CN114222821B

CN114222821B - 具有增强的l-苏氨酸生产能力的微生物及使用其生产苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN114222821B
Application number: CN202080030348.9A
Authority: CN
Inventors: 权秀渊; M·贝克; 孙承珠; 李光雨
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: US20220170059A1; CN114222821A; EP3922725A1; AU2020260919A1; MX2021011988A; EP3922725A4; WO2020218737A1; JP2022522758A; MY195400A; JP7278400B2; KR102175112B1; AU2020260919B2; ZA202106549B; KR20200123905A; BR112021018712A2

Abstract

本申请涉及具有增强的L‑苏氨酸生产能力的微生物和使用该微生物生产L‑苏氨酸的方法。

Description

具有增强的L-苏氨酸生产能力的微生物及使用其生产苏氨酸的方法

技术领域

本申请涉及具有增强的L-苏氨酸生产能力的微生物和使用该微生物生产苏氨酸的方法。

背景技术

苏氨酸是一种必需氨基酸，广泛用于饲料、食品添加剂和动物生长促进剂，且也用于医用补液(rehydration solution)和医药用合成材料。关于使用微生物生产苏氨酸的方法，已知用于增强苏氨酸生物合成基因(例如，ppc、aspC、和thrABC)和用于阻断苏氨酸降解途径的方法用于增加产率(Kwang-Ho Lee,等人,Molecular System Biology 2007)。参与苏氨酸降解途径的基因包括tdh、tdcB、glyA、ilvA等，且已知其中苏氨酸脱氨酶(ilvA)是用于苏氨酸降解最重要的基因。降解基因中ilvA的缺失极大地提高了苏氨酸的产率，但问题在于会出现昂贵的异亮氨酸营养缺陷型；因此，应用ilvA活性的弱化和异亮氨酸的高敏感性突变是众所周知的(Akhverdian Valery Z.等人)。

同时，关于苏氨酸与甘氨酸之间的关系，参与甘氨酸合成的丝氨酸羟甲基转移酶的主要前体是丝氨酸，且已知酶活性在丝氨酸作为前体时比在苏氨酸作为前体时高24倍(Simic等人,Appl Environ Microbiol.2002)。然而，甘氨酸的摄取和苏氨酸的生产能力尚不清楚。

发明内容

[技术问题]

本发明人引入了产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)来源的甘氨酸转运蛋白cycA，以便通过引入释放出细胞的甘氨酸来开发可用的微生物，且结果，他们开发了以高产率生产L-苏氨酸的菌株。

[技术方案]

本申请的一个目的是提供具有增强的甘氨酸转运蛋白活性的用于生产L-苏氨酸的棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物。

本申请的另一目的是提供包括本申请的微生物的用于生产L-苏氨酸的组合物。

本申请的又一目的是提供生产L-苏氨酸的方法，其包括培养本申请的微生物。

本申请的又另一目的是提供具有增强的甘氨酸转运蛋白活性的棒杆菌属的微生物用于生产L-苏氨酸的用途。

[技术效果]

本申请的用于生产L-苏氨酸的微生物具有优良的苏氨酸生产能力，且因此可有效地应用于L-苏氨酸的大量生产。

具体实施方式

在下文，将详细描述本申请。同时，本文公开的说明和示例性实施方式中的每个可应用于其它说明和示例性实施方式。也就是说，本文公开的各种因素的所有组合都属于本申请的范围。此外，本申请的范围不应受下文提供的具体公开的限制。

此外，本领域的普通技术人员可以能够仅使用常规实验来识别或确认与本文描述的本申请的特定方面的许多等同物。此外，还旨在将这些等同物包括在本申请中。

本申请的一个方面提供了具有增强的甘氨酸转运蛋白活性的用于生产L-苏氨酸的棒杆菌属的微生物。

如本文所用，术语“甘氨酸转运蛋白”可以包括能够将甘氨酸引入到细胞中的任何蛋白质，并且它可以具体是D-丝氨酸/D-丙氨酸/甘氨酸转运蛋白。甘氨酸转运蛋白可与D-丝氨酸/D-丙氨酸/甘氨酸转运蛋白或用于甘氨酸摄取的蛋白质互换使用。

“D-丝氨酸/D-丙氨酸/甘氨酸转运蛋白”是能够参与所有丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸转运的蛋白质，且其信息能够通过在已知数据库(如NCBI GenBank)中检索D-丝氨酸/D-丙氨酸/甘氨酸转运蛋白序列来获得。转运蛋白可以具体为CycA或AapA，且更具体为CycA蛋白，但不限于此。

如本文所用，术语“CycA蛋白”是指参与丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸摄取的蛋白。CycA蛋白由CycA基因编码，且已知CycA基因存在于微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、解淀粉欧文菌(Erwinia amylovora)和产氨棒杆菌中。

为了本申请的目的，本申请的CycA蛋白可以包括任何蛋白，只要它能增强苏氨酸生产能力。具体地，CycA蛋白可以来源于棒杆菌属的微生物，且更具体地来源于产氨棒杆菌，但不限于此。产氨棒杆菌与产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)同种，并与停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)和停滞短杆菌(Brevibacterium stationis)归为同一分类单位(taxon)(International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology 60:874–879)。此外，产氨短杆菌已更名为停滞棒杆菌。

因此，如本文所用，术语产氨棒杆菌、产氨短杆菌、停滞棒杆菌和停滞短杆菌可以互换使用。

本申请的CycA蛋白可以包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少70％同源性或同一性的氨基酸序列。

具体地，CycA蛋白可以包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的氨基酸序列。另外，明显的是，其中部分序列被缺失、修饰、取代或添加的任何氨基酸序列也可落入本申请的范围内，只要该氨基酸序列具有这种同源性或同一性，并展示与上述蛋白质相应的作用。

进一步，可以由已知的基因序列制备的探针(例如，由能够在严格条件下与核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交以编码多肽的多核苷酸编码的任何多肽)可以包括具有丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸摄取活性的多肽。

也就是，如本文所用，虽然其被描述为“包括由特定序列号描述的氨基酸序列的蛋白质或多肽”、“由特定序列号描述的氨基酸序列组成的蛋白质或多肽”、或“具有特定序列号描述的氨基酸序列的蛋白质或多肽”，但明显的是只要其具有与由相应序列号的氨基酸序列组成的多肽相同或相应的活性，则任何具有其中序列的部分被缺失、修饰的、取代的、保守取代的或添加的氨基酸序列的蛋白质都可以在本申请中使用。例如，其可以是这样的情况，其中在氨基酸序列的N-端和/或C-端添加有不改变蛋白质功能的序列、自然发生的突变、其潜在突变、沉默突变、或保守取代。

如本文所用，术语“保守取代”是指氨基酸被具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。这种氨基酸取代通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。例如，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及疏水性氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”具有通常包括DNA或RNA分子的含义。作为多核苷酸基本结构单元的核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包括其中糖或碱基位点被修饰的其修饰的类似物(参见Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman andPeyman,Chemical Reviews,90:543–584(1990))。

多核苷酸可以是编码本申请的CycA蛋白的多核苷酸，或者可以是编码与本申请的CycA蛋白具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的多肽的多核苷酸。具体地，例如，编码包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少70％同源性或同一性的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸可以是包括SEQ ID NO:17或与SEQ ID NO:17的多核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或同一性的多核苷酸。

进一步，显然的是由于密码子简并性，也可以包括包含SEQ ID NO:16或与SEQ IDNO:16具有至少70％同一性的氨基酸序列的蛋白质，或者可以被翻译成与其具有同源性或同一性的蛋白质的多核苷酸。此外，本申请的多核苷酸可以包括可以由已知的基因序列制备的探针，例如，可不受限制地包括可以在严格条件下与多核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交，以编码包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少70％同一性的蛋白质的任何多核苷酸序列。“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件在文献(参见J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)中有具体描述。例如，严格条件可以包括以下的条件，在该条件下具有70％或更高、80％或更高、具体地85％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、更加具体地97％或更高、且仍然更加具体地99％或更高的高同源性或同一性的基因彼此杂交，而具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因之间彼此不杂交，或Southern杂交的洗涤条件，即在对应于60℃下、1×SSC、0.1％SDS，具体地60℃下、0.1×SSC、0.1％SDS，以及更具体地68℃下、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下洗涤一次，具体地两次或三次。

尽管根据杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的，但杂交要求两个核酸含有互补序列。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本申请的多核苷酸可包括与整个序列互补的分离的核苷酸片段以及实质上与其相似的多核苷酸序列。

具体地，在上述条件下，可以使用包括在55℃的T_m值下的杂交步骤的杂交条件来检测具有同源性和同一性的多核苷酸。进一步，T_m值可以是60℃、63℃、或65℃，但不限于此，并可由本领域技术人员根据其目的适当地调节。

本文所用，术语“同源性”和“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，且可以以百分比来表示。术语同源性和同一性可经常彼此互换使用。保守的多核苷酸或多肽序列的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可与由正在被使用的程序建立的默认空位罚值(default gap penalty)一起使用。基本上，通常预期同源性或同一性序列在中等或高度严格的条件下与序列全长的全部或至少约50％、60％、70％、80％、或90％杂交。在杂交多核苷酸中也考虑含有代替密码子的简并密码子的多核苷酸。

多肽或多核苷酸序列的同源性或同一性可以通过例如根据文献的BLAST算法(参见：Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或根据Pearson的FASTA(参见：Methods Enzymol.,183,63,1990)来确定。基于算法BLAST，已经开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。进一步，任何氨基酸或多核苷酸序列是否彼此具有同源性、相似性或同一性可以通过在限定的严格条件下在Southern杂交实验中通过比较序列来鉴定，并且限定的适当杂交条件在本领域技术的范围内，并且可以通过本领域技术人员公知的方法来确定(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold SpringHarbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology)。

如本文所用，术语“蛋白质的活性增强”意指与微生物所具有的内源活性或转化前的活性相比，活性被增强。活性的增强可以包括引入外源蛋白和增强内源性蛋白的活性。即，它包括将外源蛋白引入到具有特定蛋白的内在活性的微生物中，以及将该蛋白引入到不具有内在活性的微生物中。“蛋白质的引入”意指将特定蛋白质的活性引入到微生物中，使得蛋白活性被修饰以用于表达。其也可以表达为相应蛋白质的活性增强。

如本文所用，术语“内源的”是指当微生物的性状由于自然或人为因素通过基因修饰而改变时，亲本菌株在转化前原来具有的状态。

在本申请中，活性的增强可以通过以下方法执行：

1)增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数的方法；

2)修饰表达调控序列使得多核苷酸的表达增加的方法；

3)修饰染色体上的多核苷酸序列使得蛋白质的活性增强的方法；

4)引入展示蛋白质的活性的外源多核苷酸或修饰的多核苷酸(其中上述多核苷酸的密码子已被优化)的方法；以及

5)通过上述方法的组合进行修饰以增强活性的方法，但方法不限于此。

上述方法1)中的多核苷酸的拷贝数的增加可以以其中多核苷酸可操作地被连接到载体的形式来执行，或者通过插入到宿主细胞的染色体中来执行，但不特别限于此。具体地，可以通过将编码本公开的蛋白质的多核苷酸可操作地连接到载体(其可与宿主细胞无关地复制并起作用)，并将其引入到宿主细胞中来执行。或者，可以通过将多核苷酸与能够将多核苷酸插入到宿主细胞染色体中的载体可操作地连接，并将其引入到宿主细胞中而增加宿主细胞的染色体中多核苷酸的拷贝数的方法来进行。

接下来，方法2)中的表达调控序列的修饰使得多核苷酸的表达增加，可以通过核酸序列的缺失、插入或非保守或保守取代、或其组合来诱导序列的修饰，从而进一步增强表达调控序列的活性，或通过用具有更强活性的核酸序列置换来执行，但不特别限于此。另外，表达调控序列可以包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合域的序列、调控转录和翻译终止的序列等，但不特别限于此。

代替原来的启动子的强异源启动子可能被连接到多核苷酸表达单元的上游区域。强启动子的实例包括CJ7启动子(韩国专利号0620092和国际公开号WO2006/065095)、lysCP1启动子(国际公开号WO2009/096689)、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等，但强启动子不限于此。进一步，方法3)中的染色体上的多核苷酸序列的修饰可以通过核酸序列的缺失、插入或非保守或保守取代、或其组合来诱导表达调控序列的修饰，从而进一步增强多核苷酸序列的活性，或通过用修饰的多核苷酸序列置换多核苷酸序列以具有更强活性来执行，但不特别限于此。

另外，方法4)中的外源多核苷酸序列的引入可以通过将编码展示出与上述蛋白质相同或相似活性的蛋白质的外源多核苷酸、或其中外源多核苷酸的密码子已经被优化的修饰多核苷酸引入到宿主细胞中来执行。只要它展示出与蛋白质的活性相同或相似的活性，外源多核苷酸可以不受其来源或序列限制而被使用。进一步，外源多核苷酸可在其密码子优化后被引入到宿主细胞中，从而在宿主细胞中实现优化的转录和翻译。引入可由本领域技术人员通过选择本领域已知的合适的转化方法来执行，并且当引入的多核苷酸在宿主细胞中表达时可生产蛋白质，从而增加其活性。

最后，方法5)中通过方法1)至方法4)的组合进行修饰以增强活性的方法可以通过组合应用以下方法中的至少一个来执行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数；修饰表达调控序列使得多核苷酸的表达增加；修饰染色体上的多核苷酸序列；以及修饰展示蛋白质的活性的外源多核苷酸或其密码子优化的修饰多核苷酸。

如本文所用，术语“载体”可指含有编码目标蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，其可操作地连接到合适的调控序列，使得目标蛋白能够在适当的宿主中表达。调控序列包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合域的序列、以及调控转录和翻译终止的序列。在被转化到合适的宿主细胞中后，载体可以与宿主基因组无关地被复制或起作用，且可以被整合到宿主基因组本身中。例如，通过用于染色体插入的载体，在染色体中编码目标蛋白的多核苷酸可以被修饰的多核苷酸取代。多核苷酸插入到染色体中可以通过本领域已知的任何方法进行，例如同源重组，但不限于此。

本公开中使用的载体只要其能够在宿主细胞中复制则不受特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等；且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、和pET等的那些载体。具体地，可以使用载体pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118和pCC1BAC等。

如本文所用，术语“转化”是指将包括编码目标多肽的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，从而使得由多核苷酸编码的多肽在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，它是被插入到宿主细胞的染色体中并位于其中，还是位于染色体外都没有关系，两种情况可以都包括在内。另外，多核苷酸包括编码目标多肽的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它能够被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入到宿主细胞中，表达盒是包括自我表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒常规地可包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、终止子、核糖体结合域和终止密码子。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以原样被引入到宿主细胞中，并可操作地连接到其在宿主细胞中表达所必要的序列，但不限于此。

进一步，如上所述，术语“可操作地连接”是指上述基因序列与启动子序列之间的功能连接，启动子序列启动并介导编码本申请的目标蛋白的多核苷酸的转录。

本申请的载体转化方法包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且可以根据宿主细胞选择本领域已知的合适的标准技术来进行。例如，可以经由电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、乙酸锂-DMSO技术等进行转化，但方法不限于此。

如本文所用，术语“用于生产L-苏氨酸的微生物”包括所有野生型微生物，或自然或人工基因修饰的微生物，并且它可以指具有L-苏氨酸生产能力的微生物，或者将L-苏氨酸生产能力赋予不具有L-苏氨酸生产能力的亲本菌株的微生物。此外，它可以是其中由于外源基因的插入或内源性基因的活性的增强或失活而削弱或增强特定机制的微生物，并且它可以是其中为了产生期望的L-苏氨酸而发生遗传突变或增强活性的微生物。

例如，用于生产L-苏氨酸的微生物可以是具有增强的甘氨酸转运蛋白活性的微生物。另外，它可以是其中苏氨酸生物合成途径上的酶的反馈被抑制的微生物，或者可以是通过增强或抑制参与苏氨酸生物合成途径的酶来产生苏氨酸的微生物。另外，它可以是这样的微生物，其通过失活不影响苏氨酸生物合成的酶或蛋白质的活性来产生苏氨酸，从而促进苏氨酸生物合成途径的代谢。进一步，它可以是这样的微生物，其中在苏氨酸生物合成途径上的中间体、辅因子、或消耗能量源的途径上的蛋白质或酶的活性被失活。

更具体地，它可以是这样的微生物，其中通过修饰lysC(天冬氨酸激酶)和hom(高丝氨酸脱氢酶)的多肽抑制苏氨酸生物合成途径上的反馈，增强参与苏氨酸生产增加的蛋白表达，或失活参与苏氨酸降解途径的酶。

然而，这仅仅是一个实例，且微生物并不限于此。此外，它可能是这样的微生物，其增强编码各种已知L-苏氨酸生物合成途径的酶的基因的表达或使降解途径上的酶失活。生产L-苏氨酸的微生物可以通过应用各种已知的方法来制备。

如本文所用，术语“蛋白质活性的失活”意指与天然野生型菌株、亲本菌株或相应的蛋白质未修饰的菌株相比，没有该酶或蛋白质的表达，或者即使表达了也没有活性或活性降低。特别地，降低是综合概念，其包括由于编码蛋白质的基因的突变、表达调控序列的修饰、或部分或全部基因的缺失等，使蛋白质本身的活性与微生物原来所具有的蛋白质的活性相比降低的情况；由于编码蛋白质的基因的表达受到抑制或翻译受到抑制，使细胞内蛋白质活性的总体水平与天然菌株或修饰前的菌株相比降低的情况；及其组合。在本申请中，可以通过应用本领域公知的各种方法来实现失活。方法的实例可以包括：1)缺失编码蛋白质的基因的部分或全部的方法；2)修饰表达调控序列使得降低基因表达的方法；3)修饰编码蛋白质的基因序列使得蛋白质活性被去除或减弱的方法；4)引入与编码蛋白质的基因的转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法；5)在编码蛋白质的基因的Shine-Dalgarno序列上游添加与Shine-Dalgarno序列互补的序列以形成二级结构，从而抑制核糖体附着的方法；和6)在编码蛋白质的基因的多核苷酸序列的开放阅读框(ORF)的3’末端添加启动子以进行反向转录的逆转录工程(RTE)方法；及其组合，但不特别限于此。

为了本申请的目的，本申请的微生物可以是任何微生物，只要它包括甘氨酸转运蛋白并且能够产生L-苏氨酸。

在本申请中，术语“能够生产L-苏氨酸的微生物”可以与“生产L-苏氨酸的微生物”、“具有L-苏氨酸生产能力的微生物”和“用于生产L-苏氨酸的微生物”互换使用。

本申请的生产苏氨酸的微生物可以是其中甘氨酸裂解(cleavage)蛋白的活性被进一步增强的微生物。“生产苏氨酸的微生物”和“蛋白质活性的增强”同上所述。

如本文所用，术语“甘氨酸裂解蛋白”是直接或间接参与甘氨酸裂解途径的蛋白，并可用于意指组成甘氨酸裂解系统(GCV)或该蛋白的复合物或甘氨酸裂解系统本身的每种蛋白。

具体地，甘氨酸裂解蛋白可以是选自以下中的任何一种或多种：构成甘氨酸裂解系统的T-蛋白(GcvT)、P-蛋白(GcvP)、L-蛋白(GcvL)或H-蛋白(GcvH)以及作为甘氨酸裂解系统辅酶的LipB或LipA，但不限于此(John E.Cronan,Microbiology and MolecularBiology Reviews.,13April 2016)。甘氨酸裂解蛋白可以源自棒杆菌属的微生物，具体地产氨棒杆菌，但不限于此。GcvP可以包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列，GcvT可以包括SEQ IDNO:39的氨基酸序列，GcvH可以包括SEQ ID NO:40的氨基酸序列，LipA可以包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列，且LipB可以包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或者与相应氨基酸序列具有至少70％同源性的氨基酸序列，但不限于此。具体地，GcvP蛋白可以包括SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或同一性的氨基酸序列。同源性或同一性的描述对于GcvT、GcvH、LipA和LipB也是相同的。另外，明显的是，只要氨基酸具有这样的同源性或同一性，并展示与上述蛋白质的作用相应的作用，任何具有其中部分氨基酸序列被缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质，也可以落入本申请的范围内。

进一步，探针可以由已知基因序列制备，例如，探针可以不受限制地包括具有甘氨酸降解活性的任何多肽，该多肽作为由在严格条件下与核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交以编码多肽的多核苷酸编码的多肽。

同源性或同一性如上所述。

如本文所用，术语“生产L-苏氨酸的棒杆菌属的微生物”是生产L-苏氨酸的微生物，并且可以意指属于棒杆菌属的微生物。生产L-苏氨酸的微生物与上述相同。具体地，在本申请中，具有L-苏氨酸生产能力的棒杆菌属的微生物可以意指其中本申请的甘氨酸转运蛋白的活性被增强，或者已经用含有编码甘氨酸转运蛋白的基因的载体转化以具有提高的L-苏氨酸生产能力的棒杆菌属的微生物。或者，它可以意指这样的棒杆菌属的微生物，其中甘氨酸裂解蛋白的活性被进一步增强，或者其已经用含有编码甘氨酸裂解蛋白的基因的载体转化以具有提高的L-苏氨酸生产能力。“具有提高的L-苏氨酸生产能力的棒杆菌属的微生物”可以意指与转化前的亲本菌株或非修饰的微生物相比，其中L-苏氨酸生产能力被提高的微生物。“非修饰的微生物”可以是指棒杆菌属的天然菌株本身、不含编码甘氨酸转运蛋白的基因的微生物、或未用含有编码甘氨酸转运蛋白的基因的载体转化的微生物。

如本文所用，术语“棒杆菌属的微生物”可包括棒杆菌属的所有微生物。具体地，其可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、克氏棒杆菌(Corynebacteriumcrudilactis)、沙漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒杆菌、单一棒杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌、污染棒杆菌(Corynebacteriumpollutisoli)、模拟棒杆菌(Corynebacterium imitans)、睾丸棒杆菌(Corynebacteriumtestudinoris)、或微黄棒杆菌(Corynebacterium flavescens)，且更具体地是谷氨酸棒杆菌。

本申请的另一方面提供了用于生产L-苏氨酸的组合物，其包括本申请的用于生产L-苏氨酸的微生物。

用于生产L-苏氨酸的组合物可以是指能够通过本申请的用于生产L-苏氨酸的微生物生产L-苏氨酸的组合物。组合物可以包括用于生产L-苏氨酸的微生物，并且可以不受限制地包括能够使用该菌株生产苏氨酸的附加组合物。能够生产苏氨酸的附加组分可进一步包括，例如，用于发酵的组合物中常用的任何合适的赋形剂、或培养基的组分。这些赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂、或等张剂，但不限于此。

本申请的另一个方面提供了生产L-苏氨酸的方法，其包括培养微生物。

用于培养本申请的微生物的培养基和其它培养条件可以是用于常规微生物培养的任何培养基，没有任何特别限制。具体地，本申请的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中在好氧或厌氧条件下，同时调节温度、pH等进行培养。

碳源可包括碳水化合物(如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等)；醇(如糖醇、甘油等)；脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸等)；有机酸(如丙酮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等)；氨基酸(如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等)，但不限于此。另外，碳源可以包括天然有机营养素(如淀粉水解物、糖蜜、赤糖糊(blackstrap molasses)、米糠、木薯、甘蔗糖蜜、玉米浆等)，也可以使用碳水化合物(如灭菌预处理糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)。此外，可以不受限制地使用适当量的各种其它碳源。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。

氮源可包括无机氮源(如氨、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等)；氨基酸(如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等)；以及有机氮源(如蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等)。这些氮源可以单独使用，也可以两种或更多种组合使用，但不限于此。

磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐等。无机化合物的实例可包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。

此外，可以包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些培养基或前体可以分批培养或连续方式添加到培养基中，但这些磷源不限于此。

在本公开中，在微生物的培养过程中，可以通过以适当的方式向培养物添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等化合物来调节培养物的pH。此外，在培养期间，可以添加诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来防止泡沫的产生。此外，为了维持培养基的好氧状态，可以向培养基中注入氧气或含氧气体；或者为了维持培养基的厌氧或微好氧状态，可以不注入气体或注入氮气、氢气或二氧化碳气体。

培养物的温度可以在25℃至40℃的范围内，且更具体地，在28℃至37℃的范围内，但不限于此。可以继续培养直到获得期望量的有用材料，且具体地为10至100小时，但不限于此。

生产L-苏氨酸的方法可以包括在培养步骤后从选自以下的至少一种材料中回收L-苏氨酸的步骤：微生物、培养基、其培养物、培养物的上清液、培养物的提取物、和微生物的裂解液。

在回收步骤中，可以根据培养方法，使用本领域已知的合适方法，例如分批、连续或补料分批培养方法，从培养液中回收作为目标物质的L-苏氨酸。例如，对于L-苏氨酸的回收，可以使用诸如沉淀、离心、过滤、层析和结晶的方法。例如，可以将通过在低速下离心培养物除去生物质而获得的上清液通过离子交换层析分离，但不限于此。

回收步骤可以包括纯化过程。

本申请的又另一方面提供了具有增强的甘氨酸转运蛋白活性的棒杆菌属的微生物用于生产L-苏氨酸的用途。

“甘氨酸转运蛋白”、“活性的增强”或“棒杆菌属的微生物”如上所述。

实施本发明的方式

以下，将通过实施例和实验实施例来详细描述本申请。然而，提供这些实施例和实验实施例仅用于示例目的，并且本申请的范围并不旨在限于这些实施例和实验实施例或由这些实施例和实验实施例所限制。

实施例1：使用野生型棒杆菌属的微生物制备L-苏氨酸生产菌株

实施例1-1：具有L-苏氨酸生产能力的棒杆菌属的微生物菌株的制备

从野生型谷氨酸杆菌ATCC13032开发出了L-苏氨酸生产菌株。具体地，为了解决通过天冬氨酸激酶(lysC)——在苏氨酸生物合成途径中首先起作用的重要酶——的反馈抑制，制备了其中在lysC的第377位氨基酸亮氨酸被赖氨酸取代了的菌株(SEQ ID NO:1)。以该菌株为基础，通过用谷氨酰胺取代hom的第398位氨基酸精氨酸制备了苏氨酸生产菌株，以解决苏氨酸生物合成途径中重要的高丝氨酸脱氢酶(hom)(SEQ ID NO:6)的反馈抑制。

实施例1-1-1：lysC突变的引入

具体地，为了制备其中引入了lysC(L377K)突变的菌株，基于ATCC13032染色体为模板，使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟。结果，在LysC基因的突变周围分别获得了5’上游区中的DNA片段(515bp)和3’下游区中的DNA片段(538bp)。使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5的引物，以两个扩增的DNA片段为模板进行了PCR。PCR进行如下：在95℃下变性5分钟；28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合2分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果，扩增了包括lysC基因突变的DNA片段(1023bp)，该基因编码其中在第377位的亮氨酸被赖氨酸取代的天门冬氨酸激酶(aspartokinase)变体。扩增的产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，并用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，用限制性内切酶SmaI处理后，将在65℃下热处理20分钟的pDZ载体(KR专利号10-0924065)与上述PCR扩增的插入DNA片段的摩尔浓度(M)之比设定为1:2，并根据制造商手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆了该载体，且从而制备了用于将lysC(L377K)突变引入到染色体中的pDZ-L377K载体。

通过电穿孔将这样制备的pDZ-L377K载体转化到ATCC13032中并进行二次交换(crossover)，且从而获得了其中核苷酸修饰中的每个被修饰的核苷酸取代的菌株。菌株被命名为CJP1。

实施例1-1-2：hom突变的引入

为了制备其中基于CJP1菌株引入了hom(R398Q)突变的菌株，基于ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟。结果，在hom基因突变周围分别获得了5’上游区中的DNA片段(668bp)和3’下游区中的DNA片段(659bp)。用作为模板的扩增的两个DNA片段，和SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10的引物进行了PCR。PCR进行如下：在95℃下变性5分钟；28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合2分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果，扩增了包括hom基因突变的DNA片段(1327bp)，该基因编码在第398位的精氨酸被谷氨酰胺取代的高丝氨酸脱氢酶变体。使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化了扩增的产物，并用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，用限制性内切酶SmaI处理后，将在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过PCR扩增的插入DNA片段的摩尔浓度(M)之比设定为1:2，并根据制造商手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆了该载体，且从而制备了用于将hom(R398Q)突变引入到染色体中的pDZ-R398Q载体。

通过电穿孔将这样制备的pDZ-R398Q载体转化到谷氨酸棒杆菌CJP1中并进行二次交换，且从而获得了其中核苷酸修饰中的每个被修饰的核苷酸取代的菌株。该菌株被命名为CJP1-R398Q，并被保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，且保藏号为KCCM12120P(韩国专利号10-1947959)。

实施例1-2：引入有D-丙氨酸/D-丝氨酸/甘氨酸转运蛋白基因的L-苏氨酸生产菌株的制备

将D-丙氨酸/D-丝氨酸/甘氨酸转运蛋白基因插入实施例1-1中制备的微生物中的谷氨酸棒杆菌染色体上进行了实验。

实施例1-2-1：引入产氨棒杆菌来源的甘氨酸转运蛋白(CycA(Cam))的菌株的制备

为了插入编码甘氨酸转运蛋白的cycA基因，使用了编码转座子的Ncgl2131基因作为插入位点(韩国专利号10-1126041；使用了在Journal of Biotechnology 104,5-25JornKalinowski等人,2003中公开的方法)(SEQ ID NO:11)。为了制备用于转座子插入的载体，基于ATCC13032的染色体为模板，使用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14和SEQID NO:15的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，且在72℃下聚合2分钟；且在72℃下聚合5分钟。结果，从Ncgl2131基因各获得了5’上游区中的DNA片段(2041bp)和3’下游区中的DNA片段(2040bp)。用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的引物，以两个扩增的DNA片段为模板进行了PCR。PCR进行如下：在95℃下变性5分钟；28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合4分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果，在中心周围扩增了包括两种限制性内切酶SpeI和XhoI的识别位点的DNA片段(4066bp)。扩增的产物用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，并用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，用限制性内切酶SmaI处理后，将在65℃下热处理20分钟的pDZ载体与通过上述PCR扩增的插入DNA片段的摩尔浓度(M)之比设定为1:2，并根据制造商手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆了该载体，且从而制备了插入到Ncgl2131基因位置中的pDZ-N2131载体。

通过电穿孔将这样制备的pDZ-N2131载体转化到上述实施例1-1中获得的KCCM12120P菌株中并进行二次交换，且从而获得了其中染色体上缺失了Ncgl2131的菌株。菌株命名为KCCM12120P-N2131。

同时，为了获得具有D-丙氨酸/D-丝氨酸/甘氨酸转运蛋白活性的基因片段，基于产氨棒杆菌ACC6872的染色体为模板，使用SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合90秒；以及在72℃下聚合5分钟。结果，获得了cycA基因片段(1595bp)，并使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化了扩增的产物，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段(SEQ ID NO:17)。

使用p117-cj7-gfp作为模板进行了PCR，该p117-cj7-gfp包括来源于已知的棒杆菌属的微生物(韩国专利号10-0620092)的cj7启动子。如本文所用，术语“p117”表示pECCG117，其为大肠杆菌-棒杆菌穿梭载体(Biotechnology Letters 13(10):721–726,1991)。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应，并用SEQID NO:21和SEQ ID NO:22的引物进行PCR。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合30秒；以及在72℃下聚合3分钟。用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化了扩增的产物，以获得cj7片段(350bp)(SEQ ID NO:20)。

使用上述制备的cj7片段和cycA片段为模板，并使用SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:19的引物进行了融合(sewing)PCR。PCR进行如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合2分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果，获得了cj7-cycA基因片段(1945bp)，且扩增的产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，并用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，将这样制备的pDZ-N2131载体用限制性内切酶xhoI处理后，然后在65℃下热处理20分钟，将载体与上述获得的cj7-cycA片段的摩尔浓度(M)之比设定为1:2，并根据制造商手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆了该载体，且从而制备了用于将cycA基因插入到Ncgl2131基因位置中的pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)载体。

通过电穿孔将这样制备的pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)载体转化到KCCM12120P菌株中并进行二次交换，且从而获得了其中染色体上Ncgl2131被cj7-cycA(Cam)取代的菌株。该菌株命名为KCCM12120P/cycA(Cam)。

实施例1-2-2：引入有大肠杆菌来源的甘氨酸转运蛋白(CycA(Eco))的菌株的制备

同时，为了比较产氨棒杆菌来源的cycA基因及其活性，以与上述相同的方式将已知的源自大肠杆菌K-12的cycA基因引入到KCCM12120P菌株(Microbiology,141(Pt 1)；133–40,1995)中。具体地，基于大肠杆菌K-12W3110的染色体为模板，用SEQ ID NO:25和SEQID NO:26的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果，获得了cycA基因片段(1544bp)，并使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化了扩增的产物，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段(SEQ IDNO:23)。

使用上述制备的cj7片段和cycA片段为模板，并使用SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:26的引物进行了融合PCR。PCR进行如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合90秒；以及在72℃下聚合5分钟。结果获得cj7-cycA基因片段(1894bp)，且扩增的产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，并用作用于制备载体插入DNA片段。同时，将这样制备的pDZ-N2131载体用限制性内切酶xhoI处理后，然后在65℃下热处理20分钟，将载体与上述获得的cj7-cycA片段的摩尔浓度(M)之比设定为1:2，并根据制造商手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆了该载体，且从而制备了用于将cycA基因插入到Ncgl2131基因位置中的pDZ-N2131/cj7-cycA(Eco)载体。

通过电穿孔将这样制备的pDZ-N2131/cj7-cycA(Eco)载体转化到KCCM12120P菌株中并进行二次交换，且从而获得了其中Ncgl2131被cj7-cycA(Eco)取代的菌株。该菌株命名为KCCM12120P/cycA(Eco)。

实施例1-3：引入有CycA的菌株的L-苏氨酸生产能力的评价

对实施例1-2中制备的菌株进行了L-苏氨酸生产能力测试。将以上获得的每种菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡板(corner-baffle)烧瓶中，并在30℃下以200rpm震荡培养20小时。然后，将1mL的种子培养液接种到含有24mL的下述L-苏氨酸生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm震荡培养48小时。

种子培养基(pH 7.0)

20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH₂PO₄、8g K₂HPO₄、0.5gMgSO₄·7H₂O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、和2000μg烟酰胺(基于1升蒸馏水)

L-苏氨酸生产培养基(pH7.2)

30g葡萄糖、2g KH₂PO₄、3g尿素、40g(NH4)₂SO₄、2.5g蛋白胨、5g CSL(Sigma)(10mL)、0.5g MgSO₄·7H₂O、400mg亮氨酸、20g CaCO₃(基于1升蒸馏水)

培养完成后，通过HPLC测量了所产各种氨基酸的生产量。结果示于下表1中。

[表1]

/>

随着L-苏氨酸生产量的增加，L-赖氨酸生产量降低，且相反，随着L-苏氨酸生产量的增加，可以在L-苏氨酸生物合成途径中作为副产物的L-异亮氨酸(Ile)和甘氨酸(Gly)能够增加，且因此确认了它们的生产量。此外，还确认了丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和缬氨酸(Val)的产量量，以研究它们作为cycA基因的转运蛋白的功能。

如上表1中所示，与亲本菌株KCCM12120P相比，引入有源自产氨棒杆菌的cycA基因的KCCM12120P/cycA(Cam)菌株的L-苏氨酸生产量显示增加了12.5％，而L-赖氨酸生产量降低了4％。此外，由于引入cycA基因的效果，确认了与亲本菌株相比，甘氨酸的生产量降低了18.5％，且与亲本菌株相比，丝氨酸和缬氨酸的生产略有降低，且丙氨酸的生产量显著降低而因此没有在培养液中检测到。

同时，确认了与亲本菌株相比，引入有大肠杆菌来源的cycA基因的KCCM12120P/cycA(Eco)菌株，显示L-苏氨酸生产量降低了14.9％，且赖氨酸和甘氨酸生产量分别增加了6.9％和10％。由此，发现了引入大肠杆菌来源的cycA基因和产氨棒杆菌来源的cycA基因的效果显著不同，但都显著降低了培养液中丙氨酸的浓度。此外，在引入大肠杆菌来源的cycA或产氨棒杆菌来源的cycA的情况下，异亮氨酸(Ile)的生产没有变化。

基于以上结果，确认了引入源自产氨棒杆菌的cycA基因对L-苏氨酸的生产是有效的。

KCCM12120P/cycA(Cam)被命名为CA09-0902，并于2019年4月10日被保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM12484P。

实施例1-4：引入有甘氨酸裂解系统相关基因的L-苏氨酸生产菌株的制备

实施例1-4-1：用于引入甘氨酸裂解蛋白的载体的制备

由于先前已确认了甘氨酸转运蛋白的活性对苏氨酸生成能力的增加有作用，因此，进行了实验以确认当引入到细胞中的甘氨酸的利用率进一步增加时，苏氨酸的生产能力。具体地，引入了甘氨酸裂解系统(以下，GCV系统)。在谷氨酸棒杆菌菌株中，在构成GCV系统的6种蛋白质中，只有编码L-蛋白、LipB和LipA的基因是已知的，而编码其它3种蛋白质的基因是未知的。因此，为了引入源自产氨棒杆菌的GCV系统，制备了用于引入gcvP(SEQ IDNO:27)、gcvT(SEQ ID NO:28)、gcvH(SEQ ID NO:29)、lipA(SEQ ID NO:30)、和lipB(SEQ IDNO:31)的载体。进行了以下实验。为了获得甘氨酸裂解系统(以下，GCV系统)相关基因中的gcvPT基因片段，基于产氨棒杆菌ATCC6872的染色体为模板，使用SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:33的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合5分钟；以及在72℃下聚合7分钟。结果，获得了包括启动子的gcvPT基因片段(4936bp)，并使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化了扩增的产物，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段(SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28)。

为了获得另一个GCV系统相关基因gcvH-lipBA基因片段，基于产氨棒杆菌ATCC6872的染色体为模板，使用SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合3分钟；以及在72℃下聚合5分钟。结果，获得了包括启动子的gcvH-lipBA基因片段(3321bp)，并使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化了扩增的产物，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段(SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31)。

使用上述获得的gcvPT片段和gcvH-lipBA片段为模板，并使用SEQ ID NO:32和SEQID NO:35的引物进行了融合PCR。PCR进行如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合10分钟；以及在72℃下聚合12分钟。结果，获得了gcvPTH-lipBA基因片段(8257bp)，并且扩增的产物使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，并用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，将上述实施例1-2中制备的pDZ-N2131载体用限制性内切酶speI和xhoI处理后，将载体与上述获得的gcvPTH-lipBA片段的的摩尔浓度(M)之比设定为1:2，并根据制造商手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆了该载体，且从而制备用于将GCV系统基因插入到Ncgl2131基因位置中的pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA载体。

实施例1-4-2：引入有甘氨酸裂解蛋白的菌株的制备

基于上述实施例1-2中获得的pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)载体为模板，使用SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:37的引物进行了PCR。使用PfuUltra^TM高保真DNA聚合酶(Stratagene)作为聚合酶用于PCR反应。PCR条件为如下：28个循环的在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合90秒；以及在72℃下聚合5分钟。结果，获得了cj7-cycA(Cam)基因片段(1944bp)，并使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化了扩增的产物，并将其用作用于制备载体的插入DNA片段。同时，用限制性内切酶xhoI处理上述制备的pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA载体后，然后在65℃下热处理20分钟，将该载体与上述获得的cj7-cycA(Cam)片段的摩尔浓度(M)之比设定为1:2，并根据制造商手册使用输注克隆试剂盒(TaKaRa)克隆了该载体，且从而制备了用于将D-丙氨酸/D-丝氨酸/甘氨酸转运蛋白基因和GCV系统基因插入到Ncgl2131基因位置中的pDZ-N2131/gcv-lip-cycA(Cam)载体。

通过电穿孔将这样制备的pDZ-N2131/gcv-lip-cycA(Cam)载体转化到KCCM12120P菌株中并进行二次交换，且从而获得了其中Ncgl2131被gcvPTH-lipBA-cycA(Cam)取代的菌株。该菌株命名为KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)。

实施例1-4-3：引入有甘氨酸转运蛋白和甘氨酸裂解蛋白的菌株的苏氨酸生产能力的评价

对实施例1-2和1-4-2中制备的菌株进行L-苏氨酸生产能力测试。将上述获得的每种菌株接种到含有25mL上述种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm震荡培养20小时。然后，将1mL的种子培养液接种到含有24mL的上述L-苏氨酸生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm震荡培养48小时。

培养完成后，通过HPLC测量了所产各种氨基酸的生产量。结果示于下表2中。

[表2]

/>

如表2中所示，与亲本菌株KCCM12120P相比，引入有D-丙氨酸/D-丝氨酸/甘氨酸转运蛋白基因和GCV系统基因的KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)菌株显示了L-苏氨酸生产量增加了26.7％，与其中仅引入cycA基因的KCCM12120P/cycA(Cam)菌株相比，显示了生产量提高了12.7％。基于该结果，确认了与其中单独引入了cycA基因的菌株的L-苏氨酸生产量相比，与GCV系统基因一起引入的菌株的L-苏氨酸生产量进一步增加。

与KCCM12120P相比，KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)菌株的L-赖氨酸生产量降低了13.6％，且与KCCM12120P相比，KCCM12120P/cycA(Cam)菌株的L-赖氨酸生产量降低了14.3％。此外，与KCCM12120P相比，KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)的L-异亮氨酸生产量增加了，但当考虑实施例1-3的结果时，可以发现由于L-苏氨酸生产量的增加，生物合成途径中的副产物L-异亮氨酸的生产量也增加了。

当仅引入cycA基因时，与KCCM12120P菌株相比，甘氨酸生产量降低了18.5％，而当一起引入GCV系统相关基因时，与KCCM12120P菌株相比，甘氨酸生产量降低了51.9％。仅通过引入cycA基因就显著减少了丙氨酸的生产量，且确认了由于GCV系统的引入没有不良效果。尽管丝氨酸和缬氨酸的生产量显著少，但确认了与亲本菌株KCCM12120P相比，KCCM12120P/cycA(Cam)菌株和KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)菌株均显示了丝氨酸和缬氨酸生产量的降低。

KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)被命名为CA09-0905，并于2019年4月10日被保藏在布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM12485P。

基于以上结果，确认了当在棒杆菌属的L-苏氨酸生产菌株的基础上，引入了cycA基因(其是源自产氨棒杆菌的D-丙氨酸/D-丝氨酸/甘氨酸转运蛋白基因)时，增加了L-苏氨酸的生产量。此外，确认了当GCV系统相关基因与cycA基因一起引入时，L-苏氨酸生产量显著增加了。

实施例2：引入有cycA和甘氨酸裂解系统的L-苏氨酸生产菌株KCCM11222P的L-苏氨酸生产能力的确认

与实施例1中一样，进行了实验以确认将cycA和GCV系统引入到现有苏氨酸生产菌株中的作用。

实施例2-1：将cycA引入到L-苏氨酸生产菌株KCCM11222P中

将上述实施例1中使用的转化载体pDZ-N2131、pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)和pDZ-N2131/cj7-cycA(Eco)载体各自转化到作为L-苏氨酸生产菌株的谷氨酸棒杆菌KCCM11222P(韩国专利号10-1335853)中，并进行二次交换，且从而各自获得了其中染色体上Ncgl2131被缺失和Ncgl2131被cj7-cycA(Cam)或cj7-cycA(Eco)取代的菌株。分别命名为KCCM11222P-N2131、KCCM11222P/cycA(Cam)或KCCM11222P/cycA(Eco)。

对这样制备的菌株进行L-苏氨酸生产能力测试。将以上获得的每种菌株接种到含有25mL种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm震荡培养20小时。然后，将1mL的种子培养液接种到含有下述24mL的苏氨酸生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm震荡培养48小时。

种子培养基(pH7.0)

L-苏氨酸生产培养基(pH7.0)

100g葡萄糖、2g KH₂PO₄、3g尿素、25g(NH4)₂SO₄、2.5g蛋白胨、5g CSL(Sigma)(10mL)、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、30g CaCO₃(基于1升蒸馏水)

培养完成后，通过HPLC测量了所产各种氨基酸的生产量。结果示于下表3中。

[表3]

如表3中所示，与亲本菌株KCCM11222p相比，KCCM11222P/cycA(Cam)显示了L-苏氨酸生产量增加了15.2％，而L-赖氨酸生产量降低了14.9％。与KCCM11222P相比，甘氨酸和丙氨酸生产量分别降低了21.5％和98.3％，确认了该结果与基于实施例1的KCCM12120P菌株的评价结果相似。在异亮氨酸的情况下，与KCCM11222P相比，KCCM11222P/cycA(Cam)菌株显示了异亮氨酸生产量降低了3％，而与KCCM11222P相比，KCCM11222P/cycA(Eco)菌株显示了异亮氨酸生产量增加了4％，确认了cycA蛋白的引入并没有显著影响异亮氨酸生产量。特别地，确认了其中引入了产氨棒杆菌来源的cycA基因的菌株显示了异亮氨酸生产量的降低。

同时，与KCCM11222P菌株相比，其中引入了大肠杆菌来源的cycA基因的KCCM11222P/cycA(Eco)菌株显示了L-苏氨酸生产量降低了12.7％且L-赖氨酸生产量增加了20.1％。因此，确认了大肠杆菌来源的cycA基因对增加L-苏氨酸的生产没有效果。

基于该结果，能够发现，将产氨棒杆菌来源的cycA蛋白引入到具有苏氨酸生产能力的突变菌株中能够增加苏氨酸生产能力。

实施例2-2：将cycA和GCV系统引入到L-苏氨酸生产菌株KCCM11222P中

以与实施例1中相同的方式，将为确认cycA(Cam)基因和GCV系统基因的组合效应而制备的pDZ-N2131/gcv-lip-cycA(Cam)载体转化到KCCM11222P菌株中并进行二次交换，且从而获得了其中Ncgl2131被gcvPTH-lipBA-cycA(Cam)取代的菌株。该菌株命名为KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)。

对这样制备的菌株进行了L-苏氨酸生产能力测试。将上述获得的每种菌株接种到含有25mL的上述种子培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm震荡培养20小时。然后，将1mL的种子培养液接种到含有24mL的L-苏氨酸生产培养基的250mL的角挡板烧瓶中，并在32℃下以200rpm震荡培养48小时。

培养完成后，通过HPLC测量了所产各种氨基酸的生产量。结果示于下表4中。

[表4]

如表4中所示，与亲本菌株KCCM11222P相比，KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)菌株显示了L-苏氨酸生产量增加了35.1％，与单独引入cycA基因的KCCM11222P/cycA(Cam)菌株相比，L-苏氨酸生产量增加了17.0％。基于该结果，与实施例1一样，确认了即使在重组L-苏氨酸生产菌株KCCM11222P中，与单独引入cycA基因的菌株相比，与GCV系统基因一起引入的菌株的L-苏氨酸生产量进一步被增加。

与KCCM11222P相比，KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)菌株的L-赖氨酸生产量降低了14.3％，而与KCCM11222P相比，KCCM11222P/cycA(Cam)菌株的L-赖氨酸生产量降低了14.9％。与KCCM11222P相比，KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)的L-异亮氨酸生产量增加了3.4％，且考虑实施例2-1的结果，这可以解释为根据L-苏氨酸生产的增加的次要效果。

与KCCM11222P菌株相比，当单独引入cycA基因时，甘氨酸生产量降低了21.1％，而当与GCV系统基因一起引入时，甘氨酸生产量降低了56.8％。cycA基因的引入显著降低了丙氨酸生产量，而GCV系统的引入进一步降低了丙氨酸生产量，而且KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)菌株中未检测到丙氨酸生产量。与亲本菌株KCCM11222P相比，KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)中的丝氨酸和缬氨酸生产量分别降低了43.7％和31.1％。

本领域普通技术人员将认识到，本申请可以在不脱离其精神或本质特征的情况下以其它具体形式体现。所描述的实施方式在所有方面仅被认为是示例性的而不是限制性的。因此，本申请的范围由所附权利要求而不是由前述描述来指示。在权利要求的等同意义和范围内的所有变化都应被包括在本申请的范围内。

/>

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 具有增强的L-苏氨酸生产能力的微生物及使用其生产苏氨酸的方法

<130> OPA19301

<150> KR 10-2019-0046935

<151> 2019-04-22

<160> 42

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C.gl lysC变体

<400> 1

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac 34

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca 30

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt 34

<210> 6

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> C.gl Hom变体

<400> 6

Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu

20 25 30

Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile

35 40 45

Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys

100 105 110

Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala

130 135 140

Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr

165 170 175

Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp

180 185 190

Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr

195 200 205

Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala

210 215 220

Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala

245 250 255

Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys

260 265 270

Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro

275 280 285

Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe

290 295 300

Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala

305 310 315 320

Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala

325 330 335

Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr

340 345 350

Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His

355 360 365

Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala

370 375 380

Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Gln Gln Glu

385 390 395 400

Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu

405 410 415

Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val

420 425 430

Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp

435 440 445

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

tcgagctcgg taccccaccg gcgctgacta tgc 33

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

cgcgctcttc ctgttggatt gtacgcaggg 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ccctgcgtac aatccaacag gaagagcgcg 30

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ctctagagga tcccgataga cagatttgtc cacg 34

<210> 11

<211> 1611

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 11

atgcaccacg agcaacccga agggtgcgaa gtgggcattc gtagaacaat cccagaggaa 60

agccgtacgg ctttcctcga catgatcaat caaggtatgt caggtcttgc tgcgtctaca 120

gcggtcgggg tcagtgaatt caccgggcga aagtgggcga aggccgccgg ggtgaaactg 180

acccgcggcc cgcgaggtgg caatgctttt gacaccgccg agaaacttga gattgcagcc 240

agcatgctag agaaaggatg cctaccccga gaaatcggcg agtatgtcgg catgactcgg 300

gccaatatat ccctatggcg caaacaaggc ccagacaagc ttcgccaacg cgcagccacc 360

ttgcgcaccg gcaagcgagc agctgaattc atccacgccc cggtgatggg cccttattat 420

gggccacgca cactccatca agtgttgcgt gaggactaca caacactgtt tgacgagtta 480

tctgcgttgg ggttgccagc acaggtgtgt ggggccttac ttcatcttgc tccaccacca 540

tcattacgct tttcttatat gtcgtgtgta gtgccgttat ttgctgatga aatcaaagtc 600

gtaggacaag gcacacgatt atcgttagaa gagaaaatga tgatccaacg tttccatgac 660

accggggtca gtgcagcaga aatcggtcga cgcctgggtc ggtgtcggca aacaatttcc 720

agggaacttc gacgtggtca agatgatgat ggacgttatc gtgcacgcga ctcctatgaa 780

ggtgcgatca ggaaactagc gcgtccgaaa acaccgaaac ttgatgccaa tcgtaggctt 840

cgggctgtgg tggtcgaggc gttgaataat aaattatctc cggagcagat ttctggtctt 900

ttagccaccg agcatgctaa cgatagctct atgcagatta gtcatgaaac tatttaccag 960

gcgttatatg ttcaaggtaa aggggcgttg cgtgatgaat tgaaggtgga gaaatttctt 1020

cgtaccggtc ggaagggacg taaaccgcag tcgaagttgc catcgagagg taagccgtgg 1080

gtggagggtg cgttgattag tcaacgccca gcagaagttg ctgatcgtgc tgtgcctggg 1140

cactgggagg gcgatttagt aattggtggt gaaaaccaag cgacagcgtt ggtgacgttg 1200

gtggagcgca cgagccggtt gacgttgatt aagcggttgg gggttaatca tgaggcgtcg 1260

actgtgacgg atgcgttggt ggagatgatg ggtgatttgc cgcaggcgtt gcgtcggagt 1320

ttgacgtggg atcagggtgt ggagatggca gagcatgcgc ggtttagcgt ggtgaccaag 1380

tgtccggtgt ttttctgtga tcctcattcg ccgtggcagc gtgggtcgaa tgagaatacg 1440

aatggattgg tcagggattt tttcccgaag ggcactaatt ttgctaaagt aagtgacgaa 1500

gaagttcagc gggcacagga tctgctgaat taccggccgc ggaaaatgca tggttttaaa 1560

agcgcgacgc aggtatatga aaaaatcgta gttggtgcat ccaccgattg a 1611

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

tcgagctcgg taccctctgg tggtagttcg tag 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ctcgagcata ctagtatccc cgcaaagatc ggc 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

actagtatgc tcgagtacac gatctggacc aac 33

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ctctagagga tccctcaagc tgcctcgcaa cta 33

<210> 16

<211> 476

<212> PRT

<213> 产氨棒杆菌

<400> 16

Met Ala Ser Tyr Asp Pro Gly His Ser Gln Val Lys Asn Thr Gly Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Ser His Val Glu Ser Asp His Leu Gln Arg Gly Leu Ser

20 25 30

Asn Arg His Ile Gln Leu Ile Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Thr Gly

35 40 45

Leu Phe Met Gly Ser Gly Lys Thr Ile Ser Leu Ala Gly Pro Ser Val

50 55 60

Ile Leu Val Tyr Gly Ile Ile Gly Phe Met Leu Phe Phe Val Met Arg

65 70 75 80

Ala Met Gly Glu Leu Leu Leu Ser Asn Leu Asn Tyr Lys Ser Leu Arg

85 90 95

Asp Ala Val Ser Asp Ile Leu Gly Pro Thr Ala Gly Phe Val Cys Gly

100 105 110

Trp Thr Tyr Trp Phe Cys Trp Ile Val Thr Gly Met Ala Asp Val Val

115 120 125

Ala Ile Thr Gly Tyr Thr Gln Tyr Trp Trp Pro Asp Ile Ala Leu Trp

130 135 140

Ile Pro Gly Ala Leu Thr Ile Leu Leu Leu Leu Gly Leu Asn Leu Val

145 150 155 160

Ala Val Arg Leu Phe Gly Glu Leu Glu Phe Trp Phe Ala Ile Ile Lys

165 170 175

Leu Val Ala Ile Thr Ala Leu Ile Leu Val Gly Ala Val Met Val Ile

180 185 190

Ser Arg Phe Gln Ser Pro Asp Gly Asp Ile Ala Ala Val Ser Asn Leu

195 200 205

Ile Asp His Gly Gly Phe Phe Pro Asn Gly Ile Thr Gly Phe Leu Ala

210 215 220

Gly Phe Gln Ile Ala Ile Phe Ala Phe Val Gly Val Glu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Thr Ala Ala Ala Glu Thr Lys Asp Pro Glu Lys Asn Leu Pro Arg Ala

245 250 255

Ile Asn Ser Ile Pro Ile Arg Ile Val Val Phe Tyr Ile Leu Ala Leu

260 265 270

Ala Val Ile Met Met Val Thr Pro Trp Asp Lys Val His Ser Asp Ser

275 280 285

Ser Pro Phe Val Gln Met Phe Ala Leu Ala Gly Leu Pro Ala Ala Ala

290 295 300

Gly Ile Ile Asn Phe Val Val Leu Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ala Asn

305 310 315 320

Ser Gly Ile Phe Ser Thr Ser Arg Met Leu Phe Gly Leu Ala Arg Glu

325 330 335

Gly Gln Ala Pro Lys Arg Trp Gly Ile Leu Ser Arg Asn Gln Val Pro

340 345 350

Ala Arg Gly Leu Leu Phe Ser Val Ala Cys Leu Val Pro Ser Leu Ala

355 360 365

Ile Leu Tyr Ala Gly Ala Ser Val Ile Asp Ala Phe Thr Leu Ile Thr

370 375 380

Thr Val Ser Ser Val Leu Phe Met Val Val Trp Ser Leu Ile Leu Ala

385 390 395 400

Ala Tyr Leu Val Phe Arg Arg Lys Phe Pro Glu Arg His Ala Ala Ser

405 410 415

Lys Phe Lys Val Pro Gly Gly Ala Phe Met Cys Trp Val Val Leu Ala

420 425 430

Phe Phe Ala Phe Met Val Val Val Leu Thr Phe Glu Asn Asp Thr Arg

435 440 445

Ser Ala Leu Met Val Thr Pro Ile Trp Phe Val Ile Leu Leu Ala Gly

450 455 460

Trp Phe Ile Ser Gly Gly Val Lys Arg Ala Arg Lys

465 470 475

<210> 17

<211> 1431

<212> DNA

<213> 产氨棒杆菌

<400> 17

atggcatctt atgatcccgg gcattcacag gttaaaaata caggagtaga actcgactct 60

cacgtggagt cagaccatct ccaacgcggt cttagcaacc gacatatcca gttgattgcc 120

attggcggtg ctatcggcac cggactattt atgggatcgg gcaaaaccat ctcccttgct 180

ggtccttccg taatcttggt gtatggcatc atcggtttta tgctcttctt cgtcatgcgg 240

gcgatgggtg agcttttgct ctcgaacctc aactacaagt cattgcgtga tgccgtctcg 300

gacatcctcg ggcctaccgc tggtttcgta tgcggctgga cctactggtt ctgctggatt 360

gtcacaggca tggctgatgt cgtggctatt accggctaca cccaatactg gtggccagat 420

atcgcgctgt ggatacctgg agcattgacg attttattac tgctcgggtt aaatctcgtg 480

gcagtccgcc tctttggtga gttggaattt tggttcgcaa tcatcaagct ggtggctatt 540

actgcgctca tcctcgtcgg cgcggtgatg gttatttcgc gcttccaatc cccagacggc 600

gacattgcgg ctgtttccaa cctgatcgac catggcggct tcttcccgaa cggaatcacg 660

ggcttcctcg ccggattcca gattgctatc ttcgccttcg tcggcgtgga gcttgccggt 720

accgcggctg cagaaaccaa agacccagaa aagaatcttc ctcgcgcgat taactcgatt 780

cctattcgta tcgtcgtgtt ctacatcctg gctcttgcgg tcatcatgat ggttacccca 840

tgggacaagg tccacagtga ctccagccca tttgtgcaga tgtttgccct ggctggactg 900

ccggcggcag caggcattat taacttcgtg gtgctgacat ctgctgcttc atccgcgaac 960

agtggtattt tctccacatc acgcatgctg ttcggtctgg ctcgcgaagg ccaagcgccc 1020

aagcgttggg gcatcttgtc ccgtaaccaa gtcccagccc gcggcctgct gttctcagta 1080

gcgtgcctgg tcccgagcct ggcaatcttg tacgccggcg ccagcgtcat tgacgccttt 1140

acgttgatta ccaccgtgtc ttctgtgctg ttcatggtgg tatggagcct gatcctcgcg 1200

gcgtaccttg tcttccgccg caagttccca gaacgccatg cagcatccaa gttcaaggtc 1260

ccaggcgggg cgtttatgtg ctgggttgtt ctcgctttct tcgcgtttat ggtcgttgta 1320

ctgacctttg aaaatgacac tcggtccgct ttgatggtca ccccaatctg gttcgtgatc 1380

ctcttggccg gctggttcat ctccggcgga gtcaagcgcg ctaggaagtg a 1431

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

cgaaaggaaa cactcatggc atcttatgat ccc 33

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

gggttgggtt ttcccgatct cgagcgattg cgtggcctcc aac 43

<210> 20

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cj7

<400> 20

agaaacatcc cagcgctact aatagggagc gttgaccttc cttccacgga ccggtaatcg 60

gagtgcctaa aaccgcatgc ggcttaggct ccaagatagg ttctgcgcgg ccgggtaatg 120

catcttcttt agcaacaagt tgaggggtag gtgcaaataa gaacgacata gaaatcgtct 180

cctttctgtt tttaatcaac atacaccacc acctaaaaat tccccgacca gcaagttcac 240

agtattcggg cacaatatcg ttgccaaaat attgtttcgg aatatcatgg gatacgtacc 300

caacgaaagg aaacactc 318

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

gccgatcttt gcggggatac tagtatgctc gagagaaaca tcccagcgct a 51

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

gagtgtttcc tttcgttg 18

<210> 23

<211> 470

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 23

Met Val Asp Gln Val Lys Val Val Ala Asp Asp Gln Ala Pro Ala Glu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Arg Arg Asn Leu Thr Asn Arg His Ile Gln Leu Ile Ala

20 25 30

Ile Gly Gly Ala Ile Gly Thr Gly Leu Phe Met Gly Ser Gly Lys Thr

35 40 45

Ile Ser Leu Ala Gly Pro Ser Ile Ile Phe Val Tyr Met Ile Ile Gly

50 55 60

Phe Met Leu Phe Phe Val Met Arg Ala Met Gly Glu Leu Leu Leu Ser

65 70 75 80

Asn Leu Glu Tyr Lys Ser Phe Ser Asp Phe Ala Ser Asp Leu Leu Gly

85 90 95

Pro Trp Ala Gly Tyr Phe Thr Gly Trp Thr Tyr Trp Phe Cys Trp Val

100 105 110

Val Thr Gly Met Ala Asp Val Val Ala Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Phe

115 120 125

Trp Phe Pro Asp Leu Ser Asp Trp Val Ala Ser Leu Ala Val Ile Val

130 135 140

Leu Leu Leu Thr Leu Asn Leu Ala Thr Val Lys Met Phe Gly Glu Met

145 150 155 160

Glu Phe Trp Phe Ala Met Ile Lys Ile Val Ala Ile Val Ser Leu Ile

165 170 175

Val Val Gly Leu Val Met Val Ala Met His Phe Gln Ser Pro Thr Gly

180 185 190

Val Glu Ala Ser Phe Ala His Leu Trp Asn Asp Gly Gly Trp Phe Pro

195 200 205

Lys Gly Leu Ser Gly Phe Phe Ala Gly Phe Gln Ile Ala Val Phe Ala

210 215 220

Phe Val Gly Ile Glu Leu Val Gly Thr Thr Ala Ala Glu Thr Lys Asp

225 230 235 240

Pro Glu Lys Ser Leu Pro Arg Ala Ile Asn Ser Ile Pro Ile Arg Ile

245 250 255

Ile Met Phe Tyr Val Phe Ala Leu Ile Val Ile Met Ser Val Thr Pro

260 265 270

Trp Ser Ser Val Val Pro Glu Lys Ser Pro Phe Val Glu Leu Phe Val

275 280 285

Leu Val Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ser Val Ile Asn Phe Val Val Leu

290 295 300

Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ala Asn Ser Gly Val Phe Ser Thr Ser Arg

305 310 315 320

Met Leu Phe Gly Leu Ala Gln Glu Gly Val Ala Pro Lys Ala Phe Ala

325 330 335

Lys Leu Ser Lys Arg Ala Val Pro Ala Lys Gly Leu Thr Phe Ser Cys

340 345 350

Ile Cys Leu Leu Gly Gly Val Val Met Leu Tyr Val Asn Pro Ser Val

355 360 365

Ile Gly Ala Phe Thr Met Ile Thr Thr Val Ser Ala Ile Leu Phe Met

370 375 380

Phe Val Trp Thr Ile Ile Leu Cys Ser Tyr Leu Val Tyr Arg Lys Gln

385 390 395 400

Arg Pro His Leu His Glu Lys Ser Ile Tyr Lys Met Pro Leu Gly Lys

405 410 415

Leu Met Cys Trp Val Cys Met Ala Phe Phe Val Phe Val Val Val Leu

420 425 430

Leu Thr Leu Glu Asp Asp Thr Arg Gln Ala Leu Leu Val Thr Pro Leu

435 440 445

Trp Phe Ile Ala Leu Gly Leu Gly Trp Leu Phe Ile Gly Lys Lys Arg

450 455 460

Ala Ala Glu Leu Arg Lys

465 470

<210> 24

<211> 1413

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 24

atggtagatc aggtaaaagt cgttgccgat gatcaggctc cggctgaaca gtcgctacgg 60

cgcaatctca caaaccgaca tattcagctt attgccattg gcggtgccat tggtacgggg 120

ttgtttatgg ggtctggcaa aacgattagc cttgccgggc cgtcgatcat tttcgtttat 180

atgatcattg gttttatgct ctttttcgtg atgcgggcaa tgggggaatt gctgctttcg 240

aatctggaat acaaatcttt tagtgacttc gcttccgatt tactcgggcc gtgggcagga 300

tatttcaccg gctggactta ctggttctgc tgggttgtaa ccggtatggc agacgtggtg 360

gcgatcacgg cttatgctca gttctggttc cccgatctct ccgactgggt cgcctcgctg 420

gcggtgatag tgctgctgct gacgctcaat ctcgccaccg tgaaaatgtt cggtgagatg 480

gagttctggt ttgcgatgat caaaatcgtc gccattgtgt cgctgattgt cgtcggcctg 540

gtcatggtgg cgatgcactt tcagtcaccg actggtgtgg aagcgtcatt cgcgcatttg 600

tggaatgacg gcggctggtt cccgaaaggt ttaagtggct tctttgccgg attccagata 660

gcggttttcg ctttcgtggg gattgagctg gtaggtacaa cagctgcgga aaccaaagat 720

ccagagaaat cactgccacg cgcgattaac tccattccga tccgtatcat tatgttctac 780

gtcttcgcgc tgattgtgat tatgtccgtg acgccgtgga gttcggtagt cccggagaaa 840

agcccgtttg ttgaactgtt cgtgttggta gggctgcctg ctgccgcaag cgtgatcaac 900

tttgtggtgc tgacctctgc ggcgtcttcc gctaacagcg gcgtcttctc taccagccgt 960

atgctgtttg gtctggcgca ggaaggtgtg gcaccgaaag cgttcgctaa actttctaag 1020

cgcgcagtac ccgcgaaagg gctgacgttc tcgtgtatct gtctgctcgg cggcgtggtg 1080

atgttgtatg tgaatcctag tgtgattggc gcgttcacga tgattacaac cgtttccgcg 1140

attctgttta tgttcgtctg gacgattatc ctttgctcgt accttgtgta tcgcaaacag 1200

cgtcctcatc tacatgagaa gtcgatctac aagatgccgc tcggcaagct gatgtgctgg 1260

gtatgtatgg cgttctttgt gttcgtggtc gtgttgctga cactggaaga tgacactcgc 1320

caggcgctgc tggttacccc gctgtggttt atcgcgctgg ggttgggctg gctgtttatt 1380

ggtaagaagc gggctgctga actgcggaaa taa 1413

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

cgaaaggaaa cactcatggt agatcaggta aaag 34

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

gggttgggtt ttcccgatct cgagctgatg gatcacatca gtc 43

<210> 27

<211> 2859

<212> DNA

<213> 产氨棒杆菌

<400> 27

atggatttca ttgcccgcca ccttgggcca gatgccacag aatctaagga catgctggcg 60

cgtgtgggtt atgacagcgt agaagcgctt gtcacctcag caatccccca gtccattagc 120

atcacggatg cgcttaatat gccgcaggca ttgagtgaga ccgacgcaca agccaagctt 180

cgcgcttacg ctgataaaaa tgtcgtgctg aagtctttct acggccaggg ctactcagac 240

accatcaccc ctgctgttat tcgccgcggt ttggtagaag acgctggttg gtacaccgct 300

tataccccat accagccaga aatttcccag ggtcgccttg agtcgctgct gaacttccag 360

accatggttc aagacctcac cggcttgcct attgcgaatg cttctttgct ggatgaggca 420

tcggcagttg ctgaggccgt gggtttgatg tctcgtgcgg tcaagaaggg ccgccgcgta 480

ctgctcgacg cccgtttgca cccacaggtt ctcaccgtgg cggcggagcg tgcccgagca 540

attgacctcg aagttgagat tgctgacttg agcaacggcg tggttggcga agacctcgtc 600

ggcgcagtag ttgcctacac cggtacggag ggcgatattt ttgacccacg tgctgttatc 660

gaagaaatcc atggccgcgg cggacttgtt tccgtcgcgg ctgacttgtt gtccttgctg 720

cttctggaag gcccaggctc gttcggtgca gacattgtca ttggttcctc ccaacgcttt 780

ggtgtgccgc tcttctttgg tggcccacac gctgctttca tggcagtaac tgacaagcta 840

aagcgtcaga tgccaggccg tttggtcggc gtatcggtcg attctgaggg ccgtcctgct 900

taccgcttgg cgctgcagac tcgtgaacag cacatccgcc gtgaacgcgc gacgtcaaat 960

atttgtaccg cgcaggcact tctggccaac gtggctgcca tgtacgccgt ctaccacggt 1020

ccagaaggct tgaaggagat tgctaaccac gtgcactcct tggctgcttc ctttgccggt 1080

gcagttacta ctcagggtct gaagattact tcctcggagt tcttcgacac cgttaccgtt 1140

gccggcgttg atgccgcatc cattaagttc agcttggaaa aggccggata cctggtgcgc 1200

accattggcg aggataaggt ttctgtctcc ttcggtgagt ccgcaaccca aggcgatgtt 1260

actgtcttgg cggacgcctt tggtgccgct gcagtagata atgcagattt cccactgcct 1320

gaagcactca cccgcaccac cgaggtgctc acccacgaaa tctttaactc cattcactcc 1380

gaaacccaga tgatgcgtta cctgcgcaag ctcggtgata aggatctggc tctagatcgc 1440

accatgattc ctttgggctc atgcaccatg aagctcaacc caaccgcagc catggaaccg 1500

atcacctggc cagaattcgc caatgttcac ccttactccc ctgaatacgc aacccagggc 1560

tggcgtgagc tcattgaaga gttggaaggc tggttggctg agctgaccgg ctacgccaag 1620

gtttctatcc aaccaaacgc tggttcccag ggcgagctag ctggtctttt ggctatccgc 1680

cgctaccacg tcgcaaatgg tgacaccaac cgcgatatcg tgttgattcc tgcgtccgcg 1740

cacggcacca acgctgcctc cgcgaccctg gcaaatctgc gcgttgttgt ggttaagacc 1800

gccgaagacg gctccatcga tctggaagat ctcgatgcga agatcgccaa gcatggtcag 1860

aacatggccg gaatcatgat cacctaccca tccactcacg gcgtctttga cccagaggtt 1920

cgtgaagtct gcgacaagat ccatgccgct ggcggccagg tctacattga tggcgcaaac 1980

atgaatgctt tgactggttg ggctcagccg ggcaagttcg gtggcgatgt ctcgcacttg 2040

aacctgcaca agactttcac cattccgcac ggcggtggcg gcccaggtgt tggaccaatt 2100

ggtgtcgctg agcacctcat tccattcctg ccaacggatg ctgcagctga tgagctggat 2160

cctgctaacc caaccccagt agaacagggc gttccaatta ctgcttcgca gtttggttcc 2220

gctggtgttc tgccgattac ctgggcatac atcgcaatga ccggtggcga gggtctaacc 2280

tccgctactg cacacgccat cttgggtgct aactaccttg cgcgcgaact ctccgattcc 2340

ttcccaattc tgttcaccgg taatgaaggt cttgttgcgc acgagtgcat tttggatctg 2400

cgcgcgctaa ccgatgcctc aggcgttact gcagcagacg ttgccaagcg tttgatcgac 2460

tttggcttcc acgctcctac cctcgcattc ccagtggctg gcaccttgat ggtggaacct 2520

actgagtctg aggatattgc tgaactggat cgtttcattg aagcaatgcg caccatccgt 2580

gcggagattc aggaaatcat cgatggcaag atcgcatatg aagattcggt catccgccac 2640

gcaccttaca ccgcaccgtc agtctcaagc gatgattggg agtactcctt tagccgtgaa 2700

aaggccgcat ggccagttcc ttcactgcgt ttgaacaagt acttcccacc ggtacgccgc 2760

ctggatgaag cttacggcga ccgcaacctg gtgtgctcct gcccaccgcc agaggcattc 2820

gacttcgatg ccgacaccga ttccaccgag gaggcttaa 2859

<210> 28

<211> 1104

<212> DNA

<213> 产氨棒杆菌

<400> 28

atgtcagaac tacgccagtc cccactgcac gcagagcacg aaaagctcgg cgcatccttt 60

accgcttttg gcccttggaa tatgccacta aagtacggca aggagctcga tgagcaccac 120

gcagtgcgta atgcagtcgg catgtttgac ctctcgcaca tgggtgagat ttgggtcaac 180

ggcccagacg ccgctgcatt tttgtcctat gcgctgatct ccaacatgga gaccgtgaaa 240

aatggcaagg cgaagtactc catgattgtt gctgaagacg gcggcatcat cgatgaccta 300

atttcctacc gtttctccga taccaagttc ttggtagtgc caaacgctgg caacactgat 360

gtggtttggg aagcttttaa tcagcgcatt gaaggcttcg atgtagaact caacaatgag 420

tccttggatg ttgcgatgat tgccctgcag ggccccaatg ctgccaaggt tctagttgaa 480

caggttgctg aagagtccaa ggaagaagta gaaaaccttc cttactatgc cgcaaccatg 540

gccaaagtcg cagacgttga caccatcgtc gcgcgcaccg gctacaccgg cgaagacggc 600

ttcgagctga tgatctacaa cgccgatgcg accaagctct ggcagctttt catcgaccaa 660

gatggtgtta ctccatgcgg tttagcttca cgcgattcct tgcgcttgga agctggcatg 720

cctttgtacg gcaatgagct ttcccgcgat atcacccctg tcgaggcagg catgggtgtg 780

gcgtttaaga agaagaccgc tgacttcgtc ggcgccgagg tcctgcgtca acgcttggaa 840

gaaggcccta agcaagttat caaggctttg acctcctctg agcgccgtgc agcgcgcacc 900

ggtgctgaaa tctatgccgg cgagcagttg gtaggcaccg taacttcggg tcagccatcg 960

ccgacgctgg gacaccctat tgccctggca ctggtagata ctgcagcaaa cctcgaagaa 1020

ggcgcagaag tagaagtgga tattcgcggc aagcgttacc ccttcaccgt taccaagacg 1080

cctttctata gccgcgagaa gtaa 1104

<210> 29

<211> 390

<212> DNA

<213> 产氨棒杆菌

<400> 29

atggctaacc tacctgcaga atttacttac tccgaagacc acgagtggat taacgccgct 60

caggacgcaa tcgttggcaa aactgttcgc atcggcatca cttctgttgc cgcagaccgt 120

cttggtgagg ttgtcttcgc tgagcttcca gcagttggcg atagcgtcac tgcaggtgaa 180

acctgtggtg aggttgaatc caccaagtcc gtttctgacc tgtacagccc tgtcaccggt 240

accgtgaccg ctgtgaacga gacagtgcac gatgattatg aaatcatcaa caatgatcct 300

ttcggtgaag gttggctgtt tgaggtcgag gttgaagaac tcggcgaggt tatgaccgct 360

gatgaatacg cggcagaaaa cggcatctaa 390

<210> 30

<211> 1062

<212> DNA

<213> 产氨棒杆菌

<400> 30

atgctccgca ttgaaaagaa gaatgcggag tcacccattg agcagaagcc gaggtggatc 60

cgcaaccagg tccgcactgg ccctggttat gaggacatga aaaagcgtgt tgctggcgct 120

ggcctgcaca ctgtctgcca ggaggcaggc tgtcctaata tccacgaatg ctgggagtcc 180

cgagaagcca ccttccttat cggcggtgac cgttgtactc gccgttgtga cttctgcgat 240

attgccactg gtaagccgca ggcattggac accgatgagc cgcgtcgcgt ttcggaaaac 300

atccaagaga tgaatctgaa ctacgccacg atcactggtg ttacccgtga tgaccttcca 360

gatgagggcg catggctata tgctgaagtg gttcgtaaga tccacgagaa gaaccctcac 420

acgggtgtag aaaacctcac cccggacttc tccggcaagc cagacctgct gcaggaagtc 480

ttcgaggctc gccctgaggt tttcgctcac aacttggaaa ccgttcctcg tattttcaag 540

cgtatccgcc cggcattccg ttatgagcgt tctctggatg ttttgcagca ggcacacgac 600

ttcggcctga tcaccaagtc gaacttgatc ttgggcatgg gtgaaactga ggaagagatt 660

caggaagctc tacgcgatat gcgctctgtg ggcactgaca tcattaccat tacgcagtac 720

ctgcgtcctg gtcctcgttt ccacccaatt gagcgttggg ttcgccctga ggagttcatt 780

gcgcactccg agtacgccaa ggaattgggc tttaccgtta tgtctggtcc tttggttcgt 840

tcttcttacc gcgcgggcaa gctctacacc caggcgatga aggcacgtgg ctgggagctg 900

ccagaaaatc tcaagcacct ggaagaaact tctgatggcg caaccgctca ggaagcttcg 960

tcgctgttga agaagtacgg cccttccgag gaaacgccag ttacttcccg catggcaaag 1020

acgcctgtgg gtgcagataa atttactgct agcatccgct aa 1062

<210> 31

<211> 822

<212> DNA

<213> 产氨棒杆菌

<400> 31

atgactgctc cgcgtgaccc gtttttcccc gctgatcgtt ctattcgcgc ttctactgcc 60

ccggtagagg tgagacgttt aggtcgtatg gattatcaag aagcctggga ctatcaagca 120

gaagtcgcag cgcagcgcgc acgtgacgaa gttgcagaca cgttgctggt cgttgagcac 180

cccgctgtgt atacggcggg caagcgcacg cagcccgaag atatgcccac caacggtctt 240

ccggttatca atgttgatcg tggcggccgg attacctggc acggcgaggg ccagttggtg 300

gtctacccga ttatcaagtt ggcagagcct gtcgatgtcg tcgattatgt ccgccgtctg 360

gaagaagctg ttattcatac cgttcgggaa atgggggtaa caactgctgg gcgtatcgat 420

ggtcgctcag gcgtgtgggt gccatcgact accgctgcga aagacccggc agcatcgcac 480

cgagaccgca agattgcggc cttaggcatc cgcattacgc gtggggttac catgcatggt 540

ctggcgctca attgcgacaa tatcttggac tactacgagc acattattgc ctgcggtatt 600

gatgatgccg atatcaccac cctggcgcta gagctgggcc gcgacgtcac cgtagatgat 660

gcggttgagc ccttgctcat tgcgcttgac gatgccttgg ccggccgcat ggtcgtcgcc 720

gaccacactt tcgcatctgc cccagacccc atcaaattag ctaatgagaa agcgcgccaa 780

gcacgcgcgc agtcttcctt gactgatcat gcaggctctt aa 822

<210> 32

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gccgatcttt gcggggatac tagtcaggat gcaattgcca tcc 43

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

atgcgccatt agcgtggttg caccggttgc tacc 34

<210> 34

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

tagcaaccgg tgcaaccacg ctaatggcgc attg 34

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

gggttgggtt ttcccgatct cgagcagcaa gcccatgccc aag 43

<210> 36

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

tgggcatggg cttgctgctc gagagaaaca tcccagcgct a 41

<210> 37

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

gggttgggtt ttcccgatct cgagcgattg cgtggcctcc aac 43

<210> 38

<211> 952

<212> PRT

<213> 产氨棒杆菌

<400> 38

Met Asp Phe Ile Ala Arg His Leu Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ser Lys

1 5 10 15

Asp Met Leu Ala Arg Val Gly Tyr Asp Ser Val Glu Ala Leu Val Thr

20 25 30

Ser Ala Ile Pro Gln Ser Ile Ser Ile Thr Asp Ala Leu Asn Met Pro

35 40 45

Gln Ala Leu Ser Glu Thr Asp Ala Gln Ala Lys Leu Arg Ala Tyr Ala

50 55 60

Asp Lys Asn Val Val Leu Lys Ser Phe Tyr Gly Gln Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Thr Ile Thr Pro Ala Val Ile Arg Arg Gly Leu Val Glu Asp Ala Gly

85 90 95

Trp Tyr Thr Ala Tyr Thr Pro Tyr Gln Pro Glu Ile Ser Gln Gly Arg

100 105 110

Leu Glu Ser Leu Leu Asn Phe Gln Thr Met Val Gln Asp Leu Thr Gly

115 120 125

Leu Pro Ile Ala Asn Ala Ser Leu Leu Asp Glu Ala Ser Ala Val Ala

130 135 140

Glu Ala Val Gly Leu Met Ser Arg Ala Val Lys Lys Gly Arg Arg Val

145 150 155 160

Leu Leu Asp Ala Arg Leu His Pro Gln Val Leu Thr Val Ala Ala Glu

165 170 175

Arg Ala Arg Ala Ile Asp Leu Glu Val Glu Ile Ala Asp Leu Ser Asn

180 185 190

Gly Val Val Gly Glu Asp Leu Val Gly Ala Val Val Ala Tyr Thr Gly

195 200 205

Thr Glu Gly Asp Ile Phe Asp Pro Arg Ala Val Ile Glu Glu Ile His

210 215 220

Gly Arg Gly Gly Leu Val Ser Val Ala Ala Asp Leu Leu Ser Leu Leu

225 230 235 240

Leu Leu Glu Gly Pro Gly Ser Phe Gly Ala Asp Ile Val Ile Gly Ser

245 250 255

Ser Gln Arg Phe Gly Val Pro Leu Phe Phe Gly Gly Pro His Ala Ala

260 265 270

Phe Met Ala Val Thr Asp Lys Leu Lys Arg Gln Met Pro Gly Arg Leu

275 280 285

Val Gly Val Ser Val Asp Ser Glu Gly Arg Pro Ala Tyr Arg Leu Ala

290 295 300

Leu Gln Thr Arg Glu Gln His Ile Arg Arg Glu Arg Ala Thr Ser Asn

305 310 315 320

Ile Cys Thr Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Val Ala Ala Met Tyr Ala

325 330 335

Val Tyr His Gly Pro Glu Gly Leu Lys Glu Ile Ala Asn His Val His

340 345 350

Ser Leu Ala Ala Ser Phe Ala Gly Ala Val Thr Thr Gln Gly Leu Lys

355 360 365

Ile Thr Ser Ser Glu Phe Phe Asp Thr Val Thr Val Ala Gly Val Asp

370 375 380

Ala Ala Ser Ile Lys Phe Ser Leu Glu Lys Ala Gly Tyr Leu Val Arg

385 390 395 400

Thr Ile Gly Glu Asp Lys Val Ser Val Ser Phe Gly Glu Ser Ala Thr

405 410 415

Gln Gly Asp Val Thr Val Leu Ala Asp Ala Phe Gly Ala Ala Ala Val

420 425 430

Asp Asn Ala Asp Phe Pro Leu Pro Glu Ala Leu Thr Arg Thr Thr Glu

435 440 445

Val Leu Thr His Glu Ile Phe Asn Ser Ile His Ser Glu Thr Gln Met

450 455 460

Met Arg Tyr Leu Arg Lys Leu Gly Asp Lys Asp Leu Ala Leu Asp Arg

465 470 475 480

Thr Met Ile Pro Leu Gly Ser Cys Thr Met Lys Leu Asn Pro Thr Ala

485 490 495

Ala Met Glu Pro Ile Thr Trp Pro Glu Phe Ala Asn Val His Pro Tyr

500 505 510

Ser Pro Glu Tyr Ala Thr Gln Gly Trp Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu

515 520 525

Glu Gly Trp Leu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Ala Lys Val Ser Ile Gln

530 535 540

Pro Asn Ala Gly Ser Gln Gly Glu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ile Arg

545 550 555 560

Arg Tyr His Val Ala Asn Gly Asp Thr Asn Arg Asp Ile Val Leu Ile

565 570 575

Pro Ala Ser Ala His Gly Thr Asn Ala Ala Ser Ala Thr Leu Ala Asn

580 585 590

Leu Arg Val Val Val Val Lys Thr Ala Glu Asp Gly Ser Ile Asp Leu

595 600 605

Glu Asp Leu Asp Ala Lys Ile Ala Lys His Gly Gln Asn Met Ala Gly

610 615 620

Ile Met Ile Thr Tyr Pro Ser Thr His Gly Val Phe Asp Pro Glu Val

625 630 635 640

Arg Glu Val Cys Asp Lys Ile His Ala Ala Gly Gly Gln Val Tyr Ile

645 650 655

Asp Gly Ala Asn Met Asn Ala Leu Thr Gly Trp Ala Gln Pro Gly Lys

660 665 670

Phe Gly Gly Asp Val Ser His Leu Asn Leu His Lys Thr Phe Thr Ile

675 680 685

Pro His Gly Gly Gly Gly Pro Gly Val Gly Pro Ile Gly Val Ala Glu

690 695 700

His Leu Ile Pro Phe Leu Pro Thr Asp Ala Ala Ala Asp Glu Leu Asp

705 710 715 720

Pro Ala Asn Pro Thr Pro Val Glu Gln Gly Val Pro Ile Thr Ala Ser

725 730 735

Gln Phe Gly Ser Ala Gly Val Leu Pro Ile Thr Trp Ala Tyr Ile Ala

740 745 750

Met Thr Gly Gly Glu Gly Leu Thr Ser Ala Thr Ala His Ala Ile Leu

755 760 765

Gly Ala Asn Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Ser Asp Ser Phe Pro Ile Leu

770 775 780

Phe Thr Gly Asn Glu Gly Leu Val Ala His Glu Cys Ile Leu Asp Leu

785 790 795 800

Arg Ala Leu Thr Asp Ala Ser Gly Val Thr Ala Ala Asp Val Ala Lys

805 810 815

Arg Leu Ile Asp Phe Gly Phe His Ala Pro Thr Leu Ala Phe Pro Val

820 825 830

Ala Gly Thr Leu Met Val Glu Pro Thr Glu Ser Glu Asp Ile Ala Glu

835 840 845

Leu Asp Arg Phe Ile Glu Ala Met Arg Thr Ile Arg Ala Glu Ile Gln

850 855 860

Glu Ile Ile Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Glu Asp Ser Val Ile Arg His

865 870 875 880

Ala Pro Tyr Thr Ala Pro Ser Val Ser Ser Asp Asp Trp Glu Tyr Ser

885 890 895

Phe Ser Arg Glu Lys Ala Ala Trp Pro Val Pro Ser Leu Arg Leu Asn

900 905 910

Lys Tyr Phe Pro Pro Val Arg Arg Leu Asp Glu Ala Tyr Gly Asp Arg

915 920 925

Asn Leu Val Cys Ser Cys Pro Pro Pro Glu Ala Phe Asp Phe Asp Ala

930 935 940

Asp Thr Asp Ser Thr Glu Glu Ala

945 950

<210> 39

<211> 367

<212> PRT

<213> 产氨棒杆菌

<400> 39

Met Ser Glu Leu Arg Gln Ser Pro Leu His Ala Glu His Glu Lys Leu

1 5 10 15

Gly Ala Ser Phe Thr Ala Phe Gly Pro Trp Asn Met Pro Leu Lys Tyr

20 25 30

Gly Lys Glu Leu Asp Glu His His Ala Val Arg Asn Ala Val Gly Met

35 40 45

Phe Asp Leu Ser His Met Gly Glu Ile Trp Val Asn Gly Pro Asp Ala

50 55 60

Ala Ala Phe Leu Ser Tyr Ala Leu Ile Ser Asn Met Glu Thr Val Lys

65 70 75 80

Asn Gly Lys Ala Lys Tyr Ser Met Ile Val Ala Glu Asp Gly Gly Ile

85 90 95

Ile Asp Asp Leu Ile Ser Tyr Arg Phe Ser Asp Thr Lys Phe Leu Val

100 105 110

Val Pro Asn Ala Gly Asn Thr Asp Val Val Trp Glu Ala Phe Asn Gln

115 120 125

Arg Ile Glu Gly Phe Asp Val Glu Leu Asn Asn Glu Ser Leu Asp Val

130 135 140

Ala Met Ile Ala Leu Gln Gly Pro Asn Ala Ala Lys Val Leu Val Glu

145 150 155 160

Gln Val Ala Glu Glu Ser Lys Glu Glu Val Glu Asn Leu Pro Tyr Tyr

165 170 175

Ala Ala Thr Met Ala Lys Val Ala Asp Val Asp Thr Ile Val Ala Arg

180 185 190

Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Gly Phe Glu Leu Met Ile Tyr Asn Ala

195 200 205

Asp Ala Thr Lys Leu Trp Gln Leu Phe Ile Asp Gln Asp Gly Val Thr

210 215 220

Pro Cys Gly Leu Ala Ser Arg Asp Ser Leu Arg Leu Glu Ala Gly Met

225 230 235 240

Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Leu Ser Arg Asp Ile Thr Pro Val Glu Ala

245 250 255

Gly Met Gly Val Ala Phe Lys Lys Lys Thr Ala Asp Phe Val Gly Ala

260 265 270

Glu Val Leu Arg Gln Arg Leu Glu Glu Gly Pro Lys Gln Val Ile Lys

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Ser Glu Arg Arg Ala Ala Arg Thr Gly Ala Glu Ile

290 295 300

Tyr Ala Gly Glu Gln Leu Val Gly Thr Val Thr Ser Gly Gln Pro Ser

305 310 315 320

Pro Thr Leu Gly His Pro Ile Ala Leu Ala Leu Val Asp Thr Ala Ala

325 330 335

Asn Leu Glu Glu Gly Ala Glu Val Glu Val Asp Ile Arg Gly Lys Arg

340 345 350

Tyr Pro Phe Thr Val Thr Lys Thr Pro Phe Tyr Ser Arg Glu Lys

355 360 365

<210> 40

<211> 129

<212> PRT

<213> 产氨棒杆菌

<400> 40

Met Ala Asn Leu Pro Ala Glu Phe Thr Tyr Ser Glu Asp His Glu Trp

1 5 10 15

Ile Asn Ala Ala Gln Asp Ala Ile Val Gly Lys Thr Val Arg Ile Gly

20 25 30

Ile Thr Ser Val Ala Ala Asp Arg Leu Gly Glu Val Val Phe Ala Glu

35 40 45

Leu Pro Ala Val Gly Asp Ser Val Thr Ala Gly Glu Thr Cys Gly Glu

50 55 60

Val Glu Ser Thr Lys Ser Val Ser Asp Leu Tyr Ser Pro Val Thr Gly

65 70 75 80

Thr Val Thr Ala Val Asn Glu Thr Val His Asp Asp Tyr Glu Ile Ile

85 90 95

Asn Asn Asp Pro Phe Gly Glu Gly Trp Leu Phe Glu Val Glu Val Glu

100 105 110

Glu Leu Gly Glu Val Met Thr Ala Asp Glu Tyr Ala Ala Glu Asn Gly

115 120 125

Ile

<210> 41

<211> 353

<212> PRT

<213> 产氨棒杆菌

<400> 41

Met Leu Arg Ile Glu Lys Lys Asn Ala Glu Ser Pro Ile Glu Gln Lys

1 5 10 15

Pro Arg Trp Ile Arg Asn Gln Val Arg Thr Gly Pro Gly Tyr Glu Asp

20 25 30

Met Lys Lys Arg Val Ala Gly Ala Gly Leu His Thr Val Cys Gln Glu

35 40 45

Ala Gly Cys Pro Asn Ile His Glu Cys Trp Glu Ser Arg Glu Ala Thr

50 55 60

Phe Leu Ile Gly Gly Asp Arg Cys Thr Arg Arg Cys Asp Phe Cys Asp

65 70 75 80

Ile Ala Thr Gly Lys Pro Gln Ala Leu Asp Thr Asp Glu Pro Arg Arg

85 90 95

Val Ser Glu Asn Ile Gln Glu Met Asn Leu Asn Tyr Ala Thr Ile Thr

100 105 110

Gly Val Thr Arg Asp Asp Leu Pro Asp Glu Gly Ala Trp Leu Tyr Ala

115 120 125

Glu Val Val Arg Lys Ile His Glu Lys Asn Pro His Thr Gly Val Glu

130 135 140

Asn Leu Thr Pro Asp Phe Ser Gly Lys Pro Asp Leu Leu Gln Glu Val

145 150 155 160

Phe Glu Ala Arg Pro Glu Val Phe Ala His Asn Leu Glu Thr Val Pro

165 170 175

Arg Ile Phe Lys Arg Ile Arg Pro Ala Phe Arg Tyr Glu Arg Ser Leu

180 185 190

Asp Val Leu Gln Gln Ala His Asp Phe Gly Leu Ile Thr Lys Ser Asn

195 200 205

Leu Ile Leu Gly Met Gly Glu Thr Glu Glu Glu Ile Gln Glu Ala Leu

210 215 220

Arg Asp Met Arg Ser Val Gly Thr Asp Ile Ile Thr Ile Thr Gln Tyr

225 230 235 240

Leu Arg Pro Gly Pro Arg Phe His Pro Ile Glu Arg Trp Val Arg Pro

245 250 255

Glu Glu Phe Ile Ala His Ser Glu Tyr Ala Lys Glu Leu Gly Phe Thr

260 265 270

Val Met Ser Gly Pro Leu Val Arg Ser Ser Tyr Arg Ala Gly Lys Leu

275 280 285

Tyr Thr Gln Ala Met Lys Ala Arg Gly Trp Glu Leu Pro Glu Asn Leu

290 295 300

Lys His Leu Glu Glu Thr Ser Asp Gly Ala Thr Ala Gln Glu Ala Ser

305 310 315 320

Ser Leu Leu Lys Lys Tyr Gly Pro Ser Glu Glu Thr Pro Val Thr Ser

325 330 335

Arg Met Ala Lys Thr Pro Val Gly Ala Asp Lys Phe Thr Ala Ser Ile

340 345 350

Arg

<210> 42

<211> 273

<212> PRT

<213> 产氨棒杆菌

<400> 42

Met Thr Ala Pro Arg Asp Pro Phe Phe Pro Ala Asp Arg Ser Ile Arg

1 5 10 15

Ala Ser Thr Ala Pro Val Glu Val Arg Arg Leu Gly Arg Met Asp Tyr

20 25 30

Gln Glu Ala Trp Asp Tyr Gln Ala Glu Val Ala Ala Gln Arg Ala Arg

35 40 45

Asp Glu Val Ala Asp Thr Leu Leu Val Val Glu His Pro Ala Val Tyr

50 55 60

Thr Ala Gly Lys Arg Thr Gln Pro Glu Asp Met Pro Thr Asn Gly Leu

65 70 75 80

Pro Val Ile Asn Val Asp Arg Gly Gly Arg Ile Thr Trp His Gly Glu

85 90 95

Gly Gln Leu Val Val Tyr Pro Ile Ile Lys Leu Ala Glu Pro Val Asp

100 105 110

Val Val Asp Tyr Val Arg Arg Leu Glu Glu Ala Val Ile His Thr Val

115 120 125

Arg Glu Met Gly Val Thr Thr Ala Gly Arg Ile Asp Gly Arg Ser Gly

130 135 140

Val Trp Val Pro Ser Thr Thr Ala Ala Lys Asp Pro Ala Ala Ser His

145 150 155 160

Arg Asp Arg Lys Ile Ala Ala Leu Gly Ile Arg Ile Thr Arg Gly Val

165 170 175

Thr Met His Gly Leu Ala Leu Asn Cys Asp Asn Ile Leu Asp Tyr Tyr

180 185 190

Glu His Ile Ile Ala Cys Gly Ile Asp Asp Ala Asp Ile Thr Thr Leu

195 200 205

Ala Leu Glu Leu Gly Arg Asp Val Thr Val Asp Asp Ala Val Glu Pro

210 215 220

Leu Leu Ile Ala Leu Asp Asp Ala Leu Ala Gly Arg Met Val Val Ala

225 230 235 240

Asp His Thr Phe Ala Ser Ala Pro Asp Pro Ile Lys Leu Ala Asn Glu

245 250 255

Lys Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gln Ser Ser Leu Thr Asp His Ala Gly

260 265 270

Ser

Claims

1.一种生产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）微生物，所述微生物具有增强的甘氨酸转运蛋白活性，

其中所述甘氨酸转运蛋白是由来源于产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）的cycA基因编码的CycA蛋白。

2. 根据权利要求1所述的微生物，其中所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。

3.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物具有进一步增强的甘氨酸裂解蛋白的活性，

其中所述甘氨酸裂解蛋白是gcvP、gcvT、gcvH、lipB和lipA 基因编码的GcvP、GcvT、GcvH、LipB和LipA蛋白。

4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述甘氨酸裂解蛋白来源于产氨棒杆菌。

5. 根据权利要求3所述的微生物，其中所述GcvP的氨基酸序列如SEQ ID NO: 38所示，GcvT的氨基酸序列如SEQ ID NO: 39所示，GcvH的氨基酸序列如SEQ ID NO: 40所示，LipA的氨基酸序列如SEQ ID NO: 41所示，且LipB的氨基酸序列如SEQ ID NO: 42所示。

6.用于生产L-苏氨酸的组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的微生物。

7. 生产L-苏氨酸的方法，其包括：

培养根据权利要求1至5中任一项所述的微生物；以及

从所述微生物或培养基中回收L-苏氨酸。

8.根据权利要求1所述的微生物用于生产L-苏氨酸的用途，所述微生物具有增强的甘氨酸转运蛋白活性。