CN105505969A

CN105505969A - 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用

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Publication number: CN105505969A
Application number: CN201410504828.0A
Authority: CN
Inventors: 郑平; 曹国强; 马红武; 张彦飞; 孙际宾; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明公开了一种提高L-苏氨酸转化率的方法，所述方法增强L-苏氨酸生产菌株中的丙酮酸羧化酶和天冬氨酸激酶的酶活，从而显著提高所述菌株产生苏氨酸时的糖酸转化效率。本发明还公开了利用所述方法获得的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株以及利用所述菌株生产L-苏氨酸以及以L-苏氨酸为前体的其它下游产物的方法。

Description

一种提高L-苏氨酸转化率的方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。具体地说，本发明涉及通过增强合适的苏氨酸生产菌株中的丙酮酸羧化酶和天冬氨酸激酶的酶活来提高L-苏氨酸的转化率的方法；丙酮酸羧化酶和天冬氨酸激酶得到增强的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株；以及本发明还涉及该菌株的用途。

背景技术

L-苏氨酸是人类和动物营养中最重要的必需氨基酸，在食品工业、养殖业和饲料工业中有着十分重要的地位。近年来，其市场需求稳步增加，世界市场销售量已经突破百万吨规模。目前，苏氨酸主要采用微生物发酵法来生产。在大肠杆菌中L-苏氨酸的合成途径是以天冬氨酸为前体，通过五步反应生产苏氨酸(如图1所示)。

工业上主要由大肠杆菌进行发酵生产。由于苏氨酸在经济生活中的重要性，研究人员不断对生产苏氨酸的大肠杆菌进行改造。目前的苏氨酸生产菌株主要通过诱变，筛选等方法来进行改善，但近些年来，随着基因工程技术的发展，代谢工程技术越来越多地应用于苏氨酸大肠杆菌改造。

目前已经有许多报道通过改造大肠杆菌的基因来提高L-苏氨酸的产量的方法。EP1687408A1报道了将大肠杆菌苏氨酸操纵子启动子改造为组成型启动子后增强了大肠杆菌的苏氨酸生产能力；EP1179597A1报道了通过增加转氨酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的酶活，增强了苏氨酸的合成能力；CN1323171C报道了在大肠杆菌中增强来源于谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶提高了改造菌株的氨基酸产量，该专利中也提及通过此方法可以提高苏氨酸产量。

虽然苏氨酸生产菌株产酸量是衡量菌株水平的一个重要指标，糖酸转化率对氨基酸生产企业来说更加重要，因为它是影响生产成本的更关键的因素，尤其是在目前能源、生产原料价格日益上涨，企业在盈利空间被进一步压缩的巨大压力下，提升苏氨酸生产菌株的糖酸转化率更为迫切。然而，目前本领域对于如何提高糖酸转化率的研究甚少，已有的研究仅仅着眼于通过发酵工艺控制的优化来达到提升糖酸转化效率的目的，在代谢工程改造方面的研究还比较少。

此外，由于L-苏氨酸亦可作为其他代谢物，例如L-异亮氨酸合成的前体，大肠杆菌中异亮氨酸经过苏氨酸脱氨酶等七步反应催化获得异亮氨酸，如果能够获得L-苏氨酸产量和转化率均显著提高的生产菌株，对于具有经济价值的其它产物的生产也都具有非常重要的意义。

因此，本领域应当继续开发新的方法，不仅能够提高苏氨酸的产量，更要能够显著的提高从葡萄糖到苏氨酸的转化效率。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种提高L-苏氨酸转化率的方法，或构建转化率提升的L-苏氨酸产生菌株的方法，采用该方法可以从本身能产生L-苏氨酸的菌株、本身不产生L-苏氨酸的菌株、或本身经修饰而产生L-苏氨酸的菌株出发，构建转化率显著提高的L-苏氨酸生产菌株。

本发明的另一目的是提供利用本发明方法构建的转化率提升的L-苏氨酸产生菌株，所述菌株在生产L-苏氨酸时的转化率显著提高。

本发明的再一目的是提供利用本发明的转化率提升的L-苏氨酸产生菌株高转化率地产生L-苏氨酸的方法。

在第一方面，本发明提供一种提高L-苏氨酸转化率的方法，或构建转化率提升的L-苏氨酸生产菌株的方法，所述方法包括：

a)增强适合生产L-苏氨酸的菌株中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性。

在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶是：

(A)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽；或

(B)将SEQIDNO:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(A)所述多肽功能的由SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽；

所述丙酮酸羧化酶是：

(C)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；或

(D)将SEQIDNO:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(C)所述多肽功能的由SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。

在进一步优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。

在另一优选的实施方式中，所述增强酶的活性可通过以下方法之一或组合来实现：表达该酶的同源或异源的编码基因，和/或增加所述酶的编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或通过SD序列改造一增加所述编码基因的转录强度，和/或通过改造其调控蛋白来增加所述编码基因的表达强度。

在另一优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的编码基因如SEQIDNO:3所示；所述丙酮酸羧化酶的编码基因如SEQIDNO:5所示。

在优选的实施方式中，所述方法在步骤a)之前还包括：将编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶、编码高丝氨酸激酶和编码苏氨酸合成酶的基因导入适合L-苏氨酸生产的菌株。

在优选的实施方式中，包含编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶、编码高丝氨酸激酶和编码苏氨酸合成酶的基因表达框的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

在优选的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或L-苏氨酸产量。

在第二方面，本发明提供一种转化率提升的L-苏氨酸生产菌株，所述菌株中的天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性增强。

在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶是：

(A)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽；或

所述丙酮酸羧化酶是：

(C)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；或

在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。

在另一优选的实施方式中，所述菌株为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；优选大肠杆菌。

在优选的实施方式中，所述菌株本身具有L-苏氨酸合成能力。

在优选的实施方式中，所述菌株通过本发明第一方面所述的方法构建。

在第三方面，本发明提供一种产生L-苏氨酸的方法，所述方法包括：

1)培养本发明第二方面所述的L-苏氨酸生产菌株，从而得到L-苏氨酸；和

2)从1)的发酵培养体系中获得L-苏氨酸。

在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述L-苏氨酸生产菌株的用途，所述菌株用于产生L-苏氨酸和/或产生以L-苏氨酸为前体的下游产物。

在优选的实施方式中，所述以L-苏氨酸为前体的下游产物是L-异亮氨酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是以天冬氨酸为前体，通过五步反应生产苏氨酸的示意图；

图2是重组质粒pwsk29-pyc-lysC的构建过程的示意图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现通过增强天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶可以大幅度提高苏氨酸生产菌株的转化率。在此基础上完成了本发明。

术语定义

本文所用的术语“外源性”是指某体系中包含了原来不存在的物质。例如，通过转化等方式在某菌株中引入该菌株中原本不存在的编码基因，则该基因对于该菌株是“外源性”的。

本文所用的术语“增强”是指增加、提高、增大或升高某种蛋白，例如酶的活性。鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员也不难理解本文所用的“增强”还应包括通过表达酶的异源编码基因而增强其活性。在具体的实施方式中，增强酶的活性可以通过表达酶的内源或异源性编码基因，和/或增加所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区或稀有密码子以增强翻译强度，和/或修改编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性、解除蛋白质的反馈抑制等方法来实现。

天冬氨酸激酶(lysC)和丙酮酸羧化酶(pyc)

本文所用的术语“天冬氨酸激酶”是指由lysC基因编码，具有天冬氨酸激酶活性，可催化天冬氨酸到天冬氨酸磷酸的酶，其是苏氨酸合成途径中的关键酶。本文所用的术语“丙酮酸羧化酶”是指由pyc基因编码，可催化丙酮酸到草酰乙酸的酶。大肠杆菌中天然不存在此酶，其属于外源性蛋白。本文实施例中涉及的pyc基因来源于菌株Rhizobuimetli652。

基于现有技术的知识，本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，MolecularBiologyofTheGene，第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

因此，在具体的实施方式中，本发明的天冬氨酸激酶可以是：(a)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO:4所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a)所述多肽功能的由SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。

类似地，在具体的实施方式中，本发明的丙酮酸羧化酶可以是：(a)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a)所述多肽功能的由SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。在优选的实施方式中，本发明的丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。

在本发明中，本发明的天冬氨酸激酶或丙酮酸羧化酶包括与氨基酸序列SEQIDNO:4或6所示的天冬氨酸激酶或丙酮酸羧化酶相比，有至多20个、较佳地至多10个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr

Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

thrA、thrB和thrC基因

本文所述的thrA基因编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶，thrB基因编码高丝氨酸激酶，thrC基因编码苏氨酸合成酶。

在L-苏氨酸生产领域，采用thrA基因、thrB基因和thrC基因过表达的菌株是常规手段。三种基因处于同一基因表达框中(thrABC)，因此，可以克隆得到包含它们的基因表达框，连接入表达载体，从而得到三种基因的过表达载体。

在具体的实施方式中，上述基因表达框的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。基于现有技术的知识和本发明的教导，本领域技术人员应该理解，本发明的创新之处并不在于thrA基因、thrB基因和thrC基因；因此，实施例中所用的SEQIDNO:1所示核苷酸序列仅仅是举例的目的，来自其它物种的、与SEQIDNO:1所示核苷酸序列有一定差异的核苷酸序列也可以应用于本发明，只要它们具备与SEQIDNO:1所示核苷酸序列相同的功能。

本发明的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株

本发明人出乎意料的发现天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性增强的菌株的糖酸转化率显著提高。

因此，本发明提供其中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性增强的L-苏氨酸生产菌株。

在具体的实施方式中，所述天冬氨酸激酶是：

(A)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽；或

所述丙酮酸羧化酶是：

(C)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；或

本发明的菌株可以是本身具有L-苏氨酸合成能力；也可以是本身不具有，经改造或修饰而具有L-苏氨酸合成能力。

在具体的实施方式中，所述菌株选自埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。在优选的实施方式中，所述菌株是大肠杆菌(Escherichiacoli)。

本发明的转化率提升的L-苏氨酸菌株具备优异的生产特性本发明的菌株对糖酸的转化率得到显著提高。

在具体的实施方式中，与天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性增强前相比，本发明菌株发酵产生L-苏氨酸的糖酸的转化率增加50％以上；优选地，增加100％以上；最优选地，增加200％。

本发明的转化率提升的L-苏氨酸菌株的用途

基于本发明的教导，本领域技术人员会知晓本发明的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株对糖酸的转化率也显著提高，同时L-苏氨酸产量也有一定程度提高。而基于现有技术知识，本领域技术人员可进一步明白，本发明的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株还可用于产生以L-苏氨酸为前体的衍生物，例如L-异亮氨酸。

转化率提升的L-苏氨酸生产菌株的构建

发明人出乎意料地发现通过增强天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶可以大幅度提高苏氨酸生产菌株的转化率，基于此，本发明提供一种转化率提升的L-苏氨酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：增强适合生产L-苏氨酸的菌株中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性。所述天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶可以是以上“天冬氨酸激酶(lysC)和丙酮酸羧化酶(pyc)”部分所述。

基于现有技术知识，本领域技术人员知晓增强适合生产L-苏氨酸的菌株中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性的各种技术手段。在具体的实施方式中，所述增强酶的活性可通过以下方法之一或组合来实现：表达同源或异源的该酶的编码基因，和/或增加所述菌株中所述编码基因的拷贝数，和/或改造所述编码基因的启动子以增强转录启动速度，和/或修改携带有所述编码基因的信使RNA的翻译调控区以增强翻译强度，和/或通过SD序列改造一增加所述编码基因的转录强度，和/或通过改造其调控蛋白来增加所述编码基因的表达强度。

在另一具体的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或L-苏氨酸产量以验证所得菌株。

基于上文所述，本领域技术人员可以理解，本发明的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株的构建方法适用于各种菌株，只要该菌株适于产生L-苏氨酸。

鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还应明白本发明是通过增强起始菌株中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性实现的。因此，只要通过以上手段来构建或改造菌株，进而提高产生L-苏氨酸时的转化率或由此得到的菌株均应落在本发明的保护范围内，本发明的保护范围并不限于实施例中采用的具体方法和得到的示例性菌株；换言之，本领域技术人员可以采用任何已知的方法，只要该方法能够增强上述两个酶的活性，这样的构建方法以及所构建的转化率提升的L-苏氨酸生产菌株均应落在本申请的保护范围内。

鉴于本发明的发明点以及本领域的现有技术知识，本领域技术人员还应知晓本发明的起始菌株可以是本身能产生L-苏氨酸的菌株，也可以是本身不产生L-苏氨酸的菌株，还可以是本身经改造或修饰而产生L-苏氨酸的菌株。

因此，在进一步的实施方式中，本发明的方法在增强起始菌株中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性的步骤(a)之前，还可以包括将编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶、编码高丝氨酸激酶和编码苏氨酸合成酶的基因导入适合L-苏氨酸生产的菌株的步骤。

本发明的优点：

1.本发明菌株产生L-苏氨酸时的转化率大大提高；

2.本发明菌株的L-苏氨酸产量也得到一定程度的提高；

3.通过增强起始菌株中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性来显著提高糖酸转化率，为工程改造L-苏氨酸生产菌株提供了新的思路；

4.本发明构建的L-苏氨酸菌株无论在表观上，还是在实质上都产生了降低企业运营成本、提升经济效益的技术效果，因而具备重大的经济意义和社会意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料与方法

本发明实施例所用的DNA聚合酶是购自北京全式金公司的Fastpfu；

限制性内切酶及DNA连接酶等均购自Fermentas公司；

酵母粉和蛋白胨购自英国Oxoid公司产品；

琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；

葡萄糖以及其他常用化学试剂均购自国药；

质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，相关操作均严格按照说明书执行；

质粒构建测序验证由华大基因(北京)完成；

DH5α感受态细胞购自北京全式金公司；

LB培养基成分：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，固体培养基中添加2％的琼脂粉；抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/mL，卡那霉素30μg/mL。

苏氨酸的检测方法：利用高效液相色谱的方法进行检测。

葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的SBA-40D生物传感分析仪进行检测。

转化率的计算：转化率也叫物料转化率，数值上等于发酵过程中所消耗的葡萄糖与发酵结束时产生的苏氨酸总量之比值，常用百分比表示，可以是摩尔比(mol％)，也可以是重量比(wt％)。本专利采用重量比。

实施例

实施例1.构建过表达thrABC基因的苏氨酸生产菌株

发明人首先构建了能够生产苏氨酸的菌株，通过增强大肠杆菌中thrA、thrB和thrC基因的表达来实现。构建了能够过表达thrA、thrB和thrC基因的载体，将其导入大肠杆菌MG1655(获自ATCC700926，可参考BlattnerFR等,ThecompletegenomesequenceofEscherichiacoliK-12.Science277:1453-62(1997))，和BW25113(来源于CGSC(美国耶鲁大学大肠杆菌保藏中心))，从而构建能够生产苏氨酸的大肠杆菌菌株MGthrABC。

具体过程如下：

37℃，将大肠杆菌MG1655在LB培养基中，以200rpm培养12-16h，然后收集细胞。采用Biomiga基因组小提试剂盒提取基因组DNA。以大肠杆菌MG1655基因组为模板，通过PCR获得野生型thrABC基因表达框。

PCR扩增：以CGCGGATTCAGCTTTTCATTCTGACTGCAACGGGC(SEQIDNO:7)和GCGGAGCTCTTACTGATGATTCATCATCAATTTACG(SEQIDNO:8)为引物，从大肠杆菌MG1655基因组DNA上扩增thrABC基因(野生型thrABC的编码基因，其氨基酸序列为SEQIDNO:2，其核苷酸序列为SEQIDNO:1)；最后所获得的DNA片段带上BamHI和SacI的酶切位点。通过BamHI和SacI双酶切获得DNA片段，利用T4连接酶连接于BamHI和SacI双酶切后的ptrc99A质粒(参考文献Amann,E.,Ochs,B.,和Abel,K.(1988)Gene(Amst.)69,301-315)，连接成功的质粒命名为ptrc-thrABC，经华大测序证明序列正确。

将构建好的质粒ptrc-thrABC转化野生型大肠杆菌MG1655，感受态细胞的制备和转化过程参考J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》。转化成功的转化子命名为MGthrABC，作为苏氨酸生产的对照菌株。

将上述构建好的质粒ptrc-thrABC转化大肠杆菌BW25113(来源于CGSC(美国耶鲁大学大肠杆菌保藏中心))，涂布Kan抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，获得重组菌株BWthrABC，作为能够生产苏氨酸的对照菌株。

实施例2.构建丙酮酸羧化酶pyc和天冬氨酸激酶lysC共表达质粒

37℃，将菌株根瘤菌RhizobuimetliCFN42(来源于菌种保藏中心DSMZ)在LB培养基中，200rpm，培养12-16h，然后收集细胞。采用Biomiga基因组小提试剂盒提取基因组DNA。设计带启动子、SD序列和酶切位点的引物GCCGTCGACTTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTATGCTAGCACTAGTGAAAGAGGAGAAATACTAGATGCCCATATCCAAGATACTCGTTG(SEQIDNO:9)和CGCGGTACCAACAGCCTGACTTTACACAATCGG(SEQIDNO:10)，利用以上引物，以Rhizobuimetli基因组DNA为模板扩增pyc基因(pyc编码基因，其氨基酸序列为SEQIDNO:6，其核苷酸序列为SEQIDNO:5)；最后所获得的DNA片段带上SalI和KpnI的酶切位点。利用SalI和KpnI双酶切获得DNA片段，然后利用T4连接酶连接于SalI和KpnI双酶切后的pwsk29质粒(参考文献RongFuWang,SidneyR.Kushner,Constructionofversatilelow-copy-numbervectorsforcloning,sequencingandgeneexpressioninEscherichiacoli,Gene,Volume100,April1991,Pages195-199)，连接成功后获得的质粒命名为pwsk29-pyc，经华大测序证明序列正确，pyc过表达载体构建完毕。

设计带启动子、SD序列和酶切位点的引物CGCGATATCTTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTATGCTAGCACTAGTGAAAGAGGAGAAATACTAGATGTCTGAAATTGTTGTCTCCAAATTTG(SEQIDNO:11)和CGCGATATTTACTCAAACAAATTACTATGCAGTT(SEQIDNO:12)，利用以上引物，以MG1655基因组DNA为模板扩增lysC基因(lysC编码基因，其氨基酸序列为SEQIDNO:4，其核苷酸序列为SEQIDNO:3)；最后所获得的DNA片段带上EcoRV的酶切位点。利用EcoRV酶切获得DNA片段，然后利用T4连接酶连接于EcoRV酶切后的pwsk29质粒，连接成功的质粒命名为pwsk29-lysC，经华大测序证明序列正确，lysC过表达载体构建完毕。

利用EcoRV酶切pwsk29-lysC获得DNA片段，然后利用T4连接酶连接于EcoRV酶切后的pwsk29-pyc质粒，连接成功的质粒命名为pwsk29-pyc-lysC，经华大测序证明序列正确，pyc和lysC共表达载体构建完毕。

实施例3.重组菌株的构建以及苏氨酸产量的比较

将上述构建的重组质粒pwsk29-pyc、pwsk29-lysC和pwsk29-pyc-lysC转化大肠杆菌MGthrABC，涂布Amp抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株MGthr1、MGthr2、MGthr3。将上述重组菌单菌落分别接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始OD为0.05转接装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶，37℃，250rpm培养38h后收集发酵液，检测苏氨酸和葡萄糖的浓度。

其中发酵培养基主要成分为：葡萄糖50g/L、硫酸铵10g/L、磷酸二氢钾2g/L、酵母粉3g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、五水合硫酸亚铁0.01g/L、五水合硫酸锰0.01g/L、MOPS0.4M。

各重组菌苏氨酸产量结果见表1，对照菌株MGThrABC中苏氨酸产量仅为0.59g/L，而lysC和pyc协同表达的MGthr3菌株苏氨酸产量为1.38g/L，比出发菌株提高234％，明lysC和pyc的协同表达可以显著提高苏氨酸的产量。

与此同时，相比于出发菌株MGthrABC，MGthr3菌株的转化率提高246％，说明lysC和pyc协同表达不仅仅对大肠杆菌的苏氨酸产量有提升作用，更显著提高了转化率。

表2.不同菌株摇瓶发酵数据

实施例4.在BW25113菌株中重复验证

重组菌株的构建：分别将上述质粒pwsk29-pyc、pwsk29-lysC和pwsk29-pyc-lysC转化大肠杆菌BWthrABC，涂布Amp抗性LB平板，过夜培养后挑取阳性克隆提取质粒验证，分别获得重组菌株BWthr1、BWthr2、BWthr3。

各重组菌摇瓶发酵及苏氨酸和葡萄糖检测方法同上，结果见表3，从表中可以看出各重组菌与相应的MG1655重组菌产量及变化基本一致，lysC和pyc协同表达的BWthr3菌株苏氨酸产量为2.04g/L，葡萄糖转化率更是达到9.00％，分别比出发菌株BWthrABC提高272％和259％，表明本发明提供的方法同样适用于大肠杆菌其他菌株。

表3.不同菌株摇瓶发酵数据

本发明的方法以及所得到的苏氨酸生产菌株出乎意料地显著提高了转化率，苏氨酸产量也有所提高，从而在表观上和实质上都降低了企业运营成本、提升了经济效益，具备重大的经济意义和社会意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种提高L-苏氨酸转化率的方法，所述方法包括增强适合生产L-苏氨酸的菌株中天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸激酶是：

(A)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽；或

所述丙酮酸羧化酶是：

(C)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；或

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌株为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；优选地，所述菌株是大肠杆菌。

5.一种L-苏氨酸生产菌株，所述菌株中的天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的活性增强。

6.如权利要求5所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于，所述天冬氨酸激酶是：

(A)具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽；或

所述丙酮酸羧化酶是：

(C)具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽；或

(D将SEQIDNO:6所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(C)所述多肽功能的由SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。

7.如权利要求6所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于，所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；所述丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。

8.如权利要求5-7中任一项所述的L-苏氨酸生产菌株，其特征在于，所述菌株为埃希氏菌属(Escherichia)的细菌、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)；优选地，所述菌株是大肠杆菌。

9.一种生产L-苏氨酸的方法，所述方法包括：

1)培养权利要求5-8中任一项所述的L-苏氨酸生产菌株，从而得到L-苏氨酸；和

2)从1)的发酵培养体系中获得L-苏氨酸。

10.权利要求5-8中任一项所述的L-苏氨酸生产菌株的用途，所述菌株用于产生L-苏氨酸和/或产生以L-苏氨酸为前体的下游产物。