TW202129007A - 使用包含nadp依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的微生物生產左旋胺基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明是有關於具有增加之左旋胺基酸生產力、包含衍生自乳酸桿菌屬之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的棒狀桿菌屬的微生物。根據本發明，衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶被導入以通過NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的活性而增加還原力，藉此增加屬於棒狀桿菌屬的菌株之左旋胺基酸生產力。

Description

使用包含NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的微生物生產左旋胺基酸的方法
本發明是有關於具有增加之左旋胺基酸生產力（L-amino acids producing ability）、包含NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）之棒狀桿菌屬（genusCorynebacterium ）的微生物，以及使用其生產左旋胺基酸的方法。
棒狀桿菌屬的微生物為革蘭氏陽性微生物，其經常被用於具有各種應用之物質的工業生產，諸如包括左旋胺基酸及各種核酸之飼料、藥品及食品。近年來，已自棒狀桿菌屬的微生物生產二胺及酮酸。
為了經由微生物發酵生產有用的產物，對於能源或還原力（reducing power）的需求已增加，伴隨著強化目標產物在微生物中之生物合成途徑的需求。其中，NADPH（還原態菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）為提供還原力之一必要元素。氧化態之NADP+ 及還原態之NADPH為活體內電子傳輸材料且涉及於各種合成方法中。在中央代謝途徑中，已知NADPH主要藉由1)氧化戊醣磷酸途徑及2) TCA途徑之NADP依賴型異檸檬酸脫氫酶（Icd 基因）而生產。另外，各種微生物具有蘋果酸酶、葡萄糖脫氫酶及非磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為供應NADPH的各種替代途徑。
再者，不論中央代謝途徑，產生NADPH之酵素包括轉氫酶，鐵氧化還原蛋白:NADP+ 氧化還原酶等（Spaanset al ., 2015, NADPH-generating systems in bacteria and archaea,Front. Microbiol . 6:742）。
［欲解決的技術問題］
本發明的發明人已盡最大努力增加生產胺基酸之微生物（amino acid–producing microorganisms）中各胺基酸的生產，結果，經由導入NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的各種研究，他們證實胺基酸及其前驅物在棒狀桿菌屬之微生物中的生產被增加，藉此完成本發明。［解決問題的技術手段］
本發明的一個目的是提供用於生產左旋胺基酸的方法，包含：於一培養基中培養含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的棒狀桿菌屬之一微生物；以及自經培養之該微生物或經培養之該培養基回收一左旋胺基酸。
本發明的另一目的是提供具有經增加之左旋胺基酸生產力的棒狀桿菌屬之微生物，其含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
本發明的再一目的是提供使用棒狀桿菌屬之微生物生產左旋胺基酸的用途，該微生物含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。［有益的技術功效］
根據本發明，編碼衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ）之gapN的基因被導入以通過gapN的活性增加還原力，藉此增加棒狀桿菌屬之微生物之左旋胺基酸生產力。
［發明的詳細說明］
下將針對本發明進行詳細說明。同時，揭露於此的各敘述及實施例亦可被應用於其他的敘述及實施例。亦即，於此揭露的各種元件的所有組合皆落入本發明的範圍內。再者，本發明的範圍不應被以下的具體敘述所限制。
為了達到上述目的，本發明的一個態樣為提供用於生產左旋胺基酸的方法，包含：於一培養基中培養含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的棒狀桿菌屬之一微生物；以及自經培養之該微生物或經培養之該培養基回收一左旋胺基酸。
在本發明中，該用語「NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶」是指具有使用NADP作為輔酶將作為基質的甘油醛-3-磷酸酯轉化成3-磷酸甘油酯（3-phosphoglycerate）之活性的多肽。NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的實例可包括衍生自動物、植物及細菌的NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。具體而言，該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶可衍生自細菌，且更具體而言，衍生自乳酸桿菌種（Lactobacillus sp.），以及衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種。該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶可為，例如，包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽。該包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽可與具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽或是由SEQ ID NO:1之胺基酸序列所組成之多肽互換使用。
在本發明中，SEQ ID NO:1是指具有NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的一胺基酸序列。具體而言，SEQ ID NO:1可為具有由該gapN基因編碼之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的多肽序列。為了達到本發明的目的，該多肽可衍生自乳酸桿菌種，且具體而言衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種，但不限於此，且可不受限地包括任何序列，只要其具有與該胺基酸相同之活性。SEQ ID NO:1之該胺基酸序列可自NIH GenBank，一已知資料庫獲得。另外，雖然具有NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的多肽於本發明中是界定為具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽，其不排除可能藉由SEQ ID NO:1之胺基酸序列之上游或下游的無意義序列添加而發生，或是自然發生的突變，或是其緘默突變（silent mutation）。對所屬技術領域具有通常知識者顯見的是，任何具有與包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之該多肽相同或對應活性的多肽可能落於本發明之具有NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的多肽的範圍內。在一個具體實例中，本發明之具有NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的多肽可以為具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽，或以具有對於SEQ ID NO:1之胺基酸序列有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高之同源性（homology）或相等性（identity）的胺基酸序列所組成的多肽。再者，顯見的是任何具有其中一部份被刪除、修飾、取代或添加的胺基酸序列的多肽亦可落於本發明之用於修飾之目標多肽的範圍內，只要其包括具有如上所述之同源性或相等性的胺基酸序列，且展現對應於上述多肽所展現者之效果。
亦即，在本發明中，雖然是敘述為「以特定SEQ ID NO之胺基酸序列所構成的蛋白質或多肽」，顯見的是任何具有該胺基酸序列之部分的刪除、修飾、取代或添加的多肽亦可被用於本發明中，只要該多肽具有相對於由該對應SEQ ID NO.之胺基酸序列所構成之多肽之相等或對應的活性。例如，顯見的是，只要該多肽具有相同或對應的活性，「以SEQ ID NO:1之胺基酸序列所構成之多肽」可落於「以SEQ NO:1之胺基酸序列所構成之多肽」的範圍內。
在本發明中，編碼該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因為該gapN基因，且該基因可衍生自細菌，且更具體而言，衍生自乳酸桿菌屬的微生物，但只要其為能夠展現該gapN基因的乳酸桿菌屬的微生物，該微生物並不被特別限制。具體而言，該乳酸桿菌屬的微生物可為戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種。該基因可為編碼SEQ ID NO:1的胺基酸序列之核苷酸序列，且更具體而言，可為包括SEQ ID NO:2之核苷酸序列的序列，但不限於此。包括SEQ ID NO:2之核苷酸序列的該多核苷酸可與具有SEQ ID NO:2之核苷酸序列的多核苷酸，以及由SEQ ID NO:2之核苷酸序列所構成的多核苷酸互換使用。
此處所使用的用語「多核苷酸」是指由在一長鏈中藉由共價鍵連接的核苷酸單體所構成的核苷酸之聚合物，表示具有至少一特定長度之DNA或RNA股，且更具體而言，表示編碼該經修飾之多肽的一多核苷酸片段。
具體而言，基於密碼子簡併性，或考量於多肽將被展現之有機物中所偏好的密碼子，本發明之該多核苷酸可在編碼區中於不改變該多肽之該胺基酸序列之範圍内進行各種修飾。具體而言，任何編碼包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之多核苷酸序列可被包括而不受限。
另外，可以自已知的基因序列，例如，可在嚴密條件（stringent conditions）下與和該核苷酸序列之整體或部分互補的序列雜交以編碼具有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列的該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的多肽之任何序列所製備的探針（probe）可被包括而不受限。該「嚴密條件」是指允許多核苷酸之間特定雜交的條件。這樣的條件被具體敘述於文獻中（請參J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, 紐約, 1989；F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 紐約, 9.50–9.51, 11.7–11.8）。例如，該嚴密條件可包括之條件係在其之下具有40%或更高，具體而言90%或更高，更具體而言95%或更高，再更具體而言97%或更高，且再更具體而言99%或更高的高同源性或相等性之基因彼此雜交，且具有較上述同源性或相等性低的同源性或相等性的基因不彼此雜交，或是南方雜交法之清洗條件，即，在對應於60°C、1× SSC，及0.1% SDS；具體而言，60°C、0.1× SSC，及0.1% SDS；及更具體而言68°C、0.1× SSC，及0.1% SDS之溫度及鹽濃度下清洗一次，具體而言清洗兩次或三次。
雜交需要包含互補序列之兩個核酸，雖然依據該雜交的嚴密性，鹼基之間的錯位是可能發生的。該用語「互補」是用於敘述可彼此雜交之核苷酸鹼基之間的關係。舉例而言，對於DNA，腺苷酸是與胸腺嘧碇互補，而胞嘧啶是與鳥糞嘌呤互補。因此，本發明可包括對整個序列互補的獨立核苷酸片段，以及與其實質上相似的核酸序列。
具體而言，具有同源性或相等性的多核苷酸可在上述條件下使用包括55°C之Tm 值之雜交步驟的雜交條件所偵測。再者，該Tm 值可為60°C、63°C，或65°C，但不限於此，且可被適當地由所屬技術領域具有通常知識者依據其目的而調整。
用於雜交多核苷酸的適當嚴密性依據該多核苷酸之長度及互補性的等級而定，且這些變數在所屬技術領域中為已知的（請參Sambrooket al .）。
此處所使用的用語「同源性」或「相等性」是指在兩個給定的胺基酸序列或核苷酸序列之間的相關度（degree of relevance），且可被以百分比表示。該用語「同源性」及「相等性」通常可被彼此互換使用。
保留多核苷酸（conserved polynucleotide）或多肽序列之序列同源性或相等性可藉由標準對位演算法（standard alignment algorithms）而決定，且可與藉由所使用之程式所確立的預設空位罰分（default gap penalty）一起使用。實質上同源或相等的序列通常被預期與該序列的全長或該序列的全長之至少約50%、50%、60%、70%、80%或90%，在中等或高度嚴密條件下雜交。在雜交多核苷酸中包含簡併密碼子而不是密碼子的多核苷酸亦被考量。
任兩個多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或相等性可以藉由，例如，已知的電腦演算法，諸如「FASTA」程式 （Pearsonet al ., (1988)Proc. Natl. Acad. Sci . USA 85: 2444）使用預設參數而決定。或者是，其可以藉由Needleman-Wunsch演算法（Needleman and Wunsch, 1970,J. Mol. Biol . 48: 443–453）決定，其是使用EMBOSS組合（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al ., 2000,Trends Genet . 16: 276–277）（較佳為5.0.0或更新之版本）（GCG program package (Devereux, J.,et al .,Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.,et al .,J MOLEC BIOL 215: 403 (1990)；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed.,Academic Press , San Diego, 1994，及CARILLOet al . (1988)SIAM J Applied Math 48: 1073)）之Needleman程式進行。舉例而言，該同源性、相似性或相等性可使用國家生物技術資訊中心資料庫（National Center for Biotechnology Information database，NCBI）的BLAST或ClustalW來決定。
多核苷酸或多肽之同源性、相似性或相等性可藉由使用，例如，GAP電腦程式比對序列資訊而決定，此種程式諸如揭露於Smith and Waterman,Adv. Appl. Math (1981) 2:482中之Needlemanet al . (1970)，J Mol Biol . 48 : 443。總而言之，該GAP程式將同源性、相似性及相等性界定為相似的經對齊之符號（亦即核苷酸或胺基酸）之數量除以兩個序列之較短者中的符號之總數所獲得之值。該GAP程式的預設參數可包括：(1)二進位比較矩陣（包含表示相同的數值1及表示不同的數值0）以及揭露於 Schwartz and Dayhoff, eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure , National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) 中的 Gribskovet al . (1986)Nucl. Acids Res . 14: 6745之加權比較矩陣（或EDNAFULL (NCBI NUC4.4之EMBOSS版本) 取代矩陣）；(2)對各空位（gap）之3.0的罰分（penalty）以及各空位中每個符號額外0.10的罰分（或是一個空位開啟10罰分，且一空位延伸0.5罰分）；以及(3)對於終端空位無罰分。
再者，任兩個多核苷酸或多肽序列之間是否具有同源性、相似性或相等性可藉由於南方雜交法實驗中，於經界定之嚴密條件下比較其等的序列而確認，且經界定之適當的雜交條件是在本技術領域的範圍內且可由所屬技術領域具有通常知識者所熟知的方法決定（例如，J. Sambrooket al .,Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, 紐約, 1989；F. M. Ausubelet al .,Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, Inc., 紐約）。
編碼該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因可藉由所屬技術領域中已知的傳統方法被導入該棒狀桿菌屬的微生物中，且該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶可被表現於棒狀桿菌屬的該微生物中。
此處所使用的用語「將被表現/被表現（to be expressed/being expressed）」是指一個其中一目標多肽被導入微生物中，或是其中一目標多肽被修飾以被表現於該微生物中之狀態。為了本發明的目的，該「目標多肽」可為上述之該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
具體而言，此處所使用的用語「導入一多肽」表示一微生物表現一目標多肽的活性，而該微生物原先並未具備該活性。舉例而言，其可表示編碼該目標多肽的一多核苷酸被導入該微生物的染色體，或包含編碼該目標多肽之該多核苷酸的載體(vector)被導入該微生物中，並藉此表現其活性。即使該目標多肽已經存在於該微生物中，相較於一未修飾之微生物，該多肽於該微生物中的表現或活性由於將該目標多肽導入至該微生物中而可能增加或增強。
另外，此處所使用的用語「活性之增強」表示相較於其內生活性（endogenous activity）或於一未修飾微生物中之多肽的活性，微生物中之特定蛋白質的活性被增強。此處所使用的用語「內生蛋白質」是指當微生物之表徵（trait）由於藉由自然或人工因素而導致的基因修飾而改變時，在轉換前之一母株（parent strain）原先具有的特定蛋白質之活性。
具體而言，活性的增強可藉由選自於由下列所組成之群組的方法之一或多者達成：將該多肽導入該微生物的方法、增加編碼該多肽之基因的胞內複製數（intracellular copy number）的方法；將修飾導入編碼該多肽之基因的表現控制序列的方法；以具有強活性的序列替代編碼該多肽之基因的表現控制序列的方法，以及將修飾進一步導入編碼該多肽的基因中使得該多肽的活性被增強的方法，但不限於此。
在上述內容中，將該多肽導入該微生物的方法或是增加基因的胞內複製數的方法可藉由使用載體而將編碼該多肽之一多核苷酸插入該微生物之染色體或質體中而進行，但並非特別限制於此。具體而言，該方法可藉由將可操作地連結至編碼本發明之該多肽的多核苷酸且得以無視宿主細胞而進行複製及發揮功能的載體而進行。或者是，該方法可藉由將得以將該多核苷酸插入一宿主細胞的染色體且是可操作地連結至該多核苷酸的載體導入一宿主細胞的染色體而進行。將該多核苷酸插入該染色體可藉由所屬技術領域中已知的方法達成，例如，藉由同源重組而達成。
接著，對該表現控制序列進行修飾以增加多核苷酸之表現可藉由透過核苷酸序列的刪除、插入、非保留取代、保留取代，或其等之組合而於該序列中導致修飾，以進一步增強該表現控制序列的活性，或藉由以一具有較強活性之核酸序列取代該核苷酸序列而進行，但不特別限於此。該表現控制序列可包括啟動子、操作子序列、核醣體結合位置編碼序列、用於調節轉錄及轉譯之終止的序列等，但不特別限於此。
具體而言，強的（strong）啟動子，而不是原生啟動子，可被連結於該多核苷酸表現單元的上游（upstream）區域。強的啟動子的實例可包括cj1至cj7啟動子（韓國發明專利第10-0620092號）、乳糖啟動子（lac promoter）、色胺酸啟動子（trp promoter）、trc啟動子（trc promoter）、tac啟動子、λ噬菌體PR啟動子（lambda phage PR promoter）、PL啟動子、tet啟動子、gapA啟動子、SPL7啟動子、SPL13(sm3)啟動子（韓國發明專利第10-1783170號）、O2啟動子（韓國發明專利第10-1632642號）、tkt啟動子及yccA啟動子，但不限於此。
再者，雖然未特別限制於此，該染色體上的該多核苷酸序列的修飾可藉由透過該核酸序列之刪除、插入、非保留取代或保留取代，或其等的組合而於該表現控制序列誘導修飾，以進一步增強該多核苷酸序列的活性，或藉由以一經修飾以具有較強活性之核苷酸序列取代該核苷酸序列而進行。
該多肽活性的導入或增強可為相較於野生種或未修飾之微生物菌株的活性或濃度，該對應之多肽的活性或濃度的增加，但不限於此。
具體而言，該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的導入或增強可藉由製備包含編碼該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶且用於表現的重組載體，以及將該載體導入棒狀桿菌屬之該微生物中以生產經轉化之該棒狀桿菌屬之微生物而達成。亦即，包含編碼該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之基因的該微生物可為藉由轉化為包含該基因之載體而生產的一重組微生物，但不限於此。
此處所使用的用語「載體」是指包含適當之控制序列及用以將目標多肽表現於一合適宿主中之該目標多肽之核苷酸序列的DNA產物。該控制序列可包括能夠起始轉錄的啟動子、用於控制該轉錄的任意操作子序列（arbitrary operator sequence）、編碼合適的mRNA核醣體結合位置的序列，以及用以控制轉錄及轉譯之終止的序列。一旦轉化成為合適的宿主細胞，該載體可無視該宿主基因組而複製或發生作用（function），或可整合至其基因組內。
只要其得以於宿主細胞中複製，用於本發明之載體並未被特別限制，且任何本技術領域中已知的載體可被使用。傳統使用之載體的實例可包括天然或重組狀態的質體（plasmid）、黏接質體（cosmid）、病毒及噬菌體（bacteriophage）。舉例而言，pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A，及Charon21A可被用作為噬菌體載體（phage vector）或黏接質體載體，且基於pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pET、pMal、pQE，及pCL可被用作為質體載體。具體而言，pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118，及pCC1BAC載體可被使用。
用於NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之表現的重組載體可藉由傳統方法製備。亦即，其可藉由使用一限制酵素而將NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之基因序列配位（ligating）至一適當載體而製備。
編碼一目標多肽之多核苷酸可使用用於多肽表現之一重組載體而被插入該染色體中。多核苷酸對該染色體的插入可藉由本領域中任何已知的方法進行，例如同源重組但不限於此。另外，該載體可進一步包括一選擇標記（selection marker）以確認插入該染色體。該選擇標記是用以選擇以該載體轉化的細胞，即，確認目標核酸分子是否被插入，且提供可選擇之表現型（selectable phenotypes），諸如抗藥性、營養缺陷性（auxotrophy）、對細胞毒性劑（cell toxic agent）之抗性，或表面多肽之表現的標記可被使用。在以選擇性試劑處理的環境中，只有表現該選擇標記的細胞可以存活或顯現其他的表現型，且因此該等被轉化的細胞可被選擇。
如此處所使用的，「轉化作用（transformation）」之用語係指導入包括編碼目標多肽之多核苷酸的載體至宿主細胞中，使得由該多核苷酸所編碼的多肽可被表現於該宿主細胞中。無論該經轉化的多核苷酸是整合入宿主細胞之染色體中而位於染色體内部或外部，只要該經轉化的多核苷酸可被表現於該宿主細胞中，兩種情況都可被包括。再者，該多核苷酸可包括編碼該目標蛋白的DNA及RNA。只要該多核苷酸可被導入至該宿主細胞並於其中被表現，該多核苷酸可以任何形式被導入宿主細胞。舉例而言，該多核苷酸可以表現匣（expression cassette）的形式被導入至宿主細胞中，其是包括對於其自主表現為必須的所有必要元素的基因建構（gene construct）。該表現匣一般可包括可操作地連結至該多核苷酸的啟動子、轉錄終止子（transcription terminator）、核醣體結合位置，或轉譯終止子（translation terminator）。該表現匣可呈自我複製表現載體的形式。另外，該多核苷酸可以其原始形式被導入至宿主細胞並可操作地連結至對於宿主細胞中之表現所需的序列，但不限於此。
另外，此處所使用的用語「可操作地連結（operably linked）」意指該基因序列是功能性地連結至起始及調解（mediates）編碼本發明之該目標多肽之該多核苷酸之轉錄的啟動子序列（promoter sequence）。
用以轉化本發明之該載體的方法包括用於將核酸導入細胞中的任何方法，且可藉由依據該宿主細胞選擇本領域中所熟知的合適標準技術進行。例如，該方法可包括電穿孔法（electroporation）、磷酸鈣（CaPO4 ）沉澱法、氯化鈣（CaCl2 ）沉澱法、顯微注射法（microinjection）、聚乙二醇（PEG）法、DEAE-聚葡萄糖法（DEAE-dextran method）、陽離子型脂質體方法，以及醋酸鋰-DMSO方法，但不限於此。
為了本發明的目的，該棒狀桿菌屬的微生物，其是被基因修飾以表現包括SEQ ID NO:1之該胺基酸序列的NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶，可為相較於一未經修飾之微生物具有增加之左旋胺基酸生產力的微生物。
此處所使用的用語「生產左旋胺基酸之微生物（L-amino acid-producing microorganism）」或「棒狀桿菌之生產左旋胺基酸之微生物（L-amino acid–producing microorganism of theCorynebacterium ）」包括其中發生天然或人工基因修飾的所有微生物或是棒狀桿菌屬的微生物，且可以是指其中發生基因突變或其中對於所欲之左旋胺基酸的生產的活性增強的棒狀桿菌屬之微生物，如由於一外來基因之插入，或是一內生基因之活性增強或去活化而具有特定被減弱或增強之機制的微生物。
具體而言，該生產左旋胺基酸之微生物可為其中由於涉及所欲之左旋胺基酸生物合成途徑的多肽之部分的活性增強，或涉及所欲之左旋胺基酸降解途徑中的多肽之部分的活性被減弱，使得所欲之左旋胺基酸生產力被增加的微生物。舉例而言，該微生物可為其中天門冬氨酸激酶（aspartate kinase，lysC）、高絲胺酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，hom）、左旋蘇胺酸脫氫酶（L-threonine dehydratase，ilvA）、2-異丙基蘋果酸合成酶（leuA）、乙醯乳酸合成酶（acetolactate synthase，ilvN），及／或高絲胺酸O-乙醯轉移酶（metX）的活性被增強的微生物。另外，該微生物可包括，例如，被修飾以具有對回饋抑制（feedback inhibition）之抗性以增強活性的基因或多肽。再者，該微生物可，例如，具有降解所欲之左旋胺基酸的各種基因或多肽的經減弱或去活化的活性。另外，該微生物可為，例如，由於隨機突變而具有增加之左旋胺基酸生產力的微生物，但不限於此。亦即，該微生物可為其中藉由增強涉及於所欲之左旋胺基酸生物合成途徑之該多肽的活性，或是藉由去活化／減弱涉及於該降解途徑之多肽的活性而使所欲之左旋胺基酸的生產增加的微生物。
如上所述，該多肽活性的增強可藉由增加編碼該多肽之基因的胞內複製數；藉由導入突變至編碼該多肽的染色體基因及／或其表現控制基因；藉由以具有強活性之序列取代編碼該多肽之該染色體上的基因表現控制序列；藉由導入突變至編碼該多肽之該染色體上的基因的一部分中以增加該多肽的表現或者具有對回饋抑制的抗性；或其等之組合而達成，但不限於此。
此處所使用的用語「多肽活性之減弱／去活化」表示一天然野生種菌株、一母株或對應之多肽，其相較於未經修飾之菌株，不具有該酵素或多肽之表現，或即使經過表現仍不具有活性或具有減低之活性。在此，該減低是一個全面的概念，包括其中相較於原先由一微生物所具有的多肽活性，由於編碼該多肽之基因的突變、表現控制序列的修飾或該等基因之部分或全部之刪除等，而使得該多肽活性本身減低的情況；相較於天然菌株或修飾前之菌株，由於編碼該多肽之該基因之表現被抑制或是轉譯被抑制，而導致胞內多肽活性的整體等級降低的情況；及其等之組合。在本發明中，該去活化可藉由應用本領域中所熟知的各種方法而達成。該等方法的實例可包括用於刪除編碼該多肽之基因的部分或全體的方法；用以修飾該表現控制序列以使得該基因之該表現被減低的方法；用於修飾編碼該多肽之該基因序列，使得該多肽的活性被移除或減弱的方法；用於導入互補地連結至編碼該多肽之基因的轉錄本（transcript）之反股寡核苷酸（antisense oligonucleotide）（例如，反股RNA）的方法；用於將一互補序列併入編碼該多肽之夏因-達爾加諾序列（Shine–Dalgarno sequence）之夏因-達爾加諾序列上游以形成一次級結構，藉此抑制核糖體附接的方法；以及用於將一啟動子併入編碼該多肽之基因的多核苷酸序列的開讀框（open reading frame, ORF）的3’終端以使其被反向轉錄的反向轉錄工程(reverse transcription engineering, RTE)方法，以及其等的組合。
然而，作為上述方法的實例，用於增強或去活化多肽之活性的方法以及用於基因操作的方法為本技術領域中已知的，且該生產左旋胺基酸之微生物可藉由應用各種已知方法而製備。
為了本發明的目的，如上所述，相較於未經修飾之野生種菌株或未經修飾之突變株，包含該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的棒狀桿菌屬之生產左旋胺基酸的微生物可以自培養基中的碳源充裕地（in excess）生產所欲之左旋胺基酸。在本發明中，「生產左旋胺基酸之棒狀桿菌屬的微生物」可與「具有左旋胺基酸生產力之棒狀桿菌屬的菌株」或「棒狀桿菌屬之生產左旋胺基酸的菌株」互換使用。
只要其是可以生產左旋胺基酸的棒狀桿菌屬的微生物，經修飾以表現具有NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之活性的多肽之該棒狀桿菌屬之生產左旋胺基酸的微生物並未被限制。具體而言，棒狀桿菌屬之微生物可為選自於以下所組成之群組的任何一或多者：麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum ）、產胺棒狀桿菌（Corynebacterium ammoniagenes ）、生乳棒狀桿菌（Corynebacterium crudilactis ）、漠氏棒狀桿菌（Corynebacterium deserti ）、有效棒狀桿菌（Corynebacterium efficiens ） 、潰瘍棒狀桿菌（Corynebacterium callunae ）、駐地棒狀杆菌（Corynebacterium stationis ）、單一棒狀桿菌（Corynebacterium singulare ）、耐鹽棒狀桿菌（Corynebacterium halotolerans ）、紋帶棒狀桿菌（Corynebacterium striatum ）、普氏棒狀桿菌（Corynebacterium pollutisoli ）、模擬棒狀桿菌（Corynebacterium imitans ）、龜口腔棒狀桿菌（Corynebacterium testudinoris ），及黄棒狀桿菌（Corynebacterium flavescens ），且具體而言，可以是麩胺酸棒狀桿菌，但不限於此。
該棒狀桿菌屬之生產左旋胺基酸的微生物可為一重組微生物。該重組微生物是如上所述者。
此處所使用的用語「培養（cultivation）」表示該微生物在適當控制之環境條件下生長。本發明的培養過程可在適合的培養基中以及本領域中已知的培養條件下進行。此培養過程可由所屬技術領域中具有通常知識者依據將被選擇的菌株而輕易調整。具體而言，培養可為批次培養、連續培養及饋料批次培養（fed-batch culture），但不限於此。
此處所使用的用語「培養基（medium）」是指包含對於微生物之培養所需之營養材料作為主要成分的材料混合物，且其供應營養材料及生長因素並伴隨對於存活及生長為必須的水。具體而言，用於培養本發明之微生物的該培養基及其他培養條件可為任何用於傳統微生物培養的培養基，而沒有任何特別限制。然而，本發明之微生物可在好氧條件下，於包含適當碳源、氮源、磷源、無機化合物、胺基酸及／或維生素的傳統培養基中，在調整溫度、pH值等下被培養。具體而言，用於棒狀桿菌屬的菌株的培養基可於文獻中找到（“Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)）。
在本發明中，該碳源可包括碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖（saccharose）、乳糖、果糖、蔗糖（sucrose）、麥芽糖等；糖醇諸如甘露醇、山梨醇等；有機酸諸如丙酮酸、乳酸、檸檬酸等；及胺基酸，諸如麩胺酸、甲硫胺酸、離胺酸等。另外，碳源可包括天然有機營養物，諸如澱粉水解產物、糖蜜（molasses）、廢糖蜜（blackstrap molasses）、米糠（rice bran）、木薯（cassava）、甘蔗糖蜜、玉米浸液（corn steep liquor）等。具體而言，可使用諸如葡萄糖及滅菌預處理糖蜜（即被轉化成還原糖的糖蜜），且另外，可不受限地使用適當量的各種其他碳源。這些碳源可被單獨使用或以兩種或更多種的組合被使用，但不限於此。
該氮源可包括無機氮源，諸如氨、硫酸銨、氯化銨、醋酸銨、磷酸銨、碳酸銨、硝酸銨等；胺基酸，諸如麩胺酸、甲硫胺酸、麩醯胺酸等；及有機氮源，諸如蛋白腖、NZ-胺、肉類萃取、酵母萃取、麥芽糖萃取、玉米浸液（corn steep liquor）、酪蛋白水解物、魚或其分解產物、脫脂大豆餅或其分解產物等。這些氮源可被單獨使用或以兩種或更多種的組合被使用，但不限於此。
該磷源可包括磷酸二氫鉀（monopotassium phosphate）、磷酸氫二鉀，或對應的含鈉鹽等。無機化合物的實例可包括氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、氯化鎂、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣等。另外，可包括胺基酸、維生素，及／或適當的前驅物。這些構成成份或前驅物可以批次培養或連續的方式添加至培養基中，但這些磷源並不限於此。
在本發明中，培養基的pH值在微生物培養期間可藉由以適當方式添加諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸、硫酸等的化合物至該培養基中而調整。另外，在培養期間，諸如脂肪酸聚甘油酯的消泡劑可被添加以預防泡沫生成。此外，氧氣或含氧氣體可被注入該培養基以維持該培養基的好氧狀態；或是氮氣、氫氣或二氧化碳氣體可在未注入氣體下被注入以維持該培養基的厭氧或微有氧（microaerobic）狀態，但該氣體不限制於此。
該培養基溫度可介於自20°C至45°C的範圍內，且具體而言，自25°C至40°C，但不限於此。該培養可繼續進行直到獲得所欲量的有用材料，且具體而言進行10至160小時，但不限於此。
由培養所生產的左旋胺基酸可被釋放至該培養基或不被釋放而留在細胞中。
在回收本發明之該培養所生產的左旋胺基酸的方法中，所欲的左旋胺基酸可依據培養方法而使用本領域中已知之適當方法自該培養溶液收集。舉例而言，諸如離心、過濾、離子交換層析法、結晶法及HPLC等方法可被使用，且所欲的左旋胺基酸可使用本領域中已知之合適方法自該培養基或微生物回收。
再者，該回收可進一步包括一純化過程，其可使用本領域中已知的適當方法進行。因此，經回收的左旋胺基酸可呈純化態或在包含該左旋胺基酸的微生物發酵液中（Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008）。
由根據本發明的生產左旋胺基酸的方法所生產的左旋胺基酸的種類並未限制。亦即，可以自棒狀桿菌屬之微生物生產的左旋胺基酸可包括任何左旋氨基酸而不受限，且可包括該等左旋胺基酸的中間物。該等左旋胺基酸可為，例如，左旋精胺酸、左旋組胺酸、左旋離胺酸、左旋天門冬胺酸、左旋麩胺酸、左旋絲胺酸、左旋蘇胺酸、左旋天門冬醯胺酸、左旋麩醯胺酸、左旋酪胺酸、左旋丙胺酸、左旋異白胺酸、左旋白胺酸、左旋纈胺酸、左旋苯丙胺酸、左旋甲硫胺酸、左旋色胺酸、甘胺酸、左旋脯胺酸及左旋半胱胺酸，且具體而言，可為左旋離胺酸、左旋蘇胺酸、左旋異白胺酸、左旋白胺酸、左旋纈胺酸、左旋精胺酸，及左旋麩醯胺酸，但不限於此。左旋胺基酸的中間物可為，例如，O -乙醯高絲胺酸（O -acetyl homoserine），但不限於此。
本發明的另一個態樣提供具有增加之左旋胺基酸生產力的棒狀桿菌屬之微生物，其含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶、編碼其之基因、其表現，及該棒狀桿菌屬之微生物是如上所述。
在本發明中，相較於未經修飾之微生物，包含編碼該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之基因的棒狀桿菌屬之微生物由於該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的表現而可具有增加或改良之左旋胺基酸生產力。
本發明之棒狀桿菌屬之微生物為能夠生產左旋胺基酸的微生物，且可包括不僅是野生種微生物，亦可包括被基因修飾以改良左旋胺基酸生產力的微生物。該生產左旋胺基酸之微生物是如上所述。
本發明之該微生物為包含衍生自乳酸桿菌屬之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的重組微生物，且相較於不包含NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的微生物，其可自培養基中之碳源充裕地生產所欲之左旋胺基酸。該重組微生物之增加之左旋胺基酸生產力及增加之還原力可藉由活化該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶而獲得。亦即，藉由導入NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶至生產左旋胺基酸之棒狀桿菌屬的微生物中，該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶被活化而使得NADP可被用以取代NAD作為輔酶，且因此NADPH的量可被增加，其接著可被使用作為左旋胺基酸之生物合成之能量來源的還原力。
在本發明中，該用語「未經修飾之微生物」可指一天然菌株本身、不包含該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的微生物，或尚未以包含編碼該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的多核苷酸之載體轉化的微生物，但不限於此。
該左旋胺基酸是如上所述。
本發明之其中藉由導入編碼NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因而左旋胺基酸之生產力被增加的棒狀桿菌屬之微生物可為選自於棒狀桿菌屬，以寄存編號No. KCCM12580P、寄存編號No. KCCM12581P、寄存編號No. KCCM12582P、寄存編號No. KCCM12583P、寄存編號No. KCCM12584P、寄存編號No. KCCM12585P、寄存編號No. KCCM12586P，或寄存編號No. KCCM12587P寄存的微生物所組成的群組的任何一者。
本發明的再另一態樣提供含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶之棒狀桿菌屬的微生物生產左旋胺基酸的用途。
該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶、該編碼其之基因、其表現、該棒狀桿菌屬之微生物、含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之該NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的棒狀桿菌屬之微生物，以及該左旋胺基酸是如上所述。［本發明的實施模式］
此後，將藉由實例而詳細說明本發明。然而，對本發明所屬技術領域具有通常知識者顯見的是，這些實施例僅被提供作為例示性的目的，且本發明的範圍並非意欲被限制於此。實例 1-1. 用於導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種 ATCC11842 之 NADP 依賴型甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶（ gapN(L) ）至棒狀桿菌屬之微生物的染色體上轉位子（ Transposon ）的載體的製備
衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶被選擇作為對於棒狀桿菌具有高親和力的NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。此後，進行下列實驗以增強其活性。
編碼衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種ATCC11842之gapN的Ldb1179基因之胺基酸序列（SEQ ID NO:1）及核苷酸序列（SEQ ID NO:2）是自NIH GenBank獲得。
再者，為了使用棒狀桿菌屬之微生物的轉位子基因區域導入Ldb1179基因至該染色體，四種用於轉化的載體被各自製備，且cj7（韓國發明專利第10-0620092號）被用作啟動子。 1-1-1) pDZ2457::P(cj7)-gapN(L)載體的製備
該Ldb1179基因使用SEQ ID NOS:3及4之引子，基於戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種ATCC11842菌株之染色體作為模版，藉由修飾該起始密碼子TTG為ATG而被擴增為約1.43 kb之基因片段（表1）。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫（annealing），以及72°C下，1分鐘30秒之延伸（extension）而進行PCR。此PCR產物於0.8%之瓊脂糖凝膠中進行電泳，且約1.4 kb的帶（band）被洗脫及純化。再者，使用一對SEQ ID NOS:5及6的引子，在相同條件下而於該cj7啟動子區域上進行PCR以獲得PCR產物。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之延伸而進行PCR。上述獲得之PCR產物受到融合複製（fusion cloning）。融合複製是使用In-Fusion® HD複製套組（Clontech）而進行。所得之質體被命名為pDZ2457::P(cj7)-gapN(L)。
該載體被用以導入該gapN至生產離胺酸、白胺酸、或乙醯高絲胺酸之菌株。 1-1-2) pDZ1108::P(cj7)-gapN(L) 載體之製備
該Ldb1179基因使用SEQ ID NOS:3及7之引子，基於戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種ATCC11842菌株作為模版，藉由修飾該起始密碼子TTG為ATG而被擴增為約1.43 kb之基因片段（表1）。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，1分鐘30秒之延伸而進行PCR。此PCR產物於0.8%之瓊脂糖凝膠中進行電泳，且約1.4 kb的帶被洗脫及純化。再者，使用一對SEQ ID NOS:8及6的引子，在相同條件下而於該cj7啟動子區域上進行PCR以獲得PCR產物。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之延伸而進行PCR。上述獲得之PCR產物受到融合複製。融合複製是使用In-Fusion® HD複製套組（Clontech）而進行。所得之質體被命名為pDZ1108::P(cj7)-gapN(L)。
該載體被用以導入該gapN至生產異白胺酸或蘇胺酸之菌株。 1-1-3) pDZTn5::P(cj7)-gapN(L)載體之製備
該Ldb1179基因使用SEQ ID NOS:3及10之引子，基於戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種ATCC11842菌株之染色體作為模版，藉由修飾該起始密碼子TTG為ATG而被擴增為約1.43 kb之基因片段（表1）。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，1分鐘30秒之延伸而進行PCR。此PCR產物於0.8%之瓊脂糖凝膠中進行電泳，且約1.4 kb的帶被洗脫及純化。再者，使用一對SEQ ID NOS:9及6的引子，在相同條件下而於該cj7啟動子區域上進行PCR以獲得PCR產物。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之延伸而進行PCR。上述獲得之PCR產物受到融合複製。融合複製是使用In-Fusion® HD複製套組（Clontech）而進行。所得之質體被命名為pDZTn5::P(cj7)-gapN(L)。
該載體被用以導入該gapN至生產纈胺酸或精胺酸之菌株。 1-1-4) pDZ0286::P(cj7)- gapN(L)載體之製備
該Ldb1179基因使用SEQ ID NOS:3及12之引子，基於戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種ATCC11842菌株之染色體作為模版，藉由修飾該起始密碼子TTG為ATG而被擴增為約1.43 kb之基因片段（表1）。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，1分鐘30秒之延伸而進行PCR。此PCR產物於0.8%之瓊脂糖凝膠中進行電泳，且約1.4 kb的帶被洗脫及純化。再者，使用一對SEQ ID NOS:11及6的引子，在相同條件下而於該cj7啟動子區域上進行PCR以獲得PCR產物。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之延伸而進行PCR。上述獲得之PCR產物受到融合複製。融合複製是使用In-Fusion® HD複製套組（Clontech）而進行。所得之質體被命名為pDZ0286::P(cj7)- gapN(L)。
該載體被用以導入該gapN至生產麩胺酸之菌株。 [表1]
SEQ ID NO: 序列 (5′–3′)
3 CCCAACGAAAGGAAACACTCATGACAGAACACTATTTAAA
4 GCTTGTGAATAAGCCTGCCCTTAGTCTTCGATGTTGAAGACAACG
5 GATTCCAGGTTCCTTAACCCAGAAACATCCCAGCGCTACT
6 TTTAAATAGTGTTCTGTCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG
7 TTTCGTGCGAGTCTAGAAGTTTAGTCTTCGATGTTGAAGA
8 ACGAGGTCAGCATCTCGAGTAGAAACATCCCAGCGCTACT
9 CGCGGAACTGTACTAGTAGAAACATCCCAGCGCTAC
10 GGAAGGATATCTCTAGAAGATAAAACGAAAGGCC
11 CCCTTCCGGTTTAGTACTAGAAACATCCCAGCGCTA
12 CTCTTCCTGTTTAGTACTTTAGTCTTCGATGTTGAAG
實例 1-2. 用於導入衍生自變種鏈球菌（ Streptococcus mutans ） ATCC25175 之 NADP 依賴型甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶（ gapN(S) ）至棒狀桿菌屬之微生物的染色體上轉位子的載體的製備
作為衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種ATCC11842之gapN的控制組，進行下列實驗以導入具有NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性之SMUFR 0590（韓國發明專利第10-1182033號）至該變種鏈球菌ATCC25175。
編碼衍生自變種鏈球菌ATCC25175之gapN的SMUFR 0590基因之胺基酸序列（SEQ ID NO:13）及核苷酸序列（SEQ ID NO:14）是自NIH GenBank獲得，且用於導入由cj7啟動子表示之SMUFR 0590至該轉位子基因的載體被製備。
如實例1-1中所示，pDZ被使用作為用於轉化的載體，且cj7被使用作為啟動子。該衍生自變種鏈球菌ATCC25175的SMUFR 0590基因使用SEQ ID NOS:15及16之引子，基於pECCG122-Pcj7-gapN（韓國發明專利第10-1182033號）作為模版而被擴增為約1.7 kb之基因片段（表2）。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，2分鐘之延伸而進行PCR。此PCR產物於0.8%之瓊脂糖凝膠中進行電泳，且一所欲尺寸的帶被洗脫及純化。上述獲得之PCR產物受到融合複製。融合複製是使用In-Fusion® HD複製套組（Clontech）而進行。所得之質體被命名為pDZTn::P(cj7)-gapN(S)。 [表2]
SEQ ID NO: 序列 (5′–3′)
15 TAGATGTCGGGCCCCATATGAGAAACATCCCAGCGCTACT
16 GCCAAAACAGCCTCGAGTTATTTGATATCAAATACGACGGATTTA
實例 1-3. 用於導入衍生自丙酮丁醇梭桿菌（ Clostridium acetobutylicum ）之 NADP 依賴型甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶（ gapN(C) ）至棒狀桿菌屬之微生物的染色體上轉位子的載體的製備
作為衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種ATCC11842之gapN的控制組，進行下列實驗以導入具有NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性之NCBI GenBank WP_010966919.1之gapN至該丙酮丁醇梭桿菌。
衍生自丙酮丁醇梭桿菌之NCBI GenBank WP_010966919.1及NCBI GenBank NC_015687.1的gapN基因之胺基酸序列（SEQ ID NO:35）及核苷酸序列（SEQ ID NO:36）自NCBI GenBank獲得，且用於導入由cj7啟動子表現之NCBI GenBank WP_010966919.1之gapN至轉位子基因的載體被製備。
如實例1-1所述，pDZ被使用作為用於轉化的載體而cj7被使用作為啟動子。衍生自丙酮丁醇梭桿菌之NCBI GenBank WP_010966919.1的gapN基因使用SEQ ID NOS:37及38之引子，基於丙酮丁醇梭桿菌之gDNA作為模版而被擴增為約1.5 kb之基因片段。另外，為了獲得該cj7啟動子，該gapN基因使用SEQ ID NOS:15及39之引子，基於pECCG122-Pcj7-gapN （韓國發明專利第10-1182033號）作為模版而被擴增為約400 bp之基因片段。此時，藉由重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，2分鐘之延伸而進行PCR。此PCR產物於0.8%之瓊脂糖凝膠中進行電泳，且一所欲尺寸的帶被洗脫及純化。上述獲得之PCR產物受到融合複製。融合複製是使用In-Fusion® HD複製套組（Clontech）而進行。所得之質體被命名為pDZTn::P(cj7)-gapN(C)。 [表3]
SEQ ID NO:  序列 (5′–3′)
37 ACCCAACGAAAGGAAACACTCATGTTTGAAAATATATCATCAAA
38 GCCAAAACAGCCTCGAGTTATAGGTTTAAAACTATTGATT
39 TTTGATGATATATTTTCAAACATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT
實例 2-1. 導入有 gapN(L) 、 gapN(S) ， 或 gapN(C) 於生產左旋離胺酸菌株 KCCM11016P 之菌株的製備及其評估
為了確認導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種鏈球菌之該gapN對於基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032菌株之左旋離胺酸生產力的效果，實例1-1-1中製備的質體、1-2中製備的質體，以及實例1-3中製備的質體藉由電穿孔法被導入麩胺酸棒狀桿菌KCCM11016P（韓國發明專利第10-0159812號）中以獲得轉形體（transformants），且該等轉形體被分布於包含康黴素（kanamycin，25微克／毫升）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷）之BHIS盤培養基（37 克／升之腦心浸液（Brain heart infusion）、91克／升之山梨醇、2%之洋菜）上，並進行培養以形成菌落。自由此形成的菌落，藍色菌落被選擇以選擇導入有P(cj7)-gapN(L)、P(cj7)-gapN(S)或P(cj7)-gapN(C)的菌株。
由此選擇的該等菌株被分別命名為KCCM11016P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S)及KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C)。
所製備的菌株以下列方式被培養以比較離胺酸生產力。各菌株被播種（seeded）至包含25毫升種子培養基（seed medium）之250毫升之轉角燒瓶（corner-baffle flask）並在30°C下，於200 rpm搖晃（shaking）下培養20小時。接著，1毫升之種子培養液被種入包含24毫升之生產培養基的250毫升轉角燒瓶，並於32°C下，於200 rpm搖晃下培養72小時。種子培養基及生產培養基的組成顯示如下。 ＜種子培養基（pH 7.0）＞
葡萄糖20克、蛋白腖10克、酵母萃取5克、尿素1.5克、KH2 PO4 4克、K2 HPO4 8克、MgSO4 ·7H2 O 0.5克、生物素100微克、硫胺素-HCl 1000微克、鈣-泛酸2000微克、菸鹼醯胺2000微克（基於1升之蒸餾水） ＜生產培養基（pH 7.0）＞
葡萄糖100克、(NH4 )2 SO4 40克、大豆蛋白2.5克、玉米浸漬固體（Corn Steep Solids）5克、尿素3克、KH2 PO4 1克、MgSO4 ·7H2 O 0.5克、生物素100微克、硫胺素-HCl 1000微克、鈣-泛酸2000微克、菸鹼醯胺3000微克、CaCO3 30克（基於1升之蒸餾水）
在培養完成後，左旋離胺酸生產力藉由HPLC量測。對於各測試菌株之培養液中的左旋離胺酸濃度及濃度增加率顯示於下表4中。 [表4]
菌株名稱 左旋離胺酸濃度(g/L) 左旋離胺酸濃度增加率(%)
KCCM11016P 43 g/L -
KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S) 50 g/L 16%
KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L) 52 g/L 20%
KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C) 47 g/L 9%
如表4中所示，經確認的是相較於生產左旋離胺酸之菌株KCCM11016P，左旋離胺酸的濃度於KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S)中增加約16%，於KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L)中約增加20%，而於KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C)中約增加9%，所有菌株都導入有該gapN基因。
該 KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L)被命名為 CA01-7528且於2019年9月2日寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12585P。實例 2-2. 導入有 gapN(L) 、 gapN(S) ， 或 gapN(C) 於生產左旋離胺酸之菌株 KCCM11347P 之菌株的製備及其評估
為了確認其他屬於麩胺酸棒狀桿菌之生產離胺酸之菌株的離胺酸生產力，導入KCCM11347P（韓國發明專利第10-0073610號） - 其為生產左旋離胺酸之菌株 - 的菌株被以與上述實例2-1相同的方式，使用實例1-1-1中製備的質體、1-2中製備的質體，及實例1-3中製備的質體製備，且被分別命名為KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L)、KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S)及KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C)。
由此製備的菌株是以上述實例2-1之相同方式培養，且左旋離胺酸生產力在培養完成後藉由HPLC量測。對於各測試菌株之培養液中的左旋離胺酸濃度及濃度增加速率顯示於下表5中。 [表5]
菌株名稱 左旋離胺酸濃度(g/L) 左旋離胺酸濃度增加率(%)
KCCM11347P 38 g/L -
KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S) 43 g/L 14%
KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L) 45 g/L 19%
KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C) 40 g/L 5%
如表5所示，經確認的是相較於生產左旋離胺酸之菌株KCCM11347P，左旋離胺酸的濃度於KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S)中增加約14%，於KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L)中約增加19%，而於KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C)中約增加5%，所有菌株都導入有該gapN基因。實例 2-3. 導入有 gapN(L) 、 gapN(S) ，或 gapN(C) 於生產左旋離胺酸之菌株 CJ3P 之菌株的製備及其評估
為了確認其他屬於麩胺酸棒狀桿菌之生產離胺酸之菌株的效果，導入麩胺酸棒狀桿菌 CJ3P（Binderet al .Genome Biology 2012, 13:R40） - 其為生產左旋離胺酸之菌株 - 的菌株被以與上述實例2-1相同的方式，使用實例1-1-1中製備的質體、1-2中製備的質體，及實例1-3中製備的質體製備，且被分別命名為CJ3P::P(cj7)-gapN(L)、CJ3P::P(cj7)-gapN(S)及CJ3P::P(cj7)-gapN(C)。該CJ3P菌株為藉由基於已知技術將三種突變體(pyc(Pro458Ser)、hom (Val59Ala)、lysC (Thr311Ile)) 導入野生種菌株而具有左旋離胺酸生產力的麩胺酸棒狀桿菌菌株。
由此製備的菌株以上述實例2-1之相同方式培養，且左旋離胺酸生產力在培養完成後藉由HPLC量測。對於各測試菌株之培養液中的左旋離胺酸濃度及濃度增加速率顯示於下表6中。 [表6]
菌株名稱 左旋離胺酸濃度(g/L) 左旋離胺酸濃度增加率(%)
CJ3P 8.3 g/L -
CJ3P::P(cj7)-gapN(S) 9.0 g/L 8%
CJ3P::P(cj7)-gapN(L) 9.4 g/L 13%
CJ3P::P(cj7)-gapN(C) 8.7 g/L 4%
如表6所示，經確認的是相較於生產左旋離胺酸之菌株CJ3P，左旋離胺酸的濃度於CJ3P::P(cj7)-gapN(S)中增加約8%，於CJ3P::P(cj7)-gapN(L)中約增加13%，而於CJ3P::P(cj7)-gapN(C)中約增加4%，所有菌株都導入有該gapN基因。實例 2-4. 導入有 gapN(L) 、 gapN(S) ，或 gapN(C) 於生產左旋離胺酸之菌株 KCCM10770P 之菌株的製備及其評估
為了確認其他屬於麩胺酸棒狀桿菌之生產離胺酸之菌株的效果，導入麩胺酸棒狀桿菌KCCM10770P（韓國發明專利第10-0924065號）- 其為其中離胺酸生物合成途徑被增強之生產左旋離胺酸之菌株 - 的菌株被以與上述實例2-1相同的方式，使用實例1-1-1中製備的質體、1-2中製備的質體，及實例1-3中製備的質體製備，且被分別命名為KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S)及KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C)。該 KCCM10770P菌株為具有aspB（編碼天門冬胺酸轉胺酶之基因）、lysC（編碼天門冬胺酸激脢之基因）、asd（編碼天門冬胺酸-半醛脫氫酶之基因）、dapA（編碼二氫二吡啶甲酸合成酶之基因）、dapB（編碼二氫二吡啶甲酸還原酶的基因），及lysA（編碼二胺庚二酸酯脫羧酶之基因）的左旋離胺酸菌株，即，在構成離胺酸生物合成途徑的基因中，染色體上具有6種基因之各2個複製數（copies）的菌株。
由此製備的菌株以上述實例2-1之相同方式培養，且左旋離胺酸生產力在培養完成後藉由HPLC量測。對於各測試菌株之培養液中的左旋離胺酸濃度及濃度增加速率顯示於下表7中。 [表7]
菌株名稱 左旋離胺酸濃度(g/L) 左旋離胺酸濃度增加率 (%)
KCCM10770P 48 g/L -
KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S) 56 g/L 17%
KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L) 60 g/L 25%
KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C) 53 g/L 10%
如表7所示，經確認的是相較於生產左旋離胺酸之菌株KCCM10770P，左旋離胺酸的濃度於KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S)中增加約17%，於KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L)中約增加25%，而於KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C)中約增加10%，所有菌株都導入有該gapN基因。
由上述實例2-1至2-4的結果發現的是，衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之gapN的導入對於各種不同族群（families）之生產左旋離胺酸之麩胺酸棒狀桿菌菌株中的左旋離胺酸生產為有效的。再者，經確認的是相較於已知的韓國發明專利第10-1182033號之導入有衍生自變種鏈球菌之gapN的菌株以及已知的NCBI GenBank WP_010966919.1之導入有衍生自丙酮丁醇梭桿菌之gapN之菌株，導入有衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之gapN之菌株顯示增加之左旋離胺酸生產力。實例 3-1. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋 蘇胺酸 之菌株的菌株之製備及其評估
生產左旋蘇胺酸之菌株藉由基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032（此後稱為WT）菌株導入lysC（L377K）變異體（韓國發明專利第10-2011994號）及hom（R398Q）變異體（韓國發明專利第10-1947959號）而製備。對於這些菌株，實例1-1-2中製備的質體及實例1-2中製備的質體被導入以通過上述實例2-1之相同方式製備菌株，且蘇胺酸生產力被比較。
為了製備用於導入lysC（377K）之載體，使用SEQ ID NOS:17及18之引子或SEQ ID NOS:19及20之引子，基於該WT之染色體作為模版進行PCR。藉由在95°C下，5分鐘之變性作用，隨後進行重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之聚合作用，且接著在72°C下，進行聚合作用7分鐘以進行PCR。結果，圍繞該lysC基因的突變之處，獲得在5’上部區域之509 bp DNA片段及在3’下部區域之520 bp DNA片段。
使用兩段擴增之DNA片段作為模版，使用SEQ ID NOS:17及20之引子，在以下PCR條件下進行PCR：在95°C下，5分鐘之變性作用，隨後進行重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，60秒之聚合作用，且接著在72°C下，進行7分鐘之聚合作用。結果，包含編碼該天門冬胺酸激脢變異體之該lysC基因的突變的1011 bp DNA片段被擴增，其中第377個白胺酸被以離胺酸取代。
無法於麩胺酸棒狀桿菌中被複製的該pDZ載體（韓國發明專利第0924065號）以及該1011 bp DNA片段被以限制酵素Xbal處理，使用DNA配位酵素進行配位，接著被複製以獲得質體，其被命名為pDZ-lysC (L377K)。
以上獲得之該pDZ-lysC (L377K)載體藉由電穿孔法被導入WT菌株中，且接著該轉化菌株於包含25毫克／升之康黴素的選擇培養基中獲得。通過次級互換，WT::lysC (L377K) - 其中核苷酸突變藉由被插入於染色體上的DNA片段而被導入該lysC基因的菌株 - 被獲得。 [表8]
SEQ ID NO: 序列 (5′–3′)
17 TCCTCTAGAGCTGCGCAGTGTTGAATACG
18 TGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGACAT
19 ACATCGAAAAGATTTCCACCTCTGAGATTC
20 GACTCTAGAGTTCACCTCAGAGACGATTA
另外，為了製備用於導入hom（R398Q）的載體，使用SEQ ID NOS:21及22之引子，及SEQ ID NOS: 23及24之引子，基於該WT基因DNA作為模版而進行PCR。PCR在以下PCR條件下進行：在95°C下，5分鐘之變性作用，隨後進行重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之聚合作用，且接著在72°C下，7分鐘之聚合作用。結果，圍繞該hom基因的突變之處，獲得在5’上部區域之290 bp DNA片段及在3’下部區域之170 bp DNA片段。使用兩段擴增之DNA片段作為模版，使用SEQ ID NOS:21及24之引子，在以下PCR條件下進行PCR：在95°C下，5分鐘之變性作用，隨後進行重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之聚合作用，且接著在72°C下，7分鐘之聚合作用。結果，包含該hom基因之突變的440 bp DNA片段被擴增。 [表9]
SEQ ID NO: 序列(5′–3′)
21 TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC
22 CTCTTCCTGTTGGATTGTAC
23 GTACAATCCAACAGGAAGAG
24 GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA
以上使用之該pDZ載體及該440 bp DNA片段被以限制酵素Xbal處理，使用DNA配位酵素配位，接著被複製以獲得質體，其被命名為pDZ-hom(R398Q)。
以上獲得之該pDZ-hom（R398Q）載體藉由電穿孔法被導入該WT::lysC(L377K)菌株，且接著該轉化菌株於包含25毫克／升之康黴素的選擇培養基中獲得。通過次級互換，WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) - 其中何苷酸突變藉由被插入於染色體上的DNA片段而被導入該hom基因的菌株 - 被獲得。
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-2中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入該WT::lysC(L377K)-hom (R398Q)菌株而製備菌株，且菌株被分別命名為WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)及WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)。
由此製備的菌株以上述實例2-1之相同方式培養，且在培養完成後，左旋蘇胺酸生產力被比較。對於各測試菌株之培養液中的左旋蘇胺酸濃度及濃度增加速率顯示於下表10中。 [表10]
菌株名稱 左旋蘇胺酸濃度 (g/L) 左旋蘇胺酸濃度增加率 (%)
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) 1.21 g/L -
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) 1.39 g/L 15%
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L) 1.48 g/L 22%
如表10中所示，經確認的是相較於WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)，左旋蘇胺酸的濃度於WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)中增加約15%，且於WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)中約增加22%，兩者都導入有該gapN基因。
該WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)被命名為 CA09-0906且於2019年9月2日依布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12586P。實例 3-2. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋 蘇 胺酸之菌株 KCCM11222P 之菌株的製備及其評估
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-2中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入麩胺酸棒狀桿菌KCCM11222P（WO 2013/081296）（其是生產左旋蘇胺酸的菌株）而製備菌株，且菌株被分別命名為 KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S)。
由此製備的菌株以上述實例2-1之相同方式培養，且在培養完成後，左旋蘇胺酸生產力被比較。對於各測試菌株之培養液中的左旋蘇胺酸濃度及濃度增加速率顯示於下表11中。 [表11]
菌株名稱   左旋蘇胺酸濃度(g/L) 左旋蘇胺酸濃度增加率 (%)
KCCM11222P 3.6 g/L -
KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S) 4.1 g/L 14%
KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L) 4.3 g/L 20%
如表11中所示，經確認的是相較於生產左旋蘇胺酸之菌株KCCM11222P，左旋蘇胺酸的濃度於KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S)中增加約14%，且於KCCM11222P:::P(cj7)-gapN(L)中約增加20%，兩者都導入有該gapN基因。
由以上實例獲得的結果教示衍生自白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之gapN的導入於屬於棒狀桿菌屬之生產左旋蘇胺酸之菌株中的左旋蘇胺酸生產為有效的。實例 4-1. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋 異白 胺酸之菌株的菌株之製備及其評估
為了確認導入衍生自白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種鏈球菌之gapN於基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032（此後稱為WT）菌株之左旋異白胺酸生產力的效果，具有經增強之左旋異白胺酸生產力的菌株藉由導入ilvA（ilvA(V323A); S. Morbachet al .,Appl. Enviro. Microbiol ., 62(12): 4345–4351, 1996）之突變而製備，其為編碼左旋蘇胺酸去氫酶之已知基因。
用於擴增該5’上部區域之引子對（SEQ ID NOS:25及26）及用於擴增該3’下部區域的引子對（SEQ ID NOS:27及28）被設計圍繞該突變位置以製備用於導入基於ilvA基因之突變的載體。SEQ ID NOS:25及28的引子在各端以BamHI限制酶位置（以底線表示）插入，而SEQ ID NOS:26及27之引子被設計為與彼此互換（crossover）以將該核苷酸取代突變（以底線表示）定位於指定位置。 [表12]
SEQ ID NO: 序列 (5′–3′)
25 ACGGATCC CAGACTCCAAAGCAAAAGCG
26 ACACCACGG CAGAACCAGGTGCAAAGGACA
27 CTGGTTCTGC CGTGGTGTGCATCATCTCTG
28 ACGGATCC AACCAAACTTGCTCACACTC
使用SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27，及SEQ ID NO:28之引子，基於該WT染色體為模版進行PCR。PCR在以下PCR條件下進行：在95°C下，5分鐘之變性作用，隨後進行重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，30秒之聚合作用，且接著在72°C下，7分鐘之聚合作用。結果，圍繞該ilvA基因的突變之處，獲得在5’上部區域之627 bp DNA片段及在3’下部區域之608 bp DNA片段。
使用兩段擴增之DNA片段作為模版，使用SEQ ID NOS:25及28之引子，在以下條件下進行PCR：在95°C下，5分鐘之變性作用，隨後進行重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，60秒之聚合作用，且接著在72°C下，7分鐘之聚合作用。結果，包含編碼該ilvA變異體之該ilvA基因之突變的1217 bp DNA片段被擴增，其中第323個位置的纈胺酸被以丙胺酸取代。
該 pECCG117（韓國發明專利第10-0057684）及該1011 bp DNA片段以限制酵素BamHI處理，使用DNA配位酵素進行配位，並複製以獲得一質體，其被命名為ECCG117- ilvA(V323A)。
其中被導入有ilvA(V323A)突變的菌株藉由導入該 pECCG117-ilvA(V323A) 載體至實例3-1之該 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)及 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)而製備。另外，僅有導入ilvA(V323A)突變至 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)的菌株被製備作為控制組。
由此製備的菌株以上述實例2-1之相同方式培養以比較左旋異白胺酸生產力。對於各測試菌株之培養液中的左旋異白胺酸濃度及濃度增加速率顯示於下表13中。 [表13]
菌株名稱 左旋異白胺酸濃度 (g/L) 左旋異白胺酸濃度增加率 (%)
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-ilvA(V323A) 4.3 g/L -
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) /pECCG117-ilvA(V323A) 5.1 g/L 18%
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A) 5.6 g/L 30%
如表13中所示，經確認的是相較於該WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-ilvA(V323A)，左旋異白胺酸的濃度於WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-ilvA(V323A)中增加約18.6%，且於WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A)中約增加30%，兩者都導入有該gapN基因。
該WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A)被命名為 CA10-3108 且於2019年9月2日依布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12582P。實例 4-2. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋 異白 胺酸之菌株 KCCM11248P 之菌株的製備及其評估
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-2及實例1-2中製備之質體導入麩胺酸棒狀桿菌KCCM11248P（韓國發明專利第10-1335789號） - 其是生產左旋異白胺酸的菌株 - 以製備菌株，且菌株被分別命名為KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S)。
由此製備的菌株以上述實例2-1之相同方式培養，且左旋異白胺酸生產力被比較。在培養完成後，左旋異白胺酸生產力藉由HPLC量測，且對於各測試菌株之培養液中的左旋異白胺酸濃度及濃度增加速率顯示於下表14中。 [表14]
菌株名稱 左旋異白胺酸濃度 (g/L) 左旋異白胺酸濃度增加率(%)
KCCM11248P 1.3 g/L -
KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S) 1.8 g/L 38%
KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L) 2.1 g/L 61.5%
如表14中所示，經確認的是相較於該生產左旋異白胺酸之菌株KCCM11248P，左旋異白胺酸的濃度於 KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S) 中增加約38%，且於KCCM11248P:::P(cj7)-gapN(L)中約增加61.5%，兩者都導入有該gapN基因。
由實例所獲得之結果教示導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之gapN對於屬於棒狀桿菌屬之生產左旋異白胺酸之菌株中的左旋異白胺酸生產為有效的。實例 5-1. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋 白 胺酸之菌株的菌株之製備及其評估
為了確認導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種鏈球菌之gapN對於基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032菌株之左旋白胺酸生產力的效果，具有經增強之左旋白胺酸生產力的菌株藉由導入leuA合成酶（leuA（R558H, G561D）；韓國發明專利公開第2018-0077008號）之突變而製備，其為編碼蘋果酸2-異丙酯合成酶之已知基因。
具體而言，於上述專利中製備的重組質體pDZ-leuA（R558H, G561D）藉由電穿孔法被導入該WT菌株，且接著於包含25毫克／升的康黴素之培養基中被選擇。通過次級互換，WT::leuA(R558H, G561D) - 其中核苷酸突變藉由插入染色體上的DNA片段而被導入至該leuA基因的菌株 - 被獲得，其被命名為CJL8001。
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-1中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入具有左旋白胺酸生產力的麩胺酸棒狀桿菌CJL8001以製備菌株，且菌株被分別命名為 CJL8001::P(cj7)-gapN(S)及CJL8001::P(cj7)-gapN(L)。
由此製備的菌株以下列方式培養以比較左旋白胺酸生產力。各菌株於一營養培養基中進行次培養（subcultured），且接著被播種至包含25毫升生產培養基之250毫升之轉角燒瓶並在30°C下，於200 rpm搖晃下培養72小時。接著，左旋白胺酸的濃度藉由HPLC分析，且經分析之左旋白胺酸濃度及濃度增加率顯示於表15中。 ＜營養培養基（pH 7.2）＞
葡萄糖10克、肉類萃取5克、聚蛋白腖10克、氯化鈉2.5克、酵母萃取5克、洋菜20克、尿素2克（基於1升之蒸餾水） ＜生產培養基（pH 7.0）＞
葡萄糖50克、硫酸銨20克、玉米浸漬固體20克、K2 HPO4 1克、MgSO4 ·7H2 O 0.5克、生物素100微克、硫胺素-HCl 1毫克、碳酸鈣15克（基於1升之蒸餾水） [表15]
菌株名稱 左旋白胺酸濃度(g/L) 左旋白胺酸濃度增加率(%)
CJL8001 3.4 g/L -
CJL8001::P(cj7)-gapN(S) 3.9 g/L 15%
CJL8001::P(cj7)-gapN(L) 4.1 g/L 21%
如表15中所示，經確認的是相較於該生產左旋白胺酸之菌株CJL8001，左旋白胺酸的濃度於 CJL8001::P(cj7)-gapN(S) 中增加約15%，且於CJL8001::P(cj7)-gapN(L)中約增加21%，兩者都導入有該gapN基因。
該 CJL8001::P(cj7)-gapN(L) 被命名為 CA13-8102 且於2019年9月2日依布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12583P。實例 5-2. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋白胺酸之菌株 KCCM11661P 及 KCCM11662P 之菌株的製備及其評估
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-1中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入麩胺酸棒狀桿菌 KCCM11661P（韓國發明專利第10-1851898號）及KCCM11662P（韓國發明專利第10-1796830號） - 其等是生產左旋白胺酸的菌株- 以製備菌株，且菌株被分別命名為KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S)、KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S)。
由此製備的菌株以上述實例5-1之相同方式培養，且在培養完成後，左旋白胺酸生產力被比較。對於各菌株中所生產的左旋白胺酸之濃度及濃度增加速率顯示於下表16中。 [表16]
菌株之名稱 左旋白胺酸濃度(g/L) 左旋白胺酸濃度增加率(%)
KCCM11661P 2.7 g/L -
KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S) 2.8 g/L 4%
KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L) 3.0 g/L 11%
KCCM11662P 3.0 g/L -
KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S) 3.1 g/L 3%
KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L) 3.3 g/L 11%
如表16中所示，經確認的是相較於生產左旋白胺酸之菌株KCCM11661P及KCCM11662P，左旋白胺酸的濃度於 KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S) 及KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S)中增加約4%，且於 KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L)中約增加11%，所有菌株都導入有該gapN基因。
由實例所獲得之結果教示導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之gapN對於屬於棒狀桿菌屬之生產左旋白胺酸之菌株中的左旋白胺酸生產為有效的。實例 6-1. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋纈胺酸之菌株的菌株之製備及其評估
為了確認導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種鏈球菌之gapN對於左旋纈胺酸生產力的效果，藉由導入一種突變（ilvN (A42V)；Biotechnology and Bioprocess Engineering , June 2014, Volume 19, Issue 3, pp. 456–467）至該野生種麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869菌株以具有左旋纈胺酸生產力而製備一變異體，且所得的重組菌株被命名為麩胺酸棒狀桿菌CJ8V。
具體而言，基於該野生種麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869菌株之基因DNA作為模版而進行PCR。為了製備用於導入A42V突變至該ilvN基因的載體，基因片段（A及B）使用SEQ ID NOS:29及30之引子對及SEQ ID NOS:31及32之引子對而獲得。PCR在以下PCR條件下進行：於94°C下，5分鐘的變性作用，隨後進行重複30個循環的94°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，60秒之聚合作用，且接著在72°C下，7分鐘之聚合作用。
結果，對於片段A及B兩者都獲得537 bp多核苷酸。重疊PCR（overlappin PCR）使用SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:32之引子，基於該兩個片段作為模版而進行以獲得1044 bp DNA片段。
所獲得之1044 bp DNA片段及以上使用之該pDZ載體被以限制酵素Xbal處理，使用配位酵素進行配位，且接著被複製以獲得一質體，其被命名為pDZ-ilvN(A42V)。 [表17]
SEQ ID NO: 序列 (5′–3′)
29 AATTTCTAGAGGCAGACCCTATTCTATGAAGG
30 AGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGAC
31 GTCCCTCGTGTCTGTAAAGACCGAAACACT
32 AATTTCTAGACGTGGGAGTGTCACTCGCTTGG
所獲得之重組質體pDZ-ilvN(A42V)藉由電穿孔法導入該野生種麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869菌株，且接著該轉化菌株於包含25毫克／升之康黴素的選擇培養基中被獲得。該等基因片段使用SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:32，基於該經轉化之麩胺酸棒狀桿菌 - 其中次級重組被完成 - 藉由PCR擴增，且接著導入有該突變的菌株由基因定序而確認。所得之重組菌株被命名為麩胺酸棒狀桿菌CJ8V。
最後，以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-3中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入具有左旋纈胺酸生產力之麩胺酸棒狀桿菌CJ8V製備菌株，且菌株被分別命名為CJ8V::P(cj7)-gapN(L)及CJ8V::Pcj7-gapN(S)。所製備的菌株被以下列方式培養以比較左旋纈胺酸生產力。
各菌株於一營養培養基中進行次培養，且接著被播種至包含25毫升生產培養基之250毫升之轉角燒瓶中並在30°C下，於200 rpm搖晃下培養72小時。接著，左旋纈胺酸的濃度藉由HPLC分析，且經分析之左旋纈胺酸濃度及濃度增加率顯示於表18中。 ＜營養培養基（pH 7.2）＞
葡萄糖10克、肉類萃取5克、聚蛋白腖10克、氯化鈉2.5克、酵母萃取5克、洋菜20克、尿素2克（基於1升之蒸餾水） ＜生產培養基（pH 7.0）＞
葡萄糖100克、硫酸銨40克、大豆蛋白2.5克、玉米浸漬固體5克、尿素3克、K2 HPO4 ) 1克、MgSO4 ·7H2 O 0.5克、生物素100微克、硫胺素-HCl 1毫克、鈣-泛酸2毫克、煙醯胺3毫克、碳酸鈣30克（基於1升之蒸餾水） [表18]
菌株名稱 左旋纈胺酸濃度(g/L) 左旋纈胺酸增加率(%)
CJ8V 3.4 g/L -
CJ8V-Pcj7/gapN(S) 3.8 g/L 12%
CJ8V-Pcj7/gapN(L) 4.0 g/L 18%
如表18中所示，經確認的是相較於控制組，CJ8V-Pcj7/gapN(L)及CJ8V-Pcj7/gapN(S)菌株之左旋纈胺酸生產力分別增加18%及12%。
結果，經確認的是導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種螺旋桿菌之gapN基因可改良屬於棒狀桿菌屬之生產左旋纈胺酸之菌株中的左旋纈胺酸生產力。
CJ8V-Pcj7/gapN(L) 被命名為 CA08-2038 且於2019年9月2日依布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12581P。實例 6-2. 導 入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋纈胺酸之菌株 KCCM11201P 之菌株的製備及其評估
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-3中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入麩胺酸棒狀桿菌KCCM11201P（韓國發明專利第10-1117022號） - 其為生產左旋纈胺酸之菌株 - 而製備菌株，且菌株被分別命名為KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S)。
為了比較左旋纈胺酸生產力，所製備之菌株以實例6-1中之相同方式培養。接著，左旋纈胺酸之濃度被分析，且左旋纈胺酸之濃度及濃度增加率被顯示於表19中。 [表19]
菌株名稱 左旋纈胺酸濃度(g/L) 左旋纈胺酸濃度增加率 (%)
KCCM11201P 2.8 g/L -
KCCM11201P:: P(cj7)-gapN(S) 3.3 g/L 17%
KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L) 3.7 g/L 32%
如表19中所示，經確認的是相較於控制組， KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S)菌株之左旋纈胺酸生產力分別增加32.1%及17.9%。
結果，經確認的是導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種螺旋桿菌之gapN基因可改良屬於棒狀桿菌屬之生產左旋纈胺酸之菌株中的左旋纈胺酸生產力。實例 7-1. 導 入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋 精 胺酸之菌株的菌株之製備及其評估
為了確認導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種鏈球菌之gapN對於左旋精胺酸生產力的效果，以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-3中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入野生種麩胺酸棒狀桿菌 ATCC21831 而製備菌株，且菌株被分別命名為ATCC21831::P(cj7)gapN(L)及ATCC21831::P(cj7)-gapN(S)。
所製備之菌株被以下列方式培養以比較左旋精胺酸生產力。各菌株於一營養培養基中進行次培養，且接著被播種至包含25毫升種子培養基之250毫升之轉角燒瓶並在30°C下，於200 rpm搖晃下培養20小時。接著，1毫升之該種子培養液被播種於包含24毫升之生產培養基之250毫升之轉角燒瓶中，並在30°C下，於200 rpm搖晃下培養72小時。該營養培養基、種子培養基及生產培養基的組成如下所示。在培養完成後，左旋精胺酸的產量藉由HPLC量測，且經分析的左旋精胺酸濃度及濃度增加率顯示於下表20中。 ＜營養培養基（pH 7.2）＞
葡萄糖10克、肉類萃取5克、聚蛋白腖10克、氯化鈉2.5克、酵母萃取5克、洋菜20克、尿素2克（基於1升之蒸餾水） ＜種子培養基（pH 7.0）＞
蔗糖20克、蛋白腖10克、酵母萃取5克、尿素1.5克、KH2 PO4 4克、K2 HPO4 8克、MgSO4 ·7H2 O 0.5克、生物素100微克、硫胺素-HCl 1毫克、鈣-泛酸2毫克、菸鹼醯胺2毫克（基於1升之蒸餾水） ＜生產培養基（pH 7.0）＞
蔗糖6%、硫酸銨3%、KH2 PO4 0.1%、MgSO4 ·7H2 O 0.2%、CSL（玉米浸漬固體）1.5%、NaCl 1%、酵母萃取0.5%、生物素100毫克／升（基於1升之蒸餾水） [表20]
菌株名稱 左旋精胺酸濃度 (g/L) 左旋精胺酸濃度增加率(%)
ATCC21831 4.1 g/L -
ATCC21831::P(cj7)gapN(S) 4.6 g/L 12%
ATCC21831::P(cj7)-gapN(L) 4.9 g/L 19%
如表20中所示，經確認的是相較於控制組， ATCC21831::P(cj7)gapN(L)及ATCC21831::P(cj7)-gapN(S)菌株之左旋精胺酸生產力分別增加19.5%及12.1%。
該 ATCC21831::P(cj7)gapN(L) 被命名為 CA06-2951 且於2019年9月2日依布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12580P。
結果，經確認的是導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種螺旋桿菌之gapN基因可改良屬於棒狀桿菌屬之生產左旋精胺酸之菌株中的左旋精胺酸生產力。實例 7-2. 導 入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產左旋 精 胺酸之菌株 KCCM10741P 之菌株的製備及其評估
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-3中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入麩胺酸棒狀桿菌 KCCM10741P （韓國發明專利第10-0791659號） - 其為生產左旋精胺酸之菌株 – 而製備菌株，且菌株被分別命名為KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S)。
為了比較左旋精胺酸生產力，由此製備的菌株以上述實例7-1之相同方式培養。接著，左旋精胺酸之濃度被分析，且經分析之左旋精胺酸濃度及濃度增加速率顯示於表21中。 [表21]
菌株名稱 左旋精胺酸濃度(g/L) 左旋精胺酸濃度增加率(%)
KCCM10741P 3.1 g/L -
KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S) 3.4 g/L 9%
KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L) 3.8 g/L 22%
如表21中所示，經確認的是相較於控制組， KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L)及KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S)菌株之左旋精胺酸生產力分別增加22.6%及9.7%。
結果，經確認的是導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種螺旋桿菌之gapN基因可改良屬於棒狀桿菌屬之生產左旋精胺酸之菌株中的左旋精胺酸生產力。實例 8-1. 導 入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產 O - 乙 醯 高絲 胺 酸之菌株的菌株之製備及其評估
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-1中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入野生種麩胺酸棒狀桿菌 ATCC13032菌株而製備菌株，且菌株被分別命名為ATCC13032::P(cj7)-gapN(L)及ATCC13032::P(cj7)-gapN(S)。所製備之菌株被以下列方式培養以比較O -乙醯高絲胺酸生產力。
各菌株被播種至包含25毫升種子培養基之250毫升之轉角燒瓶並在30°C下，於200 rpm搖晃下培養20小時。接著，1毫升之該種子培養液被播種於包含24毫升之生產培養基之250毫升之轉角燒瓶中，並在30°C下，於200 rpm搖晃下培養48小時。該種子培養基及生產培養基的組成如下所示。 ＜種子培養基（pH 7.0）＞
葡萄糖20克、蛋白腖10克、酵母萃取5克、尿素1.5克、KH2 PO4 4克、K2 HPO4 8克、MgSO4 ·7H2 O 0.5克、生物素100微克、硫胺素-HCl 1000微克、鈣-泛酸2000微克、菸鹼醯胺2000微克（基於1升之蒸餾水） ＜生產培養基（pH 7.0）＞
葡萄糖50克、(NH4 )2 SO4 12.5克、大豆蛋白2.5克、玉米浸漬固體5克、尿素3克、KH2 PO4 1克、MgSO4 ·7H2 O 0.5克、生物素100微克、硫胺素-HCl 1000微克、鈣-泛酸2000微克、菸鹼醯胺3000微克、CaCO3 30克（基於1升之蒸餾水）
在培養完成後，O -乙醯高絲胺酸生產力藉由HPLC量測。對於各測試菌株之培養液中的O -乙醯高絲胺酸濃度及濃度增加率顯示於下表22中。 [表22]
菌株名稱 O -乙醯高絲胺酸濃度(g/L) O -乙醯高絲胺酸濃度增加率(%)
ATCC13032 0.3 g/L -
ATCC13032::P(cj7)-gapN(S) 0.4 g/L 33%
ATCC13032::P(cj7)-gapN(L) 0.5 g/L 67%
如表22中所示，經確認的是相較於野生種ATCC13032菌株，O -乙醯高絲胺酸濃度於ATCC13032:::P(cj7)-gapN(S)中增加約33%，於ATCC13032::P(cj7)-gapN(L)中增加約67%，兩者都導入有該gapN基因。
該 ATCC13032:::P(cj7)-gapN(L) 被命名為 CM04-0531 且於2019年9月2日依布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12584P。實例 8-2. 導入有 衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之 gapN(L) 或 衍生自變種螺旋桿菌之 gapN(S) 於生產 O - 乙醯高絲胺酸之 麩胺酸棒狀桿菌 菌株之菌株的製備及其評估
為了確認導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種螺旋桿菌之gapN對O -乙醯高絲胺酸生產力的效果，麩胺酸棒狀桿菌之自生高絲胺酸O -乙醯轉化酶（ autogenous homoserineO -acetyltransferase）被增強。
為了擴增編碼O-乙醯高絲胺酸轉化酶（MetX）的基因，SEQ ID NOS:33及34之引子被設計用以基於衍生自野生種（WT）的經報告之序列，自一啟動子區域（位於自起始密碼子上游約300 bp）至一終止子區域（位於自停止密碼子下游約100 bp）進行擴增。該BamHI限制酵素位置被插入各SEQ ID NOS:33及34引子的兩端。在以下PCR條件下進行PCR：在95°C下，5分鐘之變性作用，隨後進行重複30個循環的95°C下，30秒之變性作用、55°C下，30秒之回溫，以及72°C下，90秒之聚合作用，且接著在72°C下，7分鐘之聚合作用。結果，在該metX基因的編碼區中獲得1546 bp DNA片段。該pECCG117載體（韓國發明專利第10-0057684號）及該metX DNA片段被以限制酵素BamHI處理，使用DNA配位酶進行配位，並被複製以獲得命名為pECCG117-metX WT的質體。 [表23]
SEQ ID NO: 序列(5′–3′)
33 GGATCCCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC
34 GGATCCCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
其中麩胺酸棒狀桿菌之自生metX被過度表現（overexpressed）的菌株藉由導入該 pECCG117-metX WT 至以上實例3-1之 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)及WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)菌株而被製備。再者，相同載體被導入該 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) 作為控制組。
所製備的菌株被以與實例8-1之燒瓶培養方法相同之方式培養以分析培養液中之O -乙醯高絲胺酸濃度及濃度增加率。結果顯示於表24中。 [表24]
菌株名稱 O- 乙醯高絲胺酸濃度(g/L) O- 乙醯高絲胺酸濃度增加率(%)
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-metX WT 2.0 g/L -
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-metX WT 2.7 g/L 35%
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-metX WT 3.1 g/L 55%
如表24中所示，經確認的是相較於 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-metX WT，O -乙醯高絲胺酸濃度於WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-metX WT 中增加約35%，於WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-metX WT中增加約55%，兩者都導入有該gapN基因。
由實例獲得的結果教示衍生自白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之gapN的導入於屬於棒狀桿菌屬之野生種菌株中的O -乙醯高絲胺酸生產為有效的。實例 9-1. 導 入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產麩胺酸之菌株的菌株之製備及其評估
為了確認導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種鏈球菌之gapN對於麩胺酸生產力的效果，以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-4中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入野生種麩胺酸棒狀桿菌 ATCC13869 菌株而製備菌株，且菌株被分別命名為 ATCC13869::P(cj7)-gapN(L)及ATCC13869::P(cj7)-gapN(S)。
各菌株被播種至包含25毫升種子培養基之250毫升之轉角燒瓶並在30°C下，於200 rpm搖晃下培養20小時。接著，1毫升之種子培養液被播種至包含25毫升之生產培養基的250毫升轉角燒瓶，並於30°C下，於200 rpm搖晃下培養40小時。該培養是在限制生物素（biotin-restricted）條件下執行。培養完成後，左旋麩胺酸濃度及濃度增加率藉由HPLC量測，且量測結果顯示於下表25中。 ＜種子培養基（pH 7.2）＞
葡萄糖1%、肉類萃取0.5%、聚蛋白腖1%、氯化鈉0.25%、酵母萃取0.5%、洋菜2%、尿素0.2% ＜生產培養基＞
粗糖6%、碳酸鈣5%、硫酸銨2.25%、KH2 PO4 0.1%、硫酸鎂0.04%、硫酸鐵10毫克／升、硫胺素-HCl 0.2毫克／升 [表25]
菌株名稱 左旋麩胺酸濃度(g/L) 左旋麩胺酸濃度增加率(%)
ATCC13869 0.5 g/L -
ATCC13869::P(cj7)-gapN(S) 0.8 g/L 60%
ATCC13869::P(cj7)-gapN(L) 0.9 g/L 80%
如表25中所示，經確認的是相較於野生種ATCC13869菌株，麩胺酸濃度於ATCC13869:::P(cj7)-gapN(S)中增加約60%，於ATCC13869:::P(cj7)-gapN(L)中增加約80%，兩者都導入有該gapN基因。
ATCC13869::P(cj7)-gapN(L) 被命名為 CA02-1360 且於2019年9月2日依布達佩斯條約寄存於韓國微生物保藏中心，寄存編號為No. KCCM12587P。實例 9-2. 導入有 gapN(L) 或 gapN(S) 於生產麩胺酸之菌株 KFCC11074 之菌株的製備及其評估
以上述實例2-1中之相同方式，藉由將實例1-1-4中製備之質體及實例1-2中製備之質體導入麩胺酸棒狀桿菌 KFCC11074 菌株（韓國發明專利第10-0292299號）- 其為生產左旋麩胺酸之菌株 - 而製備菌株，且菌株被分別命名為KFCC11074::P(cj7)-gapN(L)及KFCC11074::P(cj7)-gapN(S)。
所製備的菌株以與實例10-1之相同方式被培養以比較左旋麩胺酸生產力。培養完成後，左旋麩胺酸濃度被分析，且經分析之左旋麩胺酸濃度及濃度增加率顯示於表26中。 [表26]
菌株名稱 左旋麩胺酸濃度(g/L) 左旋麩胺酸濃度增加率(%)
KFCC11074 11.8 g/L -
KFCC11074::P(cj7)-gapN(S) 14.5 g/L 22%
KFCC11074::P(cj7)-gapN(L) 16.2 g/L 37%
如表26中所示，經確認的是相較於KFCC11074，麩胺酸濃度於 KFCC11074::P(cj7)-gapN(S) 中增加約22.9%，於KFCC11074::P(cj7)-gapN(L)中增加約37.3，兩者都導入有該gapN基因。
結果，經確認的是導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種螺旋桿菌之gapN基因可改良屬於棒狀桿菌屬之生產左旋麩胺酸之菌株中的左旋麩胺酸生產力。
總而言之，由實例1至9獲得的結果教示導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種或變種螺旋桿菌之gapN基因可以改良屬於棒狀桿菌屬之生產左旋麩胺酸之菌株中的左旋胺基酸生產力，尤其經確認的是相較於導入衍生自變種螺旋桿菌之gapN基因，導入衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種之gapN基因顯示優越的左旋胺基酸生產力。
本發明所屬技術領域具有通常知識者將能夠了解本發明可在不偏離本發明之技術概念或是必要特徵之下以其他具體形式實施。本文敘述的實施例就各方面而言僅為示例性而非限制性的。因此，本發明之範圍是由所附之申請專利範圍而不是由前述說明所表示。在本發明之申請專利範圍的意義及等效內容之範圍內的所有改變是涵蓋於本發明的範圍內。
(無)
寄存機構：韓國微生物保藏中心 寄存編號：KCCM12580P、 KCCM12581P、KCCM12582P、KCCM12583P、KCCM12584P、KCCM12585P、KCCM12586P、KCCM12587P 寄存日期：2019年9月2日
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
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(無)

Claims (7)

  1. 一種用於生產左旋胺基酸的方法，包含： 於一培養基中培養含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶的棒狀桿菌屬之一微生物；以及 自經培養之該微生物或經培養之該培養基回收一左旋胺基酸。
  2. 如請求項1之方法，其中該SEQ ID NO:1之胺基酸序列是衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ）。
  3. 如請求項1之方法，其中棒狀桿菌屬之該微生物為麩胺酸棒狀桿菌。
  4. 一種具有經增加之左旋胺基酸生產力的棒狀桿菌屬之微生物，其含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
  5. 如請求項4所述之微生物，其中該SEQ ID NO:1之胺基酸序列是衍生自戴白氏乳酸桿菌保加利亞亞種。
  6. 如請求項4所述之微生物，其中棒狀桿菌屬之該微生物為麩胺酸棒狀桿菌。
  7. 一種使用棒狀桿菌屬之微生物生產左旋胺基酸的用途，該微生物含有包括SEQ ID NO:1之胺基酸序列之NADP依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
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