WO2020218737A1 - L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 - Google Patents

L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법 Download PDF

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WO2020218737A1
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protein
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cyca
seq
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권수연
백미나
손승주
이광우
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12Y104/04002—Glycine dehydrogenase (decarboxylating) (1.4.4.2)
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    • C12Y201/02—Hydroxymethyl-, formyl- and related transferases (2.1.2)
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01013—Sterol esterase (3.1.1.13)

Definitions

  • the present application relates to a microorganism having enhanced L-threonine production capacity and a threonine production method using the same.
  • Threonine is an essential amino acid and is widely used as feed, food additives, and animal growth accelerators, and is also used as a synthetic raw material for infusions and pharmaceuticals for medicine.
  • a method of blocking the threonine decomposition pathway along with enhancing threonine biosynthesis genes is known to improve the yield (Kwang-Ho Lee , et al., Molecular System Biology 2007).
  • Genes on the threonine degradation pathway include tdh, tdcB, glyA, and ilvA, among which ilvA (Threonine deaminase) is known to be the most important threonine degradation gene. Deleting the ilvA gene among the degrading genes greatly improves the yield of threonine, but there is a problem that the demand for expensive isoleucine appears, so in general, ilvA activity is weakened and high sensitivity mutations to isoleucine are applied. It is known (Akhverdian Valery Z, et al.).
  • the main precursor of serine hydroxymethyltransferase involved in the synthesis of glycine is serine, and the enzyme activity is 24 times higher when used as serine than when using threonine as a precursor. It is known to be high (Simic et al., Appl Environ Microbiol. 2002). However, it is not known about the ability to produce glycine and threonine.
  • the present inventors introduced the glycine transporter cycA derived from Corynebacterium ammoniagenes to develop a usable microorganism by introducing glycine discharged from the cell, and as a result, a strain producing L-threonine was completed with a high yield. I did.
  • the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium producing L-threonine with enhanced glycine transporter activity.
  • This application provides a composition for producing L-threonine containing the microorganisms of the present application.
  • the present application provides a method for producing L-threonine comprising culturing the microorganism of the present application.
  • the present application provides a use for the production of L-threonine by microorganisms of the genus Corynebacterium with enhanced glycine transporter activity.
  • the L-threonine-producing microorganism of this Chuo-win has excellent threonine-producing ability, so it can be used for efficient mass production of L-threonine.
  • One aspect of the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium producing L-threonine with enhanced glycine transporter activity.
  • glycine transporter of the present application is included without limitation as long as it is a protein having a function of introducing glycine into cells, and specifically, D-serine/D-alanine/glycine transporter (D-serine/D -alanine/glycine transporter).
  • the glycine transporter may be used in combination with a D-serine/D-alanine/glycine transporter or a glycine influx protein.
  • the "D-serine/D-alanine/glycine transporter” is a protein that can participate in both serine, alanine and glycine transport, and is a known database, NCBI Genbank. The information can be obtained by searching the D-Serine/D-Alanine/glycine transporter sequence in the back.
  • the transporter may be specifically CycA or AapA, and more specifically, may be a CycA protein, but is not limited thereto.
  • CycA protein in the present application refers to a protein involved in uptake of serine, alanine and glycine. CycA protein is encoded by the cycA gene, and the cycA gene is Escherichia coli , Klebsialla pneumoniae , Mycobacterium bovis , Salmonella enterica , and Erwinia. It is known to be present in microorganisms such as Erwinia amylovora and Corynebacterium ammoniagenes .
  • the CycA protein of the present application may include any one capable of enhancing threonine production.
  • the CycA protein may be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, and more specifically, may be derived from Corynebacterium ammoniagenes, but is not limited thereto.
  • the Corynebacterium ammoniagenes is the same species as Brevibacterium ammoniagenes , Corynebacterium stationis , Brevibacterium stationis ) And were classified in the same taxon (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 60: 874-879).
  • the Brevibacterium ammonia genera has been renamed to Corynebacterium staionis.
  • Corynebacterium ammonia genera Brevibacterium ammonia genera
  • Corynebacterium stationity Brevibacterium stationity
  • the CycA protein of the present application may include SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence having 70% or more homology or identity thereto.
  • the CycA protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, Amino acid sequences having 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homology or identity may be included.
  • an amino acid sequence having the homology or identity and exhibiting efficacy corresponding to the protein is included within the scope of the present application, even if some sequences have an amino acid sequence that has been deleted, modified, substituted or added.
  • a probe that can be prepared from a known gene sequence for example, a polypeptide encoded by a polynucleotide hybridized under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, serine, Polypeptides having alanine and glycine influx activity may also be included without limitation.
  • the "conservative substitution” refers to the substitution of one amino acid for another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions can generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • Negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and aspartic acid
  • Aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine
  • hydrophobic amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine and tryptophan.
  • polynucleotide has the meaning of comprehensively including DNA or RNA molecules, and nucleotides, which are basic structural units in polynucleotides, may include not only natural nucleotides but also analogs with modified sugar or base moieties ( Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).
  • the polynucleotide is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 with the polynucleotide encoding the CycA protein of the present application or the CycA protein of the present application It may be a polynucleotide encoding a polypeptide having %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homology or identity.
  • the polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more homology or identity to SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 16 is at least 70% of the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 17 , 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99 It may be a polynucleotide having% homology or identity.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity to SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 16 due to codon degeneracy or a polynucleotide that can be translated into a protein having homology or identity thereto may also be included. It is self-evident. Or a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a complementary sequence for all or part of the polynucleotide sequence and hydride under stringent conditions, and has 70% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. Any polynucleotide sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence may be included without limitation.
  • the "stringent conditions" refer to conditions that allow specific hybridization between polynucleotides.
  • genes with high homology or identity 70% or more, 80% or more, specifically 85% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more
  • a condition in which genes having 99% or more homology or identity are hybridized, and genes with lower homology or identity are not hybridized or a washing condition of ordinary southern hybridization at 60°C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1 ⁇ SSC, at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, once, specifically 2 Conditions for washing times to three times can be listed.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have a complementary sequence, although a mismatch between bases is possible depending on the stringency of the hybridization.
  • the term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include substantially similar polynucleotide sequences as well as isolated polynucleotide fragments that are complementary to the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by a person skilled in the art according to the purpose.
  • homology refers to the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • the sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and the default gap penalty established by the program used can be used together.
  • Substantially, homologous or identical sequences are generally at least about 50%, 60%, 70%, 80% of the sequence full or full-length in medium or high stringent conditions. Or it can hybridize to 90% or more. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotide.
  • Homology or identity to the polypeptide or polynucleotide sequence can be determined, for example, by the algorithm BLAST by literature [see Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63, 1990). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the term "enhancing the activity of a protein” in the present application means that the activity is improved compared to the intrinsic activity of a protein possessed by a microorganism or activity before modification.
  • the activity enhancement may include both introduction of a foreign protein and enhancement of the activity of an intrinsic protein. That is, introducing a foreign protein into a microorganism having an intrinsic activity of a specific protein, and introducing the protein into a microorganism having no intrinsic activity are also included.
  • the "protein introduction” means that the activity of a specific protein is introduced into a microorganism and modified to be expressed. This can also be expressed by enhancing the activity of the protein.
  • the term "intrinsic" refers to a condition originally possessed by the parent strain before the change in the trait when the trait of a microorganism is changed due to genetic variation caused by natural or artificial factors.
  • It may be performed by a method of transforming to be strengthened by a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the 1) increase in the copy number of the polynucleotide may be performed in a form operably linked to a vector, but is not particularly limited thereto, or may be performed by being inserted into a chromosome in a host cell.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention is operably linked to a vector capable of replicating and functioning independently of the host and introduced into a host cell, or the polynucleotide is inserted into a chromosome in the host cell.
  • the polynucleotide is operably linked to a vector capable of being introduced into a host cell, thereby increasing the number of copies of the polynucleotide in the chromosome of the host cell.
  • 2) modification of the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide is not particularly limited thereto, but deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence to further enhance the activity of the expression control sequence, or It may be performed by inducing a mutation in the sequence by a combination of, or by replacing with a nucleic acid sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence although not particularly limited thereto, may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence controlling termination of transcription and translation, and the like.
  • a strong heterologous promoter may be connected to the upper part of the polynucleotide expression unit.
  • the strong promoter include CJ7 promoter (Korean Patent No. 0620092 and WO2006/065095), lysCP1 promoter (WO2009/096689), EF -Tu promoter, groEL promoter, aceA or aceB promoter, and the like, but are not limited thereto.
  • modification of the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited thereto, but the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence to further enhance the activity of the polynucleotide sequence, or a combination thereof It can be carried out by inducing a phase mutation, or by replacing with an improved polynucleotide sequence to have a stronger activity.
  • introduction of a foreign polynucleotide sequence may be performed by introducing a foreign polynucleotide encoding a protein exhibiting the same/similar activity as the protein, or a codon-optimized variant polynucleotide thereof into a host cell.
  • the foreign polynucleotide may be used without limitation in its origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the protein.
  • the introduced foreign polynucleotide can be introduced into the host cell by optimizing its codon so that optimized transcription and translation are performed in the host cell.
  • the introduction may be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and the introduced polynucleotide may be expressed in a host cell to produce a protein, thereby increasing its activity.
  • the method of modifying to be enhanced by the combination of 1) to 4) above includes an increase in the copy number of the polynucleotide encoding the protein, modification of the expression control sequence to increase its expression, and the polynucleotide on the chromosome Modification of the sequence and the modification of foreign polynucleotides or codon-optimized variant polynucleotides exhibiting the activity of the protein may be applied together.
  • vector refers to a DNA preparation containing a polynucleotide sequence encoding the protein of interest operably linked to a suitable regulatory sequence so that the protein of interest can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation.
  • Vectors can be transformed into a suitable host cell and then replicated or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • a polynucleotide encoding a target protein in a chromosome may be replaced with a mutated polynucleotide through a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector of the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or a cosmid vector, and as a plasmid vector, pBR system, pUC system, pBluescriptII system , pGEM system, pTZ system, pCL system, pET system, etc. can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, and the like can be used.
  • transformation in the present application means introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • Transformed polynucleotides may include all of them, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as it can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced into a host cell and expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may generally include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replicating.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked in the present application means that the gene sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a protein of interest herein.
  • the method of transforming the vector of the present application includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and may be performed by selecting an appropriate standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and acetic acid There is a lithium-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • L-threonine-producing microorganism in the present application includes both wild-type microorganisms or microorganisms that have been genetically modified naturally or artificially, and naturally has L-threonine-producing ability, or L- It may mean a microorganism that has the ability to produce L-threonine to a parent strain that does not have the ability to produce threonine.
  • a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened due to reasons such as insertion of an external gene or the activity of an intrinsic gene is strengthened or inactivated, a genetic mutation occurs or the activity is enhanced for the production of the desired L-threonine. It can be a microorganism.
  • the microorganism producing the L-threonine may be a microorganism having enhanced glycine transporter activity.
  • it may be a microorganism that produces threonine by inhibiting feedback restriction of an enzyme in the threonine biosynthetic pathway, or enhancing or inhibiting an enzyme involved in the threonine biosynthesis pathway.
  • it may be a microorganism that produces threonine by facilitating metabolism to a threonine biosynthesis pathway by inactivating the activity of an enzyme or protein that does not affect threonine biosynthesis.
  • it may be a microorganism in which the activity of a protein or enzyme on a pathway that consumes an intermediate, a cofactor, or an energy source on a threonine biosynthesis pathway is inactivated.
  • lysC (aspartate kinase) and hom (homoserine dehydrogenase) polypeptides are mutated to inhibit feedback restriction of threonine biosynthetic pathways, enhance expression of proteins involved in threonine production, or threonine It may be a microorganism in which an enzyme in a degradation pathway is inactivated.
  • Microorganisms that produce the L-threonine can be prepared by applying various known methods.
  • activation of protein activity means that the expression of an enzyme or protein is not expressed at all compared to a natural wild-type strain, a parent strain, or a strain in which the corresponding protein is unmodified. Means that. In this case, the decrease is when the activity of the protein is decreased compared to the activity of the protein originally possessed by the microorganism due to mutation of the gene encoding the protein, modification of the expression control sequence, or deletion of a part or all of the gene, and the gene encoding it In the case where the overall protein activity level in the cell is lower than that of the native strain or the strain before transformation due to inhibition of expression of or translation inhibition, the concept includes a combination thereof.
  • the inactivation can be achieved by applying various methods well known in the art.
  • the method include: 1) a method of deleting all or part of the gene encoding the protein; 2) modification of the expression control sequence to reduce the expression of the gene encoding the protein, 3) modification of the gene sequence encoding the protein so that the activity of the protein is removed or weakened, 4) the gene encoding the protein Introduction of antisense oligonucleotides (eg, antisense RNA) that complementarily bind to the transcript of 5)
  • a secondary structure is formed by adding a sequence complementary to the sine-Dalgarno sequence to the front of the sine-Dalgarno sequence of the gene encoding the protein, thereby making it impossible to attach a ribosome.
  • the microorganism of the present application may be any microorganism including the glycine transporter and capable of producing L-threonine.
  • microorganisms capable of producing L-threonine refers to "microorganisms producing L-threonine", “microorganisms having L-threonine-producing ability", and "for L-threonine production It can be used interchangeably with "microorganism”.
  • the threonine-producing microorganism of the present application may have additionally enhanced activity of a glycine-degrading protein.
  • the "microorganisms that produce threonine” and “enhance the activity of proteins” are as described above.
  • glycine degrading protein of the present application is a protein directly or indirectly involved in the glycine decomposition pathway, and each protein constituting the "glycine cleavage system (GCV)", or a complex of the proteins Or it may be used to mean the glycine decomposition system itself.
  • GCV glycine cleavage system
  • the glycine degrading protein comprises T-protein (GcvT), P-protein (GcvP), L-protein (GcvL), H-protein (GcvH), and LipB, a coenzyme of the glycine degrading system.
  • LipA may be any one or more proteins selected from the group consisting of, but is not limited thereto (John E. Cronan, Microbiology and Molecular Biology Reviews., 13 April 2016).
  • the glycine-decomposing protein may be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, specifically Corynebacterium ammoniagenes, but is not limited thereto.
  • GcvP protein is SEQ ID NO: 38
  • GcvT protein is SEQ ID NO: 39
  • GcvH is SEQ ID NO: 40
  • LipA protein is SEQ ID NO: 41
  • LipB protein is a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, or 70% or more of each of the protein. It may be same or identical, but is not limited thereto.
  • the GcvP protein comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, or at least 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, Amino acid sequences having 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% homology or identity may be included.
  • the description of the homology or identity is the same for GcvT, GcvH, LipA, and LipB.
  • an amino acid sequence having the homology or identity and exhibiting efficacy corresponding to the protein is included within the scope of the present application, even if some sequences have an amino acid sequence that has been deleted, modified, substituted or added.
  • a probe that can be prepared from a known gene sequence for example, a polypeptide encoded by a polynucleotide hybridized under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, glycine digestion
  • a polypeptide having an activity may also be included without limitation.
  • the homology or identity is as described above.
  • the term "the genus of Corynebacterium microorganisms producing L-threonine” refers to microorganisms that produce L-threonine, and the microorganisms belonging to the genus Corynebacterium It can mean.
  • the microorganisms producing the L-threonine are as described above.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having L-threonine-producing ability means that the activity of the glycine transporter of the present application is enhanced or transformed with a vector containing a gene encoding the glycine transporter.
  • microorganism of the genus Corynebacterium that has improved L-threonine production capability may mean a microorganism of the genus Corynebacterium that has improved L-threonine production capability.
  • the activity of the glycine-degrading protein is enhanced, or it is transformed with a vector containing a gene encoding the glycine-degrading protein to mean a microorganism of the genus Corynebacterium that has improved L-threonine production ability.
  • the "microorganism of the genus Corynebacterium that has improved L-threonine production ability” refers to a microorganism having an improved L-threonine production ability than a parent strain or an unmodified microorganism before transformation.
  • The'unmodified microorganism' is a native strain of the genus Corynebacterium itself, or a microorganism that does not contain the gene encoding the glycine transporter, or is not transformed with a vector containing the gene encoding the glycine transporter. Means microorganisms.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may include all microorganisms of the genus Corynebacterium. Specifically, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris (Corynebacterium testudinoris) or Corynebacterium flavescens, and more specifically Corynebacterium glutamicum.
  • Another aspect of the present application provides a composition for producing L-threonine, including the microorganism for producing L-threonine of the present application.
  • the composition for producing L-threonine may mean a composition capable of producing L-threonine by a microorganism producing L-threonine of the present application.
  • the composition includes a microorganism that produces the L-threonine, and may include, without limitation, an additional component capable of producing threonine using the strain.
  • the additional components capable of producing the threonine may further include, for example, any suitable excipients commonly used in fermentation compositions, or components of the medium. Such excipients may be, for example, a preservative, a wetting agent, a dispersing agent, a suspending agent, a buffering agent, a stabilizing agent, or an isotonic agent, but are not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing L-threonine comprising the step of culturing the microorganism.
  • the medium and other culture conditions used for culturing the microorganisms of the present application may be used without particular limitation as long as it is a medium used for culturing the microorganisms of the genus Corynebacterium.
  • the microorganisms of the present application are suitable carbon sources, It can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic or anaerobic conditions in a conventional medium containing nitrogen sources, personnel, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins.
  • the carbon source includes carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and maltose; Alcohols such as sugar alcohol, glycerol, and the like; Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, and linoleic acid; Organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, acetic acid and citric acid, amino acids such as glutamic acid, methionine, and lysine may be included, but are not limited thereto.
  • carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and maltose
  • Alcohols such as sugar alcohol, glycerol, and the like
  • Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, and linoleic acid
  • Organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, acetic acid and citric acid, amino acids such as glutamic acid, methionine, and lysine may be included, but are not limited thereto.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolyzate, molasses, black strap molasses, rice winter, cassava, sugarcane residue and corn steep liquor can be used, and sterilized pretreated molasses (ie, molasses converted to reducing sugar), etc.
  • Carbohydrates can be used, and other appropriate amounts of carbon sources can be used in various ways without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, skim soybean cake or its degradation products, etc. Can be used. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc.
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine,
  • the personnel may include first potassium phosphate, second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the inorganic compound sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, and the like may be used.
  • the medium may contain vitamins and/or suitable precursors.
  • the medium or precursor may be added to the culture in a batch or continuous manner, but is not limited thereto.
  • a compound such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, or sulfuric acid may be added to the culture in an appropriate manner during the culture of the microorganism to adjust the pH of the culture.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester can be used to suppress the generation of air bubbles.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without the injection of gas to maintain the anaerobic and microaerobic state.
  • the temperature of the culture may be 25°C to 40°C, more specifically 28°C to 37°C, but is not limited thereto.
  • the cultivation period may be continued until the production amount of the desired useful substance is obtained, and specifically, may be 1 to 100 hours, but is not limited thereto.
  • the L-threonine production method comprises the steps of recovering L-threonine from at least one material selected from the microorganism, the medium, its culture, the supernatant of the culture, the extract of the culture, and the lysate of the microorganism after the culturing step. It may include.
  • the recovery step is to recover the target substance L-threonine from the culture medium by using a suitable method known in the art according to the method of culturing the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • methods such as precipitation, centrifugation, filtration, chromatography, and crystallization may be used.
  • the culture medium may be centrifuged at a low speed to remove biomass, and the resulting supernatant may be separated through ion exchange chromatography, but is not limited thereto.
  • the recovery step may include a purification process.
  • Another aspect of the present application provides a use of a microorganism of the genus Corynebacterium in which the activity of a glycine transporter is enhanced to produce L-threonine.
  • the "glycine transporter”, "enhancing activity” or "a microorganism in the genus Corynebacterium” is as described above.
  • Example 1 Preparation of L-threonine-producing strain using wild-type Corynebacterium microorganisms
  • Example 1-1 Preparation of a microorganism strain of the genus Corynebacterium having L-threonine production ability
  • L-threonine-producing strain was developed from wild species Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Specifically, in order to resolve the feedback inhibition of aspartate kinase (lysC), which acts as the first important enzyme in the threonine biosynthesis pathway, leucine, amino acid 377 of lysC, was substituted with lysine. Was produced (SEQ ID NO: 1), and based on this strain, arginine, amino acid 398 of hom, was added to glutamine to relieve feedback inhibition of homoserine dehydrogenase (hom), which is important in the threonine biosynthesis pathway. Was replaced with a threonine-producing strain (SEQ ID NO: 6).
  • Example 1-1-1 lysC mutation introduction
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively, using the chromosome of ATCC13032 as a template in order to prepare the strain into which the lysC (L377K) mutation was introduced.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C., 1 minute was repeated 28 times.
  • PCR was performed with the primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5. PCR conditions were denatured at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 2 minutes were repeated 28 times, followed by polymerization at 72° C. for 5 minutes.
  • a DNA fragment of 1023 bp containing a mutation of the lysC gene encoding an aspartokinase variant in which the 377 th leucine was substituted with lysine was amplified.
  • the amplified product was purified using QIAGEN's PCR Purification kit and used as an insert DNA fragment for vector construction.
  • M molar concentration
  • the pDZ (Korean Patent Registration No. 10-0924065) vector treated with restriction enzyme smaI and heat-treated at 65° C. for 20 minutes and the inserted DNA fragment amplified through the PCR is 1:2.
  • the vector pDZ-L377K for introducing the lysC (L377K) mutation onto the chromosome was prepared by cloning according to the provided manual using the Infusion Cloning Kit of TaKaRa.
  • the prepared vector was transformed into ATCC13032 by electroporation, and a strain in which each base mutation was replaced with a mutant base on the chromosome was obtained through a second crossover process, which was named CJP1.
  • Example 1-1-2 hom mutation introduction
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 using the chromosome of ATCC13032 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C., 1 minute was repeated 28 times.
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10. PCR conditions were denatured at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 2 minutes were repeated 28 times, followed by polymerization at 72° C. for 5 minutes.
  • the molar concentration (M) ratio of the pDZ vector heat-treated at 65°C for 20 minutes and the inserted DNA fragment amplified through the above PCR is 1:2, so that the Infusion Cloning Kit of TaKaRa
  • the vector pDZ-R398Q was constructed to introduce the hom(R398Q) mutation onto the chromosome by cloning according to the manual provided using.
  • the prepared vector was transformed into Corynebacterium glutamicum CJP1 obtained above by electroporation, and a strain substituted with a variant base on each chromosome was obtained through a secondary crossover process.
  • This strain was named CJP1-R398Q, and it was internationally deposited with the Korea Microbial Conservation Center (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, and was given a deposit number as KCCM12120P (Korean Patent No. 10-1947959).
  • KCCM Korea Microbial Conservation Center
  • Example 1-2 Preparation of L-threonine-producing strain into which D-alanine/D-serine/glycine transporter gene was introduced
  • Example 1-2-1 Corynebacterium ammoniagenes-derived glycine transporter (CycA (Cam)) introduced strain production
  • the Ncgl2131 gene encoding the transposon was used as an insertion site (Korean Patent Registration No. 10-1126041, Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al. al, using the 2003 method) (SEQ ID NO: 11).
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 using the ATCC13032 chromosome as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C. and 2 minutes were repeated 28 times, and then polymerization reaction was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • PCR was performed with the primers of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 15.
  • PCR conditions were denatured at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 4 minutes were repeated 28 times, followed by polymerization at 72° C. for 5 minutes.
  • a 4066 bp DNA fragment containing the recognition sites of two restriction enzymes, SpeI and XhoI was amplified in the central region.
  • the amplified product was purified using QIAGEN's PCR Purification kit and used as an insert DNA fragment for vector construction.
  • the molar concentration (M) ratio of the pDZ vector heat-treated at 65°C for 20 minutes and the inserted DNA fragment amplified through the above PCR is 1:2, so that the Infusion Cloning Kit of TaKaRa
  • the vector pDZ-N2131 for insertion into the Ncgl2131 gene position was prepared by cloning according to the manual provided using.
  • the prepared vector was transformed into the KCCM12120P strain obtained in Example 1-1 above by electroporation, and a strain in which the Ncgl2131 gene was deleted on the chromosome was obtained through a secondary crossover process, which was named KCCM12120P-N2131.
  • primers of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 were used using the Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 chromosome as a template. Then, PCR was performed. PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C. and 90 seconds were repeated 28 times, followed by polymerization at 72° C. for 5 minutes. As a result, a 1595 bp cycA gene fragment was obtained, and the amplified product was purified using a PCR Purification kit from QIAGEN and used as an insert DNA fragment for vector construction (SEQ ID NO: 17).
  • PCR was carried out using p117-cj7-gfp containing the known promoter cj7 derived from a microorganism of the genus Corynebacterium as a template (Korean Patent Registration No. 10-0620092).
  • 'p117' refers to pECCG117 (Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991), which is an E. coli-Corynebacterium shuttle vector.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and the PCR reaction was denatured using the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 at 95° C.
  • PCR product amplified therefrom was purified using QIAGEN's PCR Purification kit to obtain a 350bp-sized cj7 fragment (SEQ ID NO: 20).
  • fusion PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 19.
  • PCR reaction was denatured at 95° C. for 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C. and 2 minutes were repeated 28 times, and then polymerization reaction was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • a 1945bp cj7-cycA gene fragment was obtained, and the amplified product was purified using a PCR Purification kit from QIAGEN and used as an insert DNA fragment for vector construction.
  • the pDZ-N2131 vector prepared above was treated with restriction enzyme xhoI and heat-treated at 65° C. for 20 minutes, and the molar concentration (M) ratio of the obtained cj7-cycA fragment was 1:2.
  • the vector pDZ-N2131/cj7-cycA (Cam) capable of inserting the cycA gene into the Ncgl2131 position was constructed by cloning according to the provided manual using the Infusion Cloning Kit.
  • the prepared vector was transformed into the KCCM12120P strain by electroporation, and through a second cross-over process, a strain in which the Ncgl2131 position on the chromosome was substituted in the form of cj7-cycA (Cam) was obtained, and this was obtained as KCCM12120P/cycA (Cam). Named.
  • Example 1-2-2 E. coli-derived glycine transporter (CycA (Eco)) introduced strain production
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And after the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 1 minute, polymerization was performed at 72°C for 5 minutes. As a result, a 1544 bp cycA gene fragment was obtained, and the amplification product was purified using QIAGEN's PCR Purification kit and used as an insert DNA fragment for vector construction (SEQ ID NO: 23).
  • fusion PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 26.
  • PCR reaction was denatured at 95° C. for 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C. and 90 seconds were repeated 28 times, followed by polymerization at 72° C. for 5 minutes.
  • a 1894bp cj7-cycA gene fragment was obtained, and the amplified product was purified using a PCR Purification kit from QIAGEN and used as an insert DNA fragment for vector construction.
  • the pDZ-N2131 vector prepared above was treated with restriction enzyme xhoI and heat-treated at 65° C. for 20 minutes, and the molar concentration (M) ratio of the obtained cj7-cycA fragment was 1:2.
  • the vector pDZ-N2131/cj7-cycA (Eco) capable of inserting the cycA gene into the Ncgl2131 position was constructed by cloning according to the provided manual using the Infusion Cloning Kit.
  • the prepared vector was transformed into the KCCM12120P strain by electroporation, and through a second cross-over process, a strain in which the Ncgl2131 position on the chromosome was substituted in the form of cj7-cycA (Eco) was obtained, and this was obtained as KCCM12120P/cycA (Eco). Named.
  • the L-threonine production ability test of the strains prepared in Example 1-2 was performed.
  • the strains obtained above were respectively inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium, followed by shaking culture at 30° C. for 20 hours at 200 rpm.
  • 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the following L-threonine production medium, followed by shaking culture at 30° C. for 48 hours at 200 rpm.
  • L-threonine production increases, L-lysine production decreases, while L-threonine production increases, L-Isoleucine (Ile) and glycine, which can be by-products of the L-threonine biosynthesis pathway. (Gly) could increase, so their production was checked together.
  • the production of serine (Ser), alanine (Ala), and valine (Val) were also confirmed to confirm the function of the cycA gene as a transporter.
  • the KCCM12120P/cycA (Cam) strain into which the cycA gene derived from Corynebacterium ammonia gene was introduced increased the production of L-threonine by 12.5% compared to the parent strain, KCCM12120P, while L -Lysine decreased by 4%.
  • glycine decreased by 18.5% compared to the parent strain
  • serine and valine decreased slightly compared to the parent strain
  • alanine significantly decreased indicating that it was not detected in the culture medium.
  • the KCCM12120P/cycA(Eco) strain into which the E. coli-derived cycA gene was introduced decreased the production of L-threonine by 14.9% compared to the parent strain, while L-lysine increased by 6.9% and glycine by 10%. I did.
  • the effects of introduction of cycA derived from Escherichia coli and cycA derived from Corynebacterium ammonia genes were very different, but in common, the concentration of alanine in the culture medium was significantly decreased.
  • KCCM12120P/cycA(Cam) strain was named CA09-0902, and it was deposited internationally on April 10, 2019 with the Korea Microbial Conservation Center (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, and was given a deposit number as KCCM12484P.
  • KCCM Korea Microbial Conservation Center
  • Example 1-4 Glycine Cleavage System Preparation of L-threonine-producing strain into which the corresponding gene was introduced
  • Example 1-4-1 Construction of a vector for introduction of glycine degrading protein
  • GCV system Glycine Cleavage System
  • gcvP SEQ ID NO: 27
  • gcvT SEQ ID NO: 28
  • gcvH SEQ ID NO: 29
  • lipA SEQ ID NO: 30
  • lipB SEQ ID NO: 31
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C. and 5 minutes were repeated 28 times, and then polymerization reaction was performed at 72° C. for 7 minutes.
  • a 4936bp gcvPT gene fragment including a promoter was obtained, and the amplification product was purified using a PCR Purification kit from QIAGEN and used as an insert DNA fragment for vector construction (SEQ ID NOs: 27, 28).
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 using the Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 chromosome as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C. and 3 minutes were repeated 28 times, and then polymerization reaction was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • fusion PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 35. PCR reaction was denatured at 95° C. for 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And the polymerization reaction was repeated 28 times at 72°C for 10 minutes, and then polymerization was performed at 72°C for 12 minutes. As a result, an 8257bp gcvPTH-lipBA gene fragment was obtained, and the amplification product was purified using a PCR Purification kit from QIAGEN and used as an insert DNA fragment for vector construction.
  • the pDZ-N2131 vector prepared in Example 1-2 was treated with restriction enzymes speI and xhoI, and then the molar concentration (M) ratio of the obtained gcvPTH-lipBA fragment was 1:2, so that TaKaRa
  • the vector pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA capable of inserting the gcv system gene into the Ncgl2131 position was constructed by cloning according to the provided manual using the Infusion Cloning Kit of.
  • Example 1-4-2 Glycine degrading protein introduction strain production
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 37 using the pDZ-N2131/cj7-cycA (Cam) vector obtained in Example 1-2 as a template.
  • PfuUltraTM high-reliability DNA polymerase (Stratagene) was used as a polymerase for the PCR reaction, and PCR conditions were denaturing 95° C., 30 seconds; Annealing 55° C., 30 seconds; And polymerization reaction at 72° C. and 90 seconds were repeated 28 times, followed by polymerization at 72° C. for 5 minutes.
  • a 1942bp cj7-cycA(Cam) gene fragment was obtained, and the amplified product was purified using a PCR Purification kit from QIAGEN, and used as an insert DNA fragment for vector construction.
  • the pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA vector prepared above was treated with restriction enzyme xhoI and heat-treated at 65°C for 20 minutes, and the molar concentration (M) ratio of the obtained cj7-cycA(Cam) fragment was 1:2.
  • the prepared vector was transformed into the KCCM12120P strain by electroporation, and through a second cross-over process, a strain in which the Ncgl2131 position on the chromosome was substituted in the form of gcvPTH-lipBA-cycA (Cam) was obtained, which was KCCM12120P/gcv-lip. Named -cycA(Cam).
  • Example 1-4-3 Evaluation of the threonine production ability of the glycine transporter and the glycine-degrading protein-introducing strain
  • L-threonine production ability test of the strains produced in Examples 1-2 and 1-4-2 was performed.
  • the strains obtained above were each inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the above seed medium, and then incubated with shaking at 30° C. for 20 hours at 200 rpm.
  • 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the L-threonine production medium and cultured with shaking at 30° C. for 48 hours at 200 rpm.
  • the KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) strain introduced with the gcv system gene together with the D-alanine/D-serine/glycine transporter gene was 26.7% compared to the parent strain KCCM12120P It showed improved L-threonine production, which is a 12.7% increase compared to the KCCM12120P/cycA(Cam) strain in which only the cycA gene was introduced. Based on this, it was confirmed that the L-threonine production of the strain introduced with the gcv system gene was further increased than when the cycA gene was introduced alone.
  • the L-lysine production of the KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) strain decreased by 13.6% compared to KCCM12120P, and the KCCM12120P/cycA(Cam) strain decreased by 14.3% compared to KCCM12120P.
  • L-isoleucine production was increased compared to KCCM12120P in the KCCM12120P/gcv-lip-cycA (Cam) strain, but this is a biosynthetic pathway by increasing the L-threonine production when considering the results of Example 1-3. It can be seen that L-isoleucine, a phase by-product, was increased together.
  • Glycine production decreased by 18.5% when only the cycA gene was introduced from the KCCM12120P strain, and 51.9% decreased compared to the KCCM12120P strain when the gcv system genes were introduced together.
  • Alanine was significantly reduced by introduction of the cycA gene alone, and it was confirmed that there was no adverse effect from the introduction of the gcv system.
  • the production of serine and valine was very small, it was confirmed that both the KCCM12120P/cycA(Cam) strain and the KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) strain decreased compared to the parent strain KCCM12120P.
  • KCCM12120P/gcv-lip-cycA (Cam) strain was named CA09-0905, and it was deposited internationally on April 10, 2019 with the Korea Microbiological Conservation Center (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, and deposited as KCCM12485P. Was given.
  • KCCM Microbiological Conservation Center
  • Example 2 Confirmation of L-threonine production ability of L-threonine producing strain KCCM11222P introduced with cycA and Glycine Cleavage System
  • Example 1 As in Example 1, an experiment was performed to confirm the effect of introducing the CycA and gcv system into the existing threonine-producing strain.
  • the transformation vectors pDZ-N2131, pDZ-N2131/cj7-cycA (Cam) and pDZ-N2131/cj7-cycA (Eco) used in Example 1 were respectively used as L-threonine producing strains of Corynebacterium Glue.
  • Tamicum KCCM11222P (Korean Registered Patent No. 10-1335853) strain was transformed, and the Ncgl2131 position on the chromosome was deleted, respectively, through a secondary crossover process, and replaced in the form of cj7-cycA (Cam) or cj7-cycA (Eco).
  • a strain was obtained, which was designated as KCCM11222P-N2131, KCCM11222P/cycA (Cam) or KCCM11222P/cycA (Eco), respectively.
  • the produced strains were tested for L-threonine production ability.
  • the strains obtained above were respectively inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium, followed by shaking culture at 30° C. for 20 hours at 200 rpm.
  • 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the following L-threonine production medium and cultured with shaking at 200 rpm for 48 hours at 32°C.
  • the KCCM11222P/cycA(Cam) strain showed a 15.2% increase in L-threonine production compared to the parent strain KCCM11222P, whereas the L-lysine production decreased by 14.9%.
  • Glycine and alanine showed a decrease of 21.5% and 98.3%, respectively, compared to KCCM11222P, confirming that the result was similar to the evaluation result based on the KCCM12120P strain of Example 1.
  • the KCCM11222P/cycA(Cam) strain decreased by 3% compared to KCCM11222P
  • the KCCM11222P/cycA(Eco) strain increased by 4% compared to KCCM11222P, confirming that the introduction of cycA protein did not significantly affect the production of isoleucine. I did. In particular, it was confirmed that the amount of isoleucine production decreased in the case of the strain into which the cycA gene derived from Corynebacterium ammoniagenes was introduced.
  • the KCCM11222P/cycA(Eco) strain into which the E. coli-derived cycA gene was introduced showed a 12.7% decrease in L-threonine production and a 20.1% increase in L-lysine production, respectively, compared to the KCCM11222P strain. Accordingly, it was confirmed that the cycA gene derived from E. coli was not effective in increasing L-threonine production.
  • Example 2-2 CycA and gcv system introduction into L-threonine producing strain KCCM11222P strain
  • Example 2 the vector pDZ-N2131/gcv-lip-cycA (Cam) constructed to check the combination effect of the cycA (Cam) gene and the gcv system gene was transformed into the KCCM11222P strain by electroporation, A strain in which the Ncgl2131 position was substituted in the form of gcvPTH-lipBA-cycA (Cam) was obtained through the second cross-over process, and this was named KCCM11222P/gcv-lip-cycA (Cam).
  • the produced strains were tested for L-threonine production ability.
  • the strains obtained above were each inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the above seed medium, and then incubated with shaking at 30° C. for 20 hours at 200 rpm.
  • 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the L-threonine production medium, followed by shaking culture at 32° C. for 48 hours at 200 rpm.
  • KCCM11222P/gcv-lip-cycA (Cam) strain showed a 35.1% increase in L-threonine production compared to the parent strain, KCCM11222P, which is KCCM11222P/cycA ( Cam) is an increase in L-threonine production by 17.0% compared to the strain. Based on this, it was confirmed that the L-threonine production of the strain introduced with the gcv system gene was further increased compared to the case where the cycA gene was introduced alone, even on the basis of the recombinant L-threonine producing strain KCCM11222P as in Example 1 above. .
  • the L-lysine production of the KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) strain decreased by 14.3% compared to KCCM11222P, whereas the KCCM11222P/cycA(Cam) strain decreased by 15.9% compared to KCCM11222P.
  • L-isoleucine production was increased by 3.4% compared to KCCM11222P in the KCCM11222P/gcv-lip-cycA (Cam) strain, but this was due to the increase in L-threonine production, considering the results of Example 2-1. It can be interpreted as a side effect.
  • Glycine production decreased 21.2% when only the cycA gene was introduced from the KCCM11222P strain, and 56.8% decreased compared to the KCCM11222P strain when the gcv system genes were introduced together.

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Abstract

본 출원은 L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다.

Description

L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
본 출원은 L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법에 관한 것이다.
쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 식품 첨가제 및 동물성장 촉진제로 널리 사용되며 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 미생물을 이용한 쓰레오닌 생산방법에 있어서, 수율을 향상시키기 위해 쓰레오닌 생합성 유전자(ex. ppc, aspC, thrABC) 강화와 함께 쓰레오닌 분해 경로를 차단하는 방법이 알려져 있다(Kwang-Ho Lee, et al., Molecular System Biology 2007). 쓰레오닌 분해 경로 상의 유전자로는 tdh, tdcB, glyA, ilvA 등이 있는데, 이들 중 ilvA (쓰레오닌 디아미나제, Threonine deaminase)가 가장 주요한 쓰레오닌 분해 유전자로 알려져 있다. 분해 유전자 중 ilvA 유전자를 결손할 경우 쓰레오닌의 수율은 크게 향상하지만 고가의 이소루신(isoleucine)에 대한 요구성이 나타나는 문제가 있으므로 일반적으로는 ilvA 활성 약화 및 isoleucine에 대한 고민감성 변이를 적용하는 것으로 알려져 있다(Akhverdian Valery Z, et al.).
한편 쓰레오닌과 글리신의 관계에 관해서는, 글리신 합성에 관여하는 세린 하이드록시메틸트렌스퍼라제의 주요 전구체는 세린이며, 효소 활성은 쓰레오닌을 전구체로 사용하는 경우보다 세린으로 사용할 때 24배 높다 (Simic et al., Appl Environ Microbiol. 2002)는 것이 알려져 있다. 그러나, 글리신 유입과 쓰레오닌 생산능에 관해서는 알려진 바 없다.
본 발명자들은 세포 밖으로 배출된 글리신을 유입시켜 이용 가능한 미생물을 개발하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 글리신 트랜스포터 cycA를 도입하였으며, 그 결과 높은 수율로 L-쓰레오닌을 생산하는 균주를 완성하였다.
본 출원은 글리신 트랜스포터 활성이 강화된, L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원은 본 출원의 미생물을 포함하는 L-쓰레오닌 생산용 조성물을 제공ㅎ한.
본 출원은 본 출원의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌 제조방법을 제공한다.
본 출원은 글리신 트랜스포터 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물의 L-쓰레오닌 생산 용도를 제공한다.
본 출윈의 L-쓰레오닌 생산용 미생물은 우수한 쓰레오닌 생산능을 갖는바, 효율적인 L-쓰레오닌의 대량 생산에 활용될 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 하나의 양태는 글리신 트랜스포터 활성이 강화된, L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원의 용어 "글리신 트랜스포터(glycine transporter)"는 세포 내로 글리신을 유입하는 기능을 갖는 단백질이라면 제한 없이 포함되며, 구체적으로는 D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터(D-serine/D-alanine/glycine transporter)일 수 있다. 상기 글리신 트랜스포터는 D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터 또는 글리신 유입 단백질과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 "D-세린/D-알라닌/글리신 트랜스포터(D-serine/D-alanine/glycine transporter)"는, 세린, 알라닌 및 글리신 수송에 모두 관여할 수 있는 단백질로, 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank 등에서 D-Serine/D-Alanine/glycine transporter 서열을 검색하여 그 정보를 얻을 수 있다. 상기 트랜스포터는 구체적으로 CycA, AapA 일 수 있고, 보다 구체적으로는 CycA 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 "CycA 단백질"은 세린, 알라닌 및 글리신 유입(uptake)에 관여하는 단백질을 의미한다. CycA 단백질은 cycA 유전자에 의해 코딩되며, cycA 유전자는 대장균(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsialla pneumoniae), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 등의 미생물에 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 출원의 목적상, 본 출원의 CycA 단백질은 쓰레오닌 생산능을 강화할 수 있는 것이면 어느 것이든 포함될 수 있다. 구체적으로 상기 CycA 단백질은 코리네박테리움속 미생물 유래일 수 있고, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)와 동종으로, 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis), 브레비박테리움 스테이셔니스(Brevibacterium stationis)와 동일 분류군(taxon)으로 분류되었다(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 60: 874-879). 또한 상기 브레비박테리움 암모니아게네스는 코리네박테리움 스테이셔니스로 변경되어 명명된 바 있다.
따라서, 본 출원에서 용어 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 암모니아게네스, 코리네박테리움 스테이셔니스, 브레비박테리움 스테이셔니스는 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 CycA 단백질은 서열번호 16 또는 이와 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 CycA 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 세린, 알라닌 및 글리신 유입 활성을 갖는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 폴리펩타이드' 또는 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드'라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다.
본 출원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) 참조).
상기 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 CycA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 CycA 단백질과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 서열번호 16 또는 서열번호 16과 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 서열번호 16 또는 서열번호 16과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 16의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 70% 이상, 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
본 출원에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다. 보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 용어 "단백질의 활성 강화" 는 미생물이 가진 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상되는 것을 의미한다. 상기 활성 강화는 외래의 단백질을 도입하는 것과, 내재적인 단백질의 활성 강화를 모두 포함할 수 있다. 즉, 특정 단백질의 내재적 활성이 있는 미생물에 외래 단백질을 도입하는 것과, 내재적 활성이 없는 미생물에 상기 단백질을 도입하는 것도 포함한다. 상기 "단백질 도입"은 특정 단백질의 활성이 미생물 내로 도입되어 발현되도록 변형되는 것을 의미한다. 이는 해당 단백질의 활성 강화로도 표현될 수 있다.
본 출원의 용어 "내재적"은 자연적, 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 상태를 의미한다.
본 출원에서 활성 강화는,
1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,
4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가시키는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095), lysCP1 프로모터(WO2009/096689), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 출원의 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 출원의 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 출원의 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어 "L-쓰레오닌을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 자연적으로 L-쓰레오닌 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-쓰레오닌의 생산능이 없는 모균주에 L-쓰레오닌의 생산능이 부여된 미생물을 의미할 수 있다. 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-쓰레오닌 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다.
예를 들어, 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물은 글리신 트랜스포터 활성이 강화된 미생물일 수 있다. 또는 이에 추가로 쓰레오닌 생합성 경로상의 효소의 피드백 제한이 억제되거나, 쓰레오닌 생합성 경로에 관여하는 효소를 강화 또는 억제하여 쓰레오닌을 생산하는 미생물일 수 있다. 또는 쓰레오닌 생합성에 영향을 미치지 않는 효소 또는 단백질의 활성이 불활성화 되어 쓰레오닌 생합성 경로로의 대사를 원활하게 함으로써 쓰레오닌을 생산하는 미생물일 수 있다. 또는, 쓰레오닌 생합성 경로상의 중간체, 보조인자, 또는 에너지원을 소모하는 경로상의 단백질 또는 효소의 활성을 불활성화시킨 미생물일 수 있다.
보다 구체적으로, lysC(aspartate kinase), hom(homoserine dehydrogenase) 폴리펩티드가 변이되어 쓰레오닌 생합성 경로의 피드백 제한을 억제하거나, 쓰레오닌 생산 증가에 관여하는 단백질의 발현을 강화시키거나, 쓰레오닌 분해 경로의 효소를 불활성화시킨 미생물일 수 있다.
다만 이는 한 가지 예에 불과하며, 이에 제한되지 않고, 다양한 공지의 L-쓰레오닌 생합성경로의 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시키거나 분해경로의 효소를 불활성화시킨 미생물일 수 있다. 상기의 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물은 공지의 다양한 방법을 적용하여 제조될 수 있다.
본 출원의 용어 "단백질 활성의 불활성화"는 효소 또는 단백질의 발현이 천연의 야생형 균주, 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 변이, 발현조절서열의 변형, 유전자 일부 또는 전체의 결손 등으로 단백질의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질의 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다. 본 출원에 있어서, 상기 불활성화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 목적상 본 출원의 미생물은 상기 글리신 트랜스포터를 포함하고 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원에서 상기 "L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물"은 "L-쓰레오닌을 생산하는 미생물", "L-쓰레오닌 생산능을 갖는 미생물", "L-쓰레오닌 생산용 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 쓰레오닌을 생산하는 미생물은 글리신 분해 단백질의 활성이 추가로 강화된 것일 수 있다. 상기 "쓰레오닌을 생산하는 미생물", "단백질의 활성 강화"는 전술한 바와 같다.
본 출원의 용어 "글리신 분해 단백질"은 글리신 분해 경로에 직접 또는 간접적으로 관여하는 단백질로, "글리신 분해 시스템(glycine cleavage system; GCV)"을 구성하는 각각의 단백질, 또는 상기 단백질의 복합체(complex) 또는 상기 글리신 분해 시스템 자체를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 글리신 분해 단백질은 글리신 분해 시스템을 구성하는 T-단백질(GcvT), P-단백질(GcvP), L-단백질(GcvL), H-단백질(GcvH) 및 상기 글리신 분해 시스템의 조효소인 LipB, LipA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(John E. Cronan, Microbiology and Molecular Biology Reviews., 13 April 2016). 상기 글리신 분해 단백질은 코리네박테리움 속 미생물 유래, 구체적으로 코리네박테리움 암모니아게네스 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 GcvP 단백질은 서열번호 38, GcvT 단백질은 서열번호 39, GcvH는 서열번호 40, LipA 단백질은 서열번호 41, LipB 단백질은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 단백질과 각각 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 GcvP 단백질은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 38의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 상동성 또는 동일성에 대한 설명은 GcvT, GcvH, LipA, LipB에 대해서도 동일하다. 또한, 상기 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
더불어, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 글리신 분해 활성을 갖는 폴리펩티드도 제한 없이 포함될 수 있다.
상기 상동성 또는 동일성은 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 (the genus of Corynebacterium) 미생물"이란, L-쓰레오닌을 생산하는 미생물로써, 미생물의 속이 코리네박테리움 속에 속하는 미생물을 의미할 수 있다. 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물은 전술한 바와 같다. 구체적으로, 본 출원에서 L-쓰레오닌 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물이란 본 출원의 글리신 트랜스포터의 활성이 강화되거나, 또는 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움속 미생물을 의미할 수 있다. 또한 이에 추가적으로 글리신 분해 단백질의 활성이 강화되거나, 또는 상기 글리신 분해 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움속 미생물을 의미할 수 있다. 상기 "향상된 L-쓰레오닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물"은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 천연형 코리네박테리움 속 균주 자체이거나, 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 미생물, 또는 상기 글리신 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스Cxorynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 L-쓰레오닌 생산용 미생물을 포함하는, L-쓰레오닌 생산용 조성물을 제공한다.
상기 L-쓰레오닌 생산용 조성물은 본 출원의 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물에 의해 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 조성물은 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 미생물을 포함하며, 상기 균주를 이용하여 쓰레오닌을 생산할 수 있는 추가적인 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 쓰레오닌을 생산할 수 있는 추가적인 구성은 예를 들어, 발효용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제, 또는 배지의 구성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 미생물 배양하는 단계를 포함하는 L-쓰레오닌 제조방법을 제공한다.
본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 코리네박테리움속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용될 수 있으며, 구체적으로는 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 등과 같은 알코올; 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산; 피루브산, 락트산, 아세트산, 시트르산과 같은 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다.
그 외에 상기 배지에는 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 25℃ 내지 40℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 28℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 1 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 L-쓰레오닌 제조방법은 상기 배양 단계 이후 상기 미생물, 상기 배지, 이의 배양물, 배양물의 상등액, 배양물의 추출물 및 상기 미생물의 파쇄물 중에서 선택된 하나 이상의 물질로부터 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 회수 단계는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적 물질인 L-쓰레오닌을 회수할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-쓰레오닌의 회수는 침전, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 글리신 트랜스포터의 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물의 L-쓰레오닌 생산 용도를 제공한다.
상기 "글리신 트랜스포터(glycine transporter)", "활성 강화" 또는 "코리네박테리움 속 미생물"은 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 야생형 코리네박테리움속 미생물을 이용한 L-쓰레오닌 생산균주 제작
실시예 1-1: L-쓰레오닌 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물 균주의 제작
야생종 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 로부터 L-쓰레오닌 생산 균주를 개발하였다. 구체적으로, 쓰레오닌 생합성 경로에서 첫 번째 중요한 효소로 작용하는 aspartate kinase(lysC)의 피드백 저해(feedback inhibition) 해소를 위해 lysC의 377번 아미노산인 루신(Leucine)을 라이신(Lysine)으로 치환한 균주를 제작하였고 (서열번호 1), 이 균주를 기반으로 쓰레오닌 생합성 경로에서 중요한 homoserine dehydrogenase(hom)의 피드백 (feedback inhibition) 해소를 위해 hom의 398번 아미노산인 아르기닌(Arginine)을 글루타민(Glutamine)으로 치환하여 쓰레오닌 생산 균주를 제작하였다(서열번호 6).
실시예 1-1-1: lysC 변이 도입
구체적으로, lysC(L377K) 변이가 도입된 균주를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 2 및 서열번호 3 혹은 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 515bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 538bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 2 및 서열번호 5의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 코딩하는 lysC 유전자의 변이를 포함하는 1023bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ(대한민국 등록 특허 제10-0924065호) 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 lysC(L377K) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-L377K를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각 염기변이가 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 CJP1으로 명명하였다.
실시예 1-1-2: hom 변이 도입
CJP1 균주 기반으로 hom(R398Q) 변이가 도입된 균주를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 8 혹은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복하였다. 그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 668bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 659bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 7 및 서열번호 10의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 398번째 아르기닌이 글루타민으로 치환된 homoserine dehydrogenase 변이체를 코딩하는 hom 유전자의 변이를 포함하는 1327bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 hom(R398Q) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDZ-R398Q를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법에 의해 위에서 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 CJP1에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 각각 변이형 염기로 치환되어 있는 균주를 얻었다. 이 균주를 CJP1-R398Q로 명명하였으며, 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제 기탁하여 KCCM12120P로 기탁번호를 부여받았다(대한민국 등록특허 번호 제 10-1947959호).
실시예 1-2: D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자가 도입된 L-쓰레오닌 생산균주 제작
실시예 1-1에서 제조한 미생물에 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 내에 D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자를 삽입하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 1-2-1: 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 글리신 트랜스포터(CycA(Cam)) 도입 균주 제작
글리신 트랜스포터 단백질을 코딩하는 유전자 cycA를 삽입하기 위하여, 트랜스포존(Transposon)을 코딩하는 Ncgl2131 유전자를 삽입 사이트로 이용하였다(대한민국 등록 특허 제10-1126041호, Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al, 2003 방법 이용) (서열번호 11). 트랜스포존 삽입용 벡터를 제작하기 위해 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 12 및 서열번호 13 혹은 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 각각 Ncgl2131 유전자로부터 5' 상단 부위의 2041bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 2040bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 12 및 서열번호 15의 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 4분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 중심 부위에 SpeI과 XhoI, 두 가지 제한효소의 인식부위를 포함하는 4066bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 한편 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 유전자 위치로의 삽입용 벡터 pDZ-N2131을 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 위 실시예 1-1에서 수득한 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 유전자가 결실된 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P-N2131로 명명하였다.
한편, D-alanine/D-serine/glycine transporter 활성을 가진 유전자 단편을 획득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1595bp의 cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 17).
공지된 코리네박테리움 속 미생물 유래의 프로모터 cj7을 포함하는 p117-cj7-gfp를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다(대한민국 등록특허 제10-0620092호). 여기서 'p117'은 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터(E. coli-Corynebacterium shuttle vector)인 pECCG117(Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991)을 나타내는 것이다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 반응은 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머를 사용하여 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 28회 반복한 후, 72℃에서 3분간 중합반응을 수행하였다. 이로부터 증폭된 PCR 결과물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 350bp 크기의 cj7 단편을 획득하였다 (서열번호 20).
위에서 획득한 cj7 단편과 cycA 단편을 주형으로 하고, 서열번호 21 및 서열번호 19의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1945bp의 cj7-cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 위에서 제작한 pDZ-N2131 벡터를 제한효소 xhoI으로 처리하고 65℃에서 20분간 열처리한 후, 획득한 cj7-cycA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 cycA 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)을 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 cj7-cycA(Cam) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P/cycA(Cam)으로 명명하였다.
실시예 1-2-2: 대장균 유래 글리신 트랜스포터(CycA(Eco)) 도입 균주 제작
한편, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자와 그 활성을 비교하기 위해 기공지된 대장균 K-12 유래의 cycA 유전자를 위와 동일하게 KCCM12120P 균주에 도입하였다(Microbiology, 141(Pt 1); 133-40, 1995). 구체적으로 대장균 K-12 W3110 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1544bp의 cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 23).
위에서 획득한 cj7 단편과 cycA 단편을 주형으로 하고, 서열번호 21 및 서열번호 26의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1894bp의 cj7-cycA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 위에서 제작한 pDZ-N2131 벡터를 제한효소 xhoI으로 처리하고 65℃에서 20분간 열처리한 후, 획득한 cj7-cycA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 cycA 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/cj7-cycA(Eco)를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 cj7-cycA(Eco) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P/cycA(Eco)로 명명하였다.
실시예 1-3: CycA가 도입된 균주의 L-쓰레오닌 생산능 평가
실시예 1-2에서 제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.2)
포도당 30g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 40g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5g, Leucine 400mg, CaCO3 20g (증류수 1 리터 기준)
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 1]과 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM12120P 1.61 0.27 0.04 2.73 0.07 0.14 0.04
KCCM12120P-N2131 1.60 0.28 0.04 2.74 0.08 0.15 0.05
KCCM12120P/cycA(Cam) 1.81 0.22 0.03 2.61 0.07 0.00 0.03
KCCM12120P/cycA(Eco) 1.37 0.30 0.05 2.92 0.07 0.02 0.03
L-쓰레오닌의 생산량이 늘어날수록 L-라이신의 생산량은 감소하는 반면, L-쓰레오닌 생산량이 증가할수록 L-쓰레오닌 생합성 경로상 부산물이 될 수 있는 L-이소류신(Ile), 글리신(Gly)은 증가할 수 있으므로 이들의 생산량을 함께 확인하였다. 또한, cycA 유전자의 transporter로서의 기능도 확인하고자 세린(Ser)과 알라닌(Ala), 발린(Val)의 생산량도 함께 확인하였다.
상기 [표 1]의 결과와 같이, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자가 도입된 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM12120P 균주 대비 L-쓰레오닌의 생산량은 12.5% 증가한 반면 L-라이신은 4% 가량 감소하였다. 또한 cycA 유전자 도입 효과로 글리신은 모균주 대비 18.5% 감소하였고, 세린, 발린은 모균주 대비 소폭 감소하였으며, 알라닌은 현저히 감소하여 배양액에서 검출되지 않는 것을 확인하였다.
한편, 대장균 유래 cycA 유전자가 도입된 KCCM12120P/cycA(Eco) 균주는 모균주 대비 L-쓰레오닌의 생산량이 14.9% 감소한 반면, L-라이신은 6.9%, 글리신은 10% 가량 증가하는 결과를 확인하였다. 이처럼 대장균 유래 cycA와 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자 도입의 효과가 매우 상이하게 나타났으나 공통적으로 배양액 내 알라닌의 농도는 현저히 감소하는 양상을 나타내었다. 또한, 대장균 유래 cycA 또는 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA를 도입한 경우 모두에서 이소류신(Ile) 생산량은 변화가 없었다.
위의 결과를 토대로, L-쓰레오닌 생산에 있어 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 cycA 유전자 도입이 효과적임을 확인하였다.
상기의 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주는 CA09-0902로 명명하였고, 이를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2019년4월10일자로 국제 기탁하여 KCCM12484P로 기탁번호를 부여받았다.
실시예 1-4: Glycine Cleavage System 해당 유전자가 도입된 L-쓰레오닌 생산균주 제작
실시예 1-4-1: 글리신 분해 단백질 도입을 위한 벡터 제작
앞서 쓰레오닌 생산능 증가에 글리신 트랜스포터의 활성이 영향을 미침을 확인하였으므로, 세포내로 유입된 글리신의 세포내 이용능을 더욱 증가시키는 경우의 쓰레오닌 생산능을 확인하고자 하였다. 구체적으로는 글리신 분해 시스템(Glycine Cleavage System,이하 GCV system)을 도입하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 내에는 GCV system을 구성하는 단백질 6종 중 L-단백질, LipB, LipA을를 코딩하는 유전자만 알려져 있을 뿐 나머지 3종 단백질을 코딩하는 유전자는 알려진 바 없다. 따라서 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 GCV system을 도입하기 위하여 gcvP(서열번호 27), gcvT(서열번호 28), gcvH(서열번호 29), lipA(서열번호 30), lipB(서열번호 31) 도입 벡터를 제작하였다. 다음의 실험을 진행하였다. Glycine Cleavage System(이하 gcv system) 해당 유전자들 중 gcvPT 유전자 단편을 획득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 32 및 서열번호 33의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 5분을 28회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 프로모터를 포함한 4936bp의 gcvPT 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 27, 28).
또 다른 gcv system 해당 유전자인 gcvH-lipBA 유전자 단편을 획득하기 위해 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 염색체를 주형으로 하여 서열번호 34 및 서열번호 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 3분을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 프로모터를 포함한 3321bp의 gcvH-lipBA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다 (서열번호 29, 30, 31).
위에서 획득한 gcvPT 단편과 gcvH-lipBA 단편을 주형으로 하고, 서열번호 32 및 서열번호 35의 프라이머를 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 10분을 28회 반복한 후, 72℃에서 12분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 8257bp의 gcvPTH-lipBA 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 상기 실시예 1-2에서 제작한 pDZ-N2131 벡터를 제한효소 speI과 xhoI으로 처리한 후, 획득한 gcvPTH-lipBA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 gcv system 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA를 제작하였다.
실시예 1-4-2: 글리신 분해 단백질 도입 균주 제작
상기 실시예 1-2에서 획득한 pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam) 벡터를 주형으로 하여 서열번호 36 및 서열번호 37의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 90초를 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 1944bp의 cj7-cycA(Cam) 유전자 단편을 수득하였으며, 이 증폭산물을 QIAGEN사의 PCR Purification kit를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 한편, 위에서 제작한 pDZ-N2131/gcvPTH-lipBA 벡터를 제한효소 xhoI으로 처리하고 65℃에서 20분간 열처리한 후, 획득한 cj7-cycA(Cam) 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하여 다카라(TaKaRa)의 Infusion Cloning Kit를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 Ncgl2131 위치로 D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자와 gcv system 유전자를 삽입할 수 있는 벡터 pDZ-N2131/gcv-lip-cycA(Cam)을 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 KCCM12120P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 gcvPTH-lipBA-cycA(Cam) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam)으로 명명하였다.
실시예 1-4-3: 글리신 트랜스포터 및 글리신 분해 단백질 도입 균주의 쓰레오닌 생산능 평가
실시예 1-2 및 1-4-2에서 제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 위의 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 2]와 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM12120P 1.61 0.27 0.04 2.73 0.07 0.14 0.04
KCCM12120P-N2131 1.60 0.28 0.04 2.74 0.08 0.15 0.05
KCCM12120P/cycA(Cam) 1.81 0.22 0.03 2.34 0.07 0.00 0.03
KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 2.04 0.13 0.02 2.36 0.10 0.00 0.01
상기 [표 2]의 결과와 같이, D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자와 함께 gcv system 유전자가 함께 도입된 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM12120P 균주 대비 26.7% 향상된 L-쓰레오닌 생산량을 보였는데, 이는 cycA 유전자만 도입된 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주 대비 12.7% 향상된 생산량이다. 이를 토대로 cycA 유전자를 단독 도입한 경우보다 gcv system 유전자와 함께 도입한 균주의 L-쓰레오닌 생산량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주의 L-라이신 생산량은 KCCM12120P 대비 13.6% 감소했으며 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주는 KCCM12120P 대비 14.3% 감소하였다. L-이소류신 생산량은 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주에서 KCCM12120P 대비 증가하는 양상을 보였으나, 이는 실시예 1-3의 결과를 고려했을 때, L-쓰레오닌 생산량 증가에 의해 생합성 경로상 부산물인 L-이소류신이 함께 증가한 것으로 볼 수 있다.
글리신 생산량은 KCCM12120P 균주로부터 cycA 유전자만 도입했을 때에는 18.5% 감소하였고, gcv system 유전자들이 함께 도입된 경우 KCCM12120P 균주 대비 51.9% 감소하였다. 알라닌은 cycA 유전자 도입만으로도 큰 폭으로 감소하였고, gcv system 도입에 따른 역효과는 없는 것을 확인하였다. 세린과 발린 생산량은 극소량이지만 KCCM12120P/cycA(Cam) 균주와 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주 모두 모균주 KCCM12120P 대비 감소하는 것을 확인하였다.
상기의 KCCM12120P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주는 CA09-0905로 명명하였고, 이를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2019년4월10일자로 국제 기탁하여 KCCM12485P로 기탁번호를 부여받았다.
이상의 결과를 토대로 코리네박테리움 속 L-쓰레오닌 생산균주 기반으로 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 D-alanine/D-serine/glycine transporter 유전자인 cycA 유전자를 도입되었을 때, L-쓰레오닌 생산량이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 cycA 유전자와 함께 gcv system 해당 유전자가 도입되었을 때, L-쓰레오닌 생산량은 더욱 큰 폭으로 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 2: cycA와 Glycine Cleavage System이 도입된 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P의 L-쓰레오닌 생산능 확인
실시예 1과 같이 CycA 및 gcv system을 기존 쓰레오닌 생산 균주에 도입한 효과를 확인하고자 실험을 수행하였다.
실시예 2-1: L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P 균주에 CycA 도입
상기 실시예 1에서 사용된 형질전환 벡터 pDZ-N2131, pDZ-N2131/cj7-cycA(Cam)과 pDZ-N2131/cj7-cycA(Eco)를 각각 L-쓰레오닌 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11222P(대한민국 등록 특허 제 10-1335853호) 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 Ncgl2131 위치가 각각 결실, cj7-cycA(Cam) 또는 cj7-cycA(Eco) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 각각 KCCM11222P-N2131, KCCM11222P/cycA(Cam) 또는 KCCM11222P/cycA(Eco)로 명명하였다.
제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
L-쓰레오닌 생산배지 (pH 7.0)
포도당 100g, KH2PO4 2g, Urea 3g, (NH4)2SO4 25g, Peptone 2.5g, CSL(Sigma) 5g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, CaCO3 30g (증류수 1 리터 기준)
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 3]과 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM11222P 7.64 1.30 0.86 3.68 1.46 0.60 0.46
KCCM11222P-N2131 7.66 1.28 0.88 3.68 1.47 0.59 0.41
KCCM11222P/cycA(Cam) 8.80 1.02 0.85 3.13 1.42 0.01 0.42
KCCM11222P/cycA(Eco) 6.67 1.35 0.90 4.42 1.49 0.05 0.40
상기 [표 3]에서 보는 바와 같이, KCCM11222P/cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM11222P 대비 15.2% 증가한 L-쓰레오닌 생산량을 보인 반면, L-라이신 생산량은 14.9% 감소하였다. 글리신과 알라닌은 KCCM11222P 대비 각각 21.5%, 98.3% 감소하는 결과를 보여 상기 실시예 1의 KCCM12120P 균주 기반에서의 평가 결과와 유사한 양상임을 확인하였다. 이소류신의 경우, KCCM11222P/cycA(Cam) 균주는 KCCM11222P 대비 3% 정도 감소하고, KCCM11222P/cycA(Eco) 균주는 KCCM11222P 대비 4% 정도 증가하여, 이소류신 생산량에 cycA 단백질 도입이 큰 영향을 주지 않는 것을 확인하였다. 특히 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 유전자가 도입된 균주의 경우는 이소류신 생산량이 감소함을 확인하였다.
한편, 대장균 유래 cycA 유전자가 도입된 KCCM11222P/cycA(Eco) 균주는 KCCM11222P 균주 대비 각각 12.7% 감소한 L-쓰레오닌 생산량과 20.1% 증가한 L-라이신 생산량을 나타내었다. 이로써 대장균 유래 cycA 유전자는 L-쓰레오닌 생산 증대에 효과가 없음을 확인하였다.
이를 통해, 쓰레오닌 생산능을 갖는 변이주에 코리네박테리움 암모니아게네스 유래 cycA 단백질을 도입하면 쓰레오닌 생산능을 증대시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 2-2: L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P 균주에 CycA 및 gcv system 도입
실시예 1에서와 동일하게 cycA(Cam) 유전자와 gcv system 유전자의 조합 효과를 확인하기 위해 제작된 벡터 pDZ-N2131/gcv-lip-cycA(Cam)를 전기천공법으로 KCCM11222P 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 Ncgl2131 위치가 gcvPTH-lipBA-cycA(Cam) 형태로 치환되어 있는 균주를 얻었으며, 이를 KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam)으로 명명하였다.
제작된 균주들의 L-쓰레오닌 생산능 테스트를 진행하였다. 위의 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 위에서 획득한 균주들을 각각 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기의 L-쓰레오닌 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 여러 아미노산의 생산량을 측정하였다. 그 결과는 하기 [표 4]와 같다.
균주 Amino acid (g/l)
Thr Gly Ser Lys Ile Ala Val
KCCM11222P 7.63 1.32 0.87 3.70 1.45 0.60 0.45
KCCM11222P-N2131 7.64 1.29 0.88 3.68 1.45 0.58 0.40
KCCM11222P/cycA(Cam) 8.81 1.04 0.85 3.11 1.42 0.01 0.41
KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 10.31 0.57 0.49 3.17 1.50 0.00 0.31
상기 [표 4]의 결과와 같이, KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주는 모균주인 KCCM11222P 대비 35.1% 증가한 L-쓰레오닌 생산량을 보였는데, 이는 cycA 유전자만 도입된 KCCM11222P/cycA(Cam) 균주보다 17.0% 증가한 L-쓰레오닌 생산량이다. 이를 토대로 상기 실시예 1에서와 마찬가지로 재조합 L-쓰레오닌 생산균주 KCCM11222P 기반에서도 cycA 유전자를 단독 도입한 경우보다 gcv system 유전자와 함께 도입한 균주의 L-쓰레오닌 생산량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주의 L-라이신 생산량은 KCCM11222P 대비 14.3% 감소한 반면 KCCM11222P/cycA(Cam) 균주는 KCCM11222P 대비 15.9% 감소하였다. L-이소류신 생산량은 KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주에서 KCCM11222P 대비 3.4% 증가하는 양상을 보였으나, 이는 실시예 2-1의 결과를 고려했을 때, L-쓰레오닌 생산 증가에 따른 부수적인 효과로 해석할 수 있다.
글리신 생산량은 KCCM11222P 균주로부터 cycA 유전자만 도입했을 때에는 21.2% 감소하였고, gcv system 유전자들이 함께 도입된 경우 KCCM11222P 균주 대비 56.8% 감소하였다. 알라닌은 cycA 유전자 도입만으로도 큰 폭으로 감소하였고, gcv system 도입으로 더욱 감소하여 KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주에서 측정되지 않았다. KCCM11222P/gcv-lip-cycA(Cam) 균주의 세린과 발린 생산량은 모균주 KCCM11222P 대비 각각 43.7%, 31.1% 감소하는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2020003318-appb-I000001
Figure PCTKR2020003318-appb-I000002

Claims (12)

  1. 글리신 트랜스포터의 활성이 강화된, L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글리신 트랜스포터는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 유래인, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글리신 트랜스포터 단백질은 CycA 단백질인, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 16 또는 이와 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 글리신 분해 단백질의 활성이 추가로 강화된, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 글리신 분해 단백질은 GcvP, GcvT, GcvH, LipB 및 LipA로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질인, 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 글리신 분해 단백질은 코리네박테리움 암모니아게네스 유래인, 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 GcvP는 서열번호 38, GcvT 단백질은 서열번호 39, GcvH는 서열번호 40, LipA 단백질은 서열번호 41, LipB 단백질은 서열번호 42 또는 상기 서열번호와 각각 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 L-쓰레오닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 한 항의 미생물을 포함하는 L-쓰레오닌 생산용 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 한 항의 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 미생물 또는 배지에서 L-쓰레오닌을 회수하는 단계를 포함하는, L-쓰레오닌 제조방법.
  12. 글리신 트랜스포터 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물의 L-쓰레오닌 생산 용도.
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