CN1305002A - 发酵生产l－氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

通过培养被编码丙酮酸羧化酶的基因转化了的和具有L－氨基酸产生能力埃希氏杆菌属的细菌,在培养基中产生和积累L－氨基酸,并从培养基中收集L－氨基酸生产L－氨基酸(如L－苏氨酸和L－谷氨酸)。

Description

发酵生产L-氨基酸的方法
本发明涉及一种生产L-氨基酸的方法，尤其涉及一种使用属于埃希氏杆菌属的细菌生产L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的方法。
传统上，L-氨基酸(如L-苏氨酸和L-谷氨酸)主要是采用属于短杆菌属、棒状杆菌属和微杆菌属的棒形细菌或其突变体通过发酵方法进行生产(“氨基酸发酵”，Gakkai Shuppan Center,195-215页，1986)。
另外，已经公开了采用基因重组技术培育生产L-氨基酸的埃希氏杆菌属细菌的技术。
例如，已经公开了一种采用大肠杆菌生产L-赖氨酸的方法，其中大肠杆菌中编码二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶的基因被脱敏而对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制不敏感，并且二氨基庚二酸脱氢酶(或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶)被增强(95/16042)。
尽管L-氨基酸的产生能力通过培育上述的微生物得到很大的提高或生产方法被改进，但仍然希望研究出生产L-氨基酸更有效的方法以便满足将来对氨基酸的大量需要。
丙酮酸羧化酶[丙酮酸:二氧化碳连接酶(形成ADP),EC6.4.1.1]是一种含生物素的酶。它催化丙酮酸形成草酰乙酸的羧化反应。还不知道大肠杆菌中是否有丙酮酸羧化酶，但枯草芽胞杆菌(Diesterhaft,MD.和Freese,E.,J.，生物化学，248,No.176062-6070(1973))和谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物学，144,915-927(1998))具有丙酮酸羧化酶，并且编码酶的基因的核苷序列已被报导过。
而且，已知丙酮酸羧化酶的活性被增强了的谷氨酸棒状杆菌或丙酮酸羧化酶基因被灭活了的谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物学，144,915-927(1998))。然而，构创建这些微生物是为了作为实验材料来研究利用葡萄糖生长所必需的酶。还不知道丙酮酸羧化酶活性与L-氨基酸产生能力的关系。也不知道将丙酮酸羧化酶基因引入埃希氏杆菌属的细菌中的意图。
本发明根据前述观点得以完成，其目的是提供一种高效生产L-氨基酸，尤其是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的方法。
为了达到上述目的，进行了辛勤的研究，结果本发明的发明人发现将编码丙酮酸羧化酶的基因(下文定义为“pyc基因”)引入埃希氏杆菌属的细菌中能够提高细菌生产L-氨基酸的产生能力。因此本发明得以完成。
即，本发明涉及被编码丙酮酸羧化酶的基因转化了并且具有L-氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属的细菌。
本发明也提供了含有源自于芽胞杆菌属细菌的编码丙酮酸羧化酶的基因的上述细菌。
本发明进一步提供了引入了低拷贝数的编码丙酮酸羧化酶的基因的上述细菌。
本发明还进一步提供了其中所说的L-氨基酸选自于L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸的上述细菌。
本发明也提供了包括在培养基中培养上述细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，并从培养基中收集L-氨基酸的L-氨基酸生产方法。
本发明进一步提供了其中所说的L-氨基酸选自于L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸的上述方法。
术语“L-氨基酸产生能力”是指所述细菌比其野生型菌株在培养基中更多地生产和积累L-氨基酸的特性。
根据本发明，L-氨基酸，如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-异亮氨酸的产生能力在埃希氏杆菌属的细菌中能得到提高。并且，本发明可被用来培育属于埃希氏杆菌属的L-氨基酸产生菌。
图1表示为克隆pycA基因构建枯草芽胞杆菌pyc::KmR受体菌株的方案；
图2表示自枯草芽胞杆菌168克隆pycA基因的方案；
图3表示含有pycA基因的质粒的构建方案。
下面详述本发明。
<1>用pyc基因转化的埃希氏杆菌属的细菌
本发明埃希氏杆菌属的细菌是用pyc基因转化的细菌。作为埃希氏杆菌属的细菌，以大肠杆菌为例。然而，本发明使用的pyc基因并不特别限定，只要它能编码具有丙酮酸羧化酶活性的蛋白，pyc基因的例子包括，例如，源自于芽胞杆菌属细菌的pyc基因或源自于棒状杆菌的pyc基因。已经报导了源自于枯草芽胞杆菌(Genbank/EMBL/DDBJ Accession Z97025,NID g2224758)和谷氨酸棒状杆菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物学，144,915-927(1998))的pyc基因的核苷酸序列。因此，采用根据芽胞杆菌属细菌(如枯草芽胞杆菌)或棒状杆菌属细菌(如谷氨酸棒状杆菌)染色体DNA的核苷酸序列合成的引物，以该引物作模板、通过PCR(多聚酶链反应：White,T.J.等，Trends Genet.,5,185(1989))可制备出pyc基因。
其中具有含枯草芽胞杆菌pyc基因的pMW119-pycA的大肠杆菌44/pMW119-pycA转化子自1999年8月30日被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms Depositary),GNIIgenetika；1,Dorozhny Proezd.1,113545,莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-7822,并且根据布达佩斯条约于2000年9月1日被从原始保藏转为国际保藏。
其中具有含枯草芽胞杆菌pyc基因的pMW119-pycA的大肠杆菌MG442/pMW119-pycA的转化子自1999年8月30日被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(RussianNational Collectionof Industrial Microorganisms Depositary),GNIIgenetika;1,DorozhnyProezd.1,113545，莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-7821，并且根据布达佩斯条约于2000年9月1日被从原始保藏转为国际保藏。
另外，通过下述完成本发明的方法克隆了编码枯草芽胞杆菌的丙酮酸羧化酶的基因(pycA基因)。
首先，构建了一株pycA基因缺陷型的枯草芽胞杆菌菌株。然后，以该菌株作为受体，通过从枯草芽胞杆菌野生型菌株的基因组DNA文库中分离补充柠檬酸或天冬氨酸营养缺陷菌株的DNA片段进行pycA基因的克隆。由于枯草芽胞杆菌通过丙酮酸羧化酶产生草酰乙酸，如果枯草芽胞杆菌是该酶的缺陷型，其就不能在基本培养基上生长。然而，通过添加L-天冬氨酸、L-谷氨酸、柠檬酸或琥珀酸，可以恢复生长。pycA基因的核苷酸序列和通过该基因编码的氨基酸序如SEQ ID NoS:3和4所示。
pycA基因-缺陷菌株，例如，按如下所述获得。紧接在pycA基因后面的定位在染色体上的ylaP基因的部分DNA片段通过PCR获得。作为PCR的合成引物由SEQ ID NoS:1和2所示的寡聚核苷酸举例说明。然后用含有获得的DNA片段和标记基因的质粒DNA转化一株枯草芽胞杆菌的野生型菌株，接着通过同源重组将该质粒DNA整合到染色体DNA上的ylaP基因中。采用能识别pycA基因中的限制酶切位点的限制酶，例如，PstⅠ来构建所获得的菌株的染色体DNA文库。含有标记基因和部分pycA基因片段的重组质粒可通过用该文库转化一株枯草芽胞杆菌的野生型菌株并筛选表达标记基因的克隆来获得。然后，用线性化的该重组质粒转化一株枯草芽胞杆菌的野生型菌株并且筛选出表达标记基因的克隆以便获得pycA基因-缺陷株，该基因缺陷株中的质粒DNA被整合到该菌株染色体DNA上的pycA基因中。
用pyc基因转化埃希氏杆菌属的细菌，可通过将pyc基因插到在埃希氏杆菌属的细菌中具有功能的合适载体上以构建一个重组载体，并将重组载体引入埃希氏杆菌属的细菌中来完成。
载体通过质粒(如pBR322,pMW118,pMW119,pUC18,pUC19等)，噬菌体载体(如λ1059,λBF101,M13mp9等)，和转座子(如Mu,Tn10,Tn5等)来举例说明。然而，本发明中，因为如果以高拷贝质粒作为载体引入pycA基因，含有该载体的转化子可能是不稳定的，所以低拷贝质粒诸如pMW118和pMW119是更优选的。
将DNA引入埃希氏杆菌属的细菌中可通过，例如，D.A.Morrison的方法(酶学方法68,326,(1979))或采用氯化钙处理受体细菌细胞来增加DNA的通透性的方法(Mandel,M.和Higa,A.,J.,Mol.Biol.,53,159(1970))等来完成。
基因组DNA的制备，基因组DNA文库的构建，杂交，PCR,质粒DNA的制备，DNA的消化和连接，转化等根据本技术领域的技术人员已知的方法进行。这种方法由Sambrook,J.,Fritsche,E.F.,Maniatis,T.在冷泉港实验室出版社的“分子克隆”1.21(1989)中进行了描述。
埃希氏杆菌属的细菌生产L-氨基酸的能力可通过采用PYC基因转化细菌来赋予或增强细菌中丙酮酸羧化酶的活性进行提高。这可能是由于草酰乙酸不但由磷酸烯醇丙酮酸生成，也由丙酮酸生成的缘故。即，由磷酸烯醇丙酮酸系统调节的葡萄糖(或蔗糖)分子到细菌细胞中的运送是通过消耗一个分子的磷酸烯醇丙酮酸而伴随着一个分子的丙酮酸生成而进行的。尽管形成的丙酮酸不是直接用于细菌细胞中L-氨基酸的合成，L-氨基酸的产生能力可通过从丙酮酸生成草酰乙酸来提高。
可采用一株具有产生目的L-氨基酸能力的菌株，作为引入PYC基因的埃希氏杆菌属的细菌。或者，被PYC基因转化的埃希氏杆菌属的细菌可被赋予生产L-氨基酸的能力。另外，大肠杆菌的PYC基因不是已知的，然而，如果以后大肠杆菌中发现了该基因，可以使用该基因。
下面描述生产L-氨基酸的埃希氏杆菌属细菌的实施例。
(1)L-苏氨酸-产生菌
埃希氏杆菌属的L-苏氨酸-产生菌可通过菌株MG442(被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(RussianNational Collectionof Industrial Microorganisms Depositary),GNIIgenetika;1,DorozhnyProezd.1,113545，莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-1628)(USP4278765；Guayatiner M.M.等，Genetika(在俄罗斯)，14,947-956(1978))来举例说明。所得到的菌株MG442为抗L-苏氨酸类似物，2-氨基-3-羟基戊酸的突变体，它也是一种渗漏型的异亮氨酸营养缺陷体。它以副产物的形式产生L-苏氨酸和L-谷氨酸。
或者，用pVIC40(USP5175107)转化MG442的转化体优选地被用作L-苏氨酸-产生菌株。
(2)L-赖氨酸-产生菌株
埃希氏杆菌属的L-赖氨酸-产生菌株可通过WO95/16042中描述的各种细菌来举例说明。L-赖氨酸-产生菌株通过其中天冬氨酸激酶活性和二氢二吡啶甲酸还原酶活性增高了的细菌诸如W3110(tyrA)RSFD80+pdapB来具体举例说明。
(3)L-高丝氨酸-产生菌株
埃希氏杆菌属的L-高丝氨酸-产生菌株可通过菌株44(thrB)来举例说明。这株菌是从作为Leu+回复突变株的已知菌株C600(thrB,leuB)(Appleyard R.K.,Genetics,39,440-452(1954))衍生来的。用含有编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶Ⅰ的thrA基因的质粒转化44的转化菌株可优选被使用。
大肠杆菌44的一株菌自1980年9月23日被保藏在俄罗斯国家工业微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms Depositary),GNIIgenetika;1,Dorozhny Proezd.1,113545,莫斯科，俄罗斯，保藏号是VKPM B-2175,并且根据布达佩斯条约于2000年9月1日被从原始保藏转为国际保藏。
(4)L-谷氨酸-产生菌
埃希氏杆菌属的L-谷氨酸-产生菌可通过一株抗缬氨酸的菌株，例如，大肠杆菌菌株B11,K-12(ATCC10798)，B(ATCC11303)和W(ATCC9637)来举例说明。
(5)L-异亮氨酸-产生菌
埃希氏杆菌属的L-异亮氨酸-产生菌可通过一株菌TDH6/pVIC40,pMWD5(Hashiguchi,K.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.,63(4),672-679(1999))或EPO685555A1中记载的AJ12919来举例说明。
<2>L-氨基酸的生产方法
可通过培养被上述pycA基因转化并在适当培养基中具有L-氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，和收集培养基中的L-氨基酸来有效生产L-氨基酸。
L-氨基酸优选地通过L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸来举例说明。通过本发明的方法可生产出单一种类的L-氨基酸或两种以上L-氨基酸的混合物。
本发明的方法中，埃希氏杆菌属的细菌的培养，液体培养基中的氨基酸的收集和纯化可通过与采用细菌发酵生产氨基酸的传统方法类似的方式进行。只要培养基包括碳源和氮源以及矿物质，培养使用的培养基既可以是合成培养基也可以是天然培养基，并且如果必要，细菌所用营养的量需适合于菌体的生长。碳源可包括各种碳水化合物(如葡萄糖和蔗糖)，以及各种有机酸。根据所使用细菌的同化能力，可以使用包括乙醇在内的醇和甘油。氨、各种铵盐诸如硫酸铵、其它氮化合物诸如胺、天然氮源诸如胨、大豆水解物和消化的发酵微生物被作为氮源使用。磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙被作为矿物质使用。
培养优选地是在有氧条件诸如振荡培养、和通气并搅拌培养下进行。培养的温度通常是20至40℃，优选地是30至38℃。培养PH通常是5和9，优选地是6.5和7.2。培养基的PH可采用氨，碳酸钙，各种酸，各种碱，和缓冲液来调节。通常培养1至3天可导致培养基中积累目的L-氨基酸。
L-氨基酸的收集和纯化可通过培养后的离心或膜过滤从培养基中去掉固体(如细胞)，接着进行离子交换，浓缩和结晶分馏等方法来进行。
本发明将通过下述实施例得到更具体的解释。
实施例1：从枯草芽胞杆菌168菌株克隆pycA基因
<1>用于克隆的枯草芽孢杆菌pycA::KmR受体菌株的构建
通过pycA基因的插入诱变，构建枯草芽孢杆菌的受体菌株。pycA基因的片段分两步克隆(参考图.1和图.2).
在数据库中枯草芽孢杆菌基因组序列方案中的一个阅读框(ylaP)被鉴定为pycA基因，编码丙酮酸羧化酶。使用下面一对寡聚核苷酸：5′-GATATAAGGGGACTTCAGAG，和5′-GGCGCTTTATGCGTTTCAATC通过PCR扩增克隆紧接在pycA基因终止子后面定位的区域。
用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段使269bp(碱基对)的DNA片段平端化并克隆到E.coli菌株的pBR322质粒的ScaⅠ位点上。产生的质粒pBRYCAll用ClaⅠ消化并连接到带有cat基因的1628bp(碱基对)的DNA片段上，该DNA片段通过用ClaⅠ消化pC194而获得。然后，采用获得的质粒pBRYCAllCmR3转化枯草芽胞杆菌168 trpC2菌株并筛选CmR-克隆。质粒pBRYCAllCmR3在芽胞杆菌属的细菌中不能自主复制，但能够通过与269bp DNA片段同源整合到pycA基因附近的染色体上。该菌株被命名为枯草芽孢杆菌trpC2 xyz::pBRYCACmR3。整合体携带有pBR322-复制子、源自于pBR322的抗四环素的tet编码基因和CmR标记。
分离枯草芽孢杆菌trpC2 xyz::pBRYCACmR3的染色体DNA并用来克隆pycA基因的末端部分。用PstⅠ消化的染色体DNA自身连接并转化到E.coli TGl菌株中。筛选出对四环素和氯霉素有抗性的重组子。从一个重组子中提取质粒并命名为pPYCl。质粒pPYCl获得了单一BglⅡ限制酶切位点，该位点定位在pycA基因片段中。这一位点被插到含有用于B芽胞杆菌的卡那霉素抗性标记的1818bp DNA片段中。质粒pPYCl用BglⅡ消化并连接到被BamHⅠ消化的pUC7KmR上来获得质粒pPYCl::KmR。
野生型枯草芽孢杆菌168 trpC2中的pycA基因的失活通过线性化的质粒pPYCl::KmR一步转化相同菌株而获得，接着在补充了卡那霉素的Luria培养液上进行筛选。通过同源双交换重组将KmR标记插到染色体DNA的pycA基因中。
除非培养基中加入柠檬酸或天冬氨酸，所构建的枯草芽孢杆菌pycA::KmR trpC2不能在具有色氨酸的Spizizen基本培养基(Anagnostopoulos,C和Spizizen,J.,J.Bacteriol.,81,741-746(1961))中生长。
(Spizizen基本培养基的组成)
K2HPO4·3H2O    18.3g/L
KH2PO4           6.0g/L
(NH4)2SO4        2.0g/L
五水柠檬酸钠       1.2g/L
MgSO4·7H2O      0.2g/L
葡萄糖             10.0g/L
      pH7.0枯草芽孢杆菌trpC2 pycA::KmR recE::TcR菌株通过用噬菌体E40转导枯草芽孢杆菌recE::TcR菌株中的recE基因的钝化等位基因构建(图.2)。终止受体菌株中重组过程是克隆枯草芽孢杆菌的pycA基因所必要的。所构建的枯草芽孢杆菌trpC2 pycA::KmR recE::TcR菌株被用作克隆pycA基因的受体。<2>通过互补克隆枯草芽孢杆菌的天然pycA基因从枯草芽孢杆菌168trpC2菌株克隆pycA基因。从菌株168trpC2制备的染色体DNA用EcoRⅠ部分消化并连接到被EcoRⅠ消化的pCB20(EmR)(由Yu Jomantas博士赠送，参考L.O.Butler等编的“遗传转化和表达”，eds.,Intercept Ltd.,POBOX402,Wimborne,Dorset,BH229T2,U.K.,1989,269-281页)上。然后用连接混合物转化trpC2 pycA::KmR recE::TcR受体菌株(图.2)。在没有补充柠檬酸或天冬氨酸而补充了色氨酸、红霉素和卡那霉素的Spizizen基本培养基上筛选Asp+,EmR,KmR克隆。互补了pycA突变体的一个筛选克隆中的质粒pPYCR3具有可描述的结构并在二次转化后赋予了相同的Asp+,EmR表型。<3>将含有枯草芽孢杆菌168 trpC2菌株的pycA基因的DNA片断克隆到高拷贝数质粒pUC18和pUC19中
质粒pPYCR3用HindⅡ和ScaⅠ消化，然后将带有pycA基因和其5′端上游的序列(包括启动子和核糖体结合位点)的HincdⅡ-ScaⅠ片断(4414bp)克隆到用SmaⅠ消化了的pUC18上。因此获得了质粒pUC18-pycA(图.3，上边)。连接反应如下具体进行。90ng SmaⅠ消化的pUC18和300ng由琼脂糖凝胶电泳纯化的带有pycA基因的HindⅡ-ScaⅠ片断(4414bp)在45μl含有1×One-Phor-All缓冲液(Pharmacia,Sweden)和1mM ATP的反应混合物中用2单位的T4DNA连接酶(Pharmacia,Sweden)进行连接反应。
用pUC18-pycA转化E.Coli TGl。获得的转化子通过采用KpnⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ核酸内切酶进行分析。所有克隆在pUC18质粒的lac启动子的反方向上带有pycA基因。然而，pUC18上克隆的pycA基因可在固有启动子基因的调控下表达。
然后，为了将pycA基因重新置于在lac启动子的调控下，pUC18-pycA的KpnⅠ-XbaⅠ片断被克隆到用KpnⅠ-XbaⅠ消化的pUC19上。然而，所获得的克隆不稳定并且在短的培养时间内(6-8小时)重组质粒丢失。
<4>将带有pycA基因的DNA片断克隆到低拷贝数质粒pMW119中
pUC18-pycA的KpnⅠ-XbaⅠ片断被连接到用KpnⅠ和XbaⅠ消化的低拷贝数质粒pMW119中(图.3，下边)。连接反应于50μl含有60ng用KpnⅠ和XbaⅠ消化的pMW119,120ng由琼脂糖凝胶电泳纯化的pUCl8-pycA的KpnⅠ-XbaⅠ片断，1×One-Phor-ALL缓冲液(Pharmacia,Sweden),1mM ATP和1单位的T4 DNA连接酶(Pharmacia,Sweden)的反应混合物中进行。
采用连接混合物转化E.coli TGl。产生的转化子采用SacⅠ、KpnⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ进行分析。所有克隆带有由pMW119的lac启动子和其本身启动子调控的pycA基因。由此获得的克隆被命名为TGl(pMW119-pycA)，从该克隆获得质粒pMW119-pycA。
实施例2：L-苏氨酸和L-谷氨酸的生产
E.coli菌株MG442用质粒pMW119-pycA转化并筛选出10个Ampr(抗氨苄青霉素)克隆。克隆生产L-苏氨酸和L-谷氨酸的能力通过下面的发酵培养基来检测。
(发酵培养基的组成)
葡萄糖(单独灭菌)      60g/L
(NH4)2SO4        15.0g/L
KH2PO4         1.5g/L
MgSO4·7H2O    1.0g/L
L-异亮氨酸       100mg/L
硫胺素           0.1mg/L
CaCO3(单独灭菌) 20g/L
通过摇床，发酵在32℃下于试管(20×300mm)中进行72小时。10个克隆的每一个克隆取一环接种到含有2.0ml发酵培养基的试管中。不含质粒的菌株MG442的10个单菌落作为对照。发酵培养后，通过薄层层析测定培养基中积累的L-苏氨酸和L-谷氨酸的浓度。结果见表1。
                          表1
 克隆编号       MG442(对照)      MG442(pMW119-pycA)
L-苏氨酸G/L  L-谷氨酸G/L  L-苏氨酸g/L  L-谷氨酸g/L
    1     5.5     9.5     7.8     12.3
    2     3.2     7.1     9.8     12.3
    3     3.6     7.1     9.4     13.3
    4     3.4     8.9     9.8     11.8
    5     3.3     8.9     9.8     11.8
    6     4.8     7.3     9.9     11.8
    7     3.3     7.0     10.0     10.7
    8     4.7     8.3     10.0     10.4
    9     3.2     7.3     9.7     11.2
    10     2.6     4.1     10.0     10.7
 平均值     3.8     7.4     9.6     11.6
              实施例3：L-高丝氨酸的生产
生产L-高丝氨酸的E.coli菌株44用质粒pMW119-pycA转化并筛选出5个抗氨卞青霉素的克隆。按照实施例1的方法检测L-高丝氨酸的产量，但发酵培养基中补充了0.5g/l的L-苏氨酸。使用不含质粒的菌株44的克隆作对照。发酵培养后，L-高丝氨酸的平均浓度是4.5g/l(菌株44)和5.7g/l(含有质粒pMW119-pycA的菌株44)。
pycA基因对于L-赖氨酸的产生能力的影响也是可以预测的，因为确信pycA基因对与L-赖氨酸共用部分相同的生物合成途径的L-苏氨酸和L-谷氨酸的生产具有正面影响。
                    序列表<110>Ajinomoto Co.,lnc.<120>发酵生产L-氨基酸的方法<130>OP877<141>2000-10-14<150>RU 99121636<151>2000-10-14<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>1<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>2ggcgctttat gcgtttcaatc                                             20<210>3<211>3462<212>DNA<213>芽胞枯草杆菌<220><221>CDS<222>(16)..(3458)<400>3aagggggaga aaagt ttg tct cag caa tcg ata caa aaa gta tta gta gca 51
             Leu Ser Gln Gln Ser Ile Gln Lys Val Leu Val Ala
              1               5                   10aac agg gga gaa att gca atc cga ata ttc cgg gcg tgt acc gag ttg  99Asu Arg Gly Glu Ile Ala Ile Arg Ile Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu
    15                   20                  25aat att cgt aca gtt gcg gtc tat tca aaa gaa gat tcc ggt tcc tac  147Asn Ile Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Lys Glu Asp Ser Gly Sar Tyr
30                   35                  40cat cgg tac aaa gcg gat gaa gca tac ttg gtc ggt gaa ggg aaa aaa  195His Arg Tyr Lys Ala Asp Glu Ala Tyr Leu Val Gly Glu Gly Lys Lys45                   50                  55                  60ccg att gat gct tac ctg gat att gaa ggt atc att gat att gcg aaa  243Pro Ile Asp Ala Tyr Leu Asp lle Glu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys
             65                 70                   75aga aac aaa gtc gat gca att cat ccg gga tac ggt ttc tta tct gaa  291Arg Asn Lys Val Asp Ala Ile Hls Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu
        80                  85                   90aat att cat ttt gcg aga cga tgt gaa gaa gaa ggc atc gta ttc ata  339Asn Ile His Phe Ala Arg Arg Cys Glu Glu Glu Gly Ile Val Phe Ile
    95                  100                 105ggg cca aaa tcc gag cat ctc gat atg ttt ggt gac aag gta aaa gcg  387Gly Pro Lys Ser Glu His Leu Asp Met Phe Gly Asp Lys Val Lys Ala
110                 115                 120cgt gag cag gca gaa aaa gcg gga atc ccc gtg att ccg gga agc gac  435Arg Glu Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Pro Val Ile Pro Gly Ser Asp125                 130                 135                 140ggt cct gcc gaa acg ctt gaa gcc gtc gaa caa ttt gga caa gct aac  483Gly Pro Ala Glu Thr Leu Glu Ala Val Glu Gln Phe Gly Gln Ala Asn
            145                 150                 155ggt tat ccg atc atc att aaa gcc tcg ctt ggc ggc ggc ggc cgc ggt  531Gly Tyr Pro Ile Ile Ile Lys Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Arg Gly
        160                 165                 170atg cgg att gtc aga tct gaa agt gaa gtt aaa gaa gca tat gag cgt  579Met Arg Ile Val Arg Ser Glu Ser Glu Val Lys Glu Ala Tyr Glu Arg
    175                 180                 185gct aaa tca gag gcg aaa gca gcc ttt ggc aat gat gaa gtt tat gta  627Ala Lys Ser Glu Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asn AsP Glu Val Tyr Val
190                 195                 200gaa aaa tta att gag aat ccg aaa cat att gag gtt cag gtc att gga  675Glu Lys Leu lle Glu Asn Pro Lys His Ile Glu Val GlN Val Ile Gly205                 210                 215                 220gac aag cag ggc aat gtc gtc cat ctt ttt gag agg gat tgc tcc gtt  723Asp Lys Gln Gly Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val
            225                 230                 235caa aga cgc cat caa aaa gtc att gaa gtg gcg ccg agt gtc tcg ctg  771Gln Arg Arg His Gln Lys Val Ile Glu Val Ala Pro Ser Val Ser Leu
        240                 245                 250tca cct gaa tta agg gac caa att tgt gag gct gca gLt gcg ctt gcc  819Ser Pro Glu Leu Arg Asp Gln Ile Cys Glu Ala Ala Val Ala Leu Ala
    255                 260                 265aaa aat gta aac tat ata aat gcg ggg acg gtc gaa ttc ctt gtt gca  867Lys Asn Val Asn Tyr Ile Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala
 270          275         280aac aac gag ttc tac ttt att gaa gta aat cct cgc gta caa gtt gaa  915Asn Asn Glu Phe Tyr Phe Ile Glu Val Asn Pro Arg Val Gln Val Glu285                 290                 295                 300cac acg ata aca gaa atg att act ggt gtc gat att gtt caa act cag  963Mis Thr lle Thr Glu Met Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Gln Thr Gln
            305                 310                 315atc ctt gtt gcc caa ggg cac agc ctt cac agc aaa aaa gta aat att  1011Ile Leu Val Ala Gln Gly His Ser Leu His Ser Lys Lys Val Asn Ile
        320                 325                 330cct gag caa aag gac att ttt aca atc ggc tat gcc att cag tca cgg  1059Pro Glu Gln Lys Asp Ile Phe Thr Ile Gly Tyr Ala Ile Gln Ser Arg
    335                 340                 345gtt acg act gag gat ccg caa gat gat ttc atg cct gat aca gga aaa  1107Val Thr Thr Glu Asp Pro Gln Asn Asp Phe Met Pro Asp Thr Gly Lys
350                 355                 360atc atg gct tac cgc tca ggc ggc ggt ttt ggt gtc cgt ctt gat acc  1155Ile Met Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Phe Gly Val Arg Leu Asp Thr365                 370                 375                 380gga aac agc ttc cag ggc gcc gtg atc aca cca tac tat gat tca ctt  1203Gly Asn Ser Phe Gln Gly Ala Val Ile Thr Pro Tyr Tyr Asp Ser Leu
            385                 390                 395ctc gtt aag ctt tca act tgg gct tta acg ttt gaa cag gca gct gcc  1251Leu Val Lys Leu Ser Thr Trp Ala Leu Thr Phe Glu Gln Ala Ala Ala
        400                 405                 410aaa atg gtg cga aac ctt cag gag ttt aga atc aga ggc ata aaa acg  1299Lys Met Val Arg Asn Leu Gln Glu Phe Arg Ils Arg Gly lle Lys Thr
    415                 420                 425aac att ccg ttc ctt gag aac gtt gca aag cat gag aag ttc ctg aca  1347Asn Ile Pro Phe Leu Glu Asn Val Ala Lys His Glu Lys Phe Leu Thr
430                 435                 440ggg caa tat gat aca tct ttc att gat aca acg cct gaa tta ttt aat  1395Gly Gln Tyr Asp Thr Ser Phe lle Asp Thr Thr Pro Glu Leu Phe Asn445                 450                 455                 460ttc cct aaa caa aaa gac cgc gga acg aaa atg ctc act tac atc ggc  1443Phe Pro Lys Gln Lys Asp Arg Gly Thr Lys Met Leu Thr Tyr Ile Gly
            465                 470                 475aat gtg aca gtg aac ggc ttc cct gga atc ggg aaa aaa gaa aaa ccg  1491
Asn Val Thr Val Asn Gly Phe Pro Gly Iie Gly Lys Lys Glu Lys Pro
        480                 485                 490gcg ttt gac aaa ccg tta ggc gta aag gta gac gtt gat cag cag cct  1539Ala Phe Asp Lys Pro Leu Gly Val Lys Val Asp Val Asp Gln Gln Pro
    495                 500                 505gcc aga gga aca aag caa att ctc gat gaa aaa ggt gca gaa ggg ctt  1587Ala Arg Gly Thr Lys Gln Ile Leu Asp Glu Lys Gly Ala Glu Gly Leu
510                 515                 520gca aat tgg gtt aag gag cag aaa tct gtc ctt tta act gat acg aca  1635Ala Asn Trp Val Lys Glu Gln Lys Ser Val Leu Leu Thr Asp Thr Thr525                 530                 535                 540ttc agg gat gcc cac caa tcg tta ttg gca act aga atc aga tcg cat  1683Phe Arg Asp Ala His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Ile Arg Ser His
            545                 550                 555gat ttg aaa aaa atc gca aat ccg acg gct gcg tta tgg cct gaa cta  1731Asp Leu Lys Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ala Ala Leu Trp Pro Glu Leu
        560                 565                 570ttc agt atg gaa atg tgg gga ggc gcg acc ttc gat gta gcc tac cga  1779Phe Ser Met Glu Met Trp Gly Gly Ala Thr Phe Asp Val Ala Tyr Arg
    575             580                     585ttc ctg aaa gaa gat ccg tgg aaa cgt ttg gaa gat ctt cgc aaa gaa  1827Phe Leu Lys Glu Asp Pro Trp Lys Arg Leu Glu Asp Leu Arg Lys Glu
590                 595                 600gtg ccg aat acc tta ttc cag atg ttg ctt cgc tca tca aat gcg gtc  1875Val Pro Asn Thr Leu Phe Gln Met Leu Leu Arg Ser Ser Asn Ala Val605                 610                 615                 620ggc tat acg aat tat ccg gac aat gtg att aaa gaa ttt gtg aag caa  1923Gly Tyr Thr Asn Tyr Pro Asp Ash Val Ile Lys Glu Phe Val Lys Gln
            625                 630                 635tca gct caa tcc ggt att gat gtg ttt cgt att ttc gac agc tta aac  1971Ser Ala Gln Ser Gly Ile Asp Val Phe Arg Ile Phe Asp Ser Leu Asn
        640                 645                 650tgg gta aaa ggg atg acg tta gcc att gat gct gtt agg gat acc ggc  2019Trp Val Lys Gly Met Thr Leu Ala Ile Asp Ala Val Arg Asp Thr Gly
    655                 660                 665aaa gtg gca gaa gct gcg att tgt tat gcg gga gat atc ctt gac aag  2067Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Asp Lys
670                 675                 680aac cgg acg aag tac gac ctt gca tat tat aca tcg atg gcg aag gag  2115Asn Arg Thr Lys Tyr Asp Leu Ala Tyr Tyr Thr Ser Met Ala Lys Glu685                 690                 695                 700ctt gag gcg gcc gga gcc cat att crc ggg att aaa gat atg gca ggg  2163Leu Glu Ala Ala Gly Ala His Ile Leu Gly Ile Lys Asp Met Ala Gly
            705                 710                 715ctg tta aaa ccg cag gct gca tat gag ctc gtt tct gcg ttg aaa gaa  2211Lcu Leu Lys Pro Gln Ala Ala Tyr Glu Leu Val Ser Ala Leu Lys Glu
        720                 725                 730acg arc gac att ccg gtt cac ctt cat acg cat gat acg agc gga aac  2259Thr Ile Asp Ile Pro Val His Leu His Thr His Asp Thr Ser Gly Asn
    735                 740                 745ggt att tat atg tat gcg aaa gct gtt gaa gcc ggc gtt gat atc ata  2307Gly Ile Tyr Met Tyr Ala Lys Ala Val Glu Ala Gly Val Asp Ile Ils
750                 755                 760gac gtg gcg gtc agc tca atg gcg gga tta acg tca cag cct agc gcg  2355Asp Val Ala Val Ser Ser Met Ala Gly Leu Thr Ser Gln Pro Ser Ala765                 770                 775                 780agc gga ttt tat cat gcg atg gaa ggc aac gac cgc cgt ccg gaa atg  2403Ser Gly Phe Tyr His Ala Met Glu Gly Asn Asp Arg Arg Pro Glu Met
            785                 790                 795aat gtc caa ggc gtt gaa ttg ctg tcc caa tat tgg gag tcg gtg cgt  2461Ash Val Gln Gly Val Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Trp Glu Ser Val Arg
        800                 805                 810aaa tat tat agt gaa ttt gaa agc gga atg aag tct ccg cat act gaa  2499Lys Tyr Tyr Ser Glu Phe Glu Ser Gly Met Lys See Pro His The Glu
      815          820          825att tat gaa cac gaa atg cca ggg ggc caa tac agc aac ctg cag cag  2547lle Tyr Glu His Glu Met Pro Gly Gly Gln Tyr Ser Asn Leu Gln Gln
830                 835                 840caa gcc aag gga gta ggc ctt ggc gac cgc tgg aac gaa gtc aag gaa  2595Gln Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly Asp Arg Trp Asn Glu Val Lys Glu845                 850                 855                 860atg tac aga cgc gtg aac gat atg ttc ggt gac atc gtc aag gta acg  2643Met Tyr Arg Arg Val Asn Asp Met Phe Gly Asp Ile Val Lys Val Thr
            865                 870                 875cct tcc tca aaa gta gtc gga gat atg gca ctc tac atg gtg caa aac  2691Pro Ser Ser Lys Val Val Gly Asp Met Ala Leu Tyr Met Val Gln Asn
        880                 885                 890aat ctg act gaa aaa gac gtt tac gaa aaa ggt gaa tct tta gat ttc  2739Asn Leu Thr Glu Lys Asp Val Tyr Glu Lys Gly Glu Ser Leu Asp Phe
    895                 900                 905cct gat tct gtc gtg gag ctt ttt aaa gga aat atc ggc cag cct cat  2787Pro Asp Ser Val Val Glu Leu Phe Lys Gly Asn Ile Gly Gln Pro His
910                 915                 920ggc gga ttc cca gaa aaa ctg caa aag ctg atc tta aaa ggg cgg gag  2835Gly Gly Phe Pro Glu Lys Leu Gln Lys Leu Ile Leu Lys Gly Gln Glu925                 930                 935                 940ccg att aca gtc aga ccg ggc gaa ctg ctt gag ccg gtg tca ttt gaa  2883Pro Ile Thr Val Arg Pro Gly Glu Leu Leu Glu Pro Val Ser Phe Glu
            945                 950                 955gcg atc aaa cag gaa ttt aaa gag cag cat aac ttg gaa att tca gat  2931Ala Ile Lys Gln Glu Phe Lys Glu Gln His Asn Leu Glu Ile Ser Asp
        960                 965                 970cag gat gct gtg gca tat gcc ctt tat cct aaa gtc ttc act gat tat  2979Gln Asp Ala Val Ala Tyr Ala Leu Tyr Pro Lys Val Phe Thr Asp Tyr
    975                 980                 985gtg aaa acg aca gaa agc tat gga gac atc tcg gta tta gat aca ccg  3027Val Lys Thr Thr Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Ser Val Leu Asp Thr Pro
990                 995                 1000aca ttc ttc tac ggt atg aca tta ggt gaa gag ata gaa gtt gaa att  3075Thr Phe Phe Tyr Gly Met Thr Leu Gly Glu Glu Ile Glu Val Glu Ile1005               1010                1015                1020gag cgc ggc aaa acg ctg atc gtt aag ctg att tca atc ggt gag cct  3123Glu Arg Gly Lys Thr Leu Ile Val Lys Leu Ile Ser Ile Gly Glu Pro
           1025                1030                1035cag cct gat gcc acc cgc gtc gtt tat ttc gaa ctc aac ggg cag ccg  3171Gln Pro Asp Ala Thr Arg Val Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Gln Pro
       1040                1045                1050cgt gaa gta gtc att aaa gat gaa agc att aag tct tcc gtt cag gaa  3219Arg Glu Val Val Ile Lys Asp Glu Set Ile Lys Ser Set Val Gln Glu
   1055                1060            1065agg ctg aaa gca gac cgg aca aat cca agc cac atc gca gct tcc atg  3267Arg Leu Lys Ala Asp Arg Thr Asn Pro Ser His Ile Ala Ala Ser Met1070                1075                1080cct gga aca gtt att aag gta ttg gct gaa gca ggc aca aaa gtc aat  3315Pro Gly Thr Val Ile Lys Val Leu Ala Glu Ala Gly Thr Lys Val Asn1085               1090                1095                1100aaa ggt gat cat ttg atg att aat gaa gcg atg aaa atg gaa aca acg  3363Lya Gly Asp His Leu Met Ile Asn Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Thr
           1105                1110                 1115gtt cag gcg cct ttc tca gga aca atc aag cag gtt cat gtg aaa aat  3411Val Gln Ala Pro Phe Ser Gly Thr Ile Lys Gln Val His Val Lys Asn
       1120                1125                1130ggt gag ccg atc caa acg gga gat ctg ctc ctt gaa att gaa aaa gca  3459Gly Glu Pro Ile Gln Thr Gly Asp Leu Leu Leu Glu Ile Glu Lys Ala
   1135                1140                1145taa                                                        3462<210>4<211>1148<212>PRT<213>枯草芽胞杆菌<400>4Leu Ser Gln Gln Ser Ile Gln Lys Val Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu1               5                  10                  15Ile Ala Ile Arg Ile Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu Asn Ile Arg Thr
         20                  25                  30Val Ala Val Tyr Ser Lys Glu Asp Ser Gly Ser Tyr His Arg Tyr Lys
     35                  40                  45Ala Asp Glu Ala Tyr Leu Val Gly Glu Gly Lys Lys Pro Ile Asp Ala
 50                  55                  60Tyr Leu Asp Ile Glu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Arg Agn Lys Val65                  70                  75                  80Asp Ala Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Agn Ile His Phe
             85                  90                  95Ala Arg Arg Cys Glu Glu Glu Gly Ile Val Phe Ile Gly Pro Lys Ser
        100                 l05                 110Glu His Leu Asp Met Phe Gly Asp Lys Val Lys Ala Arg Glu Gln Ala
    115                 120                 125Glu Lys Ala Gly Ile Pro Val Ile Pro Gly Ser Asp Gly Pro Ala Glu
130                 135                 140Thr Leu Glu Ala Val Glu Gln Phe Gly Gln Aly Asn Gly Tyr Pro Ile145                 150                 155                 160Ile Ile Lys Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Ile Val
            165                 170                 175Arg Ser Glu Ser Glu Val Lys Glu Ala Tyr Glu Arg Ala Lys Ser Glu
        180                 185                 190Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asn Asp Glu Val Tyr Val Glu Lys Leu Ile
    195                 200                 205Glu Asn Pro Lys His Ile Glu Val Gln Val Ile Gly Asp Lys Gln Gly
210                 215                 220Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His225                 230                 235                 240Gln Lys Val Ile Glu Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Ser Pro Glu Leu
            245                 250                 255Arg Asp Gln Ils Cys Glu Ala Ala Val Ala Leu Ala Lys Asn Val Asn
        260                 265                 270Tyr Ile Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala Asn Asn Glu Phe
    275                 280                 285Tyr Phe Ile Glu Val Asn Pro Arg Val Gln Val Glu His Thr Ile Thr
290                 295                 300Glu Met Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Gln Thr Gln Ile Leu Val Ala305                 310                 315                 320Gln Gly His Ser Leu His Ser Lys Lys Val Asn IlePro Glu Gln Lys
            325                 330                335Asp Ile Phe Thr Ile Gly Tyr Ala Ile Gln Ser Arg VAl Thr Thr Glu
        340                 345                 350Asp Pro Gln Asn Asp Phe Met Pro Asp Thr Gly Lys Ile Met Ala Tyr
    355                 360                 365Arg Ser Gly Gly Gly Phe Gly Val Arg Leu Asp Thr Gly Asn Ser Phe
370                 375                 380Gln Gly Ala Val Ile Thr Pro Tyr Tyr Asp Ser Leu Leu Val Lys Leu385                 390                 395                 400Ser Thr Trp Ala Leu Thr Phe Glu Gln Ala Ala Ala Lys Met Val Arg
            405                 410                 415Asn Leu Gln Glu Phe Arg Ile Arg Gly lle Lys Thr Asn Ile Pro Phe
        420                 425                 430Leu Glu Asn Val Ala Lys His Glu Lys Phe Leu Thr Gly Gln Tyr Asp
    435                 440                 445Thr Ser Phe Ile Asp Thr Thr Pro Glu Leu Phe Asn Phe Pro Lys Gln
450                 455                 460Lys Asp APg Gly Thr Lys Met Leu Thr Tyr Ile Gly Asn Val Thr Val465                 470                 475                 480Asn Gly Phe Pro Gly Ile Gly Lys Lys Glu Lys Pro Ala Phe Asp Lys
            485                 490                 495Pro Leu Gly Val Lys Val Asp Val Asp Gln Gln Pro Ala Arg Gly Thr
        500                 505                 510Lys Gln Ile Leu Asp Glu Lys Gly Ala Glu Gly Leu Ala Asn Trp Val
    515                 520                 525Lys Glu Gln Lys Ser Val Leu Leu Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala
 530                535                 540His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Ile Arg Ser His Asp Leu Lys Lys545                 550                 555                 560Ile Ala Asn Pro Thr Ala Ala Leu Trp Pro Glu Leu Phe Ser Met Glu
            565                 570                 575Met Trp Gly Gly Ala Thr Phe Asp Val Ala Tyr Arg Phe Leu Lys Glu
        580                 585                 590Asp Pro Trp Lys Arg Leu Glu Asp Leu Ara Lys Glu Val Pro Asn Thr
    595                 600                 605Leu Phe Gln Met Leu Leu Arg Ser Ser Asn Ala Val Gly Tyr Thr Asn
610                 615                 620Tyr Pro Asp Asn Val Ile Lys Glu Phe Val Lys Gln Ser Ala Gln Ser625                 630                 635                 640Gly Ile Asp Val Phe Arg Ile Phe Asp Ser Leu Asn Trp Val Lys Gly
            645                 650                 655Met Thr Leu Ala Ile Asp Ala Val Arg Asp Thr Gly Lys Val Ala Glu
        660                 665                 670Ala Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Asp Lys Asn Arg Thr Lys
    675                 680                 685Tyr Asp Leu Ala Tyr Tyr Thr Ser Met Ala Lys Glu Leu Glu Ala Ala
690                 695                 700Gly Ala His Ile Leu Gly Ile Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Lys Pro705                 710                 715                 720Gln Ala Ala Tyr Glu Leu Vsl Ser Ala Leu Lys Glu Thr Ile Asp Ile
            725                 730                 735Pro Val His Leu His Thr His Asp Thr Ser Gly Asn Gly Ile Tyr Met
        740                 745                 750Tyr Ala Lys Ala Val Glu Ala Gly Val Asp Ile Ile Asp Val Ala Val
    755                 760                 765Ser Ser Met Ala Gly Leu Thr Ser Gln Pro Ser Ala Ser Gly Phe Tyr
770                 775                 780His Ala Met Glu Gly Asn Asp Arg Arg Pro Glu Met Asn Val Gln Gly785                 790                 795                 800Val Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Trp Glu Ser Val Arg Lys Tyr Tyr Ser
            806                 810                 815Glu Phe Glu Ser Gly Met Lys Ser Pro His Thr Glu Ile Tyr Glu His
        820                 825                 830Glu Met Pro Gly Gly Gln Tyr Ser Asn Leu Gln Gln Gln Ala Lys Gly
    835                 840                 845Val Gly Leu Gly Asp Arg Trp Asn Glu Val Lys Glu Met Tyr Arg Arg
850                 855                 860Val Asn Asp Met Phe Gly Asp Ile Val Lys Val Thr Pro Ser Ser Lys865                 870                 875                 880Val Val Gly Asp Met Ala Leu Tyr Met Val Gln Asn Asn Leu Thr Glu
            885                 890                 895Lys Asp Val Tyr Glu Lys Gly Glu Ser Leu Asp Phe Pro Asp Ser Val
        900                 905                 910Val Glu Leu Phe Lys Gly Asn Ile Gly Gln Pro His Gly Gly Phe Pro
    915                 920                 925Glu Lys Leu Gln Lys Leu Ile Leu Lys Gly Gln Glu Pro Ile Thr Val
930                 935                 940Arg Pro Gly Glu Leu Leu Glu Pro Val Ser Phe Glu Ala Ile Lys Gln945                 950                 955                 960Glu Phe Lys Glu Gln His Asn Leu Glu Ils Ser Asp Gln Asp Ala Val
            966                 970                 975Ala Tyr Ala Leu Tyr Pro Lys Val Phe Thr Asp Tyr Val Lys Thr Thr
        980                 985                 990Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Ser Val Leu Asp Thr Pro Thr Phe Phe Tyr
    995                l000                 1005Gly Met Thr Leu Gly Glu Glu Ile Glu Val Glu Ile Glu Arg Gly Lys1010            1015                    1020Thr Leu Ile Val Lys Leu Ile Ser Ile Gly Glu Pro Gln Pro Asp Ala025                 1030               1035                1040Thr Arg Val Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Gln Pro Arg Glu Val Val
           1045                 1050                1055lle Lys Asp Glu Ser Ile Lys Ser Ser Val Gln Glu Arg Leu Lys Ala
       1060                1065                1070Asp Arg Thr Asn Pro Ser His Ile Ala Ala Ser Met Pro Gly Thr Val
    1075                1080               1085Ile Lys Val Leu Ala Glu Ala Gly Thr Lys Val Asn Lys Glu Asp His1090                1095                 1100Leu Met Ile Asn Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Thr Val Gln Ala Pro105                1110                1115                1120Phe Ser Gly Thr Ile Lys Gln Val Hls Val Lys Asn Gly Glu Pro Ile
           1125                1130                1135Gln Thr Gly Asp Leu Leu Leu Glu Ile Glu Lys Ala
       1140                1145

Claims (6)

1．一种被编码丙酮酸羧化酶的基因转化了的并且具有L-氨基酸产生能力的埃希氏杆菌属的细菌。
2．如权利要求1所述的细菌，其中编码丙酮酸羧化酶的基因源自于芽孢杆菌属的一种细菌。
3．如权利要求1所述的细菌，其中编码丙酮酸羧化酶的基因被以低拷贝数引入所述细菌。
4．如权利要求1所述的细菌，其中L-氨基酸选自L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸。
5．生产L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养权利要求1要求保护的细菌，在培养基中产生和积累L-氨基酸，并从培养基中收集L-氨基酸。
6．如权利要求5所述的方法，其中L-氨基酸选自L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-高丝氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-异亮氨酸。
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