WO2020256415A1 - L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법 - Google Patents

L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-타이로신 생산 방법 Download PDF

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서창일
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    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01013—Prephenate dehydrogenase (NADP+) (1.3.1.13)

Definitions

  • Another object of the present application is to provide an expression cassette comprising a gene encoding a trp operon regulatory region and a prephenate dehydratase operably linked thereto.
  • one aspect of the present application includes a gene encoding a trp operon regulatory region and a prephenate dehydratase operably linked thereto, L-tyrosine. Provides the microorganisms that produce it.
  • trp operon regulatory region refers to a site that is present upstream of a structural gene constituting the trp operon and can regulate the expression of a structural gene.
  • Structural genes constituting the trp operon in microorganisms of the genus Corynebacterium may be composed of trpE, trpG, trpD, trpC, trpB, and trpA genes, and the structural genes constituting the trp operon in microorganisms of the genus Escherichia are It may be composed of trpE, trpD, trpC, trpB, and trpA genes.
  • the trp operon regulatory region may be present upstream of trpE at the 5'position of the trp operon structural gene.
  • a trp regulator trpR
  • trp promoter a promoter
  • trp operator an operator
  • trp leader peptide trp L
  • trp attenuation factor trp promoter
  • trp promoter may include a promoter (trp promoter), an operator (trp operator), a trp leader peptide (trp L) and a trp attenuator (trp attenuator).
  • trp operon regulatory region may be used interchangeably with the trp operon regulatory factor, trpE promoter, trp operon promoter, trpE regulatory region, trpE regulatory factor, and trpE regulatory sequence.
  • the regulatory region is at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology with SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 1 ( It may be a nucleotide sequence having homology or identity. In addition, if it is a base sequence that has such homology or identity and exhibits a function corresponding to the control region, it is obvious that expression control sequences having a nucleotide sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the present application. .
  • sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and a default gap penalty established by the program used can be used together.
  • sequence homologous or identical sequences are generally at least about 50%, 60%, 70%, 80% of the sequence full or full-length in medium or high stringent conditions. Or it can hybridize to 90% or more. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotide.
  • homology or identity to the polypeptide or polynucleotide sequence can be determined, for example, by the algorithm BLAST by literature [see Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)], or FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63, 1990). Based on this algorithm BLAST, a program called BLASTN or BLASTX has been developed (see: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the microorganism genetically modified so that the pheA gene is regulated by the trp operon control region does not interfere with the growth of the cells, and phenylalanine It minimizes the accumulation of (phenylalanine) and is effective in improving tyrosine production.
  • the microorganisms are, for example, Enterbacter genus, Escherichia genus, Erwinia genus, Serratia genus, Providencia genus, Corynebacterium ) And may be a microorganism belonging to the genus Brevibacterium , but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides an expression cassette comprising a gene encoding the trp operon regulatory region and prephenate dehydratase operably linked thereto.
  • expression cassette may be a gene construct unit comprising essential regulatory elements operably linked to the gene so that the introduced gene is expressed when present in the cell of an individual.
  • the expression cassette may be, for example, in the form of an expression vector, but is not limited thereto, and all the gene constructs of the smallest unit capable of functioning to express the target gene to be introduced may be included.
  • the expression cassette can be prepared and purified using standard recombinant DNA techniques.
  • the type of expression cassette is not particularly limited as long as it has a function of expressing a desired gene in various host cells such as prokaryotic and eukaryotic cells and producing a desired protein.
  • the expression cassette may include a promoter, an initiation codon, a gene encoding a protein of interest, or a stop codon, and in addition, a DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, an untranslated region on the 5'side and 3'side of the gene of interest , A selection marker region, or a replicable unit may be appropriately included.
  • vector refers to a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the protein of interest operably linked to a suitable regulatory sequence so that the protein of interest can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation.
  • Vectors can be transformed into a suitable host cell and then replicated or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • operably linked in the above means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence or regulatory region that initiates and mediates transcription of the polynucleotide encoding the protein of interest in the present application.
  • the operable linkage may be prepared using a gene recombination technique known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage may be prepared using a cleavage and linkage enzyme in the art, but is not limited thereto.
  • compositions for producing L-tyrosine comprising a gene encoding the trp operon regulatory region and prephenate dehydratase operably linked thereto.
  • the upstream and downstream regions to which the amplified variant aroG will be additionally inserted, and the vector pDZ for chromosome transformation digested with SmaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, and named pDZ- ⁇ BBD29_14470. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • pheA a first-stage gene branching from Prephenic acid
  • the upstream and downstream regions of the pheA gene were obtained. Specifically, using the chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 as a template, the pheA upstream region using the primers of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32, and the downstream region using the primers of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 The (Downsteam) region of the gene fragment was obtained through PCR.
  • Example 4 Evaluation of the production ability of the pheA gene-deficient strain of the L-tyrosine producing strain
  • the strain was cultured using the method and medium composition described in Example 2.
  • upstream of the region to be inserted and the region downstream of the region to be inserted and the region to be inserted were obtained.
  • the upstream region of the region to be inserted using the primers of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 using the Corynebacterium glutamicum ATCC13869 chromosome DNA as a template, and the primers of SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40
  • a gene fragment of a downstream region of the region to be inserted was obtained through PCR.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization for 30 seconds at 72°C. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • Recombinant plasmids were obtained by cloning the amplified upstream and downstream regions of the region to be inserted, the trpE regulatory region, and the vector pDZ for chromosome transformation digested with SmaI restriction enzyme using the Gibson assembly method, and pDZ- ⁇ PpheA::PtrpE It was named as. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization for 30 seconds at 72°C. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • Recombinant plasmids were obtained by cloning the amplified upstream and downstream regions of the region to be inserted, the ilvB promoter region, and the vector pDZ for chromosome transformation digested with SmaI restriction enzyme using the Gibson assembly method, and pDZ- ⁇ PpheA::PilvB It was named as. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • an upstream region of the region to be inserted and a promoter region of leuC and a downstream region of the region to be inserted were obtained.
  • the primers of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 51 using the Corynebacterium glutamicum ATCC13869 chromosome DNA as a template, the upstream region of the region to be inserted, and the primers of SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 53
  • a gene fragment of the Downsteam region of the region to be inserted was obtained through PCR.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 that can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding regulatory region or promoter is inserted, respectively.
  • the strain in which the trpE regulatory region was inserted in front of the gene of pheA was CM06-0005
  • the strain in which the promoter of ilvB was inserted was CM06-0006
  • the strain in which the promoter of leuA was inserted was CM06-0007
  • the promoter of leuC was inserted.
  • the strain was named CM06-0008.
  • Example 6 Evaluation of the production ability of the pheA gene promoter replacement strain of the L-tyrosine producing strain
  • the strain was cultured using the method and medium composition described in Example 2.
  • CM06-0005 strain produced L-tyrosine in a 5.37% yield because the production capacity was improved than that of the CM06-0004 strain.
  • the production of L-tyrosine of CM06-0005 increased by 283% compared to the parent strain CM06-0003 and increased by 144% compared to CM06-0004.
  • Solg TM Pfu-X DNA polymerase As the polymerase, Solg TM Pfu-X DNA polymerase was used, and PCR amplification conditions were after denaturation at 95°C for 5 minutes, denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 60 seconds. , Polymerization was performed at 72° C. for 5 minutes.
  • the amplified ptsG upstream and downstream gene fragments, the glf gene fragment containing the cj7 promoter, and the vector pDZ for chromosome transformation digested with the ScaI restriction enzyme were cloned using the Gibson assembly method to obtain a recombinant plasmid, pDZ- ⁇ ptsG Named as ::pcj7-glf. Cloning was performed by mixing the Gibson assembly reagent and each gene fragment in the calculated mole number and then storing at 50° C. for 1 hour.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 that can amplify the regions outside the homologous recombination upstream region and downstream region into which the corresponding regulatory region or promoter is inserted, respectively.
  • the strain in which the trpE regulatory region was inserted in front of the gene of pheA was CM06-0010
  • the strain in which the promoter of ilvB was inserted was CM06-0012
  • the strain in which the promoter of leuA was inserted was CM06-0013
  • the promoter of leuC was inserted.
  • the strain was named CM06-0014.
  • Example 8 pheA gene deletion of non-PTS L-tyrosine-producing strain and evaluation of production ability of promoter replacement strain
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • ATCC 13869 strain was cultured in a seed medium for 18 hours, inoculated into 4 ml of a seed medium, and cultured until an OD660 reached about 1.0.
  • the culture medium was centrifuged to recover the cells, washed twice with 50 mM Tris-malate buffer (pH6.5), and suspended in the final 4 ml of the same buffer solution.
  • NTG solution (2 mg/ml in 0.05M Tris-malate buffer (pH6.5) was added to the cell suspension and allowed to stand for 20 minutes at room temperature, and then the cells were centrifuged.
  • L-tyrosine production ability was confirmed with respect to the L-tyrosine hydroxamate resistant strain of 100 strains obtained in Example 9.
  • culture was performed with shaking at 30° C. for 20 hours at 200 rpm.
  • 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium and cultured with shaking at 200 rpm for 48 hours at 30°C.
  • the pheA genes of ATCC 13869 YAR-6 and YAR-8 strains selected in Example 10 were regulated in the regulatory region of the trp operon.
  • pDZ- ⁇ PpheA::PtrpE prepared in Example 5 was transformed into ATCC 13869 YAR-6 and YAR-8 strains by electroporation, respectively, and then through a second cross-over process, the pheA gene was the regulatory region of trpE A strain made to be controlled was obtained.
  • the genetic manipulation was confirmed by PCR method and genome sequencing using primers of SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 that can amplify the external regions of the homologous recombination upstream region and downstream region into which the regulatory region is inserted, respectively.
  • ATCC 13869 YAR-6 and YAR-8 strains, which inserted the trpE regulatory region in front of the pheA gene, were named YAR-6P and YAR-8P, respectively.
  • the production amount of L-tyrosine can be significantly increased to an unexpected level without slowing the sugar consumption rate, and the combination of the regulatory region of the trp operon and the pheA gene is L-tyrosine. It was confirmed that the synergy effect was great for production.

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Abstract

본 출원은 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자를 포함하는 L-타이로신을 생산하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용한 L-타이로신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-타이로신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-타이로신 생산 방법
본 출원은 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자를 포함하는 L-타이로신을 생산하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용한 L-타이로신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-타이로신은 아미노산의 하나로써, 약품 원료와 식품 첨가제, 동물 사료, 영양제 등의 중요 소재로 사용된다. 상기 L-타이로신 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다.
미생물의 L-타이로신 생산 과정은 5탄당 회로의 중간 물질인 E4P(Erythrose-4-Phosphate)와 해당과정(glycolysis)의 중간 물질인 PEP(Phosphoenolpyruvate)가 중합 반응하여 만들어지는 DAHP(3-Deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate)로부터 시작된다. 이후 DAHP는 방향족 공통 생합성 경로를 거쳐 코리스믹산(chorismate)에서 프레펜산(prephenate)을 거쳐 L-타이로신 생합성 경로를 통해 최종적으로 L-타이로신으로 전환된다. 이 과정에서 코리스믹산은 L-트립토판으로 프레펜산은 L-타이로신 또는 L-페닐알라닌으로 분기 될 수 있다. 따라서, L-타이로신 생산량을 늘리기 위해 방향족 공통 생합성 경로를 강화할 경우에 L-트립토판과 L-페닐알라닌의 생산도 동시에 늘어날 것으로 예상할 수 있다. 즉, L-타이로신을 생산하고자 하는 경우, 부산물로서 페닐알라닌과 트립토판이 함께 생산되므로 유전자 재조합 및 정제 등의 다양한 연구가 수반되어야 한다. 한편, L-트립토판은 미생물이 생산하는 L-트립토판 농도에 따라 억제자(repressor)와 조절자(attenuator)가 이의 생산을 동시에 조절하는 것으로 알려져 있다(한국등록특허10-0792095 B1).
본 발명자들은 L-타이로신을 고효율로 생산할 수 있는 미생물을 개발하고자 예의 연구한 결과, L-페닐알라닌 생산 유전자를 L-트립토판 생산 오페론의 프로모터의 조절을 받도록 하는 경우 L-타이로신의 생산 수율이 높은 수준으로 증가한다는 사실을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-타이로신을 회수하는 단계를 포함하는 것인, L-타이로신의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현카세트를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 이용하여, 프리페네이트 디하이드라타제의 활성을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 L-타이로신을 생산을 위한, 상기 L-타이로신을 생산하는 미생물의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 L-타이로신을 생산을 위한, 상기 발현카세트의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 L-타이로신을 생산을 위한, 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자 및 trp 오페론 조절영역을 포함하는 L-타이로신을 생산하는 미생물은 균체 성장에 지장이 없으면서 L-페닐알라닌(L-phenylalanine)의 축적을 최소화하며, L-타이로신을 고효율로 생산할 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 출원의 하나의 양태는, trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물을 제공한다.
본 출원의 용어 "L-타이로신(L-Tyrosine)"은 20개 α-아미노산중에 하나로써, 친수성아미노산 또는 방향족 아미노산으로 분류된다. 타이로신은 의약품이나 플라보노이드, 알카노이드 등의 전구체로 사용되는 상업적으로 중요한 아미노산이다.
본 출원의 용어, "트립토판 오페론(tryptophan operon; Trp operon)"은 코리스민산(chorismic acid; chorismate)로부터 트립토판을 합성하는데 관여하는 효소를 암호화 하고 있는 유전자군으로, 구조 유전자(Structure Gene) 및 발현조절영역(또는 조절영역, regulatory region)을 포함한다. 구체적으로, 트립토판 오페론은 코리네박테리움 속 미생물 유래의 트립토판 오페론, 또는 에스케리키아 속 미생물 유래의 트립토판 오페론 일 수 있으나, 본 출원의 pheA 유전자를 조절할 수 있는 한 제한없이 다양한 유래의 트립토판 오페론을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 코리네박테리움속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있고, 에스케리키아속 미생물은 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 트립토판 오페론은 공지된 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 당업자는 NCBI 또는 Kegg 등의 데이터베이스를 통해 트립토판 오페론의 뉴클레오티드 서열을 용이하게 수득할 수 있다. 통상의 트립토판 오페론은 세포가 요구하는 충분한 양의 트립토판을 생산할 수 있도록 활발히 전사하지만, 세포내 트립토판이 충분히 존재하는 경우에 억제인자(repressor)가 트립토판과 결합하여 트립토판 오페론이 불활성화되므로 전사가 억제된다. 본 출원에서 상기 용어는 트립토판 오페론, trp 오페론 등과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어 "trp 오페론 조절영역"은 trp 오페론을 구성하는 구조유전자의 업스트림에 존재하여 구조유전자의 발현을 조절할 수 있는 부위를 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물에서의 trp 오페론을 구성하는 구조 유전자는 trpE, trpG, trpD, trpC, trpB, trpA 유전자로 구성되어 있을 수 있으며, 에스케리키아속 미생물에서의 trp 오페론을 구성하는 구조 유전자는 trpE, trpD, trpC, trpB, trpA 유전자로 구성되어 있을 수 있다. 상기 trp 오페론 조절영역은 trp 오페론 구조유전자의 5'위치에 있는 trpE의 업스트림에 존재하는 것일 수 있다. 구체적으로, trp 오페론을 구성할 수 있는 구조 유전자를 제외한 trp 레귤레이터(trp regulator; trpR), 프로모터(trp promoter), 오퍼레이터(trp operator), trp 리더펩타이드(trp leaderpeptide; trp L) 및 trp 감쇠인자(trp attenuator)를 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 프로모터(trp promoter), 오퍼레이터(trp operator), trp 리더펩타이드(trp leaderpeptide; trp L) 및 trp 감쇠인자(trp attenuator)를 포함하는 것일 수 있다. 본 출원에서는 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 pheA 유전자의 업스트림(Upstream)에 위치하여, pheA 유전자의 발현을 조절할 수 있는 trp 오페론에 존재하는 조절영역이라면 제한없이 포함된다. 본 출원에서, 상기 trp 오페론 조절영역은 trp 오페론 조절인자, trpE 프로모터, trp 오페론 프로모터, trpE 조절영역, trpE 조절인자 및 trpE 조절서열과 혼용되어 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 trp 오페론의 조절영역은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 1의 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI Genbank에서 그 서열을 확인할 수 있다.
구체적으로, 상기 조절영역은 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 염기 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 조절영역에 상응하는 기능을 나타내는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기 서열을 갖는 발현조절서열도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어 "상동성(homology) 및 동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
상기 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 상동성 또는 동일성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)], 또는 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 또한, 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology
본 출원의 용어 "프리페네이트 디하이드라타제(prephenate dehydratase)"는 L-페닐알라닌을 생합성하는데 필요한 단백질 중 하나이다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 그 예로 pheA 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단백질은 이중 작용성 코리스 메이트 뮤타제/프리페네이트 디하이드라타제 (Bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase)로도 명명될 수 있다. 상기 프리페네이트 디하이드라타제는 코리스메이트(chorismate) 또는 프리페네이트(prephenate)에서 L-페닐알라닌을 생산하는 경로의 효소이며 타이로신 생합성경로와 경쟁하는 단계에 있는 효소이기 때문에, 일반적으로는 타이로신 생산균주를 제작하는데 있어서 불활성화시키기 위한 대상 유전자로 선정된다. 그러나, 이를 불활성화 하는 경우, 균주의 생장에 영향을 미쳐 생산성이 크게 떨어지는 문제점이 있다.
본 출원에서 상기 pheA 유전자가 trp 오페론 조절영역에 의해 조절받도록 유전전으로 변형한 미생물은, 구체적으로, trp 오페론의 조절영역을 pheA의 조절을 위한 프로모터 부위에 적용한 미생물은 균체 성장에 지장이 없으면서 페닐알라닌(phenylalanine)의 축적을 최소화하며, 타이로신 생산을 향상시키는데 효과가 있다.
또한, 상기 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자인 pheA 유전자는 pheA 구조 유전자의 업스트림에 존재하는 조절서열의 일부 또는 전체가 결실된 것일 수 있으며, 본 출원의 목적상 pheA 구조유전자의 업스트림 위치가 trp 오페론 조절영역으로 치환 또는 pheA 구조유전자의 업스트림 위치에 trp 오페론 조절영역이 삽입되어 trp 오페론 조절영역에 의해 pheA에 의해 코딩되는 단백질의 발현의 조절을 받을 수 있는 pheA 구조유전자를 포함하는 것 일 수 있다. 본 출원에서 'pheA 유전자'는 '프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자'및'pheA 구조 유전자'와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "L-타이로신을 생산하는 미생물"이란, 자연적으로 L-타이로신의 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-타이로신의 생산능이 없는 모균주에 L-타이로신의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결 된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, "L-타이로신을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 L-타이로신 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다. 본 출원의 목적상 상기 L-타이로신을 생산하는 미생물은 상기 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결 된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 를 포함하여, 목적하는 L-타이로신 생산능이 증가된 것을 특징으로 하며, 유전적으로 변형된 미생물 또는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 출원에서 L-타이로신 생산능을 가지는 미생물이란 본 출원의 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하거나, 또는 상기 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 향상된 L-타이로신 생산능을 가지게 된 재조합 미생물을 의미한다.
본 출원에서, "유전자를 포함하는 미생물"은 "유전적으로 변형된 미생물", "유전자를 발현하도록 변형된 미생물", "유전자를 발현하는 재조합 미생물", 또는"유전자가 코딩하는 단백질의 활성을 갖는 재조합 미생물"을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
그 예로i) 본 출원의 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하거나, ii) trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 발현하도록 변형되거나, iii) trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 발현하는 재조합 미생물, iv) trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어 향상된 L-타이로신 생산능을 가지게 된 재조합 미생물을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "향상된 L-타이로신 생산능을 가지게 된 미생물"은 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물보다 L-타이로신 생산능이 향상된 미생물을 의미한다. 상기 '비변형 미생물'은 천연형 균주 자체이거나, 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 미생물을 의미한다.
본 출원의 목적상 상기 미생물은 상기 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결 된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하여 L-타이로신을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 본 출원에서 상기 "L-타이로신을 생산할 수 있는 미생물"은 "L-타이로신을 생산하는 미생물", "L-타이로신을 생산능을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 미생물은 예를 들어, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 스테이셔니스(Corynebacterium stationis) 등이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-타이로신을 회수하는 단계를 포함하는 것인, L-타이로신을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 7.0)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃ 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 출원의 상기 배양 단계에서 생산된 아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집(collect)할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 아미노산은 정제된 형태 또는 아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008). 또한, 상기 배양 단계의 전후, 상기 회수 단계의 전후에 당해분야에서 공지된 적합한 방법을 추가하여, 목적 아미노산의 회수를 효율적으로 수행할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현카세트를 제공한다.
본 발명에서 용어, "발현카세트"는 개체의 세포 내에 존재하는 경우 도입된 유전자가 발현되도록 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물 단위체일 수 있다. 상기 발현카세트는 예를 들어 발현벡터의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 도입되는 목적 유전자가 발현되도록 기능을 할 수 있는 최소 단위의 유전자 작제물은 모두 포함될 수 있다.
상기 발현카세트는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현카세트의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않는다. 발현카세트는 프로모터, 개시코돈, 목적 단백질을 코드하는 유전자, 또는 종결코돈을 포함할 수 있고, 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 목적 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 발현카세트는 하나의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 모노시스트론(mono-cistronic) 벡터, 둘 이상의 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리시스트론(poly-cistronic) 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열또는 조절영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는, L-타이로신 생산용 조성물을 제공한다.
상기 L-타이로신 생산용 조성물은 상기 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하며, 추가로 상기 유전자 또는 오페론 조절영역을 작동시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자 및 trp 오페론 조절영역은 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있게 벡터내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자인pheA 유전자의 발현은 trp 오페론 발현 조절영역에 의해 조절되는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 이용하여, 프리페네이트 디하이드라타제의 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, L-타이로신을 생산을 위한, 상기 L-타이로신을 생산하는 미생물의 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, L-타이로신을 생산을 위한, 상기 발현카세트의 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로서, L-타이로신을 생산을 위한, 조성물의 용도를 제공한다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: L-타이로신 생산 균주 제작
야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-타이로신을 생산하는 능력은 있으나, 배양액으로 배출할 만큼 과량 생산하지는 않는다. 본 출원의 목적에 따라 L-타이로신 생산능을 증가시키는 유전형질을 확인하기 위하여, 야생형 균주보다는 L-타이로신 생산능이 증가된 균주를 활용하였다. 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에 L-타이로신을 생산하는데 필요한 유전자들을 강화하여 L-타이로신 생산 균주를 제작 하였다.
먼저, L-타이로신의 전구체로서 E4P(Erythrose-4-Phosphate)의 원활한 공급을 위해 tkt 유전자의 과발현을 진행하였다. 이와 동시에 L-타이로신을 세포 내부로 유입하는 방향족 아미노산 유입 유전자인 aroP의 결손을 진행하였다.
상기 유전자 조작을 위해 우선 tkt 유전자를 대체 삽입할 aroP 다운스트림 (Downstream) 과 업스트림 (Upsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 aroP 다운스트림 (Downstream) 지역을, 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 업스트림 (Upsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
또한, tkt 프로모터를 포함한 tkt 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 6와 서열번호 7의 프라이머를 이용하여 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 150초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 aroP 프로모터 업스트림과 다운스트림 지역, tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ(특허등록 제10-0924065호) 는 깁슨 어셈블리 (DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔaroP::Pn-tkt로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
2 TCGAGCTCGGTACCCTGGGAACTTGTCGACGCTAT
3 TGTTCGGCAAGCATTGTGGTGTGGGCAATGATCAC
4 ATTAACGGTTAAAGTACTCATTGTGAGGTGGCGGG
5 CTCTAGAGGATCCCCGGAGCTGCTGTCCAACGTGG
6 CCACACCACAATGCTTGCCGAACATTTTTCTTTTC
7 CACAATGAGTACTTTAACCGTTAATGGAGTCCTTG
제작된 pDZ-ΔaroP::Pn-tkt 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 aroP 유전자를 결손하는 동시에 tkt 프로모터를 포함하는 tkt 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 8과 서열번호 9의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0001로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
8 ACGCGCCAAGTCGGACG
9 CGCACGATGTTTACCTGCG
L-타이로신 경로를 강화하기 위해서, 기존에 코리네박테리움 글루타미쿰이 가지고 있는 L-타이로신에 의한 피드백 조절을 받는 tyrA 유전자를 강한 프로모터인 gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래의 피드백 조절을 받지 않는 변이형 tyrA로 교체하였다. 대장균 유래 tyrA 단백질은 53번 메치오닌(Methionine)이 아이소루신(Isoleucine)으로, 354번 알라닌(Alanine)이 발린(Valine)으로 변이되면 피드백이 해제되는 것으로 알려져 있고 이 형태 (서열번호 10)를 사용하였다 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007)).
상기 유전자 조작을 위해 우선 tyrA 유전자를 교체 삽입할 tyrA 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 tyrA 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 13와 서열번호 14의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
또한, gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래 변이 tyrA 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 15과 서열번호 16의 프라이머를 이용하여 gapA 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, 대장균 유래 변이 tyrA 합성 DNA를 주형으로 하여 서열번호 17와 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 대장균 유래 변이 tyrA 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 tyrA 업스트림과 다운스트림 지역, gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 변이 tyrA 유전자 단편, 그리고 SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm 으로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
11 TTCGAGCTCGGTACCCTATCAAAACCGAGTTCTTCC
12 GTCGTTTTTAGGCCTCCTGACAAGTGTGGCACATAC
13 TGACAATCGCCAGTAATTTTATCGGCTGATGATTCT
14 ACTCTAGAGGATCCCCAACGCGATTGCATTCGGCTC
15 GTGCCACACTTGTCAGGAGGCCTAAAAACGACCGAG
16 TCAATTCAGCAACCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
17 TTAGAGGAGACACAACATGGTTGCTGAATTGACCGC
18 TCATCAGCCGATAAAATTACTGGCGATTGTCATTCG
제작된 pDZ-ΔtyrA::PgapA-tyrAm 벡터를 CM06-0001 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 tyrA 유전자를 결손하는 동시에 gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 변이 tyrA 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 19과 서열번호 20의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0002 로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
19 GCCCACTAGTCGAATCCC
20 CTGTCCGCAACCTGTGCG
L-타이로신 생산을 늘리기 위해 방향족 공통 생합성 경로의 첫 단계인 aroG 유전자를 대장균 유래 피드백 조절 해제 변이형 aroG에 강한 프로모터를 추가하여 강화하였다. 대장균 유래 aroG 단백질은 150번 프롤린(Proline)이 루이신(Leucine)으로 치환될 경우 피드백이 해제되는 것으로 알려져 있으며, 이 형태 (서열번호 68)를 사용하였다 (Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997)).
이러한 유전자 조작을 위해 우선 aroG 유전자를 추가 삽입할 업스트림 (Upstream)과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 21와 서열번호 22의 프라이머를 이용하여 BBD29_14470 유전자의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 23와 서열번호 24의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 변이형 aroG를 추가 삽입할 업스트림과 다운스트림 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔBBD29_14470 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
또한, gapA 프로모터를 포함한 대장균 유래 변이형 aroG 유전자를 확보하기 위해서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 15와 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 gapA 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, 대장균 유래 피드백 해제 변이형 aroG 합성 DNA를 주형으로 하여 서열번호 27와 서열번호 28의 프라이머를 이용하여 변이형 aroG 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 gapA 프로모터를 포함하는 변이형 aroG 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ-ΔBBD29_14470는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 으로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
21 TCGAGCTCGGTACCCCCCGGCGGTATCGAGGTAGT
22 GACAAGTTTAGTACTTTAATCACCCGCGGGGACCC
23 GGTGATTAAAGTACTAAACTTGTCCCGAGGGTGAG
24 CTCTAGAGGATCCCCTATCAGTCACTTCCCTGAGA
25 GCGGGTGATTAAAGTGAGGCCTAAAAACGACCGAG
26 GTTCTGATAATTCATGTTGTGTCTCCTCTAAAGAT
27 ATGAATTATCAGAACGACGA
28 CGGGACAAGTTTAGTTTACCCGCGACGCGCTTTTA
제작된 pDZ-ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 벡터를 CM06-0002 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 gapA 프로모터를 포함하는 대장균 유래 피드백 해제 변이형 aroG 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 29과 서열번호 30의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0003로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
29 TTGATATGACCGCAGCCTGA
30 CTGCATTCTCATCGATCTTG
실시예 2: L-타이로신 생산 균주의 생산능 평가
상기 실시예 1에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 평가하였다. 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 24시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판의 생산량을 측정하였다.
< 종배지 (pH 7.0) >
포도당 20g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
< 생산배지 (pH 7.0) >
포도당 30g, (NH4)2SO4 15 g, MgSO4 7H2O 1.2 g, KH2PO4 1 g, 효모추출물 5 g, 바이오틴 900 ㎍, 티아민 염산염 4500 ㎍, 칼슘-판토텐산 4500 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
균주 번호 형질 사용한포도당(g/L) L-타이로신생산량(g/L) L-페닐알라닌생산량(g/L) L-트립토판생산량(g/L)
ATCC 13869 야생형 30 0.00 0.00 0.00
CM06-0001 ATCC 13869ΔaroP::Pn-tkt 30 0.00 0.00 0.00
CM06-0002 CM06-0001ΔtyrA::PgapA-tyrAm 30 0.00 0.00 0.00
CM06-0003 CM06-0002ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 30 0.38 1.11 0.02
야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869, CM06-0001, CM06-0002, CM06-0003에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 7과 같다.
야생형 균주에 방향족 아미노산 유입 유전자 결손, 전구체인 E4P 공급 강화 균주인 CM06-0001에서는 L-타이로신이 생산되지 않았고, 이 균주에 추가적으로 tyrA 피드백 제한을 해제한 CM06-0002 에서도 L-타이로신이 검출되지 않았다.
CM06-0002 균주에 추가적으로 aroG의 피드백 제한을 해제하여 방향족 공통 생산 경로를 강화한 CM06-0003 균주에서는 L-타이로신, L-페닐알라닌의 생산을 확인하였다. L-타이로신, L-페닐알라닌은 이전 균주에 비해 큰 폭으로 생산이 증가하였으나, L-트립토판은 크게 변화가 없었다.
실시예 3: L-타이로신 생산 균주의 pheA 유전자 결손
상기 실시예 2에서 방향족 공통 생산 경로를 강화하였을 때, L-페닐알라닌이 가장 많은 양이 생산되고 그 다음으로 L-타이로신이 생산되며, L-트립토판은 소량 생산됨을 확인하였다. 따라서 L-페닐알라닌 생산 경로를 결손하면 L-타이로신과 L-트립토판 생산이 증가할 것으로 예상할 수 있다.
L-페닐알라닌 생산 경로를 결손하기 위해 프레펜산(Prephenic acid)에서 분기되는 첫 번째 단계의 유전자인 pheA를 결손하였다. 이러한 유전자 결손을 위해 우선 pheA 유전자의 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 31과 서열번호 32의 프라이머를 이용하여 pheA 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 33과 서열번호 34의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 pheA 업스트림과 다운스트림 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔpheA 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 8에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
31 TTCGAGCTCGGTACCCCCGACCAGGCCACACGCG
32 AATAATCCGGCCGGCCATGGGGTTACACAGCTTAACCCGC
33 CGGGTTAAGCTGTGTAACCCCATGGCCGGCCGGATTATT
34 CGACTCTAGAGGATCCCCGCTGACAACAGCAACGTCG
제작된 pDZ-ΔpheA 벡터를 CM06-0003 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 pheA가 결손된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 결손된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 35과 서열번호 36의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0004로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
35 CCAGCGATGATCGCGCCG
36 ATCGCCGTGGAGCCAGCC
실시예 4: L-타이로신 생산 균주의 pheA 유전자 결손 균주의 생산능 평가
상기 실시예 3에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 실시예 2에서 서술한 방법 및 배지 조성을 이용하여 균주를 배양하였다.
균주 번호 형질 사용한포도당(g/L) L-타이로신생산량(g/L) L-페닐알라닌생산량(g/L) L-트립토판생산량(g/L)
CM06-0003 ΔaroP::Pn-tkt,ΔtyrA::PgapA-tyrAm,ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 30 0.39 1.10 0.02
CM06-0004 CM06-0003 ΔpheA 13 0.89 0.04 0.02
L-타이로신 생산균주 CM06-0003, CM06-0004에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 10과 같다. pheA를 결손한 CM06-0004 균주는 L-페닐알라닌의 생산이 크게 줄면서 L-타이로신이 주요 산물로 생산되었다. 실시예 2에서와 마찬가지로 L-트립토판 생산량은 크게 변함이 없었다.
그러나 CM06-0004 균주는 L-페닐알라닌을 생산하지 못하므로 배지의 효모추출물에 포함된 L-페닐알라닌에 의존하여야만 생장할 수 있고, 비결손주에 비해서 당소모를 1/3 수준 밖에 하지 못하였다. 즉, 미생물에서 pheA유전자를 결손하는 경우 균주의 생장에 큰 영향을 미치므로, 목적산물의 생산을 위한 목적으로 상기 균주를 활용할 수 없음을 확인하였다.
실시예 5: L-타이로신 생산 균주의 pheA 유전자 프로모터 교체 균주의 제작
상기 실시예 2와 4의 결과를 통해서 L-트립토판은 배양시에 항시 낮은 농도로 유지되면서도 균체의 성장에는 지장이 없도록 정교하게 조절 받는 것으로 예측할 수 있다. 공지된 문헌에서도 L-트립토판의 생산은 L-트립토판 농도에 따른 억제자와 촉진자의 동시 조절을 받는 것으로 알려져 있다 (Appl Environ Microbiol 59 791, 1993).
따라서, L-트립토판의 조절 기작을 L-페닐알라닌 생산 유전자 pheA 에 적용하여 L-트립토판 농도에 따라 pheA 유전자가 조절을 받도록 하였다.
이 때, 대조군으로써, pheA 를 L-트립토판 농도에 조절 받게 하는 trpE의 조절역역 외에도, L-아이소루신(Isoleucine)의 농도에 조절 받게 하는 ilvB의 프로모터, L-루신(Leucine)의 농도에 조절 받게 하는 leuA의 프로모터, leuC의 프로모터를 삽입한 균주도 함께 제작하여 비교하였다.
pheA의 유전자를 trpE의 조절영역에 조절 받도록 하기 위하여 삽입하려는 지역의 업스트림 (Upstream) 과 trpE의 조절영역과 삽입하려는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 37과 서열번호 38의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 39와 서열번호 40의 프라이머를 이용하여 trpE의 조절영역을, 서열번호 41과 서열번호 42의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 삽입하고자 하는 지역의 업스트림과 다운스트림 지역, trpE 조절영역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔPpheA::PtrpE 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
pheA의 유전자를 ilvB의 프로모터에 조절 받도록 하기 위하여 삽입하려는 지역의 업스트림 (Upstream) 과 ilvB의 프로모터 지역과 삽입하려는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 37과 서열번호 43의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 44와 서열번호 45의 프라이머를 이용하여 ilvB의 프로모터 지역을, 서열번호 46과 서열번호 42의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 삽입하고자 하는 지역의 업스트림과 다운스트림 지역, ilvB 프로모터 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔPpheA::PilvB 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
pheA의 유전자를 leuA의 프로모터에 조절 받도록 하기 위하여 삽입하려는 지역의 업스트림 (Upstream) 과 leuA의 프로모터 지역과 삽입하려는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 37과 서열번호 47의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 48과 서열번호 49의 프라이머를 이용하여 leuA의 프로모터 지역을, 서열번호 50과 서열번호 42의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 삽입하고자 하는 지역의 업스트림과 다운스트림 지역, leuA 프로모터 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔPpheA::PleuA 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
pheA의 유전자를 leuC의 프로모터에 조절 받도록 하기 위하여 삽입하려는 지역의 업스트림 (Upstream) 과 leuC의 프로모터 지역과 삽입하려는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 37과 서열번호 51의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 52와 서열번호 53의 프라이머를 이용하여 leuC의 프로모터 지역을, 서열번호 54와 서열번호 42의 프라이머를 이용하여 삽입하고자 하는 지역의 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 삽입하고자 하는 지역의 업스트림과 다운스트림 지역, leuC 프로모터 지역, SmaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔPpheA::PleuC 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
제작된 pDZ-ΔPpheA::PtrpE, pDZ-ΔPpheA::PilvB, pDZ-ΔPpheA::PleuA, pDZ-ΔPpheA::PleuC 벡터를 CM06-0003 균주에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 pheA의 유전자가 trpE 조절영역, ilvB, leuA 또는 leuC의 프로모터로 조절 받도록 만든 균주를 얻었다. 해당 조절영역 또는 프로모터가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 55와 서열번호 56의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다. pheA의 유전자 앞에 trpE의 조절영역을 삽입한 균주는 CM06-0005으로, ilvB의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0006으로, leuA의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0007으로, leuC의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0008으로 명명하였다.
상기 각각의 벡터를 제작하기 위해 사용한 프라이머 서열은 하기 표 11에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'-3')
37 TTCGAGCTCGGTACCCGGAGGGGTTTCCACCTCG
38 TGGGAAGCTTGTCTCAATTATGTCTGTTGCTCAATTAGCG
39 CTAATTGAGCAACAGACATAATTGAGACAAGCTTCCCA
40 AATTGGTGCGTCGCTCATGGGGCACCTACCGAGGAA
41 TTCCTCGGTAGGTGCCCCATGAGCGACGCACCAATTGTTG
42 CGACTCTAGAGGATCCCCCCGAAGAGTTCGGCTGCG
43 CAGCGCTAATCTTGGCTCTGTCTGTTGCTCAATTAGCG
44 CTAATTGAGCAACAGACAGAGCCAAGATTAGCGCTGAA
45 AATTGGTGCGTCGCTCATCCGCTCAGGGGCGGCGG
46 TCCGCCGCCCCTGAGCGGATGAGCGACGCACCAATTGTTG
47 GGGGGGAACTTTGGAGTTTGTCTGTTGCTCAATTAGCG
48 CTAATTGAGCAACAGACAAACTCCAAAGTTCCCCCCC
49 AATTGGTGCGTCGCTCATTGTGTTCAACCTTCTTAAAAAG
50 TTAAGAAGGTTGAACACAATGAGCGACGCACCAATTGTTG
51 AAATGTAAGATTCAAAGATGTCTGTTGCTCAATTAGCG
52 CTAATTGAGCAACAGACATCTTTGAATCTTACATTTCATAG
53 AATTGGTGCGTCGCTCATGGAACTCACCGTCCTTAC
54 GTAAGGACGGTGAGTTCCATGAGCGACGCACCAATTGTTG
55 CCAGCGATGATCGCGCCG
56 ATCGCCGTGGAGCCAGCC
실시예 6: L-타이로신 생산 균주의 pheA 유전자 프로모터 교체 균주의 생산능 평가
상기 실시예 5에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 실시예 2에서 서술한 방법 및 배지 조성을 이용하여 균주를 배양하였다.
균주 번호 형질 사용한포도당(g/L) L-타이로신생산량(g/L) L-타이로신수율(%) L-페닐알라닌생산량(g/L) L-트립토판생산량(g/L)
CM06-0003 ΔaroP::Pn-tkt,ΔtyrA::PgapA-tyrAm,ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 30 0.42 1.40 1.34 0.02
CM06-0004 CM06-0003 ΔpheA 13 0.66 5.08 0.04 0.02
CM06-0005 CM06-0003 ΔPpheA::PtrpE 30 1.61 5.37 0.03 0.02
CM06-0006 CM06-0003 ΔPpheA::PilvB 30 0.35 1.16 1.51 0.02
CM06-0007 CM06-0003 ΔPpheA::PleuA 30 0.41 1.37 1.36 0.02
CM06-0008 CM06-0003 ΔPpheA::PleuC 30 0.48 1.61 0.89 0.02
L-타이로신 생산균주인 CM06-0003, CM06-0004, CM06-0005, CM06-0006, CM06-0007, CM06-0008에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 12와 같다.
pheA를 결손한 CM06-0004 균주의 경우 L-타이로신을 5.08 % 수율로 생산하였다. 따라서 L-페닐알라닌 경로를 L-트립토판 농도에 조절 받도록 한 CM06-0005 균주의 경우 L-페닐알라닌을 소량 생산하면서 L-타이로신을 생산하기 때문에 L-페닐알라닌 경로를 자연 그대로 둔 CM06-0003 균주보다는 높은 수율을 기대할 수 있지만, L-페닐알라닌 경로를 결손한 CM06-0004 균주보다는 낮은 수율을 예상할 수 있다. 그러나 예상과는 다르게 CM06-0005 균주는 CM06-0004 균주보다 생산능이 향상되어 5.37 % 수율로 L-타이로신을 생산하였다. CM06-0005의 L-타이로신 생산량은 모균주인 CM06-0003대비 283%증가하고, CM06-0004 대비 144%향상되었다.
상기 결과로부터 pheA를 L-트립토판 농도에 따라 조절 받도록 할 경우 L-타이로신 생산이 예상치 못한 수준으로 대폭 증가함을 확인할 수 있다. 또한, L-트립토판 조절 기작을 pheA에 도입하는 것과 유사한 대조군으로써, pheA를 L-아이소루신 농도에 조절 받도록 한 CM06-0006 균주나 L-루신 농도에 조절 받도록 한 CM06-0007, CM06-0008 균주에 비해서도 월등함을 확인하였다. 따라서, L-트립토판 조절 기작을 pheA에 도입하는 것이 pheA를 결손하거나 다른 조절 기작을 도입하는 것에 비해 L-타이로신 생산에 시너지 효과가 크다는 것을 확인하였다.
실시예 7: non-PTS 의 L-타이로신 생산 균주의 pheA 유전자 결손 및 프로모터 교체 균주의 제작
L-타이로신의 생산은 PEP와 E4P를 전구 물질로 시작되기 때문에 non-PTS (Phosphotransferase system)를 사용 할 경우 PEP 공급을 보다 원할하게 하여 높은 생산을 기대할 수 있다 (Nature biotechnol 14 620, 1996). 따라서, 균주의 PTS 유전자인 ptsG를 제거하고 non-PTS 유전자인 Zymomonas mobilis ATCC 10988 유래의 glf를 도입하였다.
ptsG를 결손하며 glf를 삽입하기 위해 우선 Zymomonas mobilis 유래 glf 유전자를 삽입할 업스트림 (Upstream) 과 다운스트림 (Downsteam) 지역을 수득하였다. 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 57과 서열번호 58의 프라이머를 이용하여 ptsG 업스트림 (Upstream) 지역을, 서열번호 59와 서열번호 60의 프라이머를 이용하여 다운스트림 (Downsteam) 지역의 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
또한, 기공지된 cj7 프로모터 (서열번호 61, 특허등록 제10-0620092호)를 포함한 glf 유전자를 확보하기 위해서 합성 cj7 프로모터 DNA를 주형으로 하여 서열번호 62와 서열번호 63의 프라이머를 이용하여 cj7 프로모터 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였고, Zymomonas mobilis ATCC10988 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 64와 서열번호 65의 프라이머를 이용하여 glf 유전자 단편을 PCR 수행을 통해 수득하였다. 중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
증폭된 ptsG 업스트림과 다운스트림 유전자 단편, cj7 프로모터를 포함하는 glf 유전자 단편, 그리고 ScaI 제한효소로 절단된 염색체 형질전환용 벡터 pDZ 는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 클로닝함으로써 재조합 플라스미드를 획득하였으며, pDZ-ΔptsG::pcj7-glf 로 명명하였다. 클로닝은 깁슨 어셈블리 시약과 각 유전자 단편들을 계산된 몰수로 혼합 후 50℃에 1시간 보존함으로써 수행하였다.
본 실시예에서 사용한 프라이머의 서열은 표 13에 나타낸 바와 같다.
서열번호 서열(5'->3')
57 TTCGAGCTCGGTACCCGAGGGCTCACTGACGTTGA
58 CGCTGGGATGTTTCTACCGGATTCGATTCCTCAG
59 CGCTCCCAGAAGTAGGCTCAAACCTTGCCCATAAC
60 CTCTAGAGGATCCCCCTCCCCCAAACCACGCTTTT
62 GGAATCGAATCCGGTAGAAACATCCCAGCGCTACT
63 TACTTTCAGAACTCATGAGTGTTTCCTTTCGTTGG
64 ACGAAAGGAAACACTCATGAGTTCTGAAAGTAGTC
65 GGGCAAGGTTTGAGCCTACTTCTGGGAGCGCCACA
제작된 pDZ-ΔptsG::pcj7-glf 벡터를 CM06-0003 균주에 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 cj7 프로모터를 포함하는 Zymomonas mobilis 유래 glf 유전자가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 66과 서열번호 67의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0009로 명명하였다.
서열번호 서열(5'-3')
66 ACATTAAGTGGTAGGCGCTGA
67 CATAACAGGGCAGAACAAAC
위에서 제작한 CM06-0009 균주에 실시예 3에서 제작한 pDZ-ΔpheA 벡터를 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 pheA 유전자가 결손된 균주를 얻었다. 해당 유전자가 결손된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 35와 서열번호 36의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였으며, CM06-0011로 명명하였다
위에서 제작한 CM06-0009 균주에 실시예 5에서 제작한 pDZ-ΔPpheA::PtrpE, pDZ-ΔPpheA::PilvB, pDZ-ΔPpheA::PleuA, pDZ-ΔPpheA::PleuC 벡터를 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 pheA의 유전자 앞에 각각의 조절영역 또는 프로모터가 삽입된 균주를 얻었다. 해당 조절영역 또는 프로모터가 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 55와 서열번호 56의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다. pheA의 유전자 앞에 trpE의 조절영역을 삽입한 균주는 CM06-0010으로, ilvB의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0012로, leuA의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0013으로, leuC의 프로모터를 삽입한 균주는 CM06-0014로 명명하였다.
실시예 8: non-PTS 의 L-타이로신 생산 균주의 pheA 유전자 결손 및 프로모터 교체 균주의 생산능 평가
상기 실시예 7에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 실시예 2에서 서술한 방법 및 배지 조성을 이용하여 균주를 배양하였다.
균주 번호 형질 사용한포도당(g/L) L-타이로신생산량(g/L) L-타이로신수율(%) L-페닐알라닌생산량(g/L) L-트립토판생산량(g/L)
CM06-0003 ΔaroP::Pn-tkt,ΔtyrA::PgapA-tyrAm,ΔBBD29_14470::PgapA-aroGm 30 0.42 1.40 1.34 0.02
CM06-0009 CM06-0003 ΔptsG::pcj7-glf 30 1.46 4.86 1.67 0.03
CM06-0011 CM06-0009 ΔpheA 19 1.11 5.85 0.03 0.02
CM06-0010 CM06-0009 ΔPpheA::PtrpE 30 2.12 7.06 0.04 0.03
CM06-0012 CM06-0009 ΔPpheA::PilvB 30 1.21 4.04 2.38 0.03
CM06-0013 CM06-0009 ΔPpheA::PleuA 30 1.40 4.68 1.70 0.03
CM06-0014 CM06-0009 ΔPpheA::PleuC 30 1.68 5.60 1.11 0.03
L-타이로신 생산균주인 CM06-0003, CM06-0009, CM06-0011, CM06-0010, CM06-0012, CM06-0013, CM06-0014에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 15와 같다.
예상했던대로 PTS 균주인 CM06-0003에 비해서 PEP 공급을 원활히 할 수 있는 non-PTS 균주인 CM06-0009에서 L-타이로신 및 L-페닐알라닌 생산이 증가함을 확인하였다. 마찬가지로 이 경우에도 L-트립토판 생산 증가는 크지 않았다.
non-PTS 균주를 기반으로 pheA를 결손한 CM06-0011 균주의 경우 L-타이로신을 5.85 % 수율로 생산하여 모균주대비 증가하였으나, L-타이로신 최종 생산량이 모균주대비 적고, 또 당소모 속도가 현저히 낮아 생산성이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 실시예 6에서와 마찬가지로 CM06-0010 균주는 이보다 낮은 수율로 L-타이로신을 생산할 것으로 예상할 수 있다. 그러나 실제로는 CM06-0011 균주의 수율보다 무려 20.7 % 향상된 7.06 % 수율로 L-타이로신을 생산하였다. CM06-0010 균주의 L-타이로신 생산량은 모균주인 CM06-0009대비 45% 증가하였으며, CM06-0011 대비 91%나 증가하였다. 또한, pheA를 L-아이소루신 농도에 조절 받도록 한 CM06-0012 균주나 L-루신 농도에 조절 받도록 한 CM06-0013, CM06-0014 균주에 비해서도 월등함을 확인함으로써 L-트립토판 조절 기작을 pheA에 도입하는 것이 pheA를 결손하거나 다른 조절 기작을 도입하는 것에 비해 L-타이로신 생산에 시너지 효과가 크다는 것을 확인하였다.
실시예 9. L-tyrosine 유사체에 대해 내성을 갖는 미생물의 스크리닝
본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869를 모균주로 하여 L-타이로신에 의한 피드백 억제를 해제하기 위하여 인공변이법을 이용하여 L-타이로신 유사체인 L-tyrosine hydroxamate에 대한 내성을 갖는 균주를 선별하는 실험을 실시하였다.
구체적으로는, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: 이하, NTG)을 사용한 인공변이법으로 변이를 유도하였다. ATCC 13869 균주를 종배지에서 18시간 동안 배양하여 종배지 4 ml에 접종한 후, OD660이 약 1.0이 될 때까지 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후, 50 mM Tris-malate 완충용액(pH6.5)으로 2회 세척하여 최종 4 ml의 동일한 완충용액으로 현탁하였다. 균체 현탁액에 최종농도 150 mg/l이 되도록 NTG 용액 (2 mg/ml in 0.05M Tris-malate 완충용액(pH6.5))을 첨가하여 실온에서 20분 간 정치한 후, 원심분리를 통해 균체를 수거하였으며, NTG 제거를 위하여 동일한 완충용액으로 2회 세척하였다. 최종적으로 세척한 균체를 20% 글리세롤 용액 4 ml에 현탁 한 후, 사용 전까지 -70℃에 보관하였다. NTG 처리 균주를 0.5 g/l의 L-tyrosine hydroxamate를 포함하는 최소배지에 도말하였으며, 상기 과정을 통하여, L-tyrosine hydroxamate에 내성을 갖는 100주의 균주를 획득하였다.
실시예 10. L-tyrosine hydroxamate에 내성을 갖는 균주의 L-타이로신 생산능 평가
실시예 9에서 획득한 100주의 L-tyrosine hydroxamate 내성 균주에 대하여 L-타이로신 생산능을 확인하였다. 종배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 실시예 9에서 획득한 100주의 균주를 접종한 후, 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용하여 생산된 아미노산의 생산량을 측정하였다. 실험한 100주의 균주 중 L-타이로신 생산능이 우수한 것으로 나타난 상위 10주에 대한 아미노산의 배양액 내 농도를 [표 16]에 나타내었다. 상기 과정을 통하여 확인된 10주의 후보를 각각 ATCC 13869 YAR-1 내지 ATCC 13869 YAR-10으로 명명하였다
그 중, L-타이로신 생산능이 가장 우수한 ATCC 13869 YAR-6 및 ATCC 13869 YAR-8 균주를 선별하였다.
균주 번호 사용한포도당 (g/L) L-타이로신생산량 (g/L) L-페닐알라닌생산량 (g/L) L-트립토판생산량 (g/L)
ATCC 13869 30 0.00 0.00 0.00
ATCC 13869 YAR-1 30 0.40 0.30 0.01
ATCC 13869 YAR-2 30 0.56 0.31 0.01
ATCC 13869 YAR-3 30 0.77 0.48 0.02
ATCC 13869 YAR-4 30 0.57 0.58 0.01
ATCC 13869 YAR-5 30 0.64 0.48 0.01
ATCC 13869 YAR-6 30 0.86 0.56 0.02
ATCC 13869 YAR-7 30 0.80 0.42 0.02
ATCC 13869 YAR-8 30 0.88 0.54 0.02
ATCC 13869 YAR-9 30 0.40 0.25 0.01
ATCC 13869 YAR-10 30 0.63 0.38 0.01
실시예 11. L-tyrosine hydroxamate에 내성을 갖는 균주의 pheA 유전자 프로모터 교체
실시예 10에서 선별한 ATCC 13869 YAR-6, YAR-8 균주의 pheA 유전자를 trp 오페론의 조절영역에 조절 받도록 하였다. 이를 위해, 실시예 5에서 제작한 pDZ-ΔPpheA::PtrpE 를 ATCC 13869 YAR-6, YAR-8 균주에 각각 전기천공법으로 형질 전환 후, 2차 교차 과정을 거쳐 pheA의 유전자가 trpE의 조절영역으로 조절 받도록 만든 균주를 얻었다. 상기 조절영역이 삽입된 상동재조합 업스트림 지역과 다운스트림 지역의 외부 부위를 각각 증폭할 수 있는 서열번호 55와 서열번호 56의 프라이머를 이용한 PCR 법과 게놈 시퀀싱을 통해 해당 유전적 조작을 확인하였다. pheA의 유전자 앞에 trpE의 조절영역을 삽입한 ATCC 13869 YAR-6, YAR-8균주는 각각 YAR-6P, YAR-8P로 명명하였다
실시예 12. L-tyrosine hydroxamate 내성 ATCC 13869 균주의 pheA 유전자 프로모터 교체 균주의 생산능 평가
실시예 11에서 제작한 균주의 L-타이로신 생산능을 확인하고자 실시예 2에서 서술한 방법 및 배지 조성을 이용하여 균주를 배양하였다.
균주 번호 사용한포도당(g/L) L-타이로신생산량(g/L) L-타이로신수율(%) L-페닐알라닌생산량(g/L) L-트립토판생산량(g/L)
ATCC 13869 30 0.00 0.00 0.00 0.00
ATCC 13869 YAR-6 30 0.82 2.73 0.55 0.02
ATCC 13869 YAR-6P 30 1.50 5.00 0.04 0.02
ATCC 13869 YAR-8 30 0.86 2.87 0.51 0.02
ATCC 13869 YAR-8P 30 1.52 5.07 0.03 0.02
L-tyrosine hydroxamate 내성 ATCC 13869 균주 및 pheA 유전자 프로모터 교체 균주에 대한 배양물 중의 L-타이로신, L-페닐알라닌, L-트립토판 생산에 대한 결과는 상기 표 17과 같다.
실시예 6, 8에서와 같이 pheA 유전자를 trpE 조절영역에 조절받게 할 경우 L-페닐알라닌 생산 감소 및 L-타이로신 생산 증가를 기대할 수 있다. 실제 실험 결과에서, ATCC 13869 YAR-6P 및 ATCC 13869 YAR-8P 균주는 부산물인 L-페닐알라닌 생산이 현저히 감소하였으며, 이의 감소분 보다 높은 수준의 목적산물인 L-타이로신 생산량 증가를 확인하였다. 이를 통해 L-트립토판 조절 기작을 pheA에 도입하는 경우, 당소모 속도 저하없이 L-타이로신의 생산량이 예측하지 못한 수준으로 현저히 증가할 수 있으며, trp 오페론의 조절영역 및 pheA 유전자의 조합이 L-타이로신 생산에 시너지 효과가 크다는 것을 확인하였다.
상기 결과들로부터 pheA를 L-트립토판 농도에 따라 조절 받도록 할 경우 L-타이로신 생산이 예상치 못한 수준으로 대폭 증가함을 확인할 수 있었다. 구체적인 예를 들어, L-타이로신 생산능이 증가되도록 변형된 균주뿐 아니라, 무작위 돌연변이 균주에서도 L-타이로신 생산이 예상치 못한 수준으로 대폭 증가함을 확인할 수 있었다.
상기 균주, CM06-0010은 2019년 4월 15일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM 12487P로 기탁번호를 부여 받았다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure WO-DOC-PAGE-31

Claims (9)

  1. trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는, L-타이로신을 생산하는 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 trp 오페론 조절영역은 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자의 업스트림(Upstream)에 위치하는 것인, L-타이로신을 생산하는 미생물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 프리페네이트 디하이드라타제를 코딩하는 유전자는pheA 유전자인, L-타이로신을 생산하는 미생물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 trp 오페론 조절영역은 trp 레귤레이터, trp 프로모터, trp 오퍼레이터, trp 리더펩타이드 및 trp 감쇠인자로 구성되는 군으로부터 선택되는, L-타이로신을 생산하는 미생물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 trp 오페론의 조절영역은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, L-타이로신을 생산하는 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 배양된 미생물 또는 배지로부터 L-타이로신을 회수하는 단계를 포함하는 것인, L-타이로신의 생산방법.
  7. trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현카세트.
  8. trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 발현 카세트, 이를 포함하는 미생물 또는 이들의 조합을 포함하는, L-타이로신 생산용 조성물.
  9. trp 오페론 조절영역 및 이와 작동가능하게 연결된 프리페네이트 디하이드라타제(Prephenate dehydratase)를 코딩하는 유전자를 이용하여, 프리페네이트 디하이드라타제의 활성을 조절하는 방법.
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