerização foi realizado a 72 °C por 10 minutos. Do mesmo modo, um fragmento de gene no terminal 3’ do gene hom foi preparado através de PCR com o uso de primers (SEQ ID NO: 21 e 23). Os fragmentos de DNA amplificado foram purificados com o uso de um kit de purificação por PCR da Quiagen Corporation e depois usados como fragmentos de DNA de inserção para a preparação de um vetor. Enquanto isso, um vetor pDZ tratado com uma enzima de restrição XbaI e aquecido a 65 °C por 20 minutos e o fragmento de DNA de inserção amplificado por PCR foram ligados entre si com o uso de um Kit de Clonagem de Infusão e depois transformados em E. coli DH5α e esfregados em um meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l). Colônias transformadas por um vector inserido com um gene alvo através de PCR com o uso de primers de SEQ ID NO: 20 e 21 foram rastreados e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo comumente conhecido para preparar um vetor pDZ- hom (G378E) para a introdução de um mutante de substituição de base do hom (G378E) em um cromossomo.

[0069] Posteriormente, o vetor pDZ-hom (G378E) preparado foi introduzido nas cepas CJ3P e CJ3P::PgapA-SP3- aglA (B. al) da mesma maneira que no Exemplo 2 para obter CJ3P::hom (G378E) e CJ3P::Linhagens de PgapA-SP3-aglA (B.

al)-hom (G378E). As duas cepas obtidas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 4, e a concentração de produção de treonina foi analisada e ilustrada na Tabela 4 abaixo.

[TABELA 4]

CONCENTRAÇÃO DE PRODUÇÃO DE TREONINA Concentração Concentração de Cepa N°. média de Thr Thr (g/l) (g/l) 1 1,1 CJ3P::hom 2 1,5 1,23 (G378E) 3 1,1 1 1,4 CJ3P::PgapA-SP3- aglA (B. al) - 2 1,8 1,60 hom (G378E) 3 1,6

[0070] A partir do resultado da análise da concentração de treonina, foi confirmado que a concentração de treonina estava aumentada na cepa introduzida com α- glucosidase. Na cultura de micro-organismos, é um resultado muito significativo que a produtividade da treonina tenha aumentado em 30% devido à regulação da atividade de outros genes além das vias de biossíntese. Além disso, no caso de usar peptídeos de sinal apropriados por seleção dos versados na técnica, espera-se que uma taxa de aumento mais alta seja mostrada.

EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO DA CEPA PRODUTORA DE ISOLEUCINA INTRODUZIDA COM α-GLUCOSIDASE E ANÁLISE DA PRODUTIVIDADE DA

ISOLEUCINA

[0071] A fim de confirmar um efeito na produtividade da L-isoleucina através da introdução da α-glucosidase, uma variante foi introduzida em um gene que codifica a L-treonina desidratase conhecida e aprimorada. Especificamente, uma variante conhecida de ilvA (V323A) (S. Morbach et al., Appl.

Enviro. Microbiol., 62 (12): 4345–4351, 1996) foi introduzida na cepa CJ3P::PgapA-SP3-aglA (B. al)-hom (G378E) usada no Exemplo 6 para preparar uma cepa. Além disso, foi preparada uma cepa na qual a variante ilvA (V323A) foi introduzida em um controle CJ3P::hom (G378E). Um vetor recombinante para introdução de variantes foi preparado por meio do método a seguir.

[0072] Para preparar um vetor introduzido com ilvA

(V323A), primeiro sintetizaram-se os primers (SEQ ID NO: 24 e 25) nos quais um sítio de reconhecimento XbaI da enzima de restrição foi inserido em um fragmento 5’ e um fragmento 3’ em posições sobre 600 pb a montante e a jusante das posições 966 a 969 do gene hom usando DNA genômico extraído de uma cepa de tipo selvagem de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 como modelo. Além disso, foram sintetizados primers (SEQ ID NO: 26 e 27) para substituir uma sequência de bases do gene ilvA. Um plasmídeo pDZ-ilvA (V323A) foi preparado para que fragmentos de DNA (600 pb cada) localizados nas extremidades 5’ e 3’ do gene ilvA fossem ligados ao vetor pDZ (Registro de Patente nº KR 10-0924065).

PRIMER PARA INSERIR SÍTIO DE RECONHECIMENTO XbaI Fragmento 5’ : 5’- ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG -3’ (SEQ ID NO: 24) Fragmento 3’ : 5’- ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC -3’ (SEQ ID NO: 25) PRIMER PARA SUBSTITUIR GENE ilvA 5’- ACACCACGGCAGAACCAGGTGCAAAGGACA -3’ (SEQ ID NO: 26) 5’- CTGGTTCTGCCGTGGTGTGCATCATCTCTG -3’ (SEQ ID NO: 27)

[0073] Um fragmento de gene terminal 5’ foi preparado através de PCR com o uso de primers (SEQ ID NO: 24 e 26) com o uso de um cromossomo de uma cepa de tipo selvagem como modelo. Em uma condição de PCR, após desnaturação a 94 °C por 2 minutos, desnaturação a 94 °C por 1 minuto, recozimento a 56 °C por 1 minuto e polimerização a 72 °C por 40 segundos foram repetidas 30 vezes e, em seguida, polimerização foi realizado a 72 °C por 10 minutos. Do mesmo modo, um fragmento de gene no terminal 3’ do gene ilvA foi preparado através de PCR com o uso de primers (SEQ ID NO: 25 e 27). Os fragmentos de DNA amplificado foram purificados com o uso de um kit de purificação por PCR da Quiagen Corporation e depois usados como fragmentos de DNA de inserção para a preparação de um vetor. Enquanto isso, um vetor pDZ tratado com uma enzima de restrição XbaI e aquecido a 65 °C por 20 minutos e o fragmento de DNA de inserção amplificado por PCR foram ligados entre si com o uso de um Kit de Clonagem de Infusão e depois transformados em E. coli DH5α e esfregados em um Meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l). Colônias transformadas por um vector inserido com um gene alvo através de PCR com o uso de primers de SEQ ID NO: 24 e 25 foram rastreados e, em seguida, um plasmídeo foi obtido por um método de extração de plasmídeo comumente conhecido para preparar um vetor pDZ- ilvA (V323A) para a introdução de um mutante de substituição de base de ilvA (V323A) em um cromossomo.

[0074] Posteriormente, o vetor pDZ-ilvA (V323A) preparado foi introduzido nas linhagens CJ3P::hom (G378E) e CJ3P::PgapA-SP3-aglA (B. al) -hom (G378E) da mesma maneira que no Exemplo 2 a obter cepas CJ3P::hom (G378E) -ilvA (V323A) e CJ3P::PgapA-SP3-aglA (B. al) -hom (G378E) -ilvA

(V323A). As duas cepas obtidas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 4, e a concentração de produção de isoleucina foi analisada e ilustrada na Tabela 5 abaixo.

[TABELA 5]

CONCENTRAÇÃO DE PRODUÇÃO DE ISOLEUCINA Concentração Concentração Cepa N° média de Ile de Ile (g/l) (g/l) 1 0,12 CJ3P::hom (G378E) -ilvA 2 0,10 0,10 (V323A) 3 0,09 1 0,15 CJ3P::PgapA-SP3-aglA (B. al) 2 0,11 0,13 -hom (G378E) -ilvA (V323A) 3 0,13

[0075] Como mostrado nos resultados da Tabela 5, foi confirmado que a concentração de isoleucina estava aumentada na cepa introduzida com α-glucosidase. Na cultura de micro- organismos, é um resultado muito significativo que a produtividade da isoleucina tenha aumentado em 30% devido à regulação da atividade de outros genes além das vias de biossíntese. Além disso, no caso de usar peptídeos de sinal apropriados por seleção dos versados na técnica, espera-se que uma taxa de aumento mais alta seja mostrada.

[0076] Será apreciado pelos versados na técnica que a presente revelação, como descrita acima, pode ser implantada de outras formas específicas sem se afastar do espírito técnico ou das características essenciais. Assim, deve ser apreciado que as modalidades descritas acima se destinam a ser ilustrativas em todos os sentidos, e não restritivas. O escopo da presente revelação é representado pelas reivindicações a serem descritas abaixo, e não pela descrição detalhada, e deve ser interpretado que o significado e o escopo das reivindicações e todas as alterações ou formas modificadas derivadas dos seus equivalentes estão dentro do escopo da presente revelação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Micro-organismo do gênero Corynebacterium caracterizado pelo fato de que produz um L-aminoácido com atividade aprimorada da α-glucosidase.

2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a α-glucosidase é derivada de Bifidobacterium adolescentis, Erwinia amylovora ou Saccharomyces cerevisiae.

3. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a α-glucosidase é codificada pelo gene aglA.

4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a α-glucosidase inclui uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29.

5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em L-lisina, L-treonina e L-isoleucina.

6. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.

7. Método para produzir um L-aminoácido caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um L-aminoácido com atividade aprimorada de α-glucosidase em um meio.

8. Método para produzir um L-aminoácido, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de compreender ainda: coletar o L-aminoácido do meio ou micro-organismo cultivado.

9. Método para a produção de um L-aminoácido, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a α- glucosidase é derivada de Bifidobacterium adolescentis, Erwinia amylovora ou Saccharomyces cerevisiae.

10. Método para a produção de um L-aminoácido, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a α- glucosidase é codificada pelo gene aglA.

11. Método para produzir um L-aminoácido, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a α- glicosidase é uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 29.

12. Método para produzir um L-aminoácido, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o L- aminoácido é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em L-lisina, L-treonina e L-isoleucina.

13. Método para aumentar a produção de um L-aminoácido caracterizado pelo fato de que compreende aprimorar a expressão de α-glucosidase em um micro-organismo.

14. Uso de α-glucosidase caracterizado pelo fato de que é para aumentar a produção de um L-aminoácido.