BR112021007124A2 - Método para produzir aminoácidos l com o uso do micro-organismo contendo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de nadp - Google Patents

Método para produzir aminoácidos l com o uso do micro-organismo contendo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de nadp Download PDF

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Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR AMINOÁCIDOS L COM O USO DO MICRO-ORGANISMO CONTENDO GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE DEPENDENTE DE NADP. A presente revelação refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade de produção de aminoácidos L aumentada, contendo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP derivada do gênero Lactobacillus. De acordo com a presente revelação, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP derivada de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus é introduzida para aumentar o poder de redução através da atividade da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP derivada, aumentando, assim, a capacidade de produção de aminoácidos L das cepas que pertencem ao gênero Corynebacterium.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO PARA PRODUZIR AMINOÁCIDOS L COM O USO DO MICRO-ORGANISMO CONTENDO GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE DEPENDENTE DE NADP” [CAMPO DA TÉCNICA]
[001] A presente revelação refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade de aminoácidos L aumentada, contendo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, e um método para produzir aminoácidos L usando o mesmo. [ANTECEDENTES DA TÉCNICA]
[002] Os micro-organismos do gênero Corynebacterium são micro-organismos Gram-positivos que são frequentemente usados na produção industrial de substâncias com várias aplicações, como rações, produtos farmacêuticos, e alimentos, incluindo aminoácidos L e vários ácidos nucleicos. Nos últimos anos, diaminas e cetoácidos foram produzidos a partir de micro-organismos do gênero Corynebacterium.
[003] A fim de produzir produtos úteis por meio da fermentação microbiana, a demanda por uma fonte de energia ou potência reduzida aumentou, junto com a de fortalecer a via biossintética de um produto alvo em micro-organismos. Entre esses, o NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato) é um elemento essencial no fornecimento de potência reduzida. A forma oxidada NADP+ e a forma reduzida NADPH são materiais de transferência de elétrons in vivo e estão envolvidos em vários processos de síntese. Entre as vias metabólicas centrais, NADPH é conhecido por ser produzido principalmente por 1) a via da pentose fosfato oxidativa e 2) a isocitrato desidrogenase dependente de NADP (gene Icd) da via TCA. Além disso, vários micro- organismos têm a enzima malato, glicose desidrogenase, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não fosforilante como várias vias alternativas para fornecer NADPH.
[004] Ademais, independentemente da via metabólica central, as enzimas produtoras de NADPH incluem transidrogenase, Ferredoxina: NADP+ oxidoredutase, etc. (Spaans et al., 2015, NADPH-generating systems in bacterias and archaea, Front. Microbiol. 6:742). [REVELAÇÃO] [PROBLEMA TÉCNICO]
[005] Os presentes inventores fizeram esforços intensivos para aumentar a produção de cada aminoácido em micro-organismos produtores de aminoácido e,
como resultado, através de vários estudos para introduzir o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, eles confirmaram que a produção de aminoácidos e seus precursores são aumentados em micro-organismos do gênero Corynebacterium, completando assim a presente revelação. [SOLUÇÃO TÉCNICA]
[006] Um objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir aminoácidos L, que compreende: cultivar um micro-organismo do gênero Corynebacterium que contém gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em um meio; e recuperar aminoácidos L do micro-organismo cultivado ou meio de cultura.
[007] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade de aminoácidos L aumentada, que contém gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer o uso da produção de aminoácido L de um micro-organismo do gênero Corynebacterium que contém gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. [EFEITOS VANTAJOSOS]
[009] De acordo com a presente revelação, um gapN codificador de gene derivado de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus é introduzido para aumentar a potência reduzida por meio da atividade de gapN, aumentando assim a capacidade de produção de aminoácido L do micro-organismo do gênero Corynebacterium. [DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO]
[010] A presente revelação será descrita em detalhes como segue. Enquanto isso, cada descrição e modalidade revelada no presente documento também pode ser aplicada a outras descrições e modalidades. Ou seja, todas as combinações de vários elementos revelados no presente documento caem dentro do escopo da presente revelação. Ademais, o escopo da presente revelação não é limitado pela descrição específica abaixo.
[011] Para alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação é fornecer um método para produzir aminoácidos L, que compreende: cultivar um micro- organismo do gênero Corynebacterium que contém gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em um meio; e recuperar aminoácidos L do micro-organismo cultivado ou meio de cultura.
[012] Na presente revelação, o termo “gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP” se refere a um polipeptídeo que tem uma atividade de conversão de gliceraldeído-3-fosfato como um substrato em 3-fosfoglicerato usando NADP como uma coenzima. Exemplos do gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode incluir gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP que é derivado de animais, plantas, e bactérias. Especificamente, o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ser derivado de bactérias, mais especificamente, derivado de Lactobacillus sp., e de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. O gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ser, por exemplo, um polipeptídeo que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. O polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser usada de forma intercambiável com um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[013] Na presente revelação, SEQ ID NO: 1 se refere a uma sequência de aminoácidos que tem a atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP. Especificamente, SEQ ID NO: 1 pode ser uma sequência de polipeptídeos que tem a atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP codificada pelo gene gapN. Para o propósito da presente revelação, o polipeptídeo pode ser derivado de Lactobacillus sp. e, especificamente, de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, mas não está limitado a isso, e pode incluir qualquer sequência, sem limitação, desde que tenha a mesma atividade que o aminoácido. A sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser obtida de NIH GenBank, um banco de dados conhecido. Adicionalmente, embora o polipeptídeo que tem a atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP é definida na presente revelação como o polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, ele não exclui a mutação que pode ocorrer por uma sequência sem sentido a montante ou a jusante da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou que pode ocorrer naturalmente, ou uma mutação silenciosa da mesma. É evidente para que aqueles versados na técnica que qualquer polipeptídeo que tem a mesma atividade ou atividade correspondente ao do polipeptídeo que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode cair no escopo do polipeptídeo que tem a atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP da presente revelação. Em um exemplo específico, o polipeptídeo que tem a atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP da presente revelação pode ser um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou um polipeptídeo composto de uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Ademais, é evidente que qualquer polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos, na qual parte da sequência de aminoácidos é deletada, modificada, substituída, ou adicionada, também pode cair dentro do escopo do polipeptídeo direcionado para modificação da presente revelação desde que inclua uma sequência de aminoácidos que tem tal homologia ou identidade e que exibe um efeito correspondente ao do polipeptídeo acima.
[014] Ou seja, na presente revelação, embora seja descrito como “uma proteína ou polipeptídeo composto de uma sequência de aminoácidos de um SEQ ID NO específica”, é evidente que qualquer polipeptídeo que tenha deleção, modificação, substituição, ou adição em parte da sequência de aminoácidos também pode ser usada na presente revelação, desde que o polipeptídeo tenha a mesma atividade ou atividade correspondente ao polipeptídeo composto da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Por exemplo, é evidente que o “polipeptídeo composto da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1” pode cair dentro do escopo do “polipeptídeo composto da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1” desde que o polipeptídeo tenha a mesma atividade ou atividade correspondente.
[015] Na presente revelação, o gapN codificador de gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP é o gene gapN, e o gene pode ser derivado de bactérias e, mais especificamente, derivado de um micro-organismo do gênero Lactobacillus, mas o micro-organismo não é particularmente limitado, desde que seja um micro-organismo do gênero Lactobacillus capaz de expressar o gene gapN. Especificamente, o micro-organismo do gênero Lactobacillus pode ser Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. O gene pode ser uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e, mais especificamente, uma sequência que inclui uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, mas não está limitado a ela. O polinucleotídeo que inclui a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 pode ser usado de forma intercambiável com um polinucleotídeo que tem a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 e um polinucleotídeo composto da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2.
[016] Conforme usado no presente documento, o termo “polinucleotídeo”, que se refere a um polímero de nucleotídeos composto de monômeros de nucleotídeos conectados em uma longa cadeia por ligações covalentes, significa uma fita de DNA ou RNA que tem pelo menos um determinado comprimento e, mais especificamente, um fragmento de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo modificado.
[017] Especificamente, devido à degenerescência do códon ou em consideração aos códons preferidos em um organismo em que o polipeptídeo deve ser expresso, o polinucleotídeo da presente revelação pode sofrer várias modificações na região de codificação dentro do escopo que não altera a sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Especificamente, qualquer sequência polinucleotídica que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser incluída sem limitação.
[018] Além disso, um sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida, por exemplo, qualquer sequência que pode hibridizar com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência de nucleotídeos sob condições rigorosas para codificar um polipeptídeo que tem a atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 pode ser incluída sem limitação. As “condições rigorosas” referem-se a condições sob as quais a hibridização específica entre polinucleotídeos é permitida. Tais condições são especificamente descritas na literatura (consultar J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova York, 9,50–9,51, 11,7–11,8). Por exemplo, as condições rigorosas podem incluir condições sob as quais os genes que têm uma alta homologia ou identidade de 40% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou mais, e ainda muito mais especificamente 99% ou mais são hibridizadas entre si e os genes que têm uma homologia ou identidade menor que as homologias ou identidades acima não são hibridizadas entre si, ou condições de lavagem de hibridização Southern, ou seja, lavando uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60°C, 1× SSC, e 0,1% SDS; especificamente, 60 °C, 0,1× SSC, e 0,1% SDS; e, mais especificamente, 68 °C, 0,1× SSC, e 0,1% SDS.
[019] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora sejam possíveis desajustes entre as bases dependendo do rigor da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre as bases de nucleotídeos que podem hibridizar entre si. Por exemplo, no que diz respeito ao DNA, a adenosina é complementar à timina, e a citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação pode incluir fragmentos de nucleotídeos isolados complementares a toda a sequência, bem como sequências de ácido nucleico substancialmente semelhantes às mesmas.
[020] Especificamente, os polinucleotídeos que tem uma homologia ou identidade podem ser detectados com o uso das condições de hibridização que inclui uma etapa de hibridização a um valor Tm de 55 °C sob as condições acima descritas. Além disso, o valor Tm pode ser 60 °C, 63 °C, ou 65 °C, mas não está limitado aos mesmos, e pode ser ajustado de forma apropriada por aqueles versados na técnica, dependendo da finalidade do mesmo.
[021] O rigor apropriado para hibridizar polinucleotídeos depende do comprimento dos polinucleotídeos e o grau de complementação, e essas variáveis são bem conhecidas na técnica (consultar Sambrook et al.).
[022] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” refere-se a um grau de relevância entre dias determinadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos, e pode ser expresso por uma porcentagem. Os termos “homologia” e “identidade” podem frequentemente ser usados de forma intercambiável entre si.
[023] A homologia de sequência ou identidade de sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeos conservadas pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com uma penalidade de lacuna estabelecida pelo programa que está sendo usado. Geralmente espera-se que sequências substancialmente homólogas ou idênticas hibridizem com todas ou pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%. Ou 90% de todo o comprimento das sequências sob condições moderadas ou altamente rigorosas. Os polinucleotídeos que contêm códons degenerados em vez de códons em polinucleotídeos de hibridização também são considerados.
[024] Se quaisquer duas sequências polinucleotídicas tiverem uma homologia, similaridade, ou identidade pode ser determinado, por exemplo, por um algoritmo de computador conhecido, como o programa “FASTA” (Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444) que usa parâmetros padrão. Alternativamente, pode ser determinado pelo algoritmo Needleman–Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), que é realizado usando o programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (de preferência, versão 5.0.0 ou versões posteriores) (pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J MOLEC BIOL 215: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, e CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, a homologia, similaridade, ou identidade pode ser determinada usando BLAST ou ClustalW do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI).
[025] A homologia, similaridade, ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se informações de sequência usando, por exemplo, o programa de computador GAP, como o Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443 conforme revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Em resumo, o programa GAP define a homologia, similaridade, ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos alinhados de forma semelhante (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total dos símbolos na mais curta das duas sequências. Os parâmetros padrões para o programa GAP podem incluir (1) uma matriz de comparação unária (que contém um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353 a 358 (1979) (ou matriz de substituição EDNAFULL versão (EMBOSS de NCBI NUC4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou uma penalidade de abertura de 10 e uma penalidade de extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade para lacunas nas extremidades.
[026] Ademais, se quaisquer duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas têm uma homologia, similaridade, ou identidade entre si, pode ser identificado comparando-se as sequências em um experimento de hibridização Southern sob condições rigorosas conforme definido, e condições de hibridização apropriadas definidas estão dentro da habilidade da técnica, e pode ser determinado por um método bem conhecido dos versados na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989; F. M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova York).
[027] O gene codificador de a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ser introduzido no micro-organismo do gênero Corynebacterium por um método convencional conhecido na técnica, e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ser expressa no micro-organismo do gênero Corynebacterium.
[028] Tal como no presente documento, o termo “a ser expresso/que é expresso” refere-se a um estado em que um polipeptídeo alvo é introduzido em um micro- organismo ou em que um polipeptídeo alvo é modificado para ser expresso no micro- organismo. Para o propósito da presente revelação, o “polipeptídeo alvo” pode ser a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP descrita acima.
[029] Especificamente, conforme usado no presente documento, o termo “introdução de um polipeptídeo” significa que um micro-organismo exibe a atividade de um polipeptídeo alvo que não era originalmente possuído pelo micro-organismo. Por exemplo, pode significar que um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo alvo é introduzido no cromossomo do micro-organismo, ou um vetor que contém o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo alvo é introduzido no micro-organismo, e assim, exibe sua atividade. Mesmo se o polipeptídeo alvo já estiver presente no micro- organismo, a expressão ou atividade polipeptídica no micro-organismo pode ser aumentada ou intensificada em comparação com a de um micro-organismo não modificado, devido à introdução do polipeptídeo alvo no micro-organismo.
[030] Além disso, conforme usado no presente documento, o termo “intensificação da atividade” significa que a atividade de uma proteína específica em um micro-organismo é intensificada em comparação com sua atividade endógena ou um atividade de um polipeptídeo em um micro-organismo não modificado. Conforme usado no presente documento, o termo “atividade endógena” refere-se à atividade de uma proteína específica originalmente possuída por uma cepa parental antes da transformação, quando um traço de um micro-organismo é alterado devido à modificação genética causada por um fator natural ou fator artificial.
[031] Especificamente, a intensificação da atividade pode ser alcançada por um ou mais dos seguintes métodos selecionados a partir do grupo que consiste em: um método de introdução do polipeptídeo no micro-organismo, um método de aumento do número de cópias intracelulares de um gene codificador de o polipeptídeo; um método de introdução de modificação na sequência de controle de expressão de um gene codificador de o polipeptídeo; um método de substituição da sequência de controle de expressão de um gene codificador de o polipeptídeo com uma sequência que tem forte atividade, e um método de introdução adicional de modificação em um gene codificador de o polipeptídeo de modo que a atividade polipeptídica seja intensificada, mas não se limite a isso.
[032] No acima, o método de introdução do polipeptídeo no micro-organismo ou o método de aumento do número de cópias intracelulares de um gene pode ser realizado inserindo-se um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo no cromossomo ou plasmídeo do micro-organismo usando um vetor, mas não é particularmente limitado a isso. Especificamente, o método pode ser realizado introduzindo-se um vetor que é operacionalmente ligado ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente revelação e é capaz de se replicar e funcionar independentemente da célula hospedeira. Alternativamente, o método pode ser realizado introduzindo-se um vetor, que é capaz de inserir o polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira e está operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, no cromossomo de uma célula hospedeira. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser alcançada por um método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga.
[033] Em seguida, a modificação da sequência de controle de expressão de modo aumentar a expressão do polinucleotídeo pode ser realizada induzindo-se uma modificação na sequência por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de nucleotídeos, ou uma combinação das mesmas para intensificar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão, ou substituindo-se a sequência polinucleotídica por uma sequência de ácido nucleico que tem uma atividade mais forte, mas não está particularmente limitada a ela. A sequência de controle de expressão pode incluir, mas não está limitada a, um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossomo, e uma sequência que regula a terminação da transcrição e tradução.
[034] Especificamente, um promotor forte, em vez do promotor original, pode ser conectado à região a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo. Exemplos do promotor forte pode incluir promotores cj1 a cj7 (Patente Coreana Nº. 10- 0620092), promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR de fago lamdba, promotor PL, promotor tet, promotor gapA, promotor SPL7, promotor SPL13 (sm3) (Patente Coreana Nº. 10-1783170), promotor O2 (Patente Coreana Nº. 10- 1632642), promotor tkt, e promotor yccA, mas não está limitado a isso.
[035] Além disso, embora não seja particularmente limitado a isso, a modificação da sequência polinucleotídica no cromossomo pode ser realizada introduzindo-se uma modificação na sequência de controle de expressão por deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de ácido nucleico, ou uma combinação das mesmas para intensificar ainda mais a atividade da sequência polinucleotídica, ou substituindo-se a sequência polinucleotídica por uma sequência polinucleotídica modificada para ter uma atividade mais forte.
[036] A introdução e intensificação da atividade polipeptídica pode ser um aumento na atividade ou concentração do polipeptídeo correspondente em comparação com a atividade ou concentração do polipeptídeo em uma cepa microbiana do tipo selvagem ou não modificada, mas não está limitada a isso.
[037] Especificamente, a introdução ou intensificação da atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ser alcançada preparando-se um vetor recombinante para expressão contendo um gene codificador de o mesmo, e introduzindo o vetor no micro-organismo do gênero Corynebacterium para produzir um micro-organismo transformado do gênero Corynebacterium. Ou seja, o micro-organismo que contém o gene codificador de a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ser um micro-organismo recombinante produzido por transformação em um vetor que contém o gene, mas não está limitado a ele.
[038] Conforme usado no presente documento, o termo “vetor” refere-se a um produto de DNA que contém uma sequência de controle apropriada e uma sequência de nucleotídeos de um polipeptídeo alvo para expressar o polipeptídeo alvo em um hospedeiro adequado. A sequência de controle pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição, uma sequência de operador arbitrária para controlar a transcrição, uma sequência que codifica um local de ligação ao ribossomo de mRNA apropriado, e sequências para controlar a terminação da transcrição e tradução. Uma vez transformado em uma célula hospedeira adequada, o vetor pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode ser integrado no próprio genoma.
[039] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, desde que seja capaz de se replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos do vetor convencionalmente usado podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus, e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor fago ou vetor cosmídeo, pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, e Charon21A podem ser usados; e como um vetor de plasmídeo, aqueles com base em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pET, pMal, pQE, e pCL podem ser usados. Especificamente, podem ser usados os vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, e pCC1BAC.
[040] O vetor recombinante para expressão de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ser preparado por um método convencional. Ou seja, pode ser preparado ligando-se a sequência genética da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP a um vetor apropriado usando uma enzima de restrição.
[041] Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo alvo pode ser inserido no cromossomo usando um vetor recombinante para a expressão do polipeptídeo. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por recombinação homóloga, mas o método não está limitado a isso. Além disso, o vetor pode incluir adicionalmente um marcador de seleção para confirmar a inserção no cromossomo. O marcador de seleção é para selecionar as células transformadas com o vetor, ou seja, para confirmar se a molécula de ácido nucleico alvo foi inserida, e marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis, como resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes tóxicos celulares, ou expressão de polipeptídeos de superfície, pode ser usado. Nas circunstâncias de serem tratados com um agente seletivo, apenas as células que expressam o marcador de seleção podem sobreviver ou expressar outros tipos de traços fenotípicos e, assim, as células transformadas podem ser selecionadas.
[042] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” refere- se à introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo alvo em uma célula hospedeira de modo que o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo possa ser expresso em uma célula hospedeira. Contanto que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, não importa se o polinucleotídeo transformado está integrado no cromossomo da célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado extracromossomicamente, e ambos os casos podem ser incluídos. Além disso, o polinucleotídeo pode incluir DNA e RNA que codificam a proteína alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma, desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene que inclui todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. O cassete de expressão pode comumente incluir um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, um terminador de transcrição, um local de ligação ao ribossomo, ou um terminador de tradução. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira como está e operacionalmente ligado a sequências necessárias para a expressão na célula hospedeira, mas não está limitado às mesmas.
[043] Além disso, conforme usado no presente documento, o termo “operacionalmente ligado” significa que a sequência genética está funcionalmente ligada a uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo alvo da presente revelação.
[044] O método de transformação do vetor da presente revelação inclui qualquer método de introdução de um ácido nucleico em uma célula e pode ser realizado selecionando-se uma técnica padrão adequada conhecida na técnica, que depende da célula hospedeira. Por exemplo, o método pode incluir eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, um método de polietilenoglicol (PEG), um método DEAE–dextrano, um método de lipossoma catiônico, e um método de acetato de lítio–DMSO, mas não está limitado a isso.
[045] Para os fins da presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium, que é geneticamente modificado ao expressar a gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase dependente de NADP que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, pode ser um micro-organismo com uma capacidade de aminoácidos L aumentada em comparação a um micro-organismo não modificado.
[046] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo produtor de aminoácido L” ou “micro-organismo produtor de aminoácido L de Corynebacterium” inclui todos os micro-organismos ou micro-organismos do gênero Corynebacterium em que ocorre uma modificação genética natural ou artificial, e pode se referir a um micro-organismo do gênero Corynebacterium no qual ocorrer uma mutação genética ou em que a atividade é aumentada para a produção dos aminoácidos L desejados como um micro-organismo que tem um mecanismo específico enfraquecido ou intensificado devido à inserção de um gene estranho, ou intensificação ou inativação da atividade de um gene endógeno.
[047] Especificamente, o micro-organismo produtor de aminoácido L pode ser um micro-organismo no qual a capacidade de produção de aminoácido L desejada é intensificada devido a intensificação da atividade da parte dos polipeptídeos envolvidos na via de biossíntese de aminoácido L desejada ou enfraquecimento da atividade da parte de polipeptídeos envolvidos na via de degradação do aminoácido L desejada. Por exemplo, o micro-organismo pode ser um micro-organismo no qual a atividade de aspartato quinase (lysC), homosserina desidrogenase (hom), L-treonina desidratase (ilvA), 2-isopropilmalato sintase (leuA), acetolactato sintase (ilvN), ou/e a homosserina O-acetiltransferase (metX) é intensificada. Além disso, o micro- organismo pode incluir, por exemplo, um gene ou um polipeptídeo que é modificado para ter resistência à inibição por retroalimentação de modo a intensificar a atividade. Ademais, o micro-organismo pode, por exemplo, ter uma atividade enfraquecida ou inativada de vários genes ou polipeptídeos que degradam os aminoácidos L desejados. Além disso, o micro-organismo pode ser, por exemplo, um micro- organismo que tem uma aminoácidos L aumentada devido à mutação aleatória, mas não está limitado a isso. Ou seja, o micro-organismo pode ser um micro-organismo no qual a produção de aminoácidos L desejada é aumentada através da intensificação da atividade polipeptídica envolvido na via biossintética de aminoácido L desejada ou através da inativação/enfraquecimento da atividade polipeptídica envolvido na via de degradação.
[048] Conforme descrito acima, a intensificação da atividade polipeptídica pode ser alcançada pelo aumento do número de cópias intracelulares dos genes que codificam o polipeptídeo; introduzindo-se uma mutação em um gene cromossômico que codifica o polipeptídeo e/ou sua sequência de controle de expressão; substituindo-se a sequência de controle de expressão do gene no cromossomo que codifica o polipeptídeo com uma sequência que tem forte atividade; introduzindo-se uma mutação em uma parte do gene no cromossomo que codifica o polipeptídeo para aumentar a expressão do polipeptídeo ou para ter resistência à inibição por retroalimentação; ou uma combinação dos mesmos, mas não está limitado aos mesmos.
[049] Conforme usado no presente documento, o termo “enfraquecimento/inativação da atividade polipeptídica” significa que uma cepa natural do tipo selvagem, uma cepa parental, ou o polipeptídeo correspondente não tem expressão da enzima ou polipeptídeo, ou não tem atividade ou atividade diminuída, embora expressa, em comparação a uma cepa não modificada. No presente documento, a diminuição é um conceito abrangente, que inclui o caso em que a própria atividade polipeptídica é diminuída em comparação à atividade do polipeptídeo originalmente possuído por um micro-organismo devido à mutação do gene codificador de o polipeptídeo, modificação da sequência de controle de expressão, ou deleção em uma parte ou todos os genes, etc.; o caso em que o nível geral de atividade polipeptídica intracelular é diminuído em comparação ao de uma cepa natural ou uma cepa antes da modificação devido à inibição da expressão do gene codificador de o polipeptídeo ou a inibição de tradução; e uma combinação dos mesmos. Na presente revelação, a inativação pode ser alcançada aplicando-se vários métodos bem conhecidos na técnica. Exemplos dos métodos podem incluir um método para deletar uma parte ou todos os genes que codificam o polipeptídeo; um método para modificar a sequência de controle de expressão de modo que a expressão do gene seja diminuída; um método para modificar a sequência genética que codifica o polipeptídeo de modo que a atividade polipeptídica seja removida ou enfraquecida; um método para introduzir um oligonucleotídeo antissenso (por exemplo, RNA antissenso) que se liga de forma complementar ao transcrito do gene codificador de o polipeptídeo; um método para incorporar uma sequência complementar à sequência Shine–Dalgarno a montante da sequência Shine– Dalgarno do gene codificador de o polipeptídeo para formar uma estrutura secundária, inibindo assim a fixação ribossômica; e um método de engenharia de transcrição reversa (RTE) para incorporar um promotor no terminal 3′ de uma estrutura de leitura aberta (ORF) da sequência polinucleotídica do gene codificador de o polipeptídeo de modo que seja transcrita de forma reversa; e uma combinação das mesmas.
[050] No entanto, como um exemplo do método descrito acima, um método para intensificar ou inativar a atividade de um polipeptídeo e um método para manipulação genética são conhecidos na técnica, e o micro-organismo produtor de aminoácido L pode ser preparado aplicando-se vários métodos conhecidos.
[051] Para o fim da presente revelação, o micro-organismo produtor de aminoácido L do gênero Corynebacterium que contém a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode produzir os aminoácidos L desejados em excesso a partir de uma fonte de carbono no meio, em comparação a uma cepa do tipo selvagem não modificada ou um mutante não modificado, conforme descrito acima. Na presente revelação, o “micro-organismo produtor de aminoácido L do gênero Corynebacterium” pode ser usado de forma intercambiável com “uma cepa do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade de produzir um aminoácido L” ou “uma cepa produtora de aminoácido L do gênero Corynebacterium”.
[052] O micro-organismo produtor de aminoácido L do gênero Corynebacterium, que é modificado para expressar o polipeptídeo que tem a atividade da gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, não está limitado desde que seja um micro-organismo do gênero Corynebacterium que possa produzir aminoácidos L. Especificamente, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser qualquer um ou mais selecionados o grupo que consiste em Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, e Corynebacterium flavescens, e especificamente, pode ser Corynebacterium glutamicum, mas não está limitado a isso.
[053] O micro-organismo produtor de aminoácido L do gênero Corynebacterium pode ser um micro-organismo recombinante. O micro-organismo recombinante é conforme descrito acima.
[054] Conforme usado no presente documento, o termo “cultivo” significa que o micro-organismo é cultivado sob condições ambientais controladas de forma apropriada. O processo de cultivo da presente revelação pode ser realizado em um meio de cultura adequado e sob condições de cultura conhecidas na técnica. Tal processo de cultivo pode ser facilmente ajustado para uso por aqueles versados na técnica de acordo com a cepa a ser selecionada. Especificamente, o cultivo pode ser uma cultura descontínua, uma cultura contínua, e uma cultura descontínua alimentada, mas não está limitada a elas.
[055] Conforme usado no presente documento, o termo “meio” refere-se a uma mistura de materiais que contém materiais nutrientes necessários para o cultivo do micro-organismo como um ingrediente principal, e fornece materiais nutrientes e fatores de crescimento, junto com água que é essencial para a sobrevivência e o crescimento. Especificamente, o meio e outras condições de cultura usadas para cultivar o micro-organismo da presente revelação podem ser qualquer meio usado para cultivo convencional de micro-organismos sem qualquer limitação específica. No entanto, o micro-organismo da presente revelação pode ser cultivado sob condições aeróbicas em um meio convencional que contém uma fonte de carbono apropriada, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo, composto inorgânico, aminoácido, e/ou vitamina, enquanto se ajusta a temperatura, pH, etc. Especificamente, o meio de cultura para as cepas do gênero Corynebacterium pode ser encontrado na literatura (“Manual of Methods for General Bacteriology” pela American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)).
[056] Na presente revelação, a fonte de carbono pode incluir carboidratos, como glicose, sacarose, lactose, frutose, sacarose, maltose, etc.; álcoois de açúcar, como manitol, sorbitol, etc.; ácidos orgânicos, como ácido pirúvico, ácido lático, ácido cítrico, etc.; e aminoácidos, como ácido glutâmico, metionina, lisina, etc. Além disso, a fonte de carbono pode incluir nutrientes orgânicos naturais, como hidrolisado de amido, melaço, melaço de blackstrap, farelo de arroz, mandioca, melaço de cana de açúcar, licor de maceração de milho, etc. Especificamente, carboidratos como glicose e melaço pré-tratado (isto é, melaço convertido em açúcar redutor) podem ser usados e, além disso, várias outras fontes de carbono em uma quantidade apropriada podem ser usadas sem limitação. Essas fontes de carbono podem ser usadas sozinhas ou em combinação de dois ou mais tipos, mas não estão limitadas a isso.
[057] A fonte de nitrogênio pode incluir fontes de nitrogênio inorgânico, como amônia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, etc.; aminoácidos, como ácido glutâmico, metionina, glutamina, etc.; e fontes de nitrogênio orgânicas, como peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, licor de maceração de milho, hidrolisado de caseína, peixe ou produtos de decomposição do mesmo, bolo de soja desengordurado ou produtos de decomposição do mesmo, etc. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas sozinhas ou em uma combinação de dois ou mais tipos, mas não estão limitados a isso.
[058] A fonte de fósforo pode incluir fosfato monopotássico, fosfato dipotássico, ou sais que contém sódio correspondentes, etc. Exemplos do composto inorgânico pode incluir cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês, carbonato de cálcio, etc. Além disso, aminoácidos, vitaminas, e/ou precursores apropriados podem ser incluídos. Esses ingredientes ou precursores constituem podem ser adicionados a um meio em uma cultura descontínua ou de maneira contínua, mas essas fontes de fósforo não estão limitadas a isso.
[059] Na presente revelação, o pH de um meio pode ser ajustado durante o cultivo de um micro-organismo adicionando-se um composto como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônio, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, etc. para o meio de uma maneira apropriada. Além disso, durante o cultivo, um agente antiespuma como éster de poliglicol de ácido graxo pode ser adicionado para gerar a geração de espuma. Além disso, oxigênio ou gás que contém oxigênio pode ser injetado no meio a fim de manter um estado aeróbico do meio; ou nitrogênio, hidrogênio, ou gás dióxido de carbono podem ser injetados sem a injeção de gás a fim de manter um estado anaeróbico ou microaeróbico do meio, mas o gás não está limitado a isso.
[060] A temperatura média pode ser em uma faixa de 20 °C a 45 °C, e especificamente, de 25 °C a 40 °C, mas não está limitado a isso. O cultivo pode ser contínuo até que os materiais úteis sejam obtidos em quantidades desejadas, e especificamente por 10 a 160 horas, mas não está limitado a isso.
[061] Os aminoácidos L produzidos pelo cultivo podem ser liberados no meio ou podem não ser liberados e permanecer nas células.
[062] No método de recuperação dos aminoácidos L produzidos no cultivo da presente revelação, os aminoácidos L desejados podem ser coletados a partir da solução de cultura com o uso de métodos apropriados conhecidos na técnica dependendo do método de cultivo. Por exemplo, métodos como centrifugação, filtração, cromatografia de troca iônica, cristalização, e HPLC podem ser usados, e os aminoácidos L desejados podem ser recuperados do meio ou micro-organismo com o uso de um método adequado conhecido na técnica.
[063] Ademais, a recuperação pode incluir adicionalmente um processo de purificação, que pode ser realizado usando um método apropriado conhecido na técnica. Assim, os aminoácidos L recuperados podem estar em um estado purificado ou em um caldo de fermentação microbiana que contém os aminoácidos L (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).
[064] Os aminoácidos L produzidos a partir do método para produzir aminoácidos L de acordo com a presente revelação não são limitados por tipo. Ou seja, os aminoácidos L que podem ser produzidos a partir dos micro-organismos do gênero Corynebacterium podem incluir qualquer aminoácido L sem limitação, e intermediários dos aminoácidos L também podem ser incluídos. Os aminoácidos L podem ser, por exemplo, L-arginina, L-histidina, L-lisina, L-ácido aspártico, L-ácido glutâmico, L- serina, L-treonina, L-asparagina, L-glutamina, L-tirosina, L-alanina, L-isoleucina, L- leucina, L-valina, L-fenilalanina, L-metionina, L-triptofano, glicina, L-prolina, e L- cisteína, e especificamente, pode ser L-lisina, L-treonina, L-isoleucina, L-leucina, L- valina, L-arginina, e L-ácido glutâmico, mas não está limitado a isso. O intermediário dos aminoácidos L podem ser, por exemplo, O-acetil homosserina, mas não está limitado a isso.
[065] Outro aspecto da presente revelação é fornecer um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade de aminoácidos L aumentada, que contém gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[066] A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, o gene codificador de a mesma, a expressão da mesma, e o micro-organismo do gênero Corynebacterium conforme descrito acima.
[067] Na presente revelação, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que contém o gene codificador de a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP pode ter uma capacidade de produção de aminoácido L aumentada ou melhorada em comparação a um micro-organismo não modificado devido à expressão da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP.
[068] O micro-organismo do gênero Corynebacterium da presente revelação é um micro-organismo capaz de produzir aminoácidos L, e pode incluir não apenas micro-organismos do tipo selvagem, mas também micro-organismos geneticamente modificados para melhorar a capacidade de produção de aminoácido L. O micro- organismo produtor de aminoácido L é conforme descrito acima.
[069] O micro-organismo da presente revelação é um micro-organismo recombinante que contém a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP derivada do gênero Lactobacillus, e pode produzir os aminoácidos L desejados em excesso a partir da fonte de carbono no meio em comparação a um micro- organismo que não contém a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP. A capacidade aumentada de produção de aminoácidos L do micro-organismo recombinante pode ser obtida com uma potência reduzida aumentada pela ativação da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP. Ou seja, introduzindo-se a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP no micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz aminoácidos L, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP é ativada de modo que a NADP possa ser usada em vez de NAD como uma coenzima, e consequentemente, a quantidade de NADPH pode ser aumentada, que pode então ser usada para potência reduzida como uma fonte de energia na biossíntese de aminoácidos L.
[070] Na presente revelação, o termo “micro-organismo não modificado” pode se referir a uma cepa natural em si, um micro-organismo que não contém a gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, ou um micro-organismo que não foi transformado com um vetor que contém um polinucleotídeo que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, mas não está limitado a isso.
[071] O aminoácido L é conforme descrito acima.
[072] O micro-organismo do gênero Corynebacterium em que a capacidade de produção de aminoácido L é aumentada introduzindo-se o gene codificador de a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de acordo com a presente revelação pode ser qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em micro-organismos do gênero Corynebacterium depositado com Nº. de Acesso KCCM12580P, Nº. de Acesso KCCM12581P, Nº. de Acesso KCCM12582P, Nº. de Acesso KCCM12583P, Nº. de Acesso KCCM12584P, Nº. de Acesso KCCM12585P, Nº. de Acesso KCCM12586P, ou Nº. de Acesso KCCM12587P.
[073] Ainda outro aspecto da presente revelação é fornecer o uso da produção de aminoácido L de um micro-organismo do gênero Corynebacterium que contém gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
[074] A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, o gene codificador de a mesma, a expressão da mesma, o micro-organismo do gênero Corynebacterium, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que contém a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, e o aminoácido L são conforme descrito acima. [MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO]
[075] Doravante no presente documento, a presente revelação será descrita em detalhes por meio de Exemplos. No entanto, será evidente para aqueles versados na técnica aos quais pertence a presente revelação que esses Exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos, e o escopo da invenção não se destina a ser limitado a isso. EXEMPLO 1-1. PREPARAÇÃO DE VETOR PARA INTRODUZIR LACTOBACILLUS DELBRUECKII SUBSP. BULGARICUS ATCC11842 DERIVADO DE GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE DEPENDENTE DE NADP (GAPN(L)) EM TRANSPOSON NO CROMOSSOMO DE MICRO-ORGANISMO DO
GÊNERO CORYNEBACTERIUM
[076] Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus derivado de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase dependente de NADP foi selecionado conforme gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase dependente de NADP com uma alta afinidade por Corynebacterium. Depois disso, o seguinte experimento foi realizado para intensificar sua atividade.
[077] Uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2) do gene Ldb1179 que codifica o Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842–derivado de gapN foi obtido a partir de NIH GenBank.
[078] Ademais, a fim de introduzir o gene Ldb1179 no cromossomo usando uma região do gene transposon de um micro-organismo do gênero Corynebacterium, quatro tipos de vetores para transformação foram preparados, e cj7 (Patente Coreana Nº. 10-0620092) foi usada como um promotor. 1-1-1) PREPARAÇÃO DO VETOR PDZ2457::P(CJ7)-GAPN(L)
[079] O gene Ldb1179 foi amplificado como um fragmento de gene de cerca de 1,43 kb usando iniciadores da SEQ ID NOS: 3 e 4 com base no cromossomo de cepa Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842 como um modelo modificando-se o códon de iniciação TTG para ATG (Tabela 1). Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos. Esse produto de PCR foi submetido à eletroforese em um gel de agarose de 0,8%, e uma banda de cerca de 1,4 kb foi eluída e purificada. Ademais, a PCR foi realizada na região do promotor cj7 usando um par de iniciadores da SEQ ID NOS: 5 e 6 sob as mesmas condições para obter um produto de PCR. Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos. O produto de PCR obtido acima foi submetido à clonagem de fusão. A clonagem de fusão foi realizada usando um kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech). O plasmídeo resultante foi denominado pDZ2457::P(cj7)-gapN(L).
[080] O vetor foi usado para introduzir o gapN nas cepas produtoras de lisina, leucina, ou acetil homosserina. 1-1-2) PREPARAÇÃO DO VETOR PDZ1108::P(CJ7)-GAPN(L)
[081] O gene Ldb1179 foi amplificado como um fragmento de gene de cerca de 1,43 kb usando iniciadores da SEQ ID NOS: 3 e 7 com base no cromossomo de cepa Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842 como um modelo modificando-se o códon de iniciação TTG para ATG (Tabela 1). Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos. Esse produto de PCR foi submetido à eletroforese em um gel de agarose de 0,8%, e uma banda de cerca de 1,4 kb foi eluída e purificada. Ademais, a PCR foi realizada na região do promotor cj7 usando um par de iniciadores da SEQ ID NOS: 8 e 6 sob as mesmas condições para obter um produto de PCR. Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos. O produto de PCR obtido foi submetido à clonagem de fusão. A clonagem de fusão foi realizada usando um kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech). O plasmídeo resultante foi denominado pDZ1108::P(cj7)-gapN(L).
[082] O vetor foi usado para introduzir o gapN em cepas produtoras de isoleucina ou treonina. 1-1-3) PREPARAÇÃO DO VETOR PDZTN5::P(CJ7)-GAPN(L)
[083] O gene Ldb1179 foi amplificado como um fragmento de gene de cerca de 1,43 kb usando iniciadores da SEQ ID NOS: 3 e 10 com base no cromossomo da cepa Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842 como um modelo modificando-se o códon inicial TTG para ATG (Tabela 1). Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos. Esse produto de PCR foi submetido à eletroforese em um gel de agarose de 0,8%, e uma banda de cerca de 1,4 kb foi eluída e purificada. Ademais, a PCR foi realizada na região do promotor cj7 usando um par de iniciadores da SEQ ID NOS: 9 e 6 sob as mesmas condições para obter um produto de PCR. Nesse momento, a PCR foi submetida repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos. O produto de PCR obtido acima foi submetido à clonagem de fusão. A clonagem de fusão foi realizada usando um kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech). O plasmídeo resultante foi denominado pDZTn5::P(cj7)-gapN(L).
[084] O vetor foi usado para introduzir o gapN em cepas produtoras de valina ou arginina. 1-1-4) PREPARAÇÃO DO VETOR PDZ0286::P(CJ7)- GAPN(L)
[085] O gene Ldb1179 foi amplificado como um fragmento de gene de cerca de 1,43 kb usando iniciadores da SEQ ID NOS: 3 e 12 com base no cromossomo da cepa Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842 como um modelo modificando-se o códon de iniciação TTG para ATG (Tabela 1). Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 1 minuto e 30 segundos. Esse produto de PCR foi submetido a eletroforese em um gel de agarose de 0,8%, e uma banda de cerca de 1,4 kb foi eluída e purificada. Ademais, a PCR foi realizada na região do promotor cj7 usando um par de iniciadores da SEQ ID NOS: 11 e 6 sob as mesmas condições para obter um produto de PCR. Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 30 segundos. O produto de PCR obtido acima foi submetido à clonagem de fusão. A clonagem de fusão foi realizada usando um kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech). O plasmídeo resultante foi denominado pDZ0286::P(cj7)- gapN(L).
[086] O vetor foi usado para introduzir o gapN nas cepas produtoras de ácido glutâmico. [TABELA 1] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′) 3 CCCAACGAAAGGAAACACTCATGACAGAACACTATTTAAA 4 GCTTGTGAATAAGCCTGCCCTTAGTCTTCGATGTTGAAGACAACG 5 GATTCCAGGTTCCTTAACCCAGAAACATCCCAGCGCTACT 6 TTTAAATAGTGTTCTGTCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG 7 TTTCGTGCGAGTCTAGAAGTTTAGTCTTCGATGTTGAAGA 8 ACGAGGTCAGCATCTCGAGTAGAAACATCCCAGCGCTACT 9 CGCGGAACTGTACTAGTAGAAACATCCCAGCGCTAC 10 GGAAGGATATCTCTAGAAGATAAAACGAAAGGCC 11 CCCTTCCGGTTTAGTACTAGAAACATCCCAGCGCTA 12 CTCTTCCTGTTTAGTACTTTAGTCTTCGATGTTGAAG EXEMPLO 1-2. PREPARAÇÃO DO VETOR PARA INTRODUZIR STREPTOCOCCUS MUTANS ATCC25175–DERIVADO DE GLICERALDEÍDO-3- FOSFATO DESIDROGENASE DEPENDENTE DE NADP (GAPN(S)) EM TRANSPOSON NO CROMOSSOMO DO MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO
CORYNEBACTERIUM
[087] Como grupo de controle do Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842–derivado de gapN, o experimento a seguir foi realizado a fim de introduzir SMUFR 0590 (Patente Coreana Nº. 10-1182033) que tem a atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP no Streptococcus mutans ATCC25175.
[088] Uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 14) do gene SMUFR 0590 que codifica o Streptococcus mutans ATCC25175–derivado de gapN foram obtidos a partir de NIH GenBank, e foi preparado um vetor para introduzir SMUFR 0590 expresso pelo promotor cj7 no gene transposon.
[089] Conforme no Exemplo 1-1, pDZ foi usado como um vetor para transformação, e cj7 foi usado como um promotor. O Streptococcus mutans ATCC25175–derivado do gene SMUFR 0590 foi amplificado como um fragmento de gene de cerca de 1,7 kb com base no pECCG122-Pcj7-gapN (Patente Coreana Nº. 10-1182033) como um modelo usando iniciadores da SEQ ID NOS: 15 e 16 (Tabela 2). Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 2 minutos. Esse produto de PCR foi submetido à eletroforese em um gel de agarose de 0,8%, e uma banda de um tamanho desejado foi eluída e purificada. O produto de PCR obtido acima foi submetido à clonagem de fusão. A clonagem de fusão foi realizada usando um kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech). O plasmídeo resultante foi denominado pDZTn::P(cj7)-gapN(S). [TABELA 2] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′) 15 TAGATGTCGGGCCCCATATGAGAAACATCCCAGCGCTACT 16 GCCAAAACAGCCTCGAGTTATTTGATATCAAATACGACGGATTTA EXEMPLO 1-3. PREPARAÇÃO DO VETOR PARA INTRODUZIR CLOSTRIDIUM ACETOBUTYLICUM–DERIVADO GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE DEPENDENTE DE NADP (GAPN(C)) EM TRANSPOSON NO CROMOSSOMO DO MICRO-ORGANISMO DO GÊNERO CORYNEBACTERIUM
[090] Como grupo de controle do Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842–derivado de gapN, o experimento a seguir foi realizado a fim de introduzir o gapN de NCBI GenBank WP_010966919.1 que tem a atividade de atividade gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP em Clostridium acetobutylicum.
[091] Uma sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 35) e uma sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 36) do gene gapN de Clostridium acetobutylicum–derivado de NCBI GenBank WP_010966919.1 e NCBI GenBank NC_015687.1 foram obtidos a partir de NCBI GenBank, e foi preparado um vetor para introduzir o gapN de NCBI GenBank WP_010966919.1 expresso pelo promotor cj7 no gene transposon.
[092] Conforme no Exemplo 1-1, pDZ foi usado como um vetor para transformar e cj7 foi usado como um promotor. O gene gapN de Clostridium acetobutylicum– derivado de NCBI GenBank WP_010966919.1 foi amplificado como um fragmento de gene de cerca de 1,5 kb com base no gDNA de Clostridium acetobutylicum como um modelo usando iniciadores da SEQ ID NOS: 37 e 38. Além disso, a fim de obter o promotor cj7, o gene gapN foi amplificado como um fragmento de gene de cerca de 400 bp com base no pECCG122-Pcj7-gapN (Patente Coreana Nº. 10-1182033) como um modelo usando iniciadores da SEQ ID NOS: 15 e 39. Nesse momento, a PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e extensão a 72 °C por 2 minutos. Esse produto de PCR foi submetido à eletroforese em um gel de agarose de 0,8%, e uma banda de um tamanho desejado foi eluída e purificada. O produto de PCR obtido foi submetido à clonagem de fusão. A clonagem de fusão foi realizada usando um kit de clonagem In-Fusion® HD (Clontech). O plasmídeo resultante foi denominado pDZTn::P(cj7)- gapN(C). [TABELA 3] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′) 37 ACCCAACGAAAGGAAACACTCATGTTTGAAAATATATCATCAAA 38 GCCAAAACAGCCTCGAGTTATAGGTTTAAAACTATTGATT 39 TTTGATGATATATTTTCAAACATGAGTGTTTCCTTTCGTTGGGT EXEMPLO 2-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L), GAPN(S), OU GAPN(C) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-LISINA- KCCM11016P E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[093] A fim de confirmar o efeito de introdução do gapN derivado de L. delbrueckii subsp. bulgaricus ou S. mutans na capacidade de produção de L-lisina com base na cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-1, o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2, e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-3 foi introduzido em Corynebacterium glutamicum KCCM11016P (Patente Coreana Nº. 10-0159812) por eletroporação para obter transformantes, e os transformantes foram espalhados em um meio de placa BHIS (37 g/l de infusão de cérebro e coração, 91 g/l de sorbitol, 2% de ágar) que contém canamicina (25 μg/ml) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosídeo), e cultivadas para formar colônias. A partir das colônias assim formadas, as colônias azuis foram selecionadas para selecionar cepas introduzidas com o P(cj7)-gapN(L), P(cj7)-gapN(S), ou P(cj7)- gapN(C).
[094] As cepas assim selecionadas foram denominadas KCCM11016P:::P(cj7)- gapN(L), KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S), e KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C), respectivamente.
[095] As cepas preparadas foram cultivadas da maneira a seguir para comparar a capacidade de produção de lisina. Cada cepa foi semeada em um balão defletor de canto de 250 ml que contém 25 ml de um meio de semente e cultivada a 30 °C por 20 horas a 200 rpm com agitação. Em seguida, 1 ml da solução de cultura de sementes foi semeado em um balão defletor de canto de 250 ml que contém 24 ml de um meio de produção, e cultivado a 32 °C por 72 horas a 200 rpm com agitação. As composições do meio de semente e do meio de produção são mostradas abaixo. <MEIO DE SEMENTE (pH 7,0)>
[096] Glicose 20 g, Peptona 10 g, Extrato de Levedura 5 g, Ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1.000 μg, Cálcio- ácido pantotênico 2.000 μg, Nicotinamida 2000 μg (com base em 1 l de água destilada) <MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)>
[097] Glicose 100 g, (NH4)2SO4 40 g, Proteína de Soja 2,5 g, Sólidos de Maceração de Milho 5 g, Ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1.000 μg, Cálcio-ácido pantotênico 2.000 μg, Nicotinamida 3.000 μg, CaCO3 30 g (com base em 1 l de água destilada).
[098] Após a conclusão da cultura, a capacidade de produção de L-lisina foi medida por HPLC. A concentração de L-lisina e a taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas testadas são mostradas na Tabela 4 abaixo. [TABELA 4] Nome das Cepas Concentração de L-Lisina Taxa de Aumento do (g/l) Concentrado de L-
Lisina (%) KCCM11016P 43 g/l - KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S) 50 g/l 16% KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L) 52 g/l 20% KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C) 47 g/l 9%
[099] Conforme mostrado na Tabela 4, foi confirmado que a concentração de L- lisina foi aumentada em cerca de 16% no KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S), em cerca de 20% no KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L), e em cerca de 9% no KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C), todos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação com a cepa produtora de L-lisina KCCM11016P.
[0100] O KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L) foi denominado CA01-7528 e depositado no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com o Nº. de Acesso KCCM12585P. EXEMPLO 2-2. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L), GAPN(S), OU GAPN(C) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-LISINA KCCM11347P E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0101] A fim de confirmar a capacidade de produção de lisina em outras cepas produtoras de lisina que pertencem à Corynebacterium glutamicum, cepas introduzidas em KCCM11347P (Patente Coreana Nº. 10-0073610), que é uma cepa produtora de L-lisina, foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima usando o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-1, o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2, e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-3, e foram denominadas KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L), KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S), e KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C), respectivamente.
[0102] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima, e a capacidade de produção L-lisina foi medida por HPLC após a conclusão da cultura. A concentração de L-lisina e a taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas testadas são mostradas na Tabela 5 abaixo. [TABELA 5] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Lisina (g/l) Concentrado de L-Lisina
(%) KCCM11347P 38 g/l - KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S) 43 g/l 14% KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L) 45 g/l 19% KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C) 40 g/l 5%
[0103] Conforme mostrado na Tabela 5, foi confirmado que a concentração de L- lisina foi aumentada em cerca de 14% no KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S), em cerca de 19% no KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L), e em cerca de 5% no KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C), todos quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação com a cepa produtora de L-lisina KCCM11347P. EXEMPLO 2-3. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L), GAPN(S), OU GAPN(C) EM CEPA PRODUTORA DE L-LISINA CJ3P E
AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0104] A fim de confirmar o efeito em outras cepas produtoras de lisina que pertencem a Corynebacterium glutamicum, as cepas introduzidas em Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40), que é uma cepa produtora de L-lisina, foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima usando o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-1, o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2, e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-3, e foram denominados CJ3P::P(cj7)-gapN(L), CJ3P::P(cj7)-gapN(S), e CJ3P::P(cj7)-gapN(C), respectivamente. A cepa CJ3P é uma de Corynebacterium glutamicum que tem uma capacidade de produção de L-lisina introduzindo-se três tipos de mutações (pyc(Pro458Ser), hom (Val59Ala), lysC (Thr311Ile)) em uma cepa do tipo selvagem com base em uma técnica conhecida.
[0105] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima, e a capacidade de produção de L-lisina foi medida por HPLC após a conclusão da cultura. A concentração de L-lisina e taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas testadas são mostradas na Tabela 6 abaixo. [TABELA 6] Nome das Cepas Concentração de L-Lisina Taxa de Aumento do (g/l) Concentrado de L-Lisina (%)
CJ3P 8,3 g/l - CJ3P::P(cj7)-gapN(S) 9,0 g/l 8% CJ3P::P(cj7)-gapN(L) 9,4 g/l 13% CJ3P::P(cj7)-gapN(C) 8,7 g/l 4%
[0106] Conforme mostrado na Tabela 6, foi confirmado que a concentração de L- lisina foi aumentada em cerca de 8% no CJ3P::P(cj7)-gapN(S), em cerca de 13% no CJ3P::P(cj7)-gapN(L), e em cerca de 4% no CJ3P::P(cj7)-gapN(C), todos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à cepa produtora de L-lisina CJ3P. EXEMPLO 2-4. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L), GAPN(S), OU GAPN(C) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-LISINA KCCM10770P E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0107] A fim de confirmar o efeito em outras cepas produtoras de lisina que pertencem à Corynebacterium glutamicum, as cepas introduzidas em Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Patente Coreana Nº. 10-0924065), que é uma cepa produtora de L-lisina na qual a via de biossíntese de lisina foi intensificada, foram preparados da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima usando o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-1, o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2, e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-3, e foram denominados KCCM10770P::P(cj7)- gapN(L), KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S), e KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C), respectivamente. A cepa KCCM10770P é uma cepa produtora de L-lisina que tem aspB (gene codificador de aspartato aminotransferase), lysC (gene codificador de aspartato quinase), asd (gene codificador de aspartato-semialdeído desidrogenase), dapA (gene codificador de dihidrodipicolinato sintetase), dapB (gene codificador de dihidrodipicolinato redutase), e lysA (gene codificador de diaminopimelato decarboxilase), ou seja, uma cepa que tem 2 cópias de cada um dos 6 tipos de genes no cromossomo, entre os genes que constituem a via de biossíntese de lisina.
[0108] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima, e a capacidade de produção de L-lisina foi medida por HPLC após a conclusão da cultura. A concentração de L-lisina e taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas testadas são mostradas na Tabela 7 abaixo.
[TABELA 7] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Lisina (g/l) Concentrado de L-Lisina (%) KCCM10770P 48 g/l - KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S) 56 g/l 17% KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L) 60 g/l 25% KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C) 53 g/l 10%
[0109] Conforme mostrado na Tabela 7, foi confirmado que a concentração de L- lisina foi aumentada em cerca de 17% no KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S), em cerca de 25% no KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L), e em cerca de 10% no KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C), todos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à cepa produtora de L-lisina KCCM10770P.
[0110] A partir dos resultados dos Exemplos 2-1 a 2-4 acima, verificou-se que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado de gapN foi eficaz para a produção de L-lisina em uma variedade de cepas de Corynebacterium glutamicum produtoras de L-lisina de diferentes famílias. Ademais, foi confirmado que as cepas introduzidas com L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado de gapN mostrou um aumento na capacidade de produção de L-lisina em comparação às cepas introduzidas com S. mutans–derivado do gapN da Patente Coreana conhecida Nº. 10- 1182033 e cepas introduzidas com C. acetobutylicum–derivado de gapN do NCBI GenBank WP_010966919.1 conhecido. EXEMPLO 3-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-TREONINA E AVALIAÇÃO
DAS MESMAS
[0111] Cepas produtoras de L-Treonina foram preparadas introduzindo-se uma variante lysC(L377K) (Patente Coreana Nº. 10-2011994) e uma variante hom(R398Q) (Patente Coreana Nº. 10-1947959) com base em cepa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (doravante no presente documento denominada WT). Nessas cepas, o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-2 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 foram introduzidos para preparar cepas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima, e a capacidade de produção de treonina foi comparada.
[0112] A fim de preparar um vetor para introduzir lysC(L377K), a PCR foi realizada usando iniciadores da SEQ ID NOS: 17 e 18 ou iniciadores da SEQ ID NOS: 19 e 20, com base no cromossomo do WT como um modelo. A PCR foi realizada por desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 30 segundos e, em seguida, a polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA 509 bp na região superior 5′ e um fragmento de DNA 520 bp na região inferior 3′ foram obtidos em torno da mutação do gene lysC.
[0113] Usando-se os dois fragmentos de DNA amplificados como modelos, a PCR foi realizando usando-se os iniciadores da SEQ ID NOS: 17 e 20 sob condições de PCR de desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 60 segundos e, em seguida, polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 1011 bp que contém a mutação do gene lysC que codifica a variante aspartoquinase, na qual a 377a leucina foi substituída por lisina, foi amplificada.
[0114] O vetor pDZ (Patente Coreana Nº. 0924065), que não pode ser replicado em Corynebacterium glutamicum, e o fragmento de DNA de 1011 bp foram tratados com a enzima de restrição XbaI, ligados usando uma enzima de ligação de DNA e, em seguida, clonados para obter um plasmídeo, que foi denominado pDZ-lysC (L377K).
[0115] O vetor pDZ-lysC (L377K) obtido acima foi introduzido na cepa WT por eletroporação e, em seguida, a cepa transformada foi obtida em um meio de seleção que contém 25 mg/l de canamicina. Através de um cruzamento secundário, foi obtida WT::lysC (L377K), uma cepa na qual uma mutação de nucleotídeo foi introduzida no gene lysC pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo. [TABELA 8] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′) 17 TCCTCTAGAGCTGCGCAGTGTTGAATACG 18 TGGAAATCTTTTCGATGTTCACGTTGACAT 19 ACATCGAAAAGATTTCCACCTCTGAGATTC 20 GACTCTAGAGTTCACCTCAGAGACGATTA
[0116] Além disso, a fim de preparar um vetor para introduzir hom(R398Q), a PCR foi realizada usando iniciadores da SEQ ID NOS: 21 e 22, e iniciadores da SEQ ID NOS: 23 e 24 com base no DNA genômico de WT como um modelo. O PCR foi realizado sob condições de PCR de desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 30 segundos e, em seguida, polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 290 bp na região superior 5′ e um fragmento de DNA de 170 bp na região inferior 3′ foram obtidos em torno da mutação do gene hom. Usando os dois fragmentos de DNA amplificados como modelos, a PCR foi realizada usando os iniciadores da SEQ ID NOS: 21 e 24 sob condições desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 30 segundos e, em seguida, polimerização 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 440 bp que contém a mutação do gene hom foi amplificado. [TABELA 9] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′) 21 TCCTCTAGACTGGTCGCCTGATGTTCTAC 22 CTCTTCCTGTTGGATTGTAC 23 GTACAATCCAACAGGAAGAG 24 GACTCTAGATTAGTCCCTTTCGAGGCGGA
[0117] O vetor pDZ usado acima e os fragmentos de DNA de 440 bp foram tratados com a enzima de restrição XbaI, ligados usando uma enzima de ligação de DNA e, em seguida, clonados para obter um plasmídeo, que foi denominado pDZ- hom(R398Q).
[0118] O vetor pDZ-hom(R398Q) obtido acima foi introduzido na cepa WT::lysC(L377K) por eletroporação e, em seguida, a cepa transformada foi obtida em um meio de seleção que contém 25 mg/l de canamicina. Através de um cruzamento secundário, foi obtida uma cepa WT::lysC(L377K)-hom(R398Q), na qual uma mutação de nucleotídeo foi introduzida no gene hom pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo.
[0119] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-2 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 na cepa WT::lysC(L377K)-hom (R398Q) e, foram denominados WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L) e WT::lysC(L377K)- hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0120] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima, e após a conclusão da cultura, a capacidade de produção de L- treonina foi comparada. A concentração de L-treonina e a taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas testadas são mostradas na Tabela 10 abaixo. [TABELA 10] Nome da Cepa Concentração de L- Taxa de Aumento do treonina (g/l) Concentrado de L- treonina (%) WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) 1,21 g/l - WT::lysC(L377K)- 1,39 g/l 15% hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) WT::lysC(L377K)- 1,48 g/l 22% hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)
[0121] Conforme mostrado na Tabela 10, foi confirmado que a concentração de L- treonina foi aumentada em cerca de 15% no WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)- gapN(S) e em cerca de 22% no WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L), ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à WT::lysC(L377K)-hom(R398Q).
[0122] O WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L) foi denominado CA09- 0906 e depositado no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com Nº de Acesso KCCM12586P. EXEMPLO 3-2. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-TREONINA KCCM11222P
E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0123] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-2 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 em Corynebacterium glutamicum KCCM11222P (WO 2013/081296), que é uma cepa produtora de L-treonina, e foram denominadas KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L) e KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0124] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima, e após a conclusão da cultura, a capacidade de produção de L- treonina foi comparada. A concentração de L-treonina e taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas testadas são mostradas na Tabela 11 abaixo. [TABELA 11] Nome da Cepa Concentração de L- Taxa de Aumento do treonina (g/l) Concentrado de L- treonina (%) KCCM11222P 3,6 g/l - KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S) 4,1 g/l 14% KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L) 4,3 g/l 20%
[0125] Conforme mostrado na Tabela 11, foi confirmado que a concentração de L- treonina foi aumentada em cerca de 14% no KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S) e em cerca de 20% no KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L), ambos os quais foram introduzidos no gene gapN, em comparação com a cepa produtora de L-treonina KCCM11222P.
[0126] Os resultados obtidos nos Exemplos acima sugerem que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado de gapN é eficaz para a produção de L- treonina nas cepas produtoras de L-treonina pertencentes ao gênero Corynebacterium. EXEMPLO 4-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-ISOLEUCINAE
AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0127] A fim de confirmar o efeito de introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus gapN derivado de S. mutans na capacidade de produção de L-isoleucina com base na cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (doravante denominada como WT), uma cepa que tem uma capacidade de produção L-isoleucina intensificada foi preparada introduzindo-se uma mutação de ilvA (ilvA(V323A); S. Morbach et al., Appl. Enviro. Microbiol., 62(12): 4345 a 4351, 1996), que é o gene conhecido que codifica L-treonina desidratase.
[0128] Um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 25 e ) para a amplificação da região superior 5′ e um par de iniciadores (SEQ ID NOS: 27 e 28) para a amplificação da região inferior 3′ foram projetados em torno do local de mutação a fim de preparar um vetor para introduzir uma mutação com base no gene ilvA. Os iniciadores da SEQ ID NOS: 25 e 28 foram inseridos com local de enzima de restrição BamHI (indicado por sublinhado) em cada extremidade, e os iniciadores da SEQ ID NOS: 26 e 27 foram projetados para cruzar uns com os outros de modo a localizar as mutações de substituição de nucleotídeos (indicado por sublinhado) nos locais projetados. [TABELA 12] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′) 25 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG 26 ACACCACGGCAGAACCAGGTGCAAAGGACA 27 CTGGTTCTGCCGTGGTGTGCATCATCTCTG 28 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
[0129] A PCR foi realizada usando os iniciadores da SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 28 com base no cromossomo WT como um modelo. A PCR foi realizada sob condições de PCR de desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 30 segundos e, em seguida, polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 627 bp na região superior 5′ e um fragmento de DNA de 608 bp na região inferior 3′ foram obtidos em torno da mutação do gene ilvA.
[0130] Usando os dois fragmentos de DNA amplificados como modelos, a PCR foi realizada usando os iniciadores da SEQ ID NOS: 25 e 28 sob condições de desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e, polimerização a 72 °C por 60 segundos e, em seguida, polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA de 1217 bp que contém a mutação do gene ilvA que codifica a variante ilvA na qual a valina na 323a posição é substituída por alanina foi amplificada.
[0131] A pECCG117 (Patente Coreana Nº. 10-0057684) e os fragmentos de DNA de 1011 bp foram tratados com a enzima de restrição BamHI, ligados usando uma enzima de ligação de DNA e, em seguida, clonados para obter um plasmídeo, que foi denominado pECCG117- ilvA(V323A).
[0132] As cepas nas quais a mutação ilvA(V323A) foi introduzida foram preparadas introduzindo-se o vetor pECCG117-ilvA(V323A) na WT::lysC(L377K)-
hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L) e WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) do Exemplo 3-1. Além disso, uma cepa em que apenas a mutação ilvA (V323A) foi introduzida na WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) foi preparada com um controle.
[0133] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima para comparar a capacidade de produção de L-isoleucina. A concentração de L-isoleucina e taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas testadas são mostradas na Tabela 13 abaixo. [TABELA 13] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Isoleucina (g/l) Concentrado de L- Isoleucina (%) WT::lysC(L377K)- 4,3 g/l - hom(R398Q)/pECCG117-ilvA(V323A) WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)- 5,1 g/l 18% gapN(S) /pECCG117-ilvA(V323A) WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)- 5,6 g/l 30% gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A)
[0134] Conforme mostrado na Tabela 13, foi confirmado que a concentração de L- isoleucina foi aumentada em cerca de 18,6% no WT::lysC(L377K)- hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-ilvA(V323A) e em cerca de 30% no WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A), ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à WT::lysC(L377K)- hom(R398Q)/pECCG117-ilvA(V323A).
[0135] O WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A) foi denominado CA10-3108 e depositado no Centro de Cultura Coreana de Micro- organismos sob o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com Nº de Acesso KCCM12582P. EXEMPLO 4-2. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) NA CEPA PRODUTORA DE L-ISOLEUCINA KCCM11248P
E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0136] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-2 e Exemplo 1-2 na Corynebacterium glutamicum KCCM11248P (Patente Coreana Nº. 10-1335789), que é uma cepa produtora de L-isoleucina, e foram denominadas KCCM11248P::P(cj7)-
gapN(L) e KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0137] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima, e a capacidade de produção de L-isoleucina foi comparada. Após a conclusão da cultura, a capacidade de produção de L-isoleucina foi medida por HPLC, e a concentração de L-isoleucina e taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas tratadas são mostardas na Tabela 14 abaixo. [TABELA 14] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Isoleucina (g/l) Concentrado de L- Isoleucina (%) KCCM11248P 1,3 g/l - KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S) 1,8 g/l 38% KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L) 2,1 g/l 61,5%
[0138] Conforme mostrado na Tabela 14, foi confirmado que a concentração de L- isoleucina foi aumentada em cerca de 38% no KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S) e em cerca de 61,5% no KCCM11248P::P(cj7)-gapN(L), ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à cepa produtora de L-isoleucina KCCM11248P.
[0139] Os resultados obtidos dos Exemplos sugerem que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado de gapN é eficaz para a produção de L- isoleucina nas cepas produtoras de L-isoleucina pertencentes ao gênero Corynebacterium. EXEMPLO 5-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) NA CEPA PRODUTORA DE L-LEUCINA E AVALIAÇÃO DAS
MESMAS
[0140] A fim de confirmar o efeito de introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus gapN derivado de S. mutans na capacidade de produção de L-leucina com base na cepa Corynebacterium glutamicum ATCC13032, uma cepa que tem uma capacidade de produção de L-leucina intensificada foi preparada introduzindo-se uma mutação de leuA sintase (leuA (R558H, G561D); Publicação do Pedido Coreano Nº. 2018- 0077008), que é o gene conhecido que codifica 2-isopropilmalato sintase.
[0141] Especificamente, o plasmídeo recombinante pDZ-leuA(R558H, G561D) preparado na Patente acima foi introduzido na cepa WT por eletroporação e, em seguida, selecionado em um meio que contém 25 mg/l de canamicina. Através de um cruzamento secundário, foi obtida WT::leuA(R558H, G561D), uma cepa em que uma mutação de nucleotídeo foi introduzida no gene leuA pelo fragmento de DNA inserido no cromossomo, que foi denominado CJL8001.
[0142] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-1 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 no Corynebacterium glutamicum CJL8001 que tem a capacidade de produção de L-leucina, e foram denominados CJL8001::P(cj7)- gapN(S) e CJL8001::P(cj7)-gapN(L), respectivamente.
[0143] As cepas assim preparadas foram cultivadas da seguinte maneira para comparar a capacidade de produção de L-leucina. Cada cepa foi subcultivada em um meio nutriente e, em seguida, semeada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 25 ml de um meio de produção e cultivada a 30 °C por 72 horas a 200 rpm com agitação. Em seguida, a concentração de L-leucina foi analisada por HPLC, e a concentração de L-leucina analisada e a taxa de aumento do concentrado são mostradas na Tabela 15. <MEIO NUTRIENTE (pH 7,2)>
[0144] Glicose 10 g, Extrato de Carne 5 g, Polipeptona 10 g, Cloreto de Sódio 2,5 g, Extrato de Levedura 5 g, Ágar 20 g, Ureia 2 g (com base em 1 l de água destilada) <MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)>
[0145] Glicose 50 g, Sulfato de Amônio 20 g, Sólidos de Maceração de Milho 20 g, K2HPO4 1 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1 mg, Carbonato de Cálcio 15 g (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 15] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Leucina (g/l) Concentrado de L- Leucina (%) CJL8001 3,4 g/l - CJL8001::P(cj7)-gapN(S) 3,9 g/l 15% CJL8001::P(cj7)-gapN(L) 4,1 g/l 21%
[0146] Conforme mostrado na Tabela 15, foi confirmado que a concentração de L- isoleucina foi aumentada em cerca de 15% no CJL8001::P(cj7)-gapN(S) e em cerca de 21% no CJL8001::P(cj7)-gapN(L), ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à cepa produtora de L-leucina CJL8001.
[0147] O CJL8001::P(cj7)-gapN(L) foi denominado CA13-8102 e depositado no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com Nº de Acesso KCCM12583P. EXEMPLO 5-2: PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) NAS CEPAS PRODUTORAS DE L-LEUCINA KCCM11661P E KCCM11662P E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0148] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-1 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 na Corynebacterium glutamicum KCCM11661P (Patente Coreana Nº. 10-1851898) e KCCM11662P (Patente Coreana Nº. 10-1796830), que são cepas produtoras de L-leucina, e foram denominadas KCCM11661P::P(cj7)- gapN(L), KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L), e KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S).
[0149] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 5-1, e após conclusão da cultura, a capacidade de produção de L-leucina foi comparada. A concentração de L-leucina produzida em cada cepa e a taxa de aumento do concentrado são mostradas na Tabela 16 abaixo. [TABELA 16] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Leucina (g/l) Concentrado de L- Leucina (%) KCCM11661P 2,7 g/l - KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S) 2,8 g/l 4% KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L) 3,0 g/l 11% KCCM11662P 3,0 g/l - KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S) 3,1 g/l 3% KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L) 3,3 g/l 11%
[0150] Conforme mostrado na Tabela 16, foi confirmado que a concentração de L- leucina foi aumentada em cerca de 4% no KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S) e KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S), e em cerca de 11% no KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L) e KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L), todos os quais foram introduzidos com o gene gapN,
em comparação às cepas produtoras de L-leucina KCCM11661P e KCCM11662P.
[0151] Os resultados obtidos dos Exemplos sugerem que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado de gapN é eficaz para a produção de L- leucina nas cepas produtoras de L-leucina pertencentes ao gênero Corynebacterium. EXEMPLO 6-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPA PRODUTORA DE L-VALINA E AVALIAÇÃO DAS
MESMAS
[0152] A fim de confirmar o efeito de introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus gapN derivado de S. mutans na capacidade de produção de L-valina, uma variante foi preparada introduzindo-se um tipo de mutação (ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, junho 2014, Volume 19, nº 3, pp. 456 a 467) na cepa do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC13869 para ter uma capacidade de produção de L-valina, e a cepa recombinante resultante foi denominada Corynebacterium glutamicum CJ8V.
[0153] Especificamente, a PCR foi realizada com base no DNA genômico da cepa do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC13869 como um modelo. A fim de preparar um vetor para introduzir mutação A42V no gene ilvN, os fragmentos de gene (A e B) foram obtidos usando um par de iniciadores da SEQ ID NOS: 29 e 30 e um par de iniciadores da SEQ ID NOS: 31 e 32. A PCR foi realizada sob condições de PCR de desnaturação a 94 °C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 60 segundos e, em seguida, polimerização a 72 °C por 7 minutos.
[0154] Como resultado, foram obtidos polinucleotídeos 537 bp para ambos os fragmentos A e B. A PCR de sobreposição foi realizada usando os iniciadores da SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 32 com base nos dois fragmentos como modelos para obter um fragmento de DNA de 1044 bp.
[0155] O fragmento de DNA 1044 bp assim obtido e o vetor pDZ usado acima foram tratados com a enzima de restrição XbaI, ligados usando uma enzima de ligação e, em seguida, clonados para obter um plasmídeo, que foi denominado pDZ- ilvN(A42V). [TABELA 17] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′)
29 AATTTCTAGAGGCAGACCCTATTCTATGAAGG 30 AGTGTTTCGGTCTTTACAGACACGAGGGAC 31 GTCCCTCGTGTCTGTAAAGACCGAAACACT 32 AATTTCTAGACGTGGGAGTGTCACTCGCTTGG
[0156] O plasmídeo recombinante assim preparado plasmídeo pDZ-ilvN(A42V) foi introduzido na cepa do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC13869 por eletroporação e, em seguida, a cepa transformada foi obtida em um meio de seleção que contém 25 mg/l de canamicina. Os fragmentos de gene foram amplificados por PCR usando os iniciadores da SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 32 com base na cepa transformada Corynebacterium glutamicum, na qual a segunda recombinação foi concluída e, em seguida, a cepa introduzida com a mutação foi confirmada pelo sequenciamento genético. A cepa recombinante resultante foi denominada Corynebacterium glutamicum CJ8V.
[0157] Por último, as cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-3 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 na Corynebacterium glutamicum CJ8V que tem uma capacidade de produção de L-valina, e foram denominados CJ8V::P(cj7)-gapN(L) e CJ8V::Pcj7-gapN(S), respectivamente. As cepas assim preparadas foram cultivadas da seguinte maneira para comparar a capacidade de produção de L-valina.
[0158] Cada cepa foi subcultivada em um meio nutriente e, em seguida, semeada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 25 ml de um meio de produção e cultivado a 30 °C por 72 horas a 200 rpm com agitação. Em seguida, a concentração de L-valina foi analisada por HPLC, e a concentração de L-valina analisada e a taxa de aumento do concentrado são mostradas na Tabela 18. <MEIO NUTRIENTE (pH 7,2)>
[0159] Glicose 10 g, Extrato de Carne 5 g, Polipeptona 10 g, Cloreto de Sódio
2.5 g, Extrato de Levedura 5 g, Ágar 20 g, Ureia 2 g (com base em 1 l de água destilada) <MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)>
[0160] Glicose 100 g, Sulfato de Amônio 40 g, Proteína de Soja 2.5 g, Sólidos de Maceração de Milho 5 g, Ureia 3 g, K2HPO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1 mg, Cálcio-ácido pantotênico 2 mg, Nicotinamida 3 mg, Carbonato de
Cálcio 30 g (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 18] Nome das Cepas Concentração de L-Valina Taxa de Aumento do (g/l) Concentrado de L-Valina (%) CJ8V 3,4 g/l - CJ8V-Pcj7/gapN(S) 3,8 g/l 12% CJ8V-Pcj7/gapN(L) 4,0 g/l 18%
[0161] Conforme mostrado na Tabela 18, foi confirmado que a capacidade produtora de L-valina de cepas de CJ8V-Pcj7/gapN(L) e CJ8V-Pcj7/gapN(S) foi aumentada em 18% e 12%, respectivamente, em comparação ao controle.
[0162] Como resultado, foi confirmado que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado– ou S. mutans de gene gapN pode melhorar a capacidade de produção de L-valina nas cepas produtoras de L-valina pertencentes ao gênero Corynebacterium.
[0163] A CJ8V-Pcj7/gapN(L) foi denominada CA08-2038 e depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com Nº de Acesso KCCM12581P. EXEMPLO 6-2. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-VALINA KCCM11201P E
AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0164] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-3 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 no Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (Patente Coreana Nº. 10-1117022), que é uma cepa produtora de L-valina e, foram denominados KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L) e KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0165] A fim de comparar a capacidade de produção de L-valina, as cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 6-1. Em seguida, a concentração de L-valina foi analisada e a concentração de L-valina analisada e a taxa de aumento do concentrado são mostrados na Tabela 19. [TABELA 19]
Nome das Cepas Concentração de L-Valina Taxa de Aumento do (g/l) Concentrado de L-Valina (%) KCCM11201P 2,8 g/l - KCCM11201P:: P(cj7)- 3,3 g/l 17% gapN(S) KCCM11201P::P(cj7)- 3,7 g/l 32% gapN(L)
[0166] Conforme mostrado na Tabela 19, foi confirmado que a capacidade de produção de L-valina de cepas de KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L) e KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S) foi aumentada em 32,1% e 17,9%, respectivamente, em comparação ao controle.
[0167] Como resultado, foi confirmado que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado– ou S. mutans do gene gapN pode melhorar a capacidade de produção da L-valina nas cepas produtoras de L-valina pertencentes ao gênero Corynebacterium. EXEMPLO 7-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-ARGININAE AVALIAÇÃO
DAS MESMAS
[0168] A fim de confirmar o efeito de introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado– ou S. mutans do gene gapN na capacidade de produção de L-arginina, as cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-3 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 com base na cepa do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC21831, e foram denominados ATCC21831::P(cj7)gapN(L) e ATCC21831::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0169] As cepas assim preparadas foram cultivadas da seguinte maneira para comparar a capacidade de produção de L-arginina. Cada cepa foi subcultivada em um meio nutriente e, em seguida, semeado em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 25 ml de um meio de semente e cultivada a 30 °C por 20 horas a 200 rpm com agitação. Em seguida, 1 ml da solução de cultura de sementes foi semeada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 24 ml de um meio de produção, e cultivado a 30 °C por 72 horas a 200 rpm com agitação. As composições do meio nutriente, meio de semente e meio de produção são mostrados abaixo. Após a conclusão da cultura, a quantidade de produção de L-arginina foi medida por HPLC, e a concentração de L-arginina analisada e a taxa de aumento do concentrado são mostradas na Tabela 20 abaixo. <MEIO NUTRIENTE (pH 7,2)>
[0170] Glicose 10 g, Extrato de Carne 5 g, Polipeptona 10 g, Cloreto de Sódio 2,5 g, Extrato de Levedura 5 g, Ágar 20 g, Ureia 2 g (com base em 1 l de água destilada) <MEIO DE SEMENTE (pH 7,0)>
[0171] Sacarose 20 g, Peptona 10 g, Extrato de Levedura 5 g, Ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1 mg, Cálcio-ácido pantotênico 2 mg, Nicotinamida 2 mg (com base em 1 l de água destilada) <MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)>
[0172] Sacarose 6%, Sulfato de Amônio 3%, KH2PO4 0,1%, MgSO4·7H2O 0,2%, CSL (Sólidos de Maceração de Milho) 1,5%, NaCl 1%, Extrato de Levedura 0,5%, Biotina 100 mg/l (com base em 1 l de água destilada) [TABELA 20] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Arginina (g/l) Concentrado de L- Arginina (%) ATCC21831 4,1 g/l - ATCC21831::P(cj7)-gapN(S) 4,6 g/l 12% ATCC21831::P(cj7)-gapN(L) 4,9 g/l 19%
[0173] Conforme mostrado na Tabela 20, foi confirmado que a capacidade de produção de L-arginina de cepas ATCC21831::P(cj7)-gapN(L) e ATCC21831::P(cj7)- gapN(S) foi aumentada em 19,5% e 12,1%, respectivamente, em comparação ao controle.
[0174] A ATCC21831::P(cj7)-gapN(L) foi denominada CA06-2951 e depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com Nº de Acesso KCCM12580P.
[0175] Como resultado, foi confirmado que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado– ou S. mutans do gene gapN pode melhorar a capacidade de produção de L-arginina nas cepas produtoras de L-arginina pertencentes ao gênero
Corynebacterium. EXEMPLO 7-2. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPAS PRODUTORAS DE L-ARGININA KCCM10741P
E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0176] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-3 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 no Corynebacterium glutamicum KCCM10741P (Patente Coreana Nº. 10-0791659), que é uma cepa produtora de L-arginina, e foram preparadas KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L) e KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0177] A fim de comparar a capacidade de produção de L-arginina, as cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 7-1. Em seguida, a concentração de L-arginina foi analisada e a concentração de L-analisada e a taxa de aumento do concentrado são mostradas na Tabela 21. [TABELA 21] Nome das Cepas Concentração de L- Taxa de Aumento do Arginina (g/l) Concentrado de L- Arginina (%) KCCM10741P 3,1 g/l - KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S) 3,4 g/l 9% KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L) 3,8 g/l 22%
[0178] Conforme mostrado na Tabela 21, foi confirmado que a capacidade de produção de L-arginina de cepas de KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L) e KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S) foi aumentada em 22,6% e 9,7%, respectivamente, em comparação ao controle.
[0179] Como resultado, foi confirmado que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado– ou S. mutans do gene gapN pode melhorar a capacidade de produção de L-arginina nas cepas produtoras de L-arginina pertencentes ao gênero Corynebacterium. EXEMPLO 8-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPAS PRODUTORAS DE O-ACETIL HOMOSSERINA
E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0180] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-1 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 na cepa do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC13032, foram denominados ATCC13032::P(cj7)-gapN(L) e ATCC13032::P(cj7)- gapN(S), respectivamente. As cepas assim preparadas foram cultivadas da seguinte maneira para comparar a capacidade de produção de O-acetil homosserina.
[0181] Cada cepa foi semeada em um frasco defletor de canto em 250 ml que contém 25 ml de um meio de cultura e cultivado a 30 °C por 20 horas a 200 rpm com agitação. Em seguida, 1 ml da solução de cultura de sementes em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 24 ml de um meio de produção, e cultivado a 30 °C por 48 horas a 200 rpm com agitação. As composições do meio de semente e do meio de produção são mostradas abaixo. <MEIO DE SEMENTE (pH 7,0)>
[0182] Glicose 20 g, Peptona 10 g, Extrato de Levedura 5 g, Ureia 1,5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1.000 μg, Cálcio- ácido pantotênico 2.000 μg, Nicotinamida 2.000 μg (com base em 1 l de água destilada) <MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)>
[0183] Glicose 50 g, (NH4)2SO4 12.5 g, Proteína de Soja 2,5 g, Sólidos de Maceração de Milho 5 g, Ureia 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, Biotina 100 μg, Tiamina-HCl 1.000 μg, Cálcio-ácido pantotênico 2.000 μg, Nicotinamida 3.000 μg, CaCO3 30 g (com base em 1 l de água destilada)
[0184] Após a conclusão da cultura, a capacidade de produção de O-acetil homosserina foi medida por HPLC. A concentração de O-acetil homosserina e a taxa de aumento do concentrado na solução de cultura para cada uma das cepas tratadas são mostardas na Tabela 22 abaixo. [TABELA 22] Nome das Cepas Concentração de O- Taxa de Aumento do Acetil Homosserina Concentrado de O-Acetil (g/l) Homosserina (%) ATCC13032 0,3 g/l - ATCC13032::P(cj7)- 0,4 g/l 33% gapN(S) ATCC13032::P(cj7)- 0,5 g/l 67% gapN(L)
[0185] Conforme mostrado na Tabela 22, foi confirmado que a concentração de O-acetil homosserina foi aumentada em cerca de 33% no ATCC13032::P(cj7)- gapN(S) e em cerca de 67% no ATCC13032::P(cj7)-gapN(L), ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à cepa do tipo selvagem ATCC13032.
[0186] O ATCC13032::P(cj7)-gapN(L) foi denominado CM04-0531 e depositado no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sobre o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com Nº de Acesso KCCM12584P. EXEMPLO 8-2. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM L. DELBRUECKII SUBSP. BULGARICUS DERIVADO DE GAPN(L) OU DERIVADO DE S. MUTANS GAPN(S) NA CEPA PODUTORA DE O-ACETIL HOMOSSERINA
CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0187] A fim de confirmar o efeito de introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus gapN derivado de S. mutans na capacidade de produção de O-acetil homosserina, a homosserina autógena O-acetiltransferase de Corynebacterium glutamicum foi intensificada.
[0188] A fim de amplificar o gene codificador de O-acetil homosserina transferase (MetX), os iniciadores da SEQ ID NOS: 33 e 34 foram projetados para amplificação de uma região promotora (localizada cerca de 300 bp a montante de um códon de iniciação) par uma região terminadora (localizada cerca de 100 bp a jusante de um códon de terminação) com base em uma sequência relatada derivada do tipo selvagem (WT). O local da enzima de restrição BamHI foi inserido em ambas as extremidades de cada um dos iniciadores da SEQ ID NOS: 33 e 34. A PCR foi realizada sob condições de PCR de desnaturação a 95 °C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos, e polimerização a 72 °C por 90 segundos e, em seguida, polimerização a 72 °C por 7 minutos. Como resultado, um fragmento de DNA 1546 bp foi obtido na região de codificação do gene metX. O vetor pECCG117 (Patente Coreana Nº. 10- 0057684) e o fragmento de DNA metX foram tratados com a enzima de restrição BamHI, ligada usando uma ligase DNA, e clonada para obter um plasmídeo que foi denominado pECCG117-metX WT. [TABELA 23] SEQ ID NO: Sequência (5′–3′)
33 GGATCCCCTCGTTGTTCACCCAGCAACC 34 GGATCCCAAAGTCACAACTACTTATGTTAG
[0189] As cepas, em que o metX autógeno de Corynebacterium glutamicum foi superexpresso, foram preparadas introduzindo-se o pECCG117-metX WT no WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L) e WT::lysC(L377K)- hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S) cepas do Exemplo 3-1 acima. Além disso, o mesmo vetor foi introduzido no WT::lysC(L377K)-hom(R398Q) como um controle.
[0190] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como o método de cultura em frasco do Exemplo 8-1 para analisar a concentração de O-acetil homosserina e a taxa de aumento do concentrado na solução de cultura. Os resultados são mostrados na Tabela 24. [TABELA 24] Nome das Cepas Concentração de Taxa de Aumento do O-Acetil Concentrado de O-Acetil Homosserina (g/l) Homosserina (%) WT::lysC(L377K)- 2,0 g/l - hom(R398Q)/pECCG117-metX
WT WT::lysC(L377K)- 2,7 g/l 35% hom(R398Q)::P(cj7)- gapN(S)/pECCG117-metX WT WT::lysC(L377K)- 3,1 g/l 55% hom(R398Q)::P(cj7)- gapN(L)/pECCG117-metX WT
[0191] Conforme mostrado na Tabela 24, foi confirmado que a concentração de O-acetil homosserina foi aumentada em cerca de 35% no WT::lysC(L377K)- hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-metX WT e em cerca de 55% no WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-metX WT, ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à WT::lysC(L377K)- hom(R398Q)/pECCG117-metX WT.
[0192] Os resultados obtidos dos Exemplos sugerem que a introdução de L. delbrueckii subsp. bulgaricus derivado de gapN é eficaz para a produção de O-acetil homosserina nas cepas do tipo selvagem pertencentes ao gênero Corynebacterium. EXEMPLO 9-1. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM
GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPA PRODUTORA DE ÁCIDO GLUTÂMICO E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0193] A fim de confirmar o efeito de introdução de gapN derivado de L. delbrueckii subsp. bulgaricus ou S. mutans na capacidade de produção de ácido glutâmico, as cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-4 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 com base na cepa do tipo selvagem Corynebacterium glutamicum ATCC13869, e foram denominadas ATCC13869::P(cj7)-gapN(L) e ATCC13869::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0194] Cada cepa foi semeada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 25 ml de um meio de semente e cultivada a 30 °C por 20 horas a 200 rpm com agitação. Em seguida, 1 ml da solução de cultura de semente foi semeada em um frasco defletor de canto de 250 ml que contém 25 ml de um meio de produção, e cultivada a 30 °C por 40 horas a 200 rpm com agitação. A cultura foi realizada sob condições de restrição de biotina. Após a conclusão da cultura, a concentração de L- ácido glutâmico e a taxa de aumento do concentrado foi medida por HPLC, e a medição dos resultados são mostrados na Tabela 25 abaixo. <MEIO DE SEMENTE (pH 7,2)>
[0195] Glicose 1%, Extrato de Carne 0,5%, Polipeptona 1%, Cloreto de Sódio 0,25%, Extrato de Levedura 0,5%, Ágar 2%, Ureia 0,2% <MEIO DE PRODUÇÃO>
[0196] Açúcar Bruto 6%, Carbonato de Cálcio 5%, Sulfato de Amônio 2,25%, KH2PO4 0,1%, Sulfato de Magnésio 0,04%, Sulfato de Ferro 10 mg/l, Tiamina-HCl 0,2 mg/l [TABELA 25] Nome das Cepas Concentração de Ácido Taxa de Aumento de Ácido Glutâmico (g/l) Glutâmico Concentrado (%) ATCC13869 0,5 g/l - ATCC13869::P(cj7)-gapN(S) 0,8 g/l 60% ATCC13869::P(cj7)-gapN(L) 0,9 g/l 80%
[0197] Conforme mostrado na Tabela 25, foi confirmado que a concentração de ácido glutâmico foi aumentada em cerca de 60% no ATCC13869::P(cj7)-gapN(S) e em cerca de 80% no ATCC13869::P(cj7)-gapN(L), ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação à cepa do tipo selvagem ATCC13869.
[0198] O ATCC13869::P(cj7)-gapN(L) foi denominado CA02-1360 e depositado no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos sob o Tratado de Budapeste em 2 de setembro de 2019, com Nº de Acesso KCCM12587P. EXEMPLO 9-2. PREPARAÇÃO DE CEPAS INTRODUZIDAS COM GAPN(L) OU GAPN(S) EM CEPA PRODUTORA DE ÁCIDO GLUTÂMICO KFCC11074 E AVALIAÇÃO DAS MESMAS
[0199] As cepas foram preparadas da mesma maneira como no Exemplo 2-1 acima introduzindo-se o plasmídeo preparado no Exemplo 1-1-4 e o plasmídeo preparado no Exemplo 1-2 na cepa Corynebacterium glutamicum KFCC11074 (Patente Coreana Nº. 10-0292299), que é uma cepa produtora de L-ácido glutâmico, e foi denominada KFCC11074::P(cj7)-gapN(L) e KFCC11074::P(cj7)-gapN(S), respectivamente.
[0200] As cepas assim preparadas foram cultivadas da mesma maneira como no Exemplo 10-1 para comparar a capacidade de produção de L-ácido glutâmico. Após a conclusão da cultura, a concentração de L-ácido glutâmico foi analisada, e a concentração de L-ácido glutâmico analisada e a taxa de aumento do concentrado são mostradas na Tabela 26. [TABELA 26] Nome das Cepas Concentração de Ácido Taxa de Aumento de Glutâmico (g/l) Ácido Glutâmico Concentrado (%) KFCC11074 11,8 g/l - KFCC11074::P(cj7)-gapN(S) 14,5 g/l 22% KFCC11074::P(cj7)-gapN(L) 16,2 g/l 37%
[0201] Conforme mostrado na Tabela 26, foi confirmado que a concentração de ácido glutâmico foi aumentada em cerca de 22,9% no KFCC11074::P(cj7)-gapN(S) e em cerca de 37,3% no KFCC11074::P(cj7)-gapN(L), ambos os quais foram introduzidos com o gene gapN, em comparação a KFCC11074.
[0202] Como resultado, foi confirmado que a introdução de um gene gapN derivado de L. delbrueckii subsp. bulgaricus ou S. mutans pode melhorar a capacidade de produção de L-ácido glutâmico nas cepas produtoras de L-ácido glutâmico pertencentes ao gênero Corynebacterium.
[0203] Em conclusão, os resultados obtidos dos Exemplos 1 a 9 sugerem que a introdução do gene gapN derivado de L. delbrueckii subsp. bulgaricus ou S. mutans pode melhorar a capacidade de produção de aminoácido L nas cepas produtoras de L-ácido glutâmico pertencentes ao gênero Corynebacterium e, em particular, foi confirmado que a introdução do gene gapN derivado de L. delbrueckii subsp. bulgaricus mostrou capacidade de produção superior de aminoácido L em comparação à introdução do gene gapN derivado de S. mutans.
[0204] Aqueles versados na técnica à qual a presente revelação pertence reconhecerão que a presente revelação pode ser abrangida em outras formas específicas sem se afastar do seu espírito ou características essenciais. As modalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos apenas como ilustrativas e não restritivas. O escopo da presente revelação é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas em vez de pela descrição anterior. Todas as mudanças vêm dentro do significado e faixa de equivalência das reivindicações devem ser abrangidas dentro do escopo da presente revelação.

Claims (4)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para produzir um aminoácido L caracterizado por compreender: cultivar um micro-organismo do gênero Corynebacterium contendo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 derivada de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, em um meio; e recuperar um aminoácido L do micro-organismo cultivado ou meio cultivado.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro- organismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.
3. Micro-organismo do gênero Corynebacterium caracterizado por ter uma capacidade de produção de aminoácidos L aumentada, contendo gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase dependente de NADP, que inclui uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, derivada de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o micro-organismo do gênero Corynebacterium ser Corynebacterium glutamicum.
BR112021007124-5A 2020-01-21 2021-01-21 Método para produzir aminoácidos l com o uso do micro-organismo contendo gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de nadp BR112021007124B1 (pt)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114765989B (zh) * 2021-04-07 2022-11-22 Cj第一制糖株式会社 新3-磷酸甘油醛脱氢酶变体及使用其生产l-缬氨酸的方法
CN114107141B (zh) * 2021-08-19 2022-07-12 中国科学院天津工业生物技术研究所 高产l-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌以及高产l-脯氨酸的方法
CN116555132A (zh) * 2022-01-28 2023-08-08 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种修饰的棒状杆菌属微生物及其生产苏氨酸的应用和构建方法
CN116622598A (zh) * 2022-02-10 2023-08-22 廊坊梅花生物技术开发有限公司 苏氨酸生产菌株的构建方法
KR102572850B1 (ko) * 2022-07-11 2023-08-31 대상 주식회사 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 변이 미생물 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
KR100292299B1 (ko) 1999-03-22 2001-06-01 손경식 글루탐산 생산 미생물 및 이를 이용한 글루탐산 생산방법
GB0227435D0 (en) * 2002-11-25 2002-12-31 Univ Denmark Tech Dtu Metabolically engineered micro-organisms having reduced production of undesired metobolic products
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
KR100768748B1 (ko) * 2004-12-30 2007-10-19 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
KR100791659B1 (ko) 2006-07-13 2008-01-03 씨제이 주식회사 알지닌을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 엘-알지닌의제조방법
US8906667B2 (en) * 2006-08-29 2014-12-09 William Marsh Rice University Increasing NADPH-dependent products
EP2066782A4 (en) 2006-09-15 2010-02-03 Cj Cheiljedang Corp CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH
KR101182033B1 (ko) * 2009-07-08 2012-09-11 씨제이제일제당 (주) 외래종 유래의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 획득한 코리네박테리움 속의 ｌ-라이신 생산방법
KR101117022B1 (ko) 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
KR101335853B1 (ko) 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
KR101335789B1 (ko) 2012-01-13 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-이소루신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-이소루신 제조방법
CA2891130A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Novozymes, Inc. 3-hydroxypropionic acid production by recombinant yeasts
EP2843043A1 (en) * 2013-08-27 2015-03-04 Evonik Industries AG A method for producing acyl amino acids
KR101518860B1 (ko) * 2013-10-11 2015-05-12 씨제이제일제당 (주) L-아미노산의 생산 방법
WO2015173247A1 (en) * 2014-05-12 2015-11-19 Metabolic Explorer New microorganism and method for the production of 1.2-propanediol based on nadph dependent acetol reductase and improved nadph supply
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
KR101796830B1 (ko) 2015-08-25 2017-11-13 씨제이제일제당 (주) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
ES2907694T3 (es) 2016-08-31 2022-04-26 Cj Cheiljedang Corp Nuevo promotor y uso del mismo
JP6848067B2 (ja) 2016-12-28 2021-03-24 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規なイソプロピルリンゴ酸シンターゼ変異体及びそれを用いたｌ−ロイシンの生産方法
KR101851898B1 (ko) 2017-06-15 2018-04-25 씨제이제일제당 (주) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
KR102011994B1 (ko) 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
KR102011394B1 (ko) * 2017-07-19 2019-10-22 씨제이제일제당 주식회사 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR101947959B1 (ko) 2018-05-28 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법

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