CZ295853B6 - DNA kódující aspartokinázu a způsob výroby L-aminokyseliny - Google Patents
DNA kódující aspartokinázu a způsob výroby L-aminokyseliny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ295853B6 CZ295853B6 CZ19973272A CZ327297A CZ295853B6 CZ 295853 B6 CZ295853 B6 CZ 295853B6 CZ 19973272 A CZ19973272 A CZ 19973272A CZ 327297 A CZ327297 A CZ 327297A CZ 295853 B6 CZ295853 B6 CZ 295853B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- residue
- replaced
- amino acid
- mutation
- another amino
- Prior art date
Links
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 title claims description 23
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 title claims description 20
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 73
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 33
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 11
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 127
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 93
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 72
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 64
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 49
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 30
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 20
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 19
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 17
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 17
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 15
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 14
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 12
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 11
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 10
- 101000779368 Bacillus subtilis (strain 168) Aspartokinase 3 Proteins 0.000 claims description 9
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 6
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101000779367 Escherichia coli (strain K12) Lysine-sensitive aspartokinase 3 Proteins 0.000 abstract description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 51
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 67
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 40
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 3
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 3
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- -1 aspartic acid amino acid Chemical class 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AQVDGWSWFLGAHQ-PIKHSQJKSA-N (2r)-2-amino-3-phosphonobutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C(C(O)=O)P(O)(O)=O AQVDGWSWFLGAHQ-PIKHSQJKSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZGKAASZIMOAMU-UHFFFAOYSA-N 124177-85-1 Chemical compound NP(=O)=O UZGKAASZIMOAMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound CN=C(N)NN=O DMSDCBKFWUBTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxynorvaline Chemical compound CCC(O)C(N)C(O)=O LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSHIQPFXKULOPB-UHFFFAOYSA-N 6-(hydroxyamino)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound ONC1=CC=NC(=O)N1 OSHIQPFXKULOPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002089 ferrous chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091006091 regulatory enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150014006 thrA gene Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- YSGSDAIMSCVPHG-UHFFFAOYSA-N valyl-methionine Chemical compound CSCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)C YSGSDAIMSCVPHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Popisuje se produkce mutantního genu AKIII získaného z bakterií rodu Escherichia, ve kterých je dobře uvolněna zpětnovazebná inhibice L-lysinem. Kmen produkující L-aminokyselinu, který je lépe upraven ve srovnání s předchozími kmeny, se může vytvořit zavedením zmiňovaného genu do bakterií rodu Escherichia. Dále se popisuje postup produkce L-aminokyseliny fermentací, který je účinnější ve srovnání s běžnými postupy, jež používají stejný kmen produkující L-aminokyselinu.
Description
Oblast vynálezu
Vynález se dotýká oblasti biotechnologické výroby. Přesněji vynález popisuje popis výroby L-aminokyseliny za použití fermentace, DNK a mikroorganizmu.
Dosavadní stav techniky
Při produkci L-lysinu pomocí fermentace se za účelem zvýšení produktivity používají přirozené izoláty nebo jejich syntetické formy. Je znám velký počet syntetických mutant, které produkují L-lysin. Řada z nich jsou mutanty rezistentní na aminoetylcystein (AEC) a patří krodu Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus nebo Escherichia. Dále se používají transformanti získaní použitím rekombinantní DNK patent US 4 278 765). Popisuje se řada různých technologií vhodných ke zvýšení produktivity aminokyselin.
V publikacích v japonském Laid-Open (Kokai) 18,596/1981, v patentu US 4 346 170 a v Applied Microbiology and Biotechnology 15, 227 (1982) se popisuje postup produkce L-lyrinu zvýšením syntetázy dihydrodipicolinové kyseliny (zde se používá zkratka „DDPS“) za použití mikroorganizmů rodu Escherichia.
Syntetáza dihydrodipicolinové kyseliny (DDPS) je enzym, který katalyzuje dehydrokondenzaci aspartosemialdehydu a kyseliny pyrohroznové za vzniku kyseliny dihydrodipicolinové. Do této rekce vstupuje biosyntetický systém L-lysinu v podobě biosyntézy aminokyseliny typu aspartové kyseliny. O tomto enzymu se ví, že spolu se aspartokinázou slouží jako důležité regulační místo biosyntézy L-lysinu v bakteriích rodu Escherichia.
DDPS je v bakteriích Escherichia coli (E. coli) kódován genem, který se nazývá dapA. Tento gen dapA byl už klonován a stanovila se jeho základní sekvence (Richaud, F. et al., J. Bacteriol. 297(1986).
Aspartokináza (AK) je enzym, který katalyzuje reakci, při které kyselina aspartová přechází na kyselinu β-fosfoaspartovou a je hlavní regulační enzym systému biosyntézy aminokyseliny typu aspartové kyseliny. Aspartokináha (AK) bakterií E. coli zahrnuje tři typy (AKI, AKI, AKIII). Dva z nich jsou enzymy konjugované s homoserinovou dehydrogenázou (HD). Jeden z těchto konjugovaných enzymů je AKI-HDI a je kódován genem thrA. Další konjugovaný enzym je AKI-HDII a je kódován genem metLM. AKI se podrobuje současně probíhající supresi threoninem a izoleucinem a inhibici threoninem. AKII se podrobuje supresi methioninem.
AKII je enzym, který má jedinou funkci a je produktem genu lysC. Je známo, že se podrobuje supresi a zpětnovazebně inhibici s L-lysinem. Poměr aktivit enzymů AKI:AKII:AKIII je v buňkách přibližně 5:1:4.
Gen lysC v bakteriích E. coli se už klonoval a určila se jeho základní sekvence (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N., a Patte, J. C., J. Biol. Chem. 261,1052 (1986).
V publikaci mezinárodní přihlášky WO95/16042 se popisuje postup produkce L-lysinu za použití E. coli obsahující gen dapA, který má mutace, jež umožňují zpětnovazebnou inhibici lysinem a gen lysC, který má také mutace umožňující zpětnovazebnou inhibici lysinem.
V případě produkce L-threoninu fermentací se používají přirozené mikroorganizmy nebo jejich syntetické mutanty. Je známo velké množství syntetických mutant, které produkují L-threonin. Řada žních je rezistantních na a-amino-P-hydroxyvalerovou kyselinu a patří krodu
-1 CZ 295853 B6
Escherichia, Serratia, Brevibacterium nebo Corynebacterium. V publikacích v japonské Laid-Open (Kokai) 131,397/1980, 31,691/1984 a 15,696/1981 a vjaponském Patent Announcement 501,682/1991 se popisuje, s ohledem na rod Escherichia, postup produkce Lthreoninu za použití kmene transformovaného rekombinantním plazmidem, který obsahuje operon pro threoninu.
V publikaci mezinárodní přihlášky WO94/11517 se dokládá postup produkce L-threoninu za použití E. coli obsahující gen lysC, který má mutaci, jež umožňuje uvolnění zpětnovazebně inhibice lysinem.
Podstata vynálezu
Cílem vynálezu je získat ΑΚΊΙΙ z bakterií rodu Escherichia, kde se dobře uvolňuje zpětnovazebná inhibice L-lysinem, a poskytnout postup pro produkci L-aminokyseliny použitím zdokonalené fermentace.
Vynález vede k řešení dříve uvedených problémů. Podařilo se získat DNK kódující AKII z bakterií rodu Escherichia, ve kterých se dobře uvolňuje zpětnovazebná inhibice L-lysinem. DNK kódující AKII získaná z bakterií rodu Escherichia, ve kterých se dobře uvolňuje zpětnovazebná inhibice L-lysinem, se nazývá mutantní gen lysC nebo mutantní gen ΑΚΙΠ.
DNK kódující DDPS získaný z bakterií E. coli, ve kterých se dobře uvolňuje zpětnovazebná inhibice L-lysinem, se nazývá mutantní gen dapA nebo mutantní gen DDPS.
Vynálezci produkovaly bakterie rodu Escherichia, které obsahují v buňkách mutantní gen lysC. a zjistily, že v kultuře se může produkovat a akumulovat značné množství L-lysinu nebo L-threoninu.
Vynález se týká DNK kódující aspartokinázu III bakterií, které patří do rodu Escherichia a mají v kódující oblasti mutaci, kterou se uvolňuje zpětnovazebná inhibice zmíněné aspartokinázy III lysinem. Zmíněnou mutací je:
mutace, při níž 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen jiným zbytkem aminokyseliny a 323 zbytek glycinu je nahrazen jiným zbytkem aminokyseliny;
mutace, při níž 325 zbytek leucinu je nahrazen jinou aminokyselinou a 347 zbytek valinu je nahrazen jiným zbytkem aminokyseliny, mutace, při níž 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při níž 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při níž 250 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 346 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 374 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 250 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 346 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 202 zbytek aspartové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny,
-2CZ 295853 B6 mutace, při které 283 zbytek argininu nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 346 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, nebo mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 405 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny.
Vynález se týká DNK kódující asapartokinázu III bakterií, patřící k rodu Escherichia. Tato DNK má v kódující oblasti mutaci, kterou se uvolňuje zpětnovazebná inhibice zmíněné aspartokinázy III lysinem. Zmíněná mutace je:
mutace, při které 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen zbytkem izoleucinu a 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem aspartové kyseliny, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem leucinu, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu, mutace, při které 346 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem lysinu a 374 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu a 364 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 202 zbytek aspartové kyseliny je nahrazen zbytkem glycinu a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem prolinu, mutace, při které 283 zbytek argininuje nahrazen zbytkem šeřinu, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem threoninu, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem threoninu 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem šeřinu, nebo mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem lysinu, 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytek prolinu, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem glycinu a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem valinu.
Vynález se týká shora uvedené rekombinantní DNK, která vzniká ligací DNK, která je popsána v nároku 1, a vektorové DNK, která je schopna se replikovat v buňkách bakterií rodu Escherichia. Dále se vynález týká mikroorganizmu rodu Escherichia, který obsahuje uvedenou DNK.
Vynález popisuje postup produkce L-aminokyseliny, jež zahrnuje inkubaci shora zmíněného mikroorganizmu, který má schopnost produkovat L-aminokyselinu ve fermentačním médiu, dále zahrnuje produkci a akumulaci L-aminokyseliny v kultuře a izolaci L-aminokyseliny z kultury.
-3 CZ 295853 B6
DNK kódující DDPS nebo AKIII nebo DNK nesoucí uvedené geny a promotor se nazývá gen „DDPS“ nebo gen „AKIII“. Dále mutantní enzym, ve kterém je uvolněná zpětnovazebná inhibice L-lysinem, se nazývá „mutantní enzym“. DNK kódující stejný enzym nebo DNK obsahující stejný gen a promotor se nazývá „mutantní gen“. Termín „uvolnit zpětnovazebnou inhibice L-lysinem“ znamená, že inhibice je značně uvolněná a není nezbytné, aby se uvolnila zcela.
<1> DNK kódující mutantní aspartokinázu (AKIII) podle vynálezu.
DNK kódující mutantní aspartokinázu (AKIII) podle vynálezu je DNK kódující divoký typ AKIII, který má mutaci, jež uvolňuje zpětnovazebnou inhibici AKIII L-lysinem. AKIII je AKIII získaná z bakterií rodu Escherichia, zvláště AKIII získaná z E. coli. Mutace, jež uvolňuje zpětnovazebnou inhibici AKIII lysinem, v aminokyselinové sekvenci AKIII reprezentované sekvencí č. 1 počítané z N-konce zahrnuje (a) mutaci, při které 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek leucinu, a 323 zbytek glycinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek kyseliny aspartové.
(b) mutace, při které 325 zbytek leucinu je substituován jinou aminokyselinou, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu, a 347 zbytek valinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek methioninu.
(c) mutace, při které 323 zbytek glycinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek kyseliny aspartové, a 347 zbytek valinu je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek methioninu.
(d) mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu, a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek leucinu.
(g) mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysin.
(h) mutace, při které 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysinu, a 374 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu.
(i) mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysinu, a 346 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek methioninu.
(j) mutace, při které 202 zbytek kyseliny aspartové je substituován zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek glycinu, a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek prolinu.
(k) mutace, při které 283 zbytek argininu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek šeřinu, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek threoninu, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek threoninu, 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek kyseliny aspartové, a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek šeřinu, nebo (l) mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek lysinu, 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny,
-4CZ 295853 B6 upřednostňuje se zbytek prolinu, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek fenylalaninu, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek glycinu, a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, upřednostňuje se zbytek valinu.
DNK kódující divoký typ ΑΚΙΠ není v podstatě limitována. Zmiňuje se DNK, která kóduje AKIII a získala se z bakterií rodu Escherichia, například E. coli. Přesněji se zmiňuje DNK kódující aminokyselinovou sekvenci, kterou představuje sekvence č. 1 a dále sekvenci, kterou představují báze čísla 584 až 1930 v základní sekvenci reprezentovanou sekvencí č. 1. AKIII z E. coli se kóduje genem lysC.
Sekvence, která má mutaci v základní sekvenci, jež způsobuje substituci zbytku aminokyseliny, je DNK kódující mutantní AKIII podle vynálezu. Typ kodónu, který odpovídá substituovanému aminokyselinovému zbytku, není zvláště omezen pokud kóduje uvedený aminokyselinový zbytek. Aminokyselinová sekvence AKIII divokého typu se liší v závislosti na druhu bakterií nebo druhu kmenů. Gen mutantní AKIII také zahrnuje sekvenci, která má substituci, deleci nebo inzerci zbytku aminokyseliny v poloze, jejíž se nepodílí na enzymatické aktivitě.
Například základní sekvence (sekvence č. 1) genu lysC divokého typu získaná v příkladu 1 se na šesti místech liší od základní sekvence genu lysC z E. coli kmene K-12 JC411, který byl již zpřístupněn (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J. C., J. Biol. Chem. 261, 1052 (1986)). Kódované aminokyselinové zbytky se liší na dvou místech ze šesti (v genu lysC kmene JC411; v aminokyselinové sekvenci genu lysC, kterou tvoří sekvence č. 1, je 58 zbytek glycinu, počítáno zN-konce, nahrazen zbytkem cysteinu a 401 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem alaninu.
V případě, že se v genu lysC, který má stejnou sekvenci jako gen lysC E. coli kmene K-12 JC411, uplatní libovolné dříve uvedené mutace a) až 1), očekává se, že se získá gen lysC mající mutace, které uvolnily zpětnovazebnou inhibici L-lysinem.
Popis získání DNK kódující mutantní AKIII, ve kterém je uvolněna zpětnovazebná inhibice lysinem následuje. Nejdříve se DNK obsahující gen AKIII divokého typu nebo gen AKIII mající jiné mutace in vitro mutagenizuje. Mutagenizovaná DNK je ligována do vektoru DNK, který je použitelný ve vhodném hostiteli, za účelem vytvořit rekombinantní DNK. Za účelem získat trans· formant se do hostitele zavedla rekombinantní DNK. Izolovaný transformant, který má exprimovat mutantní AKIII, obsahuje mutantní gen. Dále, DNK kódující gen AKIII divokého typu nebo gen AKII obsahující jinou mutaci se liguje do vektoru DNK, který je použitelný ve vhodném hostiteli, za účelem vytvořit rekombinantní DNK. Rekombinantní DNK se pak in vitro mutagenizuje a mutagenizovaná DNK se vnáší do hostitelských mikroorganizmů za účelem získat transformant. Izolovaný transformant, který má exprimovat mutantní AKIII, obsahuje mutantní gen.
V jiném případě je také možné, mutagenizovat mikroorganizmus, který produkuje enzym divokého typu, za účelem vytvořit mutantní kmen, který produkuje mutantní enzym. Mutantní gen je pak možné získat z tohoto mutantního kmene.
Jako činidlo pro přímou mutagenezi DNK se může použít hydroxylamin a podobně. Hydroxylamin je chemické mutagenační činidlo, které způsobuje mutagenezi z cytosinu na tymin změnou cytosinu na N4-hydroxycytosin. K mutagenezi samotného organizmu je možné použít ozáření ultrafialovým světlem nebo aplikaci mutagenačního činidla, které se obyčejně používá v případě umělé mutace. Je to například N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Jako dárce DNK obsahující gen AKIII divokého typu nebo gen AKIII obsahující jinou mutaci se mohou použít libovolné mikroorganizmy patřící do rodu Eschericha. Přesněji ty organizmy, které se popisují v dokumentech autory F. C. Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C., et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurin, Američan Society for Microbiology, Washingon D.C., p. 1208, Tabulka 1.). Příkladem takového organizmu je kmen JM109 E. coli a kmen MC1061 E. coli.
-5CZ 295853 B6 (1) Získání genu AKIII divokého typu
Příklad produkce DNK obsahující gen AKIII se popisuje dále. Nejdříve se vytvoří kultura například E. coli kmene MC1061 divokého typu nesoucí gen lysC. Ke kultivaci tohoto organizmu se může použít postup obvyklý pro kultivaci na pevné půdě. Lepší výtěžek se dosáhne za použití kapalné kultury. V tomto případě se kultivační médium může například získat přidáním ke zdroji uhlíku jednoho nebo více druhů anorganických solí ze skupiny, která zahrnuje hydrogenfosforečnan draselný, dihydrogenfosforečnan draselný, síran amonný, chlorid sodný, chlorid hořečnatý, chlorid železnatý, síran železnatý a síran hořečnatý. Jako zdroj uhlíku se může použít jedna nebo více půd ze skupiny, která zahrnuje kvasinkový extrakt, pepton, extrakt z masa, kukuřičný sirup a tekutý odpad vznikající při zpracování sóji nebo obilí. Dále se do média musí přidat vhodné množství sacharidů, vitaminů a podobných látek, které jsou nutné.
Počáteční pH kultury by se mělo upravit na hodnotu mezi 6 a 8. Inkubace probíhá při teplotě od 30 °C do 42 °C. Upřednostňuje se kultivace při teplotě přibližně 37 °C po dobu 4 až 24 hodin, míchaná vzduchem, míchaná mechanicky nebo stacionární kultivace.
Takto získaná kultura se separuje například centrifugací při 3 000 ot/min po dobu 5 minut. Tak je možné získat kmen MC1061 E. coli. Chromazomální DNK je možné získat z buněk tohoto kmene například způsoby, které popisuje Saito a Miura (Biochem. Biophys. Acta. 72, 619, (1963)) nebo K. S. Kirby (Biochem. J. 64,405, (1956)).
Za účelem izolovat gen AKIII z výsledné chromozomální DNAk se připravila knihovna chromozomální DNK. Nejdříve se chromozomální DNK částečně štěpila vhodnou restrikční endonukleázou za účelem získat směsi různých fragmentů. Jestliže stupeň štěpení je řízen časem štěpení nebo podobně, tvoří se velké množství různých fragmentů. Například chromozomální DNK se inkubuje s restriktázou Sau3A, která je přítomna v koncentraci 1 až 10 jednotek/ml, při teplotě 30 °C a vyšší. Upřednostňuje se inkubace při teplotě 37 °C o dobu od 1 minuty do 2 hodin.
Pak fragmenty vzniklé štěpením chromozomální DNK se ligovaly do vektoru, který je schopný se replikovat v buňkách bakterií rodu Escherichia a vytvářet rekombinantní DNK. Přesněji, vektor DNK se štěpí restrikční endonukleázou, která umožní vytvoření stejné terminální sekvence jako restrikční endonukleáza Sau3A použitá ke štěpení chromozomální DNK. Může se použít enzym BamHI v koncentraci od 1 do 100 jednotek/ml při teplotě 30 °C nebo vyšší. Inkubace trvá po dobu 1 hodiny nebo více, upřednostňuje se doba trvání od 1 do 3 hodin, kdy dochází k úplnému štěpení. V postatě shora zmiňovaná směs fragmentů chromozomální DNK je smíchána se štěpeným vektorem. Ke směsi se přidá DNK ligáza, upřednostňuje se T4 DNK ligáza v koncentraci od 1 do 100 jednotek/min, a směs se inkubuje při teplotě od 4 °C do 116 °C po dobu jedné hodiny nebo více, upřednostňuje se doba inkubace od 6 do 24 hodin. Tvoří se rekombinantní DNK.
Mikroorganizmus rodu Escherichia, například kmen E. coli K-12, upřednostňuje se kmen, který nanese gen kódující AKI, AKII a AKIII, například kmen E. coli GT3 (který je možné získat z instituce Genetic Stock Center for E. coli, Connecticum, U.S.A), se transformoval za účelem připravit knihovnu chromozomální DNK. Transformace proběhla způsobem popsaným D.M. Morrison (Methods in Enzymology 68, 326, (1979)) nebo způsobem, kde pravděpodobnost prostupnosti DNK se zvýší chloridem vápenatým, který se aplikuje na buňky (Mandel, M., and Higa, A., J. Mol., Biol. 53,159 (1970).
Kmen nesoucí rekombinantní DNK s genem AKIII se získal z kmene, který má zvýšenou aktivitu AKIII nebo z kmene, kde auxotrofie způsobená delecí genu AKII je vyrovnána výslednou knihovnu chromozomální DNK. V případě, že se jako host použije mutant, který je zcela deficientní k produkci AK, je možné získat rekombinantní kmen, který může růst na médiu bez Llysinu, L-threoninu, L-methioninu a kyseliny diaminopimelové. Z tohoto kmene je možné získat rekombinantní DNK, což umožňuje získat fragment DNK obsahující gen AKII. Z vhodného
-6CZ 295853 B6 kmene se připraví buněčný extrakt, z něhož se připraví roztok surového enzymu. Pak se určí aktivita AKIII. Enzymatická aktivita AKIII se může měřit způsobem podle E.R. Stadtmana (Stadtman, E. R., Cohen, G.N., LeBras, G. and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem. 236, 2033 (1961)).
Rekombinantní DNK získaná inzercí DNK obsahující gen AKIII do vektoru DNK, který se může izolovat způsobem podle P. Guerry et al. (J. Bacteriol. 116, 1064, (1973)) nebo podle D.B. Clewell (Bacteriol. 110, 667 (1972)).
Gen AKIII divokého typu je také možné získat tak, že se izoluje chromozomální DNK z kmene, který má na chromozómu gen kódující AKIII, způsobem podle Saita a Miura. Tento gen se amplifíkuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR, White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185, (1989)). Primer DNK používaný při amplifíkaci je komplementární s oběma 3' konci dvouřetězové DNK, která obsahuje celou oblast genu AKII nebo její část. V případě, že se amplifíkuje pouze část oblasti genu AKIII, je nezbytné vybrat fragment DNK obsahující celou oblast z knihovny chromozomální DNK za použití fragmentu DNK, který obsahuje část oblasti AKIII jako primer. Když se amplifíkuje celá oblast genu AKIII, roztok PCR obsahující fragment DNK, který nese amplifíkovaný gen AKIII, se analyzuje elektroforézou na agarózovém gelu. Požadovaný fragment se pak extrahuje, přičemž se může izolovat fragment DNK obsahující gen AKIII.
Primer DNK se může přesně vytvořit na základě známé sekvence kmenu E. coli. (Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and patte, J. C., J. Biol. Chem. 261, 1052 (1986)). Vhodný je primer, který je schopný amplifíkovat oblast obsahující 1 347 bází a nesoucí gen lysC. Vhodné jsou například dva typy primerů, které jsou reprezentovány sekvencemi číslo 2 a 3. Primer DNK se může syntetizovat obvyklým způsobem, například fosfoamidovou metodou (Tetrahedron Letters 22, 1859 (1981)) za použití obecně dostupného syntezátoru DNK (například syntezátor DNK Model 380B vyrobený firmou Applied Biosystems). PCR může probíhat způsobem, který určí dodavatel, za použití komerčně dostupných PCR zařízení (DNK Thermal Cyclec Model PJ2000, který vyrobila firma Takara Shuzo Co., Ltd.) a Taq DNK polymerázy (Takara Shuzo Co., Ltd.).
Amplifíkovaný gen AKIII se liguje s vektorem, který je schopný se replikovat v buňkách bakterií, které patří do rodu Escherichia. Tento vektor se zavede do buněk bakterií rodu Escherichia, přičemž je jednoduché provést mutaci genu AKIII. Vektor DNK, transformace a určení přítomnosti genu AKIII jsou shora popsány.
(2) Zavedení mutace do genu ΑΚΠΙ.
Gen AKIII získaný shora popsaným způsobem je mutován substitucí, inzercí nebo delecí aminokyselinového zbytku způsobem rekombinantního PCR (Higuchi, R. 61, in PCR Technology (Erlich, H.A., Eds., Stockton Press (1989)), způsobem mutace na specifickém místě (Kramer, W., and Frits, H.J., Methods in Enzymology 154, 350 (1987); Kulkel, T.A. et al., Methods in Enzymology 154, 367 (1987)) a podobně. Tyto metody mohou způsobit požadované mutace v požadovaných místech.
Mutace nebo náhodné mutace se mohou zavést do požadovaného místa způsobem, při kterém se chemicky syntetizuje požadovaný gen.
Existuje způsob, při kterém se přímo na gen AKIII, nacházející se na chromozómu nebo na plazmidu, aplikuje hydroxylamin (Hashimoto, T. a Sekiguchi, M., J. Bacteriology 159, 1039 (1984)). Dále se může použít způsob, při kterém bakterie rodu Escherichia obsahující gen AKIII, jsou ozářeny ultrafialovým světlem nebo způsob, kde se aplikuje chemické činidlo, jako je N-metyl-N'-nitrosoguanidin nebo kyselina dusitá. Tyto metody mohou zavést náhodnou mutaci.
Způsob selekce mutantního genu AKIII se popisuje dále. Rekombinantní DNK obsahující gen AKIII, který se nejdříve mutagenizuje, se transformuje do kmene, který je zcela AK deficientní.
-7CZ 295853 B6
Je to například kmen E. coli GT3. Transformant se pak inkubuje na minimálním médiu, například na médiu M9, které obsahuje podstatné množství L-lysinu. Přestože pouze AK se inhibuje L-lysinem v kmenu, který zahrnuje rekombinantní DNK obsahující gen ΑΚΠΙ divokého typu. L-threonin, L-izoleucin, L-methionin a kyselina diaminopimerová (DAP) se nemůže syntetizovat, protože řídí růst tohoto kmene. Kmen nesoucí rekombinantní DNK, jež obsahuje mutantní gen AKIII, ve kterém je uvolněna inhibice L-lysinem, se musí kultivovat na minimálním médiu obsahující podstatné množství L-lysinu. Na základě tohoto jevu je možné vybrat kmen, který je rezistentní na L-lysinu nebo S-2-aminoetylcystein (AEC), který je růstovým analogem L-lysinu. Jde o kmen, který obsahuje rekombinantní DNK nesoucí mutantní gen AKIII, ve kterém je uvolněna inhibice.
Takto získaný rekombinantní gen je v podobě rekombinantní DNK zaveden do vhodného mikroorganizmu (hostitele) a je exprimován. Takto je možné získat mikroorganizmus obsahující AKIII, ve kterém je uvolněna zpětnovazebná inhibice.
Jako hostitel se preferují mikroorganizmy, které patří do rodu Escherichia, například E. coli.
Dále se může použít látka získaná izolací fragmentu mutantního genu AKIII z rekombinantní DNK a inzercí uvedeného fragmentu do jiného vektoru. Podle vynálezu se preferuje použití plazmidového vektoru. Mezi tyto plazmidové vektory patří pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 a pMW218. Mohou se použít také fágové vektory nebo transpozónový vektor.
Za účelem účinné exprese mutantního genu AKII se může proti směru transkripce DNK oblasti kódující mutantní AKIII ligovat jiný promotor, který je ve zmíněných mikroorganizmech funkční. Takovým promotorem může být lac, trp a PL. Nebo se může použít promotor obsažený v genu AKIII, tak že je implifikován.
DNK získaná inzercí mutantního genu do DNK vektoru, který se schopný se replikovat, se může vnést do hostitele. V buňce zůstává jako extrachromozomální DNK v podobě plazmidu.
Nebo mutantní gen se může začlenit do chromozómu hostitelského mikroorganizmu pomocí transdukce transpozonem (Berg, D.E. and berg, C.M., Bio/Techol. 1, 417 (1983)), Mu fágem (japanese Laid-Open (Kokai) č. 109 985/1990) nebo komplementární rekombinací (Experimente in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)).
<3> Produkt L-aminokyseliny podle vynálezu.
L-aminokyselina se může účinně produkovat inkubací bakterií rodu Escherichia, které jsou transformovány dříve získaným mutantním genem AKIII, ve vhodném bakteriálním kultivačním médium. L-aminokyseliny se produkují a akumulují do kultury a je možné je získat.
Bakterie rodu Escherichia obsahující AK, ve kterém je uvolněna zpětnovazebná inhibice L-lysinem, zahrnují bakterie rodu Escherichia, které jsou transformovány inzercí DNK kódující AKIII s mutací, jež uvolňuje zpětnovazebnou inhibici L-lysinem, do chromozómu a dále zahrnují bakterie rodu Escherichia, které jsou transformovány rekombinantní DNK tvořenou ligací dříve zmiňované DNK s DNK vektorem, který je schopný se replikovat v buňkách bakterií rodu Escherichia. Dostupné jsou také mutanty bakterií rodu Escherichia, které produkují mutantní AKIII a které vznikly mutagenezí buněk bakterií rodu Escherichia.
Jako hostitel pro transformaci se mohou použít libovolné bakterie, kde je funkční promotor mutantního genu AKIII nebo jiný promotor, který umožňuje expresi tohoto genu. Nebo mutantní gen AKIII je začleněn do plazmidu a zůstává jako extrachromozomální DNK. V tomto případě se může jako hostitel použít libovolná bakterie, kde počátek replikace DNK vektoru je funkční ve zmíněných buňkách a extrachromozomální DNK se může replikovat.
-8CZ 295853 B6
Kultivační médium používané pro inkubaci mikroorganizmu, který nese mutantní gen podle vynálezu, je běžné kultivační médium obsahující zdroj uhlíku, dusíku, anorganické ionty a jiné organické látky, je-li to nutné.
Jako zdroj uhlíku slouží například sacharidy, jak oje glukóza, laktóza, galaktóza, fruktóza a hydrolyzát škrobu, alkoholy, jako je glycerol a sorbitol; a organické kyseliny, jako je kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantarová.
Mezi zdroj dusíku patří anorganické amonné sole, jako jsou síran amonný, chlorid amonný a fosforečnan amonný; sójový hydrolyzát; plynný amoniak a volný roztok amoniaku.
Pro kultivaci je vhodné, aby půda obsahovala vhodné množství organických mikronutrientů, jako je vitamin Bj nebo L-izoleucin nebo kvasinkový extrakt. Dále se může přidat malé množství fosforečnanu draselného, síranu amonného, iontů železa a hořčíku.
Inkubace se provádí za anaerobních podmínek po dobu 16 až 72 hodin. Inkubační teplota je mezi 25 °C a 45 °C. Hodnota pH se během kultivace pohybuje mezi 5 a 8. Pro úpravu pH se mohou použít anorganické nebo organické, kyselé nebo alkalické látky a nebo plynný amoniak.
L-aminokyselina se může obvykle získat z kapalné fermentace ligací na iontoměničovou pryskyřici, srážením a jinou známou metodou.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Získání mutantního genu ΑΚΙΠ (1) <1> Klonování genu AKIII divokého typu
Základní sekvence genu AKIII E. coli (lysC) byla již publikována (Cassan, M. Parsot, C. Cohen G.H., and Patte, J.C., J. Biol. Chem, 261,1052 (1986)). Je známo, že otevřený čtecí rámec (ORF) se skládá z 1 347 párů bází, které kódují protein zahrnující 449 zbytků aminokyselin. Tento gen má operátor a může být potlačen L-lysinem. Za účelem odstranění oblasti jeho operátoru se amplifíkovala pomocí PCR SD sekvence a samotná oblast obsahující ORF. Tato amplifikovaná DNK se pak se klonovala.
Způsob podle Saito a Miura (Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)) se připravila celá genomová DNK kmene K-12 MC1061 E. coli a vytvořily se dva typy primerů mající sekvence, které jsou tvořeny sekvencemi číslo 2 a 3. PCR amplifíkace genu AKIII se uskutečnila způsobem podle H.A. Erlicha et al. (PCR Technology, Stockton Press (1989)). Výsledná DNK se štěpila restriktázami BamHI a Asel, pak se upravily konce na tupé konce a fragment se vnesl do Smál místa vektoru pMWl 19 s nízkým počtem kopií a vznikla konstrukce pMLYSC2. Uvedené Smál místo se nachází po směru transkripce promotoru LacZ, který je přítomen ve vektoru. V případě, že rekombinantní DNK získaná inzercí fragmentu DNK do restrikčního místa Smál vektoru pMW119 je zaveden do e. coli, fragment je přepisován transkripcí za řízení promotorem lacZ (Obr,. 1).
<2> Klonování mutantního genu AKIII.
Plazmidy, které nesou mutantní gen AKIII, jmenovitě pLYSCl*80, pLYSCl*117 apLXSCl*126 popsané v Intemational Laid-OpenPamphlets WO94/11517 a WO95/16042 se štěpily restriktázami EcoRI a HindlII, aby se získaly fragmenty obsahující mutantní gen AKIII.
-9CZ 295853 B6
Tyto fragmenty se začlenily do EcoRI-HindlII místa vektoru pMW119, za účelem vytvořit plazmidy s označením pLYSC2*80 a pLYSC2*126.
Plazmid pLYSC2*80 se může vytvořit zpLLC*8 podle popisu v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO94/11517. Kmen. Tento plazmid se získal zavedením pLLC*80 do kmene HB101 E. coli se označil AJ12750. Tento kmen se uložil vNational Institute ofBioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (č. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod číslem FERM P-13136 ke kmeni 1. září 1992. Tento kmen byl zařazen do mezinárodní sbírky podle Budapešťské úmluvy 4. listopadu 1993, je uložen pod číslem FERM BP-4462. Plazmidy pLYSC2*l 17 a pLYSC2*126 není ještě uložen. Ale protože místa mutace jsou doloženy v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO94/11517, mohou se připravit zplazmidu pLYSCl*80, který se používá jako počátečný materiál.
<3> Studie podmínek selekce nového mutantního genu ΑΚΙΠ.
Transformant získaný zavedením pMLYSCl do kmene E. coli GT3, který je zcela deficientní na AK (thrAlOlób, metLM1005, lysC 1004), se označil GT3/pMLYSC2. Tímto způsobem vznikly GT3/pMLYSC2*80, GT3/pMLYSC2*117 a GT3/pMLYSC2*126. Kmen GT3/pMLYSC2 má plazmid, který obsahuje divoký typ lysC a ΑΚΙΠ kódovaná tímto genem lysC je samotný AK. Protože divoký typ AKIII, který je samotný AK, je inhibován L-lysinem, L-threoninem, L-isoleucinem, L-methioninem v přítomnosti dostatečného množství L-lysinu v minimálním médiu a nemůže se syntetizovat kyselina diaminopimeronová, která potlačuje jeho růst. Kmen obsahující plazmid s mutantním lysC, ve kterém se může uvolnit inhibice L-lysinem, může růst v minimálním médiu, které obsahuje potřebné množství L-lysinu. Izoloval se kmen, který je rezistantní na L-lysin a kmen nesoucí plazmid s mutantním genem lysC. ve kterém se uvolnila inhibice L-lysinem. Kmeny GT3/pMLYSC 2, GT3/pMLYSC2*80, GT3/pMLYSC2*117 aGT3/pMLYSC2*126 se inkubovaly na minimálním agarovém médiu, které obsahuje různé koncentrace L-lysinu. Účelem této inkubace bylo stanovit koncentraci inhibice růstu a podmínky selekce kmenů nesoucích plazmid. V Tabulce č. 1 je znázorněn růst transformantů na minimálním agarovém médiu, které obsahuje L-lysin v různých koncentracích. V tabulce č. 1 jsou + označeny transformanty, které rostou, +/- transformanty, které rostou slabě, a - označuje, že transformanty nerostou.
Tabulka č. 1: koncentrace L-lysinu a růst
| 0 0,2 0,4 0, 6 0,8 (M) | |
| GT3/pMLYSC2 | +/- - |
| GT3/pMLYSC2*80 | + + +/- |
| GT3/pMLYSC2’117 | + +/- _ _ _ |
| GT3/pMLYSC2‘126 | + +/- - |
Růst kmene GT3/pMLYSC2, který má divoký typ lysC byl zcela potlačen při koncentraci L-lysinu vyšší než je 0,2M. Kmeny GT3/pMLYSC2*80, GT3/pMLYSC2*117 aGT3/pMLYSC2*126, které nesou mutantní lysC. byly skoro potlačeny přidáním L-lysinu v koncentraci vyšší než 0,4M. To naznačuje, že mutant mající stále vyšší stupeň uvolnění inhibice ve srovnání s mutantním lysC, je možné získat selekcí za přítomnosti 0,4M L-lysinu. Zjistilo se, že tato inhibice růstu se eliminovala současným přidáním homoserinu a kyseliny diaminopimerinové.
Při zavádění mutací se použilo pro selekci kmene nesoucího plazmid s mutantním lysC minimální agarové médium M9 obsahující 0,4M L-lysin. Toto médium se v příkladu 1 nazývá selektivní médium.
-10CZ 295853 B6 <4> Mutageneze genu AKIII a vytvoření mutantního AKIII genu.
Při zavádění mutací do plazmidů pMLYSCl se používají dvě metody. Je to in vitro mutageneze, při které je plazmid přímo ošetřen hydroxylaminem a způsob PCR mutageneze, který poskytuje různé mutace. Očekávají se i mutace jiné než mutace z cystainu na thymin.
Dva mikroorganizmy s plazmidem pMLYSC2 byly ošetřeny 0,4M hydroxylaminem (objem roztoku obsahující 100μ1 směsi Ο,ΙΜ KH2PO4 a lmM EDTA (pH 6,0) a směs 1M hydroxylaminu a lmM EDTA (pH6,0) a 2 μg DNK byl upraven přidáním vody na 200 μΐ) při teplotě 75 °C po dobu 1 až 4 hodin. Takto skleněným prachem upravená DNK byla zavedena do kmene E. coli GT3, který je zcela AK deficientní. Vzniklý transformant se nanesl na médium (obsahující 1% L-půdu, 0,5% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl, 50mg/l ampicilinu a 1,5% agar), aby mohly vzniknout kolonie. Kolonie se replikovaly na selektivním médiu a kmeny schopné růst na selektivním médiu se vybraly jako kandidáti.
Náhodná mutageneze pomocí PCR se provedla metodou C. Cadwell et al. (Candwell, C. and. G.F. Joyce, PCR methods Applic. 2, 28, (1982)). To znamená, že fragment lysC se amplifíkoval shora zmiňovaným způsobem, za použití univerzálních primerů pro pMLYSC2 aM13. Tento fragment se štěpil s restrikčními enzymy Eco RI a Hind III a pak se začlenil do EcoRIHindlII místa pMWl 19. Vzniklý vektor se zavedl do kmene E. coli GT3, který je zcela AK defícientní. Transformant se nanesl na médium (obsahující 1% L-půdu, 0,5% kvasinkový extrakt, 0,5% NaCl, 50mg/l ampicilinu a 1,5% agar), aby mohly vzniknout kolonie. Kolonie se replikovaly na selektivním médiu a kmeny schopné růst na selektivním médiu se vybraly jako kandidáti. Z 47 kandidátních kmenů se získaly plazmidy. Přesněji 44 kmenů vzniklo mutagenezí hydroxylaminem, 3 kmeny vznikly náhodnou mutagenezí pomocí PCR. Určily se základní mutantní sekvence lysC a místa jejich mutace. Určení základních sekvencí se provedlo obvyklým způsobem za použití sekvenátoru DNK ABI model 3 73A (poskytla firma ABI). Výsledkem mutageneze hydroxylaminem byl mutantní kmen AKIII, který má čtyři typy (číslo 1, 6, 14 a 21) míst mutace. Výsledkem náhodné mutageneze pomocí PCR je mutantní kmen AKIII, který má tři typy míst mutace (čísla 28, 29 a 30) (tabulka č. 2).
-11 CZ 295853 B6
Tabulka č. 2
| mutant lyse | způsob mutageneze | misto mutace (aminokyselina) |
| č.l* | hydroxylamin | ACG-»ATG (344Thr—>Met) |
| č.6 | hydroxylamin | GAG—>AAG (250Glu->Lys) |
| č.14 | hydroxylamin | GAA->AAA (346Glu->Lys) CTT-»TTT (374Leu->Phe) |
| č.21 | hydroxylamin | GAG—>AAG (250G1U—>Lys) ACG—>ATG (364Thr->Met) |
| č.28 | PCR | GAT->GGT (202Asp—>Gly) TCT-ACCT (321Ser—>Pro) |
| δ.29 | PCR | CGC-»AGC (283Arg~>Ser) GCG-4ACG (333Ala~>Thr) TCG—»ACG (338Ser->Thr) GAA—»GAT (34 6G1U—>Asp) AAC-»AGC (414Asn~>Ser) |
| č.30 | PCR | ATG—>AAG (318Met~»Lys) TCT->CCT (321Ser~-»Pro) GTT->TTT |
(328Val->Phe)
GTG—>GGG (349Val—>Gly)
GAG—>GTG (450Glu->Val) nejde o sloučeninu podle vynálezu
- 12CZ 295853 B6
Těchto sedm plazmidů (pMLYSC2*Yl, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29 a pMLYSC2*Y30) bylo zavedeno do kmene GT3, který je zcela AK defícientní. Z transformantů se připravil bezbuněčný extrakt. Enzymatická aktivita AKIII se měřila použitím stejného shora popsaného způsobu. Produkce bezbuněčných extraktů a měření enzymatické aktivity AKIII se provedla podle způsobu E.R. Stadtman et al. (Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., and Robichon-Szulmajster, H., J. Biol. Chem. 236, 2033 (1961)). Při měření enzymatické aktivity AKIII se přidal do roztoku enzymatické reakce L-lysin v různých koncentracích, za účelem zjistit stupeň uvolnění inhibice L-lysinem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 3. Stupeň uvolnění inhibice ukazuje poměr zbytkové aktivity AK v přítomnosti 0,4M L-lysinu a aktivity AK bez přítomnosti L-lysinu.
Tabulka č. 3
| Kmen | Stupeň uvolnění zpětnovazebně inhibice |
| GT3/pMLYSC2*80 | 75 (%) |
| GT3/pMLYSC2'l 17 | 76 |
| GŤ3/pMÍL.YŠČ2ΎΓ | 56 |
| GT3/pMLYSC2*Y6 | 127 |
| GT3/pMLYSC2*Y14 | 87 |
| GT3/pMLYSC2’Y21 | 117 |
| GT3/pMLYSC2*Y28 | 114 |
| GT3/pMLYSC2*Y29 | 99 |
| GT3/pMLYSC2‘Y30 | 116 |
nejde o sloučeninu podle vynálezu
Ze shora uvedených výsledků je zřejmé, že mutantní AKIII, který vykazuje vyšší stupeň uvolnění inhibice, než běžný typický mutantní AKIII (mutantní AKIII kódovaný v GT3/pMLYSC2*80 a GT3/pMLYSC2*l 17) by mohl být získán způsobem selekce používané v tomto případě. Specifická aktivita založená na celkovém proteinu je obvykle ovlivněna podmínkami růstu buněk nebo přípravou vzorků. Specifická aktivita byla ekvivalentní specifické aktivitě divokého typu a běžným mutantům. Po zavedení mutace se nepozoroval skoro žádný pokles aktivity. Proto se očekávalo, že centrum aktivity AKIII a řídicí místo pro L-lysin jsou na sobě nezávislé.
Příklad 2: Získání mutantního genu (2) AKIII.
Gen lysC, kde 358 Ser byl nahrazen Leu se připravil zavedením místně specifické mutace za použití LA PCR in vitro mutagenizační soupravy (poskytlaTakara Shuzo Co., Ltd.). Jako templát se použito plazmid pLYSCl popsaný v publikacích Intematiol Laid-Open Pamphlet WO94/11517 a WO95/16042. Jak primer pro zavedení mutace se použil primer popsaný v tabulce sekvencí č. 4. Oba konce PCR amplifikovaného fragmentu se štěpily restrikčními endonukleázami EcoRI a Hindin a fragment se dále ligoval s fragmentem získaným štěpením pUC19 restriktázami EcoRI a HindlII, vznikl pLYSC358L. Shora uvedeným způsobem se připravil mutantní gen AKIII, ve kterém 354 Ser se mutagenizovala na Ile nebo Val. Pro tuto mutagenezi se použil primer popsaný v tabulce č. 5 nebo 6. Tento gen se ligoval s fragmentem získaným štěpením pUC19 restriktázami EcoRI a HindlII. Touto cestou vznikly plazmidy pLYSC345I apLYSC354V.
Fragmenty nesoucí gen lysC, které vznikly štěpením plazmidů pLYSCl*48, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSCl*150 a pLYSCl*158 restriktázami EcoRI a HindlII se začlenily do
-13CZ 295853 B6 restrikčního místa Eco-HindlII plazmidu pUC19 a výsledné fragmenty se označily pLYSC2*48, pLYSC2*117, pLYSC2*126, pLYSC2*150 a pLYSC2*158. Publikace Intemational Laid-Open Pamphlets WO94/11517 a WO95/16042 uvádí strukturu plazmidu pLYSCl a mutačních míst plasmidů pLYSCl*48, pLYSCl*117, pLYSCl*126, pLYSC2*150 a pLYSC2*158. Tyto plazmidy se mohou připravit ze shora zmiňovaného plazmidu pLYSCl *80.
V podstatě se připravil mutantní gen lysC, který má dva typy mutací za použití restrikčního míst SspI, jež je přítomné v blízkosti centra bodů mutace takto získaného monobazického mutantu lysC a SspI restrikčního místa, které se nachází po směru transkripce lysC v plazmidu pUC19. Plazmid pU2547M se připravil ligací fragmentu SssI, který obsahuje gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*48 s SspI fragmentem obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*158. Plazmid pU2347M se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícího gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*126 s fragmentem SspI, který obsahuje gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*158; plazmid pU2545L se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícího gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*48 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC2*117. Plazmid pU2358L se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícího gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*126 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC358L. Plazmid pU234V se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícího gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*126 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC345V. Plazmid pU2345I se připravil ligací fragmentu SspI obsahujícího gen lysC v oblasti proti směru transkripce plazmidu pLYSC2*126 s fragmentem SspI obsahujícím gen lysC v oblasti po směru transkripce plazmidu pLYSC3451. Protože místa mutace se nacházejí v plazmidech pLYSC2* 150 a pLYSC2* 126 více proti směru transkripce než restrikční místa Ssp, dibazický mutant lysC, který má tyto dvě místa mutace se připravil následujícím způsobem. Fragment DNK, který má dvě místa mutace, se amplifíkoval za použití plazmidu pLYSC2*126 jako templátu. Jako primer se použil oligonukleotid popsaný v tabulce sekvencí č. 7, dále se použila shora uvedená souprava. Oba konce výsledného fragmentu DNK se štěpily restriktázami EcoRI a HindlII a ligoval se s fragmentem získaný štěpením plazmidu pUC19 s restriktázou EcoRI a HindlII. Takto získaný produkt se označil pU1823D.
Stupeň uvolnění inhibice takto získaného dibazického lysC genového produktu (ΑΚΙΠ) ve srovnání s Lys se měřil způsobem, který se popisuje v příkladu 1. Stupeň uvolnění inhibice libovolného dibazického mutantního AklII byl vyšší než stupeň uvolnění inhibice monobazického mutantního AklII (tabulka č. 4). Mutantní lysC v plazmidech pLYSC582L, pLYSC345I a pLYSC345V je nový mutantní gen. Zpětnovazebná inhibice L-lysinem je uvolněna v každém genovém produktu. Ligace s jinými mutacemi zvyšuje stupeň uvolnění inhibice.
Produkt je také používaný jako prostředek pro konstrukci dibazického mutantního AKIII.
-14CZ 295853 B6
Tabulka č. 4
| Kmen | Místo mutace (aminokyselina) | Stupeň uvolněni zpětnovazebně inhibice (%) |
| GT3/pLYSC2*48 | 325Leu—Phe | 12 |
| GŤ3/pLYSC2*117 | 345Ser-»Leu | 75 |
| GT3/pLYSC2*126 | 323Gly—Asp | 5 |
| GT3/pLYSC2T150 | 318Met-»Ile | 8 |
| GT3/pLYSC2'158 | 347Val-Met | 3 |
| GT3/pU345I | 345Ser—Ile | 108 |
| GT3/pU345V | 345Ser—Val | 98 |
| GT3/pU358L | 358Ser-*Leu | 3 |
| GT3/pU2547M | 325Leu-*Phe, 347Val-Met | 90 |
| GT3/pU2347M | 323Gly-Asp, 347Val-4íet | 94 |
| GT3/pU2545L | 325Leu—Phe, 345Ser—Leu | 172 |
| GT3/pU2358L* | 323Gly—Asp, 358Ser-Leu | 18 |
| GT3/pU2345V | 323Gly-»Asp, 345Ser—Val | 109 |
| GT3/pU2345l | 323Gly—Asp, 345Ser-Ile | 152 |
| GT3/pU1823D | 318Met-.Ile, 323Gly-Asp | 91 |
* nejde o sloučeninu podle vynálezu
Příklad 3: Produkce L-lysinu pomocí fermentace za použití kmene, který má zavedený mutantní gen DDPS a mutantní gen ΑΚΠΙ.
Účinek produkce L-lysinu s ohledem na mutantní gen DDPS a mutantní gen ΑΚΠΙ se popisuje v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO95/16042. Za účelem zlepšit tento účinek mutantní gen ΑΚΠΙ získaný v příkladu 1 se dal dohromady s mutantním genem DDPS.
Kmen E. coli JM109, kdo které se zavedl plazmid RSF24P s mutantním genem DDPS se popisuje v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO95/16042, se označil AJ12395. Tento kmen byl uložen v instituci Nationl Institute of Bioscience and Human Technology of the Avency of Industrial Science and Technology (č, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragiken, 305) pod číslem uložení ferm P-13935 28. října 1993. Tento kmen se převedl do mezinárodní sbírky na základě Budapešťské dohody 1. listopadu 1994 pod novým číslem uložení FERM BP-4858.
Plazmidy RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFDY2547M, RSFDY2347M, RSFDY2545L, RSFDY2358L, RSFDY2345I a RSFDY1823D, jak se uvádí na obrázku č. 2, se připravily zjednoho typu, který se vybral ze skupiny plazmidů obsahující mutantní en ΑΚΠΙ pMLYSC2*Yl, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, pMLYSC2*Y28, pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30, pU2547M, pU2347M, pUM2545L, pU2358L, pU2545V, pU2345I a pU1823D.
Plazmid RSFD80 popsaný v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO95/16042 se používal jako kontrola. Kmen získaný zavedením plazmidů RSFD80 do kmene E. coli JMI09 se označil jako AJ12396. Tento kmen se uložil v instituci National Institute of Bioscience and
-15CZ 295853 B6
Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (č. 1-3, Higashi 1-chome, Twsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) pod depozitním číslem FERm P—13936 28. října 1993. Uvedený kmen se přenesl do mezinárodní sbírky na základě Budapešťské dohody 1. listopadu 1949 pod depozitním číslem FERM BP-4859.
Plazmidy získané shora popsaným způsobem RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFDY2547M, RSFDY2347M, RSFDY254L, RSFDY2358L, RSFDY2345V, RSFDY2345I a RSFDY1823D se zavedly do kmene B-399 obvyklým způsobem a vznikly kmeny, které produkují L-lysin. Hodnotila se produktivita ío L-lysinu shora uvedených kmenů. Hodnocení produktivity lysinu se provedlo s ohledem na kmen B-399/RSFD80, který se používal jako kontrola. Způsob získání kmene B-399 se popisuje v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO95/16042.
Inkubace se provedla v kultivačním médiu, které je vhodné pro produkci lysinu, při teplotě 37 °C 15 po dobu 48 hodin, za stálého míchání při rozmezí otáček 114 až 116, podle způsobu, který se popisuje v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO95/16042. Výsledky se uvádějí v tabulce č. 5.
Tabulka č. 5
| Kmen. | Množství vytvořeného hydrochloridu L-lysinu (g/1) |
| B-399/RSFD80 | 9,2 |
| B-399/RSFDY1 B-399/RSFDY6 B-399/RSFDY14 B-399/RSFDY21 B-399/RSFDY23· B-399/RSFDY29 B-399/RSFDY30 | 9/4 9/6 9,6 9.5 9.6 9,5 9,3 |
| B-399/RSFD2547M B-399/RSFD234.7M B-399/RSFD2545L B-399/RSFD2358L B-399/RSFD2345V B-399/RSFD23451 B-399/RSFD1823D | 9, 6 9.5 9.6 9.3 9.4 9,3 9, 6 |
Příklad 4: Produkce L-lysinu fermentací za použití kmene, do kterého se zavedl mutantní gen DDPS a mutantní gen AKIII.
V příkladu 3 se určilo, že produktivita L-lysinu by mohla být vylepšena, tak že bakterie rodu Escherichia ponesou mutantní gen DDPS a mutantní gen AKIH. Tento test se provedl a zjistilo se, že se může za tímto účelem použít i jiný hostitel.
Kmen E. coli W3110 (tyrA) se použil jako hostitel. Kmen W3110 (tyrA) se detailně popisuje v publikaci European Patent Laid-Open No. 488, 424/1992. Tato publikace popisuje velké množství kmenů, které se získaly zavedením plazmidu do kmene W3110 (tyrA). Například kmen, jež se získal zavedením plazmidu pHATer se označil jako kmen E. coli W3110 (tyrAj/pHATerm. Byl uložen v instituci National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of
Industrial Science and Technology (č. 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, 305) 18
-16CZ 295853 B6 listopadu 1991, na základě Budapešťské dohody pod depozitním číslem FERM BP-3653. Kmen W3110 (tyrA) se může také získat ztrátou plazmidu pHATerm zkmene E. coli W3110 ('tyrAWHATerm. Ztráta plazmidu se může uskutečnit obvyklým způsobem.
Plazmidy obsahující mutantní gen DDPS a mutantní gen ΑΚΙΠ, popis jejich začlenění se uvádí v příkladu 3, jmenovitě RSFDY1, RSFDY6, RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30, RSFDY2547M, RSFDY2347M, RSFDY2545L, RSFDY2358L, RSFDY2345I, RSFDY2345V a RSFDY1823D byly zavedeny do kmen W3110 (tyrA). Produktivita L-lysinu se hodnotila jako v příkladu 3. Jako kontrola se použil kmen W3110 (tyrA). do kterého se zavedl ío plazmid RSDF80. Výsledky se uvádí v tabulce č. 6.
Tabulka č. 6
| Kmen | Množství vytvořeného hydrochloridu L-lysinu (g/1) |
| W3110(tyrA)/RSFD80 | 8,9 |
| W3110(tyrA)/RSFDY1 | 9,1 |
| W3110(tyrA)/RSFDY6 | 9,3 |
| W3110(tyrA)/RSFDY14 | 9,3 |
| W3110(tyrA)/RSFDY21 | 9,2 |
| W3110(tyrA)/RSFDY28 | 9,3 |
| W3U0(tyrA)/RSFDY29 | 9,2 |
| W3110(tyrA)/RSFDY30 | 9,0 |
| W3110(tyrA)/RSFD2547M | 9,3 |
| W3110(tyrA)/RSFD2347M | 9,2 |
| W3110(tyrA)/RSFD2545L | 9,3 |
| W3110(tyrA)/RSFD2358L | 9,0 |
| W3110(tyrA)/RSFD2345V | 9,1 |
| W3110(tyrA)/RSFD2345I | 9,0 |
| W3110(tyrA)/RSFD1823D | 9,3 |
Příklad 5: Produkce L-threoninu fermentací za použití kmene, do kterého se zavedl mutantní gen AKIII.
Kmen E. coli B-3996 produkuje threonin a jeho produktivita je nejvyšší z kmenů, které jsou doposud známi. Proto kmen B-3996 se použil jako hostitel k hodnocení mutantního genu AKIII. Uvedený kmen B-3996 se popisuje v americkém patentu US 5 175 107 a je uložen v instituci Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding pod depozitním číslem BKIIIM B-3996. Mezi mutantními geny, které mají vysokou produktivitu L-lysinu, se vybraly tři typy mutantních genů (mutantní AKIII geny RSFDY6, RSFE254M a RSFDY1823D) a podrobily se testu. Za účelem zvýšit expresi mutantního AKIII genu, mutantní AKIII gen přítomný v plazmidu pMLYSC*Y6 se ligo val s oblastí ležící po směru transkripce od promotoru lacZ plazmidu pUC19 (poskytla Takara Shuzo Co., Ltd.). Takto nově vytvořený plazmid se označil pLLC*Y6 (Obr. č. 3). Protože vplazmidech pU2547M a pU1823D je mutantní gen
AKIII původně umístěn po směru transkripce od promotoru lacZ plazmidu pUC19 (poskytla Takara Shuzo Co., Ltd.), použil se v této formě.
Tyto plazmidy se zavedly do kmene B-3996 obvyklým způsobem a provedlo se hodnocení. Inkubace proběhla způsobem popsaným v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet 35 WO 94/11517.
-17CZ 295853 B6
Plazmidy pLLC*Y6, pU2547M a pU1823D se transformovaly do kmene B-3996 a transformanty se inkubovaly v přítomnosti a v nepřítomnosti lysinu o koncentraci lg/1. Hostitelský kmen B-3996 samotný a B-3996/pLLC*80, který se popisuje v publikaci Intemational Laid-Open Pamphlet WO94/11517, se použily jako kontrolní kmeny.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 7. Poměr výtěžek spotřebovaného cukru v přítomnosti lysinu ku výtěžek spotřebovaného cukru bez přítomnosti lysinu ukazuje citlivost na lysin, což se uvádí v tabulce č. 7. V případě kmene B-3996 pokles výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci v přítomnosti lysinu je přibližně 0,74, vztaženo k výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci bez přítomnosti lysinu. V případě kmene B-3996/pLLC*80 pokles výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci v přítomnosti lysinu je přibližně 0,9, vztaženo k výtěžku spotřebovaného cukru při inkubaci bez přítomnosti lysinu. Nově získané mutantní geny AKIII mají o málo vyšší produktivitu threoninu a citlivost na lysin.
Tabulka č. 7
| Kmen | Množství přidaného L- lysinu (g/1) | Výtěžek spotřebovaného cukru (%) | Citlivost na lysin |
| B-3996 | 0 1 | 30,7 22, 6 | 0,74 |
| B~3996/pLLC’8O | 0 1 | 39, 7 35,6 | 0, 90 |
| B-3996/pLLC'Y6 | 0 1 | 40, 5 39,2 | 0, 97 |
| B-3996/pU2547M | 0 1 | 40,7 39,5 | 0, 97 |
| B-3996/pU1823D | 0 1 | 41, 4 40, 5 | 0, 98 |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. DNK bakterií patřící do rodu Escherichia, která kóduje aspartokinázu ΙΠ a má v kódující oblasti mutaci, která uvolňuje zpětnovazebnou inhibici zmíněné aspartokinázy III lysinem, přičemž zmíněná mutace je:mutace, při které 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen jiným zbytkem aminokyseliny a 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny;mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny,-18CZ 295853 B6 mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 250 zbytek glutamové kyseliny je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 374 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 364 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 202 zbytek kyseliny aspartové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, mutace, při které 283 zbytek argininu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny nebo mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem jiné aminokyseliny.
- 2. DNK podle nároku 1, kde mutace je mutace, při které 318 zbytek methioninu aspartokinázy III je nahrazen zbytkem izoleucinu a 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 323 zbytek glycinu je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 347 zbytek valinu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 325 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu a 345 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem leucinu, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lyshu, mutace, při které 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu a 374 zbytek leucinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu, mutace, při které 250 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem lysinu a 364 zbytek threoninu je nahrazen zbytkem methioninu, mutace, při které 202 zbytek kyseliny aspartové je nahrazen zbytkem glycinu a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem prolinu, mutace, při které 283 zbytek argininuje nahrazen zbytkem šeřinu, 333 zbytek alaninu je nahrazen zbytkem threoninu, 338 zbytek šeřinu je nahrazen zbytkem threoninu, 346 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem kyseliny aspartové a 414 zbytek asparaginu je nahrazen zbytkem šeřinu, nebo-19CZ 295853 B6 mutace, při které 318 zbytek methioninu je nahrazen zbytkem lysinu a 321 zbytek šeřinu je nahrazen zbytek prolinu, 328 zbytek valinu je nahrazen zbytkem fenylalaninu, 349 zbytek valinu je nahrazen zbytkem glycinu a 405 zbytek kyseliny glutamové je nahrazen zbytkem valinu.
- 3. Rekombinantní DNK, která vznikla ligací DNK podle nároku 1 s vektorem DNK, jež je schopný se samostatně replikovat v buňkách bakterií rodu Escherichia.
- 4. Mikroorganizmus rodu Eschericia, vyznačující se tím, že nese DNK podle nároku 1.
- 5. Způsob výroby L-aminokyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje inkubaci mikroorganizmu podle nároku 4, který má schopnost produkovat L-aminokyselinu ve fermentačním médiu, produkci a akumulaci L-aminokyseliny ve zmíněné kultuře a získání L-aminokyseliny z kultury.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznaču j ící se tí m , že L-aminokyselinaje L-lysinnebo L-threonin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27211496A JP4088982B2 (ja) | 1996-10-15 | 1996-10-15 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ327297A3 CZ327297A3 (cs) | 1998-06-17 |
| CZ295853B6 true CZ295853B6 (cs) | 2005-11-16 |
Family
ID=17509288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19973272A CZ295853B6 (cs) | 1996-10-15 | 1997-10-15 | DNA kódující aspartokinázu a způsob výroby L-aminokyseliny |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5932453A (cs) |
| EP (1) | EP0837134A3 (cs) |
| JP (1) | JP4088982B2 (cs) |
| KR (1) | KR100430168B1 (cs) |
| CN (1) | CN1110560C (cs) |
| AU (1) | AU725935B2 (cs) |
| BR (1) | BR9705038B1 (cs) |
| CA (1) | CA2214498C (cs) |
| CZ (1) | CZ295853B6 (cs) |
| HU (1) | HU225538B1 (cs) |
| ID (1) | ID18631A (cs) |
| MY (1) | MY138770A (cs) |
| PE (1) | PE44399A1 (cs) |
| PL (1) | PL192391B1 (cs) |
| RU (1) | RU2204604C2 (cs) |
| SK (1) | SK139297A3 (cs) |
| ZA (1) | ZA979229B (cs) |
Families Citing this family (69)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2175351C2 (ru) * | 1998-12-30 | 2001-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот |
| BRPI0016995B1 (pt) * | 2000-01-21 | 2016-03-08 | Ajinomoto Kk | bactéria escherichia coli geneticamente modificada, e, método para produzir l-lisina |
| DE10046934A1 (de) * | 2000-09-21 | 2002-04-18 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
| US20030017554A1 (en) * | 2000-11-15 | 2003-01-23 | Mechthild Rieping | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| JP2002209596A (ja) * | 2001-01-19 | 2002-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| US20030054503A1 (en) * | 2001-04-03 | 2003-03-20 | Degussa Ag | Process for the production of L-amino acids using strains of the family enterobacteriaceae that contain an attenuated dgsA gene |
| US6579705B2 (en) * | 2001-04-04 | 2003-06-17 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Process for preparing non-proteinogenic L-amino acids |
| US7172883B2 (en) * | 2001-07-06 | 2007-02-06 | Degussa Ag | Process for L-amino acid production using Enterobacteriaceae by enhancing ahpC or ahpF encoding alkyl hydroperoxide reductase |
| BR0304860A (pt) * | 2002-11-11 | 2004-08-31 | Ajinomoto Kk | Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia |
| RU2413001C2 (ru) * | 2005-07-18 | 2011-02-27 | Эвоник Дегусса Гмбх | Применение диметилдисульфида для продукции метионина микроорганизмами |
| JP2007185184A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2007086546A1 (en) * | 2006-01-26 | 2007-08-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of enterobacteriaceae family with attenuated expression of the aldh gene |
| WO2007086618A1 (en) | 2006-01-30 | 2007-08-02 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid |
| JP2009095237A (ja) * | 2006-02-02 | 2009-05-07 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2009118740A (ja) * | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2351830B1 (en) * | 2006-03-23 | 2014-04-23 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA |
| JP2009060791A (ja) | 2006-03-30 | 2009-03-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2007873B1 (en) * | 2006-04-18 | 2015-11-18 | Ajinomoto Co., Inc. | A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE |
| JP2009165355A (ja) * | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2035569A1 (en) * | 2006-06-01 | 2009-03-18 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the rcsa gene |
| RU2337961C2 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН rspAB |
| CN101490251B (zh) * | 2006-07-19 | 2016-06-29 | 味之素株式会社 | 使用肠杆菌科细菌产生l-氨基酸的方法 |
| CN1928104B (zh) * | 2006-09-07 | 2010-09-22 | 山东西王糖业有限公司 | 一种赖氨酸发酵液的二次发酵方法 |
| JP2010017081A (ja) * | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| WO2008072761A2 (en) * | 2006-12-11 | 2008-06-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing an l-amino acid |
| RU2006143864A (ru) * | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2006145712A (ru) * | 2006-12-22 | 2008-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина |
| JP2010088301A (ja) * | 2007-02-01 | 2010-04-22 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010263790A (ja) * | 2007-09-04 | 2010-11-25 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
| RU2395579C2 (ru) * | 2007-12-21 | 2010-07-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| JP5217780B2 (ja) * | 2008-02-08 | 2013-06-19 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| DK2262894T3 (da) | 2008-03-03 | 2014-09-29 | Global Bio Chem Technology Group Company Ltd | Rekombinante mikroorganismer og fremgangsmåde til fremstilling af L-lysin |
| GB0809169D0 (en) | 2008-05-20 | 2008-06-25 | Sinvent As | Method of L-lysine production |
| JP5504608B2 (ja) * | 2008-10-23 | 2014-05-28 | 東レ株式会社 | １，５−ペンタンジアミンの製造方法 |
| JP2012029565A (ja) | 2008-11-27 | 2012-02-16 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2382320B1 (en) | 2009-01-23 | 2018-04-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration |
| JP5521347B2 (ja) | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2460883A4 (en) | 2009-07-29 | 2013-01-16 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID |
| JP2012223091A (ja) | 2009-08-25 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2012223092A (ja) | 2009-08-28 | 2012-11-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2363489A1 (en) * | 2010-03-03 | 2011-09-07 | Technische Universität Hamburg-Harburg | Enzyme Aspartokinase III having a reduced L-lysine feedback inhibition |
| BR112013010268B1 (pt) | 2010-10-28 | 2020-09-08 | Adisseo France S.A.S. | Método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-dhb), malato quinase e seu uso, malato semialdeído desidrogenase e seu uso, dhb desidrogenase, sequência de ácido nucleico isolado, gene quimérico, vetor de expressão, microorganismo hospedeiro, processo de produção de 2,4-dhb, uso de uma metilbutiraldeído redutase ou de uma semialdeído succínico redutase |
| JP2015013812A (ja) | 2011-11-01 | 2015-01-22 | 味の素株式会社 | 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法 |
| CN103773745B (zh) * | 2012-10-18 | 2018-03-23 | 中粮生物化学（安徽）股份有限公司 | 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用 |
| CN103215286B (zh) * | 2012-11-12 | 2015-11-25 | 江南大学 | 用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用 |
| CN104099308B (zh) * | 2013-04-03 | 2019-05-31 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | 一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其应用 |
| CN105008532B (zh) | 2013-05-13 | 2017-07-21 | 味之素株式会社 | L‑氨基酸的制造方法 |
| CN103361289B (zh) * | 2013-07-08 | 2014-12-31 | 南京工业大学 | 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法 |
| CN106459857B (zh) | 2013-10-02 | 2019-04-19 | 味之素株式会社 | 氨控制装置及氨控制方法 |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| EP2886651B1 (en) | 2013-10-21 | 2018-08-22 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid |
| BR112016008830B1 (pt) | 2013-10-23 | 2023-02-23 | Ajinomoto Co., Inc | Método para produzir uma substância alvo |
| EP3094718A4 (en) * | 2014-01-16 | 2017-06-07 | Calysta, Inc. | Microorganisms for the enhanced production of amino acids and related methods |
| CN105505969A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用 |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| CN106978405B (zh) * | 2016-01-18 | 2021-03-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
| EP3420096A1 (en) | 2016-02-25 | 2019-01-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| BR112021011882A2 (pt) | 2018-12-27 | 2021-09-08 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para produzir um l-aminoácido básico |
| WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
| JP7524909B2 (ja) | 2019-04-05 | 2024-07-30 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造方法 |
| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
| CN119012914A (zh) | 2022-04-04 | 2024-11-22 | 味之素株式会社 | 防治寄生植物的方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5243039A (en) * | 1989-04-10 | 1993-09-07 | Regents Of The University Of Minnesota | Bacillus MGA3 aspartokinase II gene |
| EP0485970A3 (en) * | 1990-11-13 | 1992-07-01 | Yeda Research And Development Company Limited | Transgenic plants overproducing threonine and lysine |
| JPH07504821A (ja) * | 1992-03-19 | 1995-06-01 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 植物の種子のリシンおよびスレオニン含有量を増加させるための核酸断片および方法 |
| ATE203769T1 (de) * | 1992-11-10 | 2001-08-15 | Ajinomoto Kk | Dna, die aspartokinase iii-mutanten kodiert und ihre verwendung zur herstellung von l-threonin durch fermentation |
| PL314696A1 (en) * | 1993-11-30 | 1996-09-16 | Du Pont | Chiaeric genes and method of increasing lysine content in soya, maize and rape plant seeds |
| JPH07155184A (ja) * | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−リジンの製造法 |
| IL113685A0 (en) * | 1994-05-13 | 1995-08-31 | Du Pont | Nucleic acid fragments chimeric genes and methods for increasing the methionine content of the seeds of plants |
| WO1996041871A1 (fr) * | 1995-06-13 | 1996-12-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine par fermentation |
-
1996
- 1996-10-15 JP JP27211496A patent/JP4088982B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-10-10 MY MYPI97004766A patent/MY138770A/en unknown
- 1997-10-13 SK SK1392-97A patent/SK139297A3/sk unknown
- 1997-10-13 PE PE1997000901A patent/PE44399A1/es not_active IP Right Cessation
- 1997-10-13 ID IDP973423A patent/ID18631A/id unknown
- 1997-10-14 BR BRPI9705038-5B1A patent/BR9705038B1/pt active IP Right Grant
- 1997-10-14 AU AU40965/97A patent/AU725935B2/en not_active Expired
- 1997-10-14 RU RU97117473/13A patent/RU2204604C2/ru active
- 1997-10-15 KR KR1019970052674A patent/KR100430168B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-15 EP EP97117878A patent/EP0837134A3/en not_active Ceased
- 1997-10-15 CA CA2214498A patent/CA2214498C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-15 PL PL322611A patent/PL192391B1/pl unknown
- 1997-10-15 CZ CZ19973272A patent/CZ295853B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-15 CN CN97122854A patent/CN1110560C/zh not_active Ceased
- 1997-10-15 ZA ZA9709229A patent/ZA979229B/xx unknown
- 1997-10-15 US US08/950,737 patent/US5932453A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-15 HU HU9701652A patent/HU225538B1/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1110560C (zh) | 2003-06-04 |
| HUP9701652A3 (en) | 2000-12-28 |
| PE44399A1 (es) | 1999-05-05 |
| CA2214498A1 (en) | 1998-04-15 |
| SK139297A3 (en) | 1998-06-03 |
| CZ327297A3 (cs) | 1998-06-17 |
| AU725935B2 (en) | 2000-10-26 |
| BR9705038A (pt) | 1999-04-06 |
| EP0837134A3 (en) | 1999-09-22 |
| JPH10113183A (ja) | 1998-05-06 |
| BR9705038B1 (pt) | 2014-11-04 |
| MY138770A (en) | 2009-07-31 |
| HU225538B1 (en) | 2007-02-28 |
| ZA979229B (en) | 1998-05-11 |
| KR19980032831A (ko) | 1998-07-25 |
| CA2214498C (en) | 2011-09-13 |
| CN1182133A (zh) | 1998-05-20 |
| RU2204604C2 (ru) | 2003-05-20 |
| ID18631A (id) | 1998-04-30 |
| HU9701652D0 (en) | 1997-12-29 |
| JP4088982B2 (ja) | 2008-05-21 |
| PL322611A1 (en) | 1998-04-27 |
| KR100430168B1 (ko) | 2004-07-19 |
| HUP9701652A2 (hu) | 1999-06-28 |
| MX9707921A (es) | 1998-10-31 |
| PL192391B1 (pl) | 2006-10-31 |
| US5932453A (en) | 1999-08-03 |
| EP0837134A2 (en) | 1998-04-22 |
| AU4096597A (en) | 1998-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ295853B6 (cs) | DNA kódující aspartokinázu a způsob výroby L-aminokyseliny | |
| RU2113484C1 (ru) | Фрагмент днк, кодирующий аспартокиназу iii, способ получения l-треонина | |
| EP0733710B1 (en) | Process for producing l-lysine by fermentation | |
| JP2000139471A (ja) | 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法 | |
| CZ285915B6 (cs) | Materiály a metody pro biosyntézu serinu a produktů odvozených od serinu | |
| EP0834559B1 (en) | Process for producing l-lysine by fermentation | |
| KR100319566B1 (ko) | 발효법에의한l-트레오닌의생산방법 | |
| MXPA97007921A (en) | Procedure for the production of l-aminoacidomediantefermentac | |
| MXPA97010044A (en) | Method to produce l-lysine by means of fermentation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20171015 |