KR20010042974A - 방향족 대사/ⅲ로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법 - Google Patents

방향족 대사/ⅲ로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방향족 대사, 특히 방향족 아미노산 대사에서 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법 및 유전자 구조물 및 형질전환된 세포에 관한 것으로서,
본 발명에 따르면, 물질 생성의 증가, 특히 방향족 아미노산의 증가는 글루코스 탈수소효소의 활성을 도입 또는 증가시킴에 의해서 관찰되고, 글루코스-산화효소의 활성을 증가시킴에 의해서 글루코스-함유 기질에서 글루코노락톤 및 글루콘산의 세포내 형성을 유도하며, 바람직한 구체예에서, 글루코스 탈수소효소가 바실러스 메가테리움에서 유도되며, 본 발명에 따른 방법은 물질의 더 넓은 스펙트럼을 제공하는데 사용되는 것을 특징으로 한다.

Description

방향족 대사/Ⅲ로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법{MICROBIAL PREPARATION OF SUBSTANCES FROM AROMATIC METABOLISM/Ⅲ}
본 발명은 청구항 1 내지 19 및 29에 따른 방향족 화합물의 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법, 청구항 20 내지 22에 따른 유전자 구조물과, 청구항 23 내지 28에 따른 형질전환된 세포에 관한 것이다.
방향족 화합물 대사로부터 미생물에 의해 제조된 물질, 특히 방향족 아미노산은 예를들면 아미노산에 대한 요구가 계속 증가되고 있기때문에 경제적으로 매우 흥미로운 것이다.
이와같이, 예를들면 L-페닐알라닌은 약제를 제조하는데 사용되고, 특히 감미료 아스파탐(α-L-아스파틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르)의 제조에 사용된다. L-트립토판은 사료용 약제 및 첨가제로서 요구되고; 마찬가지로 L-티로신은 제약산업에서 약제 또는 원료로서 요구된다. 천연물질에서 분리되는 것 뿐만아니라, 경제적으로 유익한 조건하에서 소망하는 광학적 활성형태로 아미노산을 수득하는 생물공학적 제조방법은 매우 유용하다. 생물공학적 제조방법은 효소적으로 또는 미생물을 사용하여 실시된다.
후자인 미생물을 사용하는 제조방법은 간단하고, 경제적인 원료가 사용된다는 잇점이 있다. 그러나 아미노산의 생합성은 세포내에서 매우 다양한 방법으로 조절되기때문에, 생성물의 형성을 증가시키기위해서 이미 많은 다른 시도가 있었다. 그러므로 예를들면 아미노산 유사물은 생합성 조절을 차단시키는데 사용된다. 예를들면 페닐알라닌 유사물에 대한 저항성을 선택함에 의해서, 대장균(Escherichia coli)의 변이체가 수득되고, L-페닐알라닌의 제조를 증가시킬 수 있다(GB-2,053,906). 유사한 방법으로 코리네박테리움(Corynebacterium, JP-19037/1976 및 JP-39517/1978) 및 바실러스(Bacillus, EP-0,138,526) 균주의 과잉생산을 유도한다.
또한, 재조합 DNA 기술에 의해서 제조되는 미생물은 마찬가지로 생합성 조절이 더이상 피드백 억제되지 않는 중요한 효소를 코딩하는 유전자의 발현 및 클로닝에 의해서 파괴되는 것이 공지되어 있다. 예로서, EP-0,077,196에서는 피드백 억제되지 않는 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제(DAHP synthase)가 대장균에서 과잉발현되어 방향족 아미노산을 제조하는 방법이 기술되어 있다. EP-0,145,156에서는 L-페닐알라닌을 제조하기위해서 코리스메이트 뮤타제/프리페네이트 탈수효소가 추가적으로 과잉발현되는 대장균 균주를 기술하고 있다.
언급된 방법은 대개 제조를 향상시키기위한 조정은 방향족 아미노산에 대해 특이적인 생합성 경로에 한정되는 것을 특징으로 한다. 그러나 추가적으로 생산을 증가시키기위해서, 1차 대사물, 포스포에놀피루베이트(PEP) 및 에리트로스-4-포스페이트(Ery4P)의 공급을 향상시키기위한 노력이 요구되며, 방향족 아미노산을 제조하는 것이 요구된다.
PEP는 해당 생성물인 피루베이트의 활성 전구체(피루브산)이고; Ery4P는 펜토스 포스페이트 경로의 중간체이다.
생산성을 증가시키기위한 많은 다른 시도가 아미노산의 세포내 합성에 한정되는 것을 극복하는 것에 관심이 있다. 방향족 아미노산의 제조에 있어서, 1차 대사물인 포스포에놀피루베이트(PEP) 및 Ery4P가 축합반응하여 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트(DAHP)를 형성한다.
Ery4P의 이용성을 증가시키기위한 몇가지 방법이 문헌에 기술되어 있으며, 예를들면 L-트립토판, L-티로신 또는 L-페닐알라닌 생성물의 형성을 향상시키도록 Ery4P공급의 증가는 트란스케톨라제의 과잉발현에 의해서 가능해진다(EP 특허출원 제0 600 463; Frost ＆ Draths, Ann. Rev. Microbiol. 49(1995) 557-579). 대장균의 PTS-음성 변이체의 자연적인 글루코스-양성 복귀 변이체는 GalP 시스템에 의해서 세포로 글루코스를 흐르게하여, 글루코스상에서 성장할 수 있다는 것이 최근 주장되었다(Flores et al., Nature Biotechnology 14(1996) 620-623). 트란스케톨라제 유전자 tktA의 추가적인 발현은 관찰되는 중간체 DAHP의 형성을 증가시킨다(Flores et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623).
참고번호 독일 제196 44 566.3호 및 독일 196 44 567.1호의 두개의 독일특허 출원은 아직 공고되진 않았지만, 상기 출원인들은 예를들면 대장균에서 트란스알돌라제 또는 트란스알돌라제 및 트란스케톨라제의 효소 활성을 증가시킴에 의해서 또는 대장균에서 글루코키나제와 대장균에서 당에 있어서 PEP-비의존성 전달 시스템의 활성을 증가시킴에 의해서 또는 인용된 효소와 전달 시스템을 조합시킴에 의해서 페닐알라닌의 양을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 방향족 화합물 대사에서 미생물을 이용하여 물질을 합성시키는 추가적인 공정을 이용할 수 있다.
방향족 화합물 대사에서 물질의 형성을 증가시키는 미생물이 제조될 수 있다.
놀랍게도, 본 목적은 글루코스 또는 글루코스-함유 물질이 글루코스-산화 효소의 활성을 증가시킴에 의해서 방향족 화합물 대사에서 미생물이 물질을 생성하도록 형질전환됨에 의해서 이루어질 수 있다. 이와같이, 선택적인 대사경로가 제공된다. 상기 경로는 유리 글루코스를 글루코노락톤/글루코네이트로 산화시키고, 글루코네이트를 인산화함에 의해서 6-포스포글루코네이트를 형성하는 것으로 이루어진다.
상기의 결과는 글루코스-산화 효소의 활성을 간단히 증가시킴에 의해서 방향족 화합물 대사에서 물질을 생성하는데 중요한 역할을 하기때문에 매우 놀라운 것이다.
본 발명에서, 방향족 화합물의 대사에서 나온 물질은 그의 생화학적 합성이 Ery4P 또는 Ery4P와 PEP의 공급을 증가시키는 모든 화합물을 의미한다. 예를들면 방향족 아미노산, 인디고, 인돌아세트산, 아디프산, 멜라닌, 시킴산, 코리슴산, 퀴논 및 벤조산 및 그의 가능한 유도체 및 2차 생성물이다.
상기에서, 본 발명에 따른 조절 뿐만아니라 물질을 생성하는 미생물에 대한 유전적인 선택성은 인디고, 아디프산 및 다른 비천연의 2차 생성물을 제조하는데 요구된다(Frost ＆ Draths, Ann. Rev. Microbiol. 49(1995) 557-579).
방향족 화합물 대사에서 나온 물질을 생성하는 미생물은 글루코스 또는 글루코스-함유 물질, 예를들면 글루코스-함유 디사카라이드 또는 올리고사카라이드를 다양한 방법으로 대사시킬 수 있다: 이와같이 글루코스가 ATP-의존성 키나제(헥소키나제 및 글루코키나제)에 의해서 인산화되어, 해당화시킨다. 또한, 많은 박테리아가 글루코스를 얻고, 이를 인산화시키기위해 PEP-의존성 시스템을 이용할 수 있다.
글루코스가 다양한 용해성 또는 막-결합 효소(글루코노락톤에 의해서 글루콘산으로)에 의해서 산화될 수 있다. 상기 효소는 글루코스 산화효소 또는 글루코스 탈수소효소를 포함한다. 글루코스 산화효소는 분자성 산소를 환원시킴에 의해서 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시킨다. 또한 글루코스 탈수소효소가 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시키는 한편, 이들은 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)과 같은 다른 전자 수용체 또는 니코틴 아데닌 디누클레오티드(NAD) 또는 NADP와 같은 다른 보조인자를 사용한다. 막-결합 글루코스 탈수소효소는 보조인자인 피롤로퀴놀론 퀴논(PQQ)를 사용하여 글루코스를 산화시키고, 상기 반응은 막의 외부측에서 일어난다고 알려져 있다. 생성물(글루코노락톤 또는 글루콘산)을 세포로 모이도록하기위해서, 특정의 운반시스템이 요구되고, 이는 van Schie 등의, Journal of Bacteriology 163(1985) 493-499; Isturiz 등의 Journal of General Microbiology 132(1986) 3209-3219; Izu 등의 Journal of Molecular Biology 267(1997) 778-793에 나타나 있고, 글루코스의 존재에 의해서 나타내는 그의 발현은 대체로(예를들면 대장균) Izu 등의 Journal of Molecular Biology 267(1997) 778-793 및 Conway. FEMS Microbiology Reviews 103 (1992) 1-27에 기술되어 있다.
보조인자 NAD 또는 NADP를 사용하는 글루코스 탈수소효소는 세포내에서 발견되는 가용성 효소이다. 공지된 제조자는 바실러스 균주, 글루코스 탈수소효소의 몇가지 이소효소 몇가지를 포함한다(예를들면 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)의 경우에 글루코스 탈수소효소 I 내지 IV; Mitamura 등의 1990, Journal of Fermentation and Bioengineering 70, 363-369). 글루코스 탈수소효소의 발현은 엄격하게 조절되고, 예를들면 바실러스종에 의해서 내생포자를 형성하는 동안 선포자 단계에서만 발생한다고 알려져 있다; 글루코스상에서 성장과 함께 글루코스 탈수소효소의 생리학적 역할은 Lampel 등의 Journal of Bacteriology 166(1986) 238-243 및 최근에 Steinmetz 또는 Fortnagel("바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)와 다른 그람-양성 박테리아"(Sonenshein, Hoch and Losick, eds), M.Steinmetz pp. 157-170과 P.Fortnagel pp. 171-180; ISBN 1-55581-053-5; ASM Press, Washington, D.C.1993)에 기술되어 있다.
NAD(P)-의존성 글루코스 탈수소효소가 특히 대장균, 코리네박테리아(Corynebacteria) 또는 브레비박테리아(Brevibacteria)에는 기술되어 있지 않다. 글루코스 탈수소효소에 대해서 바실러스 균주-유도된 유전자는 대장균으로 클로닝되고, 상기 박테리아에서 발현된다(Hilt등의 Biochimica et Biophysica Acta 1076 (1991) 298-304). 특히 본 발명의 목적은 재조합 글루코스 탈수소효소를 수득하는 것이며, 글루코스 또는 보조인자를 재생하기위한 검출시스템으로 사용될 수 있다(Hilt등의 Biochimica et Biophysica Acta 1076(1991) 298-304; DE 특허출원 제3 711 881호). 반대로, 상기 유전자는 방향족 화합물 대사에서 물질을 수득하기위한 기질로서 글루코스를 사용하는 방법이 기술되어 있지 않다.
본 발명에 따르면, 글루코스 탈수소효소의 활성을 도입 및 증가시킴에 의해서 물질이 형성되는 것을 발견하였다. 글루코스-산화효소의 활성을 증가시킴에 의해서 글루코스-함유 기질에서 글루코노락톤 및 글루콘산의 세포내 형성을 유도한다. 바람직한 실시예에서, 글루코스 탈수소효소는 바실러스 메가테리움, 특히 바실러스 메가테리움 글루코스 탈수소효소 IV에서 유도되며, Mitamura 등의 Journal of Fermentation and Bioengineering 70(1990) 363-369 및 Nagao 등의 Journal of Bacteriology 15(1992) 5013-5020에 기술되어 있다.
글루콘산은 그의 활성에 있어서 글루콘산-인산화효소에 의존한다. 예를들면 상기 효소는 글루콘산에 특이성을 갖는 포스포에놀-피루베이트-의존성 효소 II 또는 글루콘산에 특이성을 갖는 ATP-의존성 키나제일 수 있다고 알려져 있다. 예를들면 Izu등의 FEBS Letters 394(1996) 14-16; Izu 등의 Journal of Molecular Biology 267(1997) 778-793, 및 Tong등의 Journal of Bacteriology 178(1996) 3260-3269에 기술되어 있는 대장균 ATP-의존성 글루코네이트 키나제 GntK가 알려져 있다.
대장균에서, 생성물인 6-포스포글루코네이트는 펜토스 인산경로 및 엔트너-도우데로프(Entner-Douderoff) 경로의 산화의 중간물이고, 이는 Fraenkel, pp 189-198의 "Escherichia coli and Salmonella". 2판(Neidhardt et al., Eds.), ASM Press, Washington, USA, ISBN-1-55581-084-5, 1996에 기술되어 있다.
물질의 생성은 글루콘산 (글루코네이트)-인산화 효소의 활성을 추가적으로 증가시킴에 의해서 향상될 수 있다. 글루콘산-인산화효소가 사용되는 경우, 예를들면 다양한 미생물에서 글루콘산-인산화효소가 적당하며, 이는 방향족 화합물의 대사에서 생성된 물질이 미생물에서 기능적으로 발현할 수 있어야 한다. ATP-의존성 글루코네이트 키나제, 바람직하게는 대장균 글루코네이트 키나제, 특히 대장균 K-12에서 글루코네이트 키나제(GntK)를 사용하다. 그의 유전자 생성물 인산화 글루콘산에 있어서 글루콘산-인산화 효소에 대한 다른 유전자가 본 발명에 따른 방법에 적당하다. 다른 엔테로박테리아, 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 바실러스 서브틸리스 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이 실시예에 언급되어 있다.
글루코네이트 키나제의 효과가 글루콘산/글루코네이트를 활성화시키는데 한정되지만, 그러나 예를들면 글루코스의 존재하에서 대장균 또는 다른 박테리아에 의해서 대사되지는 않는다. 예를들면 대장균에서, 글루코네이트 키나제 GntK는 생물체가 글루콘산에서 성장하는 경우에 중요하며, 글루코스의 대사에 기여하지는 않으며; 실제로 그의 형성은 글루코스의 존재에서 실제로 억제되며, Izu 등의 Journal of Molecular Biology 267(1997) 778-793 과 Tong 등의 Journal of Bacteriology 178(1996)3260-3269에 기술되어 있으며, 글루코스의 존재하에서 일어나지 않는다.
그러므로 상기 특정의 구체예에서, 글루콘산-인산화효소, 특히 글루코네이트 키나제, 특히 모든 대장균 글루코네이트 키나제 및 특히 대장균 K-12에서 글루코네이트 키나제 GntK의 활성을 증가시켜서, 세포외의 글루코네이트가 없거나 또는 글루코스의 존재에서 미생물에서 이용할 수 있도록 글루콘산-인산화 효소인 효소를 제공한다. 본 발명에 따른 대사경로에 의해서 물질의 흐름을 증가시키는 잇점이 있다. 상기는 글루코스의 존재에서도 증가되도록 글루콘산을 6-포스포글루코네이트로 전환시킬 수 있다. 상기는 6-포스포글루코네이트의 세포내 비율을 증가시켜서, 공지된 대사서열에 의해서 상기 물질로 전환될 수 있다.
글루코노락톤은 글루코스-산화효소의 반응 생성물이다. 글루코노락톤은 글루콘산으로 자발적으로 전환될 수 있고, 효소는 상기 전환을 가속화시킨다고 기술되어 있다(지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 글루코노락토나제, 예를들면 Kanagasundaram and Scopes, Biochimica et Biophysica Acta 1171(1992) 198-200에 기술됨). 그러므로 다른 구체예에서, 글루코노락토나제에 대한 유전자(예를들면 지모모나스 모빌리스)가 발현되고, 추가적으로 글루코스-산화효소 또는 글루코스-산화효소 및 글루콘산-인산화효소가 발현되어 글루코노락톤을 글루콘산(또는 6-P-글루코네이트, 각각)으로의 전환을 촉진시킨다.
글루코스 탈수소효소 및 글루코네이트 키나제에 대한 유전자가 몇가지의 바실러스종에서 자연적으로 발생할 수 있다고 알려져 있다; 그러나 상기 효소에 대한 유전자가 다른 오페론으로 배열되고, 글루코스를 대사하는데 함께 사용되지는 않으며, 이는 Steinmetz 또는 Fortnagel("바실러스 서브틸리스 및 다른 그람-양성 박테리아"(Sonenshein, Hoch and Losick, Eds), Steinmetz pp. 157-170 및 Fortnagel pp.171-180; ISBN 1-55581-053-5; ASM Press, Washington, D.C., 1993)에 기술되어 있다. 또한 포자형성 조건하에서 글루코스 탈수소효소의 특이적인 유도때문에, 상기 두개의 효소는 물질의 형성에 함께 기여할 것으로 기대되진 않는다.
결과적으로, 본 발명에서 상기 기술되는 글루코스 또는 글루코스-함유 기질에서 성장과 조합하여 방향족 화합물의 대사에서 물질을 생성하기위해서 글루코스-산화효소 또는 글루코스-산화효소 및 글루콘산-인산화 효소의 각각의 증가된 활성의 효과는 완전히 기대할 수 없다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 당의 PEP-비의존성 흡수에 대한 운반 단백질의 활성이 증가되고, 또한 글루코스-산화효소 또는 글루코스-산화효소 및 글루콘산-인산화효소가 증가된다.
또한 상기 구체예는 PEP-의존성 운반 시스템에 의해서 당을 흡수할 수 있는 방향족 화합물의 대사에서 나오는 물질을 생성하는 미생물에서 글루코스-함유 물질 또는 글루코스의 PEP-비의존성 흡수를 위한 운반 단백질의 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 상기 PEP-비의존성 운반 시스템의 추가적인 통합은 상기 물질을 생성하는 미생물에서 당의 공급을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 당은 글루코노락톤으로 세포내 글루코스-산화효소에 의해서 전환되어, 연속적으로 글루콘산이 된다. 그리고 글루콘산은 글루콘산-인산화효소에 대한 물질이다. 대개 PEP는 상기 반응에 있어서 에너지 주개로서 요구되지 않으며, 그러므로 해당작용에서 물질의 일정한 흐름에 근거하여 이용할 수 있고, 펜토스 인산 경로, 다량의 Ery4P의 축합물에 대해서 이용할 수 있으며, 방향족 화합물의 일반적인 생합성 경로의 1차 대사물질인, 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트(DAHP)를 형성하고, 방향족 화합물 대사에서 물질을 생성할 수 있다.
운반 단백질의 경우에, 활성은 단백질-매개 흡수율을 의미한다.
글루코스 또는 글루코스-함유 기질의 PEP-비의존성 흡수를 위한 운반 단백질에 있어서, 단백질-매개를 이용한 분산의 원리에 따라 작용하는 운반 단백질인 운반 단백질, 특히 촉진자를 사용하는 것이 유익하다. 지모모나스 모빌리스에서 글루코스 촉진자 단백질(Glf)의 사용이 특히 적당하다. 후자를 사용하는 경우에, 단백질을 코딩하는 유전자로 예를들면 glf가 지. 모빌리스에서 유도되고, 특히 촉진자 유전자 glf가 지. 모빌리스 ATCC 31821에서 분리되며, Parker 등의(1995) Molecular Microbiology 15(1995) 795-802 및 Weisser등의(1995) Journal of Bacteriology 177(1995) 3351-3354에 기술되어 있다. 그러나, 다른 박테리아에서 유도된 당 운반 유전자, 그의 유전자 생성물은 글리코스를 운반하며, 이때 특정의 PEP를 사용하지 않으며, 예를들면 대장균 GalP 시스템은 본 발명에 따른 방법에서 적당하다. 또한, 진핵 미생물인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서 유도되는 당 운반 시스템으로, 가령 HXT1 내지 HXT7 또는 미생물에서 기능적으로 발현할 수 있는 다른 미생물에서 유도되는 당 운반 유전자를 사용할 수 있으며, 동시에, 상기 유전자 생성물은 글루코스를 인산화 및/또는 운반하는데 PEP 없이 작동할 수 있다. 특히, 당운반 유전자가 아미노산 생산자에서 발현될 수 있는 것이 유익하다.
본 발명의 의미안에서, 활성을 증가시키는 방법은 글루코스-산화 효소의 활성 또는 글루코스-산화효소의 활성을 증가 및 또한, 글루콘산 인산화 효소, 글루코노락토나제 및 당의 PEP-비의존성 흡수를 위한 운반 단백질에서 적어도 하나의 활성을 증가시킬 수 있는 적당한 모든 방법을 의미한다. 하기는 상기 목적에 특히 적당하다:
-예를들면 벡터 또는 용원 파아지를 사용하여 유전자를 도입하고;
-예를들면 플라스미드를 사용하여 본 발명에 따른 유전자를 증가된 카피수로, 약간(예를들면 2 내지 5배)에서 크게 증대된 카피수(예를들면 15 내지 50배)로 미생물로 도입시키기위해서 유전자 카피수를 증가시키고;
-예를들면 Ptac, Ptet 또는 다른 조절 누클레오티드 서열과 같은 촉진인자를 사용함에 의해서 예를들면 전사율을 증가시킴에 의하거나 및/또는 예를들면 컨센서스 리보솜 결합자리를 사용함에 의해서 해독율을 증가시킴에 의해서 유전자 발현을 증가시키며;
-예를들면 종래의 방법에 따라 방향성이 없는 방법으로 생성되는, 예를들면 UV조사 또는 돌연변이-생성 화학약품에 의한 돌연변이화에 의해서, 또는 결실, 삽입 및/또는 누클레오티드 교환과 같은 재조합 DNA 기술에 의해서 특이적으로 발생되는 돌연변이화에 의해서 존재하는 효소의 내인성 활성을 증가시키며;
-예를들면 물리적, 화학적, 분자 생물학적 또는 다른 미생물학적 방법을 사용하여 돌연변이화 시킴에 의해서 효소의 구조를 변경하여 효소의 활성을 증가시키며;
-예를들면 더이상 피드백-억제가 일어나지 않는 효소인 조절이 해제된 효소를 사용하고;
-조절이 해제된 효소를 코딩하는 상응하는 유전자를 도입한다.
또한 활성을 증가시키기위해서 인용된 방법 및 다른 유사한 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 운반 단백질의 경우에, 예를들면 내인성 활성이 상기의 방법을 사용하여 유전자를 클로닝함에 의해서 또는 기질 운반의 증가를 나타내는 변이체를 선택함에 의해서 증가시킬 수 있다.
바람직하게, 활성에 있어서의 증가는 유전자 또는 유전자 구조물 또는 몇개의 유전자 구조물로 통합된 유전자에 의해서 실시되며, 유전자 또는 유전자들은 단일 카피 또는 증가된 카피수로 유전자 구조물로 도입된다.
본 발명의 의미안에서, 유전자 구조물은 유전자 또는 본 발명에 따른 유전자를 운반하는 특정의 누클레오티드 서열인 것으로 이해된다. 예를들면 적당한 누클레오티드 서열은 플라스미드, 벡터, 크로모좀, 파아지 또는 원형 방법으로 닫히지 않는 다른 누클레오티드 서열일 수 있다.
방향족 아미노산 대사의 제1 중간물을 제조하는데 PEP의 이용성은 Ery4P로 물질이 흐르는 것이 증가된 미생물에 한정되는 것이다. 상기 경우에, 대사에서 다른 PEP-소비 반응, 존재한다면 가령 PEP:당 포스포트란스퍼라제 시스템(PTS)의 반응을 감소 또는 차단에 유익하며, PEP-의존성 당 흡수율을 활성화시킨다.
본 발명에 따르면, PTS 활성의 천연적인 수준을 나타내는 생물체를 사용하고; 그러나 상기 방법을 추가적으로 향상시키기위한 방법으로, PTS의 활성이 감소되어진 PTS 변이체를 사용한다. 상기 성질의 감소는 효소의 수준에서 또는 유전자 방법에 의해서 실시될 수 있으며, 예를들면 pts 유전자를 발현시키는 선택적으로 강한 억제 촉진인자를 사용하거나, 또는 크로모좀으로 glf 유전자를 삽입함에 의하며, 동시에 크로모좀에서 재조합 DNA의 안정화(분리 안정성)를 포함하며, 결과적으로 벡터를 사용하지 않는다. 또한, 조절 촉진인자와의 결합에서, PTS의 활성은 배양하는 동안 상대 촉진인자의 유발인자 또는 억제인자를 첨가함에 의해서 영향을 줄 수 있다.
방향족 대사에서 물질을 제조하는 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 물질의 합성에서 추가적으로 포함되는 하나 이상의 효소가 조절이 해제되거나 및/또는 그들의 활성이 증가된 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.
특히 상기 효소는 방향족 아미노산 대사 및 특히 DAHP 신타아제, 시키메이트 키나제 및 코리스메이트 뮤타제/프리페네이트 탈수소효소 및 또한 모든 다른 효소, 특히 트란스알돌라제, 트란스케톨라제 및 글루코키나제의 효소이고, 방향족 화합물 대사에서 물질의 합성이 포함된다.
본 발명에 따른 효소와는 달리, 특히 아디프산, 빌산 및 퀴논 화합물과 그들의 유도체와 같은 물질의 제조에 중요한 DAHP 신타아제를 조절 해제 및 과잉발현시킨다. 또한, 시키메이트 키나제는 조절이 해제되어야 하고, 예를들면 L-트립토판, L-티로신, 인디고 및 히드록시- 및 아미노벤조산의 유도체 및 나프토- 및 안트라퀴논 및 그들의 2차 생성물의 과잉 합성되도록 그의 활성을 증가시킨다. 조절이 해제되고 및 과잉 발현된 코리스메이트 뮤타제/프리페네이트 탈수소효소는 페닐알라닌 및 페닐피루브산 및 그의 유도체를 효과적으로 제조하는데 특히 중요하다. 그러나 상기는 Ery4P 또는 Ery4P 및 PEP의 공급에 의해서 생성이 촉진되는 물질의 생화학적 합성에 기여되는 모든 다른 효소를 포함하는 것이다.
본 발명의 조정과는 달리, 추가적으로 미생물에 대한 추가적인 유전적 선택예가 인디고, 아디프산 및 다른 비천연의 제2 생성물을 제조하기위해서 요구된다. 상기 방법은 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다(Frost ＆ Draths, Ann. Rev. Microbiol. 49 (1995) 557-579).
본 발명에 따른 방법은 방향족 아미노산, 특히 L-페닐알라닌을 제조하는데 적당하다. L-페닐알라닌의 경우에, 조절이 해제된 DAHP 신타제(예를들면 대장균 AroF 또는 AroH) 및/또는 마찬가지로 조절이 해제된 코리스메이트 뮤타제/프리페네이트 탈수소효소(PheA)의 유전자 발현 및/또는 효소 활성을 증가시킨다.
적당한 제조 생물체는 대장균 및 세라티아속(Serratia), 바실러스, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 및 종래의 아미노산방법에서 공지되어 있는 다른 균주가 있다. 또한, 박테리아는 노카디아세애(Nocardiaceae) 및 악티노마이세탈(Actinomycetales)에서 유도된다. 대장균이 특히 적당하다.
본 발명은 또한 상기 유전자 구조물을 운반하고, 특히 성공적으로 본 발명을 수행할 수 있는 적당한 유전자 구조물 및 형질전환된 세포의 공급에 관한 것이다.
본 발명의 문맥안에서, 새로운 유전자 구조물이 사용될 수 있으며, 재조합 형태의 유전자 구조물은 글루콘산-인산화 효소를 코딩하는 유전자와 함께 또는 (b)당의 PEP-비의존성 흡수에 대한 운반 단백질을 코딩하는 유전자와 함께, 또는 (c)글루콘산-인산화 효소, 글루코노락토나제를 코딩하는 유전자 또는 당의 PEP-비의존성 흡수에 대한 운반 단백질을 코딩하는 세개의 유전자 중 적어도 두개를 함께 각각 포함되는 것이 사용된다.
특히, 글루코스-산화 효소의 유전자는 글루코스 탈수소효소를 코딩하고, 글루콘산-인산화 효소의 유전자는 글루코네이트 키나제를 코딩한다.
글루코스 탈수소효소에 대한 유전자가 바람직하게 바실러스 메가테리움에서 유도되고, 글루코네이트 키나제에 대한 유전자는 바람직하게 대장균에서 유도되고, 글루코노락토나제에 대한 유전자 및 운반 단백질은 바람직하게 지모모나스 모빌리스에서 유도되는 것이 바람직하다. 글루코스 탈수소효소에 대한 유전자는 바실러스 메가테리움에서 글루코스 탈수소효소 IV(gdhIV)이고, 글루코네이트 키나제에 대한 gntK 유전자는 대장균에서 유도되는 GntK 이고, 운반 단백질 및 글루코노락토나제에 대한 유전자는 지모모나스 모빌리스에서 유도되는 glf 및 gnl이고, 특히 유익하다. 상대 유전자의 분리 및 세포의 형질전환은 현 방법에 따라서 실시되며; 예를들면 대장균 글루코네이트 키나제 유전자 gntK를, 바실러스 메가테리움 글루코스 탈수소효소 IV(gdh IV) 유전자, 또는 지모모나스 모빌리스 글루코노락토나제(gnl) 유전자 또는 운반 유전자(glf)를 클로닝하는 경우에, 유전자를 특이적으로 증폭시키기위해서 폴리머라아제 사슬 반응(PCR) 방법이 대장균 K-12(gntK), 바실러스 메가테리움(gdhIV) 및 지모모나스 모빌리스 균주 ATCC 29191 또는 ATCC 31821(gnl, glf)에서 각각 유도된 크로모좀 DNA를 사용하는 것이 적당하다.
DNA를 증폭시키고 및 이를 실험관내에서 공지된 벡터(pGEM7, pUCBM20, pUC19 또는 다른 것)로 재조합시킨 후에, 숙주세포가 화학적방법, 전기영동, 형질도입 또는 접합에 의해서 형질전환된다.
3개의 공여자 생물체에서 gntK, gdhIV, gnl 및 glf 유전자의 완전한 누클레오티드 서열은 공지되어 있고, 하이델베르그의 접수번호 D 84362(gntK), D 10626(gdhIV), X 67189(gnl) 및 M 60615(glf)로 EMBL/HUSAR과 같은 데이타베이스에 기탁된 것으로부터 수득할 수 있다. 대장균 K-12 균주로부터 크로모좀 DNA를 사용한 유전자 및 Izu등의 Journal of Molecular Biology 267(1997) 778-793 및 Tong등의 Journal of Bacteriology 178(1996) 3260-3269에 기술된 유전자 서열을 특이적으로 증폭시키기위한 PCR은 대장균 gntK 유전자를 클로닝하는데 적당하다. 예를들면 바실러스 메가테리움에서 유도된 크로모좀 DNA는 바실러스 메가테리움 gdhIV 유전자를 클로닝하는데 적당하다(Nagao 등의 Journal of Bacteriology 174(1992) 5013-5020).
분리된 글루코스 탈수소효소 IV 유전자가 본 발명에서 기술된 하나 이상의 유전자와 함께 특정의 조합으로 유전자 구조물 또는 몇개의 유전자 구조물로 통합될 수 있다. 유전자 구조물로 정확하게 분배되었는지를 고려하지 않고, 상기는 gdhIV + gntK, gdhIV + glf, gdhIV + gntK + glf; gdhIV + gntK + gnl; gdhIV + gnl + glf; gdhIV + gntK + gnl + glf와 같은 조합을 이룬다. 상기에 언급된 유전자 구조물 뿐만아니라, 특정의 유전자 구조물은 추가적으로 트란스케톨라제, 트란스알돌라제, 글루코키나제, DAHP-신타제, 코리스메이트/뮤타제/프리페네이트 탈수소효소, 코리스메이트 뮤타제/프리페네이트 탈수소효소를 코딩하거나 또는 방향족 화합물 대사에서 물질의 합성에 긍정적인 영향을 주는 다른 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 것을 의미한다.
유전자를 분배하는 경우에, glf는 바람직하게 유전자 구조물 또는 유전자 구조물들로 낮은 카피수(X)(가령 X=1 내지 10)로 도입되어 막 단백질을 과잉발현시키는 가능한 나쁜 결과를 피해야 한다.
유전자 중 하나로 확인될 수 있는 적어도 하나의 조절 유전자 서열을 포함하는 유전자 구조물이 유익하다.
이와같이, 조절인자는 바람직하게 전사단계에서 강화될 수 있고, 특히 전사신호를 강하게 할 수 있다. 예를들면 상기는 구조 유전자의 업스트림에 위치한 촉진인자 서열을 변경함에 의해서 촉진인자 또는 촉진인자들의 활성을 증가시키거나 또는 많은 활성 촉진인자로 촉진인자를 완전히 대체시킴에 의해서 실시될 수 있다. 또한 전사는 유전자로 확인되는 조절 유전자을 적당하게 영향을 줌에 의해서 강화될 수 있으며; 그러나 또한 전사 RNA(mRNA)의 안정성을 향상시킴에 의해서 전사를 강화할 수 있다.
또한, 본 발명의 구성안에서, 복제가능한 형태로 본 발명에 따른 유전자 구조물을 포함하는 형질전환된 세포가 또한 이용할 수 있다. 본 발명의 의미안에서, 형질전환 세포는 방향족 화합물 대사에서 물질의 세포내에서 형성을 증가시킬 수 있는 본 발명에 따른 유전자 구조물을 운반하는 특정의 미생물로서 이해된다. 상기 숙주세포가 화학적인 방법(Hanahan J. Mol. Biol. 166(1983)557-580) 및 또한 전기영동, 접합 또는 형질도입에 의해서 형질전환될 수 있다.
형질전환에 있어서, 물질의 합성에서 추가적으로 포함되는 하나 이상의 효소가 조절이 해제되고 및/또는 그들의 증가된 활성을 갖는 숙주세포를 사용하는 것이 유익하다. 방향족 화합물 대사에서 방향족 아미노산 또는 다른 물질을 생성하는 본 발명에 따른 미생물 균주, 특히 대장균이 상대 유전자를 포함하는 유전자 구조물로 형질전환된다.
유전자 구조물로 형질전환에 있어서, 또한 존재한다면 PEP-의존성 당 흡수 시스템은 그의 활성이 감소되거나 또는 차단된 숙주세포를 사용하는 것이 유익하다.
특히, 형질전환된 세포가 방향족 아미노산을 제조할 수 있는 것이 사용되고, 방향족 아미노산은 L-페닐알라닌이 바람직하다.
방향족 대사에 있어서 미생물로 물질을 제조하는 방법이 결론적으로 사용될 수 있으며, 상기에 기술된 것과 같은 유전자 구조물을 갖는 상기에 기술된 형질전환된 세포를 사용한다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 구체예에서, Ery4P 이외의 증가된 이용성으로 중심 대사의 다른 대사물질을 포함하는 형질전환된 세포를 사용할 수 있다. 상기 대사물질의 예로는 세포내 합성방법에서 기인되는 α-옥소글루타레이트 또는 옥살로아세테이트이고, 또는 시트르산 사이클의 대사물질로서 상응하는 화합물, 또는 그들의 전구체로 가령 푸마레이트 또는 말레이트에서 공급함에 의해서 세포를 성장시킨다.
대장균 균주 AT2471/pGEM7gntkgdhIV가 부다페스트 조약에 의거하여 1998년 4월 15일에 기탁번호 DSM 12118로 DSMZ(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 기탁되었다.
사용된 숙주 생물체로, 예를들면 AT2471이 Taylor 및 Trotter(Bacteriol. Rev. 13(1967) 332-53)에 의해서 CGSC에 제4510호로 기탁되었으며, 지불없이 얻을 수 있다.
하기에서 사용된 물질 및 방법이 기술될 것이며, 본 발명은 실험 실시예 및 비교 실시예에 의해서 지지될 것이다:
일반적인 방법
유전자 연구에서, 대장균 균주는 언급하지 않는 한 Difco Bacto 트립톤(10g·ℓ-1), Difco 효모 추출물(5g·ℓ-1) 및 NaCl(10g·ℓ-1)로 이루어진 LB 배지에서 배양되었다. 사용되는 균주의 내성에 따라서, 암피실린(100㎎·ℓ-1) 및 클로람페니콜(17-34㎎·ℓ-1)이 필요하다면 배지로 첨가된다. 상기에서, 암피실린은 이미 물에 용해되었고, 클로람페니콜은 이미 에탄올에 용해되었으며, 그리고 여과에 의해서 멸균되어진 후에 이미 오토클레이브된 배지로 첨가된다. Difco Bacto 아가(1.5%)가 아가 플레이트를 제조하기위해서 LB 배지로 첨가된다.
대장균에서 플라스미드 DNA가 상업적으로 이용가능한 시스템(Qiagen, Hilden)을 사용하여 알카리 분해에 의해서 분리된다. 크로모좀 DNA가 Chen 및 Kuo(Nucl. Acid Res. 21(1993) 2260)의 방법을 사용하여 대장균 및 바실러스 메가테리움 DSM 319에서 분리된다. 제한 효소, Taq DNA 중합효소, DNA 중합효소 I, 알카리 인산화효소, RNase 및 T4 DNA 리가제가 제조자의 지시에 따라서 사용된다(Boehringer, Mannheim, Germany or Promega, Heidelberg, Germany). 제한 분석에 있어서, DNA 절편이 아가로스 겔(0.8%)에서 분획화되고, 상업적으로 이용하는 시스템(QuiaExII, Hilden, Germany)을 사용하는 추출에 의해서 아가로스에서 분리된다.
형질전환되기 전에, 상기 세포가 LB 배지에서 2.5-3시간동안 200rpm 및 37℃에서 배양된다(5㎖ 튜브). 대략 0.4의 광학밀도(620nm)에서, 세포가 원심분리되고, TSS(10%(w/v) PEG 8000, 5% (v/v) DMSO 및 50mM MgCl2을 함유하는 LB배지)의 부피의 1/10이 얻어진다. 4℃에서 30분동안 0.1 내지 100ng의 DNA를 배양하고, 연속적으로 1시간동안 37℃에서 배양시킨후에, 상기 세포가 적당한 항생제를 함유하는 LB 배지에 도말된다.
실시예 1
본 발명에 따른 플라스미드-계 유전자 구조물의 모델로서 pGEM7gntKgdhIV의 제조
글루코스 탈수소효소 IV를 코딩하는 바실러스 메가테리움 DSM 319 gdhIV 유전자가 클론되어 Nagao등의 Journal Bacteriology 15(1992) 5013-5020에 기술되어 있는 유전자의 공지된 서열에 근거하여 중합효소 사슬반응(PCR)에 의해서 바실러스 메가테리움 DSM 319의 크로모좀 DNA을 특이적으로 증폭된다. PCR 올리고누클레오티드 프라이머가 제한효소 BamHI(5' 말단) 및 SacI(3' 말단)에 대한 분해자리로 제공된다. 프라이머 1(BamHI)은 5' ATG GAT CCA TGA AAA CAC TAG GAG GAT TTT 3'로 이루어진다. 프라이머 2(SacI)는 5' GCC AGA GCT CTT TTT TCC ACA TCG ATT AAA AAC TAT 3'로 이루어지며, gdhIV 유전자의 3' 말단에 상보적이다. 대략 800염기쌍의 생성된 DNA 증폭 생성물이 BamHI + SacI으로 제한되고, 벡터 pGEM7에 연결되어 같은 방법으로 처리된다(표 1 참조) 형질전환이 X-Gal 및 암피실린을 포함하는 LB 아가 플레이트에 대한 선택성으로 JM109DE3 균주로 실시된다. 클론된 gdhIV 유전자의 DNA 서열을 측정함에 의해서 클로닝이 성공적인지 검사한다. 상기 벡터(pGEM7gdhIV)는 T7 중합효소 시스템(균주 JM109DE3) 없이도 발현되는 글루코스 탈수소효소 IV를 활성화 시킨다. 대장균 K-12 글루코네이트 키나제에 대한 gntK 유전자가 크로모줌 주형으로 대장균 K-12 W3110을 사용하여 특이적으로 DNA를 증폭시킴에 의해서 클로닝된다. gntK 유전자의 서열이 Tong등의 Journal of Bacteriology 178 (1966) 3260-3269에 기술되어 있다. PCR에 의한 증폭에 있어서, 올리고누클레오티드 프라이머가 EcoRI(5') 및 BamHI(3')에 대한 제한분해자리로 추가적으로 제공되는 것이 선택된다. 프라이머 1은 5' CCG AAT TCT TGT ATT GTG GGG GCA C 3'로 이루어지고, gntK 유전자의 5' 업스트림에 결합되고; 프라이머 2는 5' CCG GAT CCG TTA ATG TAG TCA CTA CTT A 3'로 이루어지고, gntK 유전자의 3' 말단에 대해 상보적이다. 대략 600염기쌍의 증폭 생성물이 정제되고, EcoRI + BamHI로 절단되어, 벡터 pGEM7로 결찰되며, 이는 또한 오픈된다. 형질전환이 X-Gal 및 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트에 대해 선택성을 갖는 JM109DE3 균주에서 실시된다. 클론된 gntK 유전자의 DNA 서열을 측정함에 의해서 클로닝이 성공적인지 검사한다. 상기 벡터(pGEM7gntK)가 T7 중합효소 시스템(JM109DE3) 없이도 발현되는 글루코네이트 키나제가 활성화된다(표 2 참조).
상기 gntK 및 gdhIV 유전자가 BamHI + SacI로 이중으로 절단시킴으로서 벡터 pGEM7gntK를 개환시킴에 의해서 조합된다. 벡터 pGEM7gdhIV로 제한시킨 후에 수득되어지고, gdhIV 유전자를 포함하는 800염기쌍 절편이 상기 방법으로 개환되어진 상기 벡터로 결찰된다. 형질전환이 암피실린에 대한 선택성으로 다시 실시된다. 본 발명에 따른 새로운 유전자 구조물 pGEM7gntKgdhIV가 글루코스 탈수소효소 IV 및 글루코네이트 키나제 GntK에 대한 효소 활성의 T7 중합효소-비의존성 발현을 매개한다(표 2 참조).
수득되어진 형질전환체가 -80℃에서 글리세롤 배양액(30%)의 형태로 LB 배지에서 저장된다. 필요한 경우, 글리세롤 배양액이 사용전에 직접 해동된다.
실시예 2
글루코스 탈수소효소 및 글루코네이트 키나제의 효소 활성의 측정
미정제의 박테리아 추출물에서 효소 활성을 측정하기위해서, 대장균 세포 및 플라스미드를 갖는 변이체의 세포가 미네랄 배지에서 배양된다. 상기 배지는 시트르산나트륨·3H2O(1.0g·ℓ-1), MgSO4·7H2O(0.3g·ℓ-1), KH2PO4(3.0g·ℓ-1), K2HPO4(12.0g·ℓ-1), NaCl(0.1g·ℓ-1), (NH4)2SO4(5.0g·ℓ-1), CaCl2·2H2O(15.0㎎·ℓ-1), FeSO4·7H2O(0.075g·ℓ-1) 및 L-티로신(0.04g·ℓ-1)로 이루어진다. 또한 미네랄이 Al2(SO4)3·18H2O(2.0g·ℓ-1), CoSO4·6H2O(0.7g·ℓ-1), CuSO4·5H2O(2.5g·ℓ-1), H3BO3(0.5㎎·ℓ-1), MnCl2·4H2O(20.0g·ℓ-1), Na2MoO4·2H2O(3.0g·ℓ-1), NiSO4·3H2O(2.0g·ℓ-1) 및 ZnSO4·7H2O(15.0g·ℓ-1)로 이루어진 미량원소용액(1㎖·ℓ-1)의 형태로 첨가된다. 비타민 B1(5.0㎎·ℓ-1)이 물에 용해되고, 여과에 의해서 멸균된 후에 오토클레이브된 배지로 첨가되고, 필요한 경우 암피실린 및/또는 암피실린 및 클로람페니콜이 첨가된다. 글루코스(30g·ℓ-1)가 각각 오토클레이브되고, 마찬가지로 오토클레이브된 배지로 첨가된다.
수득된 세포가 100mM 트리스/HCl 완충액(pH 8.0)에서 세척된다. 상기 침전된 세포가 세포 현탁액의 ㎖당 4분동안 40와트 세기의 25%의 초음파 사이클로 초음파에 의해서 분해되다(마이크로팁을 갖춘 Branson sonifier 250). 18,000g 및 4℃에서 30분동안 원심분리한 후에, 상청액(미정제의 추출물)이 글루코스 탈수소효소 및/또는 글루코네이트 키나제의 활성을 측정하는데 사용된다.
글루코스 탈수소효소의 활성이 Harwood ＆ Cutting, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley ＆ Sons에 따라 측정된다. 글루코스 탈수소효소가 글루코스를 글루코노락톤으로의 산화를 활성화한다. 효소의 활성이 감소된 보조인자 NADH + H+의 농도에서 증가에 의해서 340nm의 파장에서 광학적으로 측정된다. 상기 측정은 1㎖의 전체 부피를 갖는 석영 큐벳에서 실시된다. 상기 반응 혼합물은 트리스 HCl(최종농도 250mM, pH 8.0), 2.5mM EDTA 나트륨, 100mM KCl 및 2mM NAD로 이루어진다. 미정제의 추출물이 완충액내 5분동안 25℃에서 예비배양된다. 글루코스(최종농도, 100mM)가 검출반응을 개시하기위해서 첨가된다. 흡광도에 있어서의 증가가 340nm에서 모니터된다. 글루코스를 포함하지 않는 혼합물이 각 경우에 대조군으로 제공된다. 특정의 글루코스 탈수소효소 활성은 U/㎎으로 표시되며, 분당 및 단백질의 ㎎당 NADH 1μmol의 형성으로 정의되며, 분당 및 단백질의 ㎎당 글루코스의 1μmol의 전환에 상응하도록 설정된다.
글루코네이트 키나제가 Izu등의 FEBS Letters 394 (1996) 14-16에서 기술된 것과 같은 미정제의 추출물에서 측정된다.
글루코네이트 키나제는 글루코네이트를 6-포스포글루코네이트로 ATP-의존성 인산화를 활성화시킨다. 효소 시험에서, 형성된 6-포스포글루코네이트가 NADP-의존성 보조효소 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 사용하는 경우 NADPH 농도를 증가시킴에 의해서 340nm의 파장에서 광학적으로 측정된다(Boehringer Mannheim, No. 108 405). 상기에서, NADPH 1μmol의 형성은 글루코네이트 1μmol의 인산화에 상응하는 것이다. 상기 효소의 검출은 1㎖의 전체부피를 갖는 석영 큐벳 25℃에서 실시된다. 반응 혼합물은 50mM 트리스 HCl, pH 8.0, 100mM ATP, 0.25mM NADP, 보조효소 6-포스포글루코네이트 탈수소효소의 1.2단위 및 미정제의 추출물 다양한 양을 포함한다. 상기 혼합물은 5분동안 25℃에서 예비배양되고, 반응은 글루콘산(pH 6.8; 혼합물내 최종 농도, 10mM)을 첨가함에 의해서 개시된다. 글루콘산이 첨가되지 않은 혼합물은 대조군으로 사용된다.
미정제 추출물내 단백질 농도가 상업적으로 입수할 수 있는 유색 시약을 사용함에 의해서 Bradford M.M.에 따라 측정된다(Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254). 소의 혈청이 표준으로 사용된다.
표 2는 숙주균주 대장균 W3110 및 플라스미드 pGEM7gdhIV, pGEM7gntK 또는 pGEM7gntKgdhIV를 갖는 그의 변이체를 사용하는 경우 효소 측정의 결과를 보여준다. 본 발명에 따른 유전자 구조물이 사용되는 경우, 본 발명에 따른 세포에서 기능적인 방법으로 효소를 발현시킬 수 있다는 것을 알았다.
실시예 3
증가된 글루코스 탈수소효소 활성을 나타내는 균주를 사용한 물질의 제조
대장균 AT2471 및 대장균 AT2471/pGEM7ghdIV의 합성 효율성이 실시예 2에 기술된 미네랄 배지에서 측정되었다. 상기에 있어서, 플라스크를 진탕시키면서(100㎖의 배지를 함유하는 1000㎖) 글리세롤 배양액의 2㎖를 접종하고, 72시간동안 150rpm 및 37℃의 오비탈 진탕기에서 배양한다. 배양액의 pH가 대략 12시간 간격으로 측정되고, 필요하다면 KOH(45%)를 첨가함에 의해서 7.2의 개시값으로 저장한다. 또한 시료는 글루코스와 L-페닐알라닌의 광학밀도 및 농도를 측정하기위해서 24시간 및 48시간후에 취한다.
페닐알라닌의 농도는 형광(흡광 335nm, 방출 570nm)에 의해서 검출되는 것과 조합하여 고압액체 크로마토그래피(HPLC, Hewlett Packard, Munich, Germany)에 의해서 조사하고, 누클레오실-120-8 C18 컬럼(250·4.6mm)이 고체상으로 사용되며; 구배(용리액 A: 90% 50mM 인산, 10% 메탄올, pH 2.5; 용리액 B: 20% 50mM 인산, 80% 메탄올, pH 2.5; 구배: 0-8분, 100% A, 8-13분, 0% A, 13-19분, 100%A)를 사용하여 용리가 실시된다. 상기 용리율은 1.0㎖·분-1및 40℃의 컬럼 온도에서 설정된다. 후-컬럼 유도화가 실내온도에서 반응 모세관(14m·0.35㎜)내 o-프탈디알데히드를 사용하여 실시된다. 기술된 조건하에서, L-페닐알라닌이 6.7분의 유지시간을 갖는 것을 발견하였다.
효소적 시험 스트립을 사용하여 글루코스 농도를 측정함에 의해서(Diabur, Boehringer Mannheim, Germany) 및 농축된 글루코스용액 2㎖로 측정된 결과, 글루코스는 실험적 혼합물에서 한정되지 않는 것이 확인되었다.
플라스미드 pGEM7gdhIV를 간단히 도입하고, 48시간의 배양후 페닐알라닌 농도를 기술하는 지수값은 145로 숙주균주 대장균 AT2471에 대한 100의 지수값(페닐알라닌)과 비교된다. 상기 결과는 연속적으로 제조되는 미생물에서 글루코스 탈수소효소의 활성을 증가시키는 본 발명에 따른 방향족 화합물 합성-증가 효과를 입증하였다.
실시예 4
글루코스 탈수소효소의 활성이 증가될 뿐만아니라 PEP-비의존성 당 흡수 시스템이 발현되는 균주를 사용한 물질의 제조
지모모나스 모빌리스 glf 유전자가 주형으로서 플라스미드 pZY600을 사용하여 증폭된다(Weisser등의 J.Bacteriol 177 (1995) 3351-3345). 동시에, 프라이머의 선택으로 BamHI 분해자리 및 KpnI 분해자리가 도입된다. 상기의 유일한 분해자리를 사용하여, 벡터 pUCBM20(Boehringer Mannheim)으로 유전자가 삽입되어 BamHI 및 KpnI으로 오픈된다. 1.5kb 크기의 DNA 절편이 BamHI 및 HindIII로 잘라 상기 벡터(pBM20glf)에서 분리되고, 벡터 플라스미드 pZY507로 결찰되고(Weisser등의, J. Bacteriol 177(1995) 3351-3345), 제한효소 BamHI 및 HindIII로 오픈된다. 상기 재조합 플라스미드 pZY507glf가 대장균을 형질전환하고, 형질전환체를 클로닝함에 의해서 수득된다. 상기 벡터는 클로람페니콜에 대한 내성을 갖고, lacIq-tac 촉진인자 시스템을 포함하며, 낮은 카피수를 갖는다.
벡터 pZY507glf가 실시예 1에서 기술된 것과 같이 수득된 본 발명의 유전자 구조물과 함께 숙주 AT2471 균주로 형질전환된다.
실시예 3에서 기술된 실험 조건에 의해서, 변이체 대장균 AT2471glf, 대장균 AT2471glf/pGEM7, 대장균 AT2471glf/pGEM7gntK 및 대장균 AT2471glf/pGEM7gntKgdhIV가 각 경우에 두개의 평행한 혼합물에서 배양된다. 48시간후에, 배지내 L-페닐알라닌의 농도가 측정된다.
100의 지수값에 상응하는 L-페닐알라닌 농도가 되도록 개시 균주 대장균 AT2471glf와 비교하기위해서, 벡터 pGEM7의 존재는 96의 지수값이고, 결론적으로 실제로 동일한 농도가 얻어진다. 반면에, 대장균 AT247glf/pGEM7gntK의 사용은 이전에 공지되어 있는 균주와 비교하여 179의 지수값에 해당하는 L-페닐알라닌 농도가 얻어진다. 대장균 AT2471glf/pGEMgntKgdhIV에서 선택적인 대사 유전자들로, 예를들면 글루코스 탈수소효소 및 글루코네이트 키나제의 발현은 195의 페닐알라닌 농도-를 나타내는 지수값이 추가적으로 증가될 수 있다.
상기 결과는 글루코스 탈수소효소의 활성을 도입하고, 글루코네이트 키나제의 활성을 증가시킴에 의해서 선택적 대사경로의 발현은 미생물에서 L-페닐알라닌 합성에 긍정적인 영향을 줄 뿐만아니라 동시에 PEP-비의존성 당 흡수 시스템이 형질전환되고, 발현된다.
실시예 5
글루코스 탈수소효소 활성을 증가시킬 뿐만아니라 PEP-비의존성 당 흡수 시스템이 발현되는 PTS-변이체를 사용한 물질의 제조
대장균 PTS 시스템의 성분을 코딩하는 유전자로 glf 유전자를 통합시키기위해서, 플라스미드 pPTS1이 BglII로 분해되고, 클레노우 단편으로 처리된다. 유일한 분해자리는 ptsI 유전자에 있다. 상기 glf 유전자가 플라스미드 pBM20glfglk에서 BamHI/KpnI 절편으로서 분리되고, 마찬가지로 클레노우 절편으로 처리된다. ptsHI 유전자와 같은 방향성으로 glf유전자를 운반하는 클론이 블런트 말단 결찰에 의해서 수득된다. 통합된 glf 및 crr를 갖는 ptsH 유전자 및 ptsI의 3' 영역을 운반하는 PstI 절편 4.6kb가 생성되는 플라스미드 pPTSglf에서 수득된다. 상기 절편이 벡터 pGP704의 EcoRV 분해자리로 결찰된다. 상기 벡터가 λpir 균주내 복제될 수 있기 때문에, 상기 파아지를 갖지 않는 형질전환체가 카베니실린에서 성장할 수 있다면 벡터를 크로모좀으로 통합시킨다. 상기 통합이 서던 분석에 의해서 확인된다(Miller V.L.등의 J.Bacteriol. 170 (1988) 2575-83). glf 유전자 뿐만아니라, 생성된 형질전환체가 또한 완전한 PTS 유전자를 포함한다.
상기 벡터 성분이 제2 동일 가교에서 재조합될 수 있고, 카베니실린에 대한 저항성을 손실시킨다. pts 유전자가 상기 경우에 glf 유전자의 삽입에 의해서 방해되기 때문에 상기 PTS가 상기 변이체에서 기능적으로 발현되지 않는다. 상기 소망하는 PTS-변이체가 하기와 같이 선택된다: 항생제없이 LB 배지상에 PTS+형질전환체을 반복적으로 서브접종한 후에, 세포 현탁액의 분획량이 100㎍·ℓ-1포스포마이신을 함유하는 LB 플레이트에 도포한다. PTS-변이체가 상기 플레이트에서 성장할 수 있다. 클론을 성장시켜서 포스포마이신 또는 20㎍·ℓ-1카베니실린을 함유하는 LB배지상에 도말한다. 크로모좀 DNA가 포스포마이신 플레이트상에서 새롭게 성장하지만 카베니실린 플레이트에서 성장하지 않는 클론으로부터 분리된다. PTS 시스템을 코딩하는 유전자로 glf 유전자의 통합이 서든 분석에 의해서 확인된다. 상응하는 변이체가 표현형 PTS-결핍에서와 같다.
하나의 클론이 숙주 생물체 대장균 AT2471glfintPTS-으로 선택되고, 플라스미드 pGEM7gntKgdhIV로 형질전환(상기를 참조할 것)에 사용된다.
실시예 3 및 4에 기술된 실험 조건에 따라서, PTS-음성 변이체 대장균 AT2471glfintPTS-/pGEM7gntKgdhIV 및 상응하는 숙주 균주 AT2471glfintPTS-가 각 경우에 두개의 평행한 혼합물에서 배양된다. 48시간동안 배양한 후에, 통합 생물량-특이적 생산성이 결과로부터 계산된다.
통합 생물량-특이성 생산성이 100의 지수값으로 나타내는 숙주 균주 대장균 AT2471glfintPTS-와 비교하여, 변이체 AT2471glfintPTS-/pGEM7gntKgdhIV는 133의 지수값을 갖는 통합 생물량-특이 생산성을 이룬다.
상기 결과는 글루코스 탈수소효소의 활성을 도입하고, 글루코네이트 키나제의 활성을 증가시키는 활성을 감소시키거나 또는 완전히 차단시킨 PTS 시스템에 의해 특징화되고, 동시에 PEP-비의존성 당 흡수 시스템이 통합된 미생물에서 페닐알라닌 합성 생성물에 긍정적인 영향을 주는 것이 입증되었다.
균주 유전자형 특징적인 공급원 및 참고문
바실러스 메가테리움 DSM 319 gdhIV 유전자에 대한 공여체 Nagao 등의 J. Bacteriol. 174, 5013-5020
대장균 AT2471 tyrA4, relA1, spoT1, thi-1 Taylor and Trotter, Bacteriol. Rev. 13(1967) 332-53
JM109DE3 Δ(pro-lac)/F'pro+lacZΔM15; T7 RNA 중합효소에 대한 유전자를 운반 Promega Co.
대장균 K-12 W3110 F-, 프로토트로픽 야생형 균주, thi-1; gntK 유전자에 대한 공여체 Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT, U.S.A.
플라스미드 pZY507 Cm2 Weisser 등의 J. Bacteriol 177(1995) 3351-4
pZY507glf pZY507내 지. 모빌리스 glf-유전자 Weisser 등의 J. Bacteriol 177(1995) 3351-4
PGEM7 ApR; T7 및 SP6 촉진인자 Promega Co.
PGEM7gntK 대장균 gntK 유전자를 포함하는 pGEM7 본 출원
PGEM7gdhIV 바실러스 메가테리움 gdhIV 유전자를 포함하는 pGEM7 본 출원
pGEM7gntKgdhIV gntK 및 gdhIV 유전자를 포함하는 pGEM7 본 출원
다양한 유전자 구조물을 갖는 대장균의 미정제 추출물에서 글루코스 탈수소효소 및 글루코네이트 키나제 활성의 측정
균주 글루코스 탈수소효소의 특이적 활성 글루코네이트 키나제의 특이적 활성
W3110/pGEM7 n.d.a. n.d.a.
W3110/pGEM7gdhIV 0.4U/㎎ n.d.
W3110/pGEM7gntK n.d.a. 0.9U/㎎
W3110/pGEM7gntKgdhIV 1.0U/㎎ 0.9U/㎎
n.d.a.= 활성이 검출되지 않음; n.d.= 측정되지 않음

Claims (29)

  1. 물질을 생성하는 미생물에서 글루코스를 함유하는 기질이 글루코스-산화효소의 활성의 증가의 결과로서 형질전환되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    글루코스 탈수소효소의 활성이 미생물에 도입되거나 및/또는 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    바실러스 메가테리움 글루코스 탈수소효소의 활성이 미생물에 도입되거나 및/또는 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    바실러스 메가테리움 글루코스 탈수소효소 IV의 활성이 미생물에 도입되거나 및/또는 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    글루콘산-인산화 효소의 활성이 추가적으로 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    글루코네이트 키나제의 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    대장균 글루코네이트 키나제의 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    글루코노락토나제, 특히 지모모나스 모빌리스 글루코노락토나제의 활성이 추가적으로 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    당의 PEP-비의존성 흡수를 위한 운반 단백질의 활성이 추가적으로 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 운반 단백질은 촉진인자인 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 촉진인자는 지모모나스 모빌리스 글루코스 촉진인자 단백질(Glf)인 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  12. 제 2 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    글루코스-산화효소의 활성 또는 글루코스-산화효소의 활성 및 추가적으로 글루콘산-인산화 효소, 글루코노락토나제 및 PEP-비의존성 당 흡수를 위한 운반 단백질 중 적어도 하나의 활성이 (a)유전자를 도입함에 의해서, 및/또는 (b)유전자 카피수를 증가시킴에 의해서, 및/또는 (c)유전자 발현을 증가시킴에 의해서, 및/또는 (d)상기 효소의 내인성 활성을 증가시킴에 의해서, 및/또는 (e)상기 효소의 구조를 변경시킴에 의해서, 및/또는 (f)조절이 해제된 효소를 사용함에 의해서, 및/또는 (g)조절이 해제된 효소를 코딩하는 유전자를 도입함에 의해서 증가되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    활성에 있어서의 증가는 유전자 또는 유전자들을 유전자 구조물 또는 몇개의 유전자 구조물로 통합시키고, 유전자 또는 유전자들은 단일 카피 또는 증가된 카피수로 유전자 구조물로 도입되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    만약 존재한다면, PEP-의존성 당 흡수 시스템의 활성이 추가적으로 감소 또는 차단되는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    물질의 합성에서 추가적으로 포함되는 하나 이상의 효소가 조절 해제되거나 및/또는 그(들)의 활성이 증가되는 미생물을 사용하는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제조된 물질이 방향족 아미노산인 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 방향족 아미노산은 L-페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    사용된 미생물은 대장균, 세라티아, 바실러스, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 방향족 화합물 대사로부터 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
  20. 재조합의 형태로, 글루콘산-인산화효소를 코딩하는 유전자와 함께 글루코스-산화효소를 코딩하는 유전자; 또는 당의 PEP-비의존성 흡수를 위한 운반 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 글루코스-산화효소를 코딩하는 유전자; 또는 글루콘산-인산화 효소를 코딩하거나, 글루코노락토나제를 코딩하거나 또는 당의 PEP-비의존성 흡수를 위한 운반 단백질을 코딩하는 세개의 유전자들 중 적어도 두개와 함께 글루코스-산화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    글루코스-산화효소에 대한 유전자는 글루코스 탈수소효소를 코딩하고, 글루콘산-인산화효소에 대한 유전자는 글루코네이트 키나제를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    글루코스 탈수소효소에 대한 유전자는 바실러스 메가테리움에서 유도되고, 글루코네이트 키나제에 대한 유전자는 대장균에서 유도되며, 글루코노락토나제 및 운반 단백질에 대한 유전자는 지모모나스 모빌리스에서 유도되는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  23. 복제가능한 형태로 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 유전자 구조물을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
  24. 제 23 항에 있어서,
    세포에서 물질의 합성을 추가적으로 포함하는 하나 이상의 효소가 조절이 해제되거나 및/또는 그(들)의 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    상기 세포는 대장균 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
  26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    만약 존재한다면, PEP-의존성 당 흡수 시스템이 추가적으로 그의 활성이 감소되거나 또는 차단되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
  27. 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    방향족 아미노산을 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 방향족 아미노산은 L-페닐알라닌인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
  29. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 유전자 구조물이 존재하는 제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 물질을 제조하는 미생물에 의한 방법.
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