JP2015156844A - 枯草菌変異株及びそれを用いたジピコリン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、且つ枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とが強化された枯草菌変異株。
【選択図】なし
Description
枯草菌変異株であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、且つ
枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とが強化された、枯草菌変異株。
枯草菌変異株の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とを強化することを含む、方法。
本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、JAFAN:Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)でインターネット公開([bacillus.genome.ad.jp/]、2006年1月18日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。
(2−1.ゲノム欠失枯草菌変異株)
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、且つ枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とが強化された、枯草菌変異株である。好ましくは、本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とを強化する改変を加えることによって作製される。
次いで、上記所定の領域を欠失した枯草菌変異株において、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現を強化する。
(i)下記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットA遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(a)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示すヌクレオチド配列と少なくとも80%、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び、
(f)配列番号4に示すアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは80%以上、より好ましくは85%、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)下記(j)〜(o)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットB遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(j)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(k)配列番号5に示すヌクレオチド配列と少なくとも80%、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(m)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(n)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び、
(o)配列番号6に示すアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは80%以上、より好ましくは85%、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明の枯草菌変異株は、上述したジピコリン酸シンターゼを強化した枯草菌変異株において、さらに枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現を強化することにより得ることができる。
(q)配列番号1に示すヌクレオチド配列と少なくとも80%、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(r)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(s)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(t)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び、
(u)配列番号2に示すアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは80%以上、より好ましくは85%、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明の枯草菌変異株は高いDPA生産能を有している。本発明の枯草菌変異株は、ゲノムの大領域が欠失したゲノムを有し且つ枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株と比べて、DPA生産能が向上している(下記実施例2参照)。本発明の枯草菌変異株を培養することによって当該菌体外に効率よくDPAが生産される。したがって、本発明の別の態様は、上述した本発明の枯草菌変異株を用いるDPA又はその塩の製造方法に関する。
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、且つ
枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とが強化された、
枯草菌変異株。
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とを強化することを含む、方法。
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、且つ枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株において、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現を強化することを含む、方法。
(i)下記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットA遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(a)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示すヌクレオチド配列と好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号4に示すアミノ酸配列と好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)下記(j)〜(o)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットB遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(j)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(k)配列番号5に示すヌクレオチド配列と好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(m)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(n)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(o)配列番号6に示すアミノ酸配列と好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
上記(i)記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つと、上記(ii)記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つとの組み合わせ;
上記(i)(a)の遺伝子と、上記(ii)(j)〜(o)の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つとの組み合わせ;
上記(i)(a)〜(f)の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つと、上記(ii)(j)の遺伝子との組み合わせ;又は
上記(i)(a)の遺伝子と上記(ii)(j)の遺伝子との組み合わせ。
好ましくは、枯草菌のspoVFA遺伝子及びspoVFB遺伝子、Bacillus licheniformisのspoVFA遺伝子及びspoVFB遺伝子、Bacillus clausiiのspoVFA遺伝子及びspoVFB遺伝子、Clostridium stercorariumのspoVFA遺伝子及びspoVFB遺伝子、ならびにBacillus amyloliquefaciensのspoVFA遺伝子及びspoVFB遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである;
より好ましくは、枯草菌spoVFA遺伝子及び枯草菌spoVFB遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである。
好ましくは、枯草菌のspoVFA遺伝子、Bacillus licheniformisのspoVFA遺伝子、Bacillus clausiiのspoVFA遺伝子、Clostridium stercorariumのspoVFA遺伝子、及びBacillus amyloliquefaciensのspoVFA遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つと、枯草菌のspoVFB遺伝子、Bacillus licheniformisのspoVFB遺伝子、Bacillus clausiiのspoVFB遺伝子、Clostridium stercorariumのspoVFB遺伝子、及びBacillus amyloliquefaciensのspoVFB遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つとの組み合わせである;
より好ましくは、枯草菌spoVFA遺伝子及び枯草菌spoVFB遺伝子との組み合わせである。
(p)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(q)配列番号1に示すヌクレオチド配列と好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(r)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(s)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(t)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(u)配列番号2に示すアミノ酸配列と好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
上記(p)〜(u)からなる群より選択される少なくとも1つ;又は
上記(p)。
好ましくは、枯草菌のpycA遺伝子、Bacillus licheniformisのpycA遺伝子、Bacillus clausiiのpycA遺伝子、Clostridium acetobutylicumのpycA遺伝子、及びBacillus amyloliquefaciensのpycA遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである;
より好ましくは、枯草菌のpycA遺伝子である。
(1−1)トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株(MGB874株;特開2007−130013号公報)におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株MGB874株の元株である枯草菌168株は、遺伝子型としてtrpC2を所持している。つまり168株はトリプトファン合成に関与するインドール−3−グリセロールリン酸シンターゼをコードするtrpC遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ATCC6051T株はトリプトファン非要求性であることが知られている(Albertini,A.M.&Galizzi,A.Microbiology,1999,145(Pt12):3319−3320)。枯草菌168株とATCC6051T株のtrpC遺伝子を比較したところ、328番目から330番目のヌクレオチドATTが枯草菌168株では存在しないことがわかった。そこで、ATCC6051T株ゲノムを鋳型とし、表2記載のtrpC_F1(配列番号19)及びtrpC_R1(配列番号20)のプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物を構築した。このPCR産物を用いて枯草菌変異株MGB874株をコンピテント法で形質転換し、トリプトファン非添加のSMA寒天培地(0.2%硫酸アンモニウム、1.4%リン酸水素2カリウム、0.6%リン酸2水素カリウム、0.1%クエン酸3ナトリウム-2水和物、0.5%グルコース、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、1.5%寒天)に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性MGB874T株を得た。
(1−1)で構築したMGB874T株を宿主として、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株(MGB874T_PspoVG−spoVFAB株)の構築を行った。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表2記載のプライマーspoVFA−F1(配列番号21)及びspoVFA−R1(配列番号22)を用いて、断片(A)をPCRにより増幅した。この断片(A)はspoVFA遺伝子(配列番号3)の開始コドンの上流に隣接する領域である。また、同ゲノムDNAを鋳型とし、表2記載のプライマーspoVFA−F2(配列番号23)及びspoVFA−R2(配列番号24)を用いて、断片(B)をPCRにより増幅した。この断片(B)は、spoVFA遺伝子の開始コドンから下流の領域である。さらに、同ゲノムDNAを鋳型とし、表2記載のプライマーspoVGpro−F(配列番号25)及びspoVGpro−R(配列番号26)を用いて、spoVG制御領域配列を含む断片(C)をPCRにより増幅した。さらに、プラスミドpDLT3(Morimoto,T.et al.,Microbiology,2002,Pt11:3539−3552)を鋳型とし、表2記載のプライマーCm−F(配列番号27)及びCm−R(配列番号28)を用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子とその制御領域を含む断片(D)をPCRにより増幅した。
恒常的発現制御領域として、リボソームタンパク質の一種であるrplS遺伝子の制御領域を選出し、このrplS遺伝子の下流とターミネーターとの間にピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子pycAを結合したコンストラクトを構築した。
枯草菌変異株MGB874T株のゲノムDNAを鋳型として、表2記載のプライマーrplS−UF(配列番号29)及びrplS/SD−rplV−R(配列番号30)を用いて、rplS遺伝子上流領域である断片(A)をPCRにより増幅した。次いで、表2記載のプライマーkan−pt4/rplS−DF(配列番号31)及びrplS−DR(配列番号32)を用いて、rplS遺伝子下流領域である断片(B)をPCRにより増幅した。さらに、表2記載のプライマーSD−rplV/pycA−F(配列番号33)と、プライマーpycA/kan−pt4−R(配列番号34)とを用いて、枯草菌変異株MGB874T株のゲノムDNAを鋳型としてPCR増幅を行い、リボソームタンパク質をコードするrplV遺伝子のSD配列(rplV−SD)とpycA遺伝子のORFが結合した断片(C)を得た。次いで、カナマイシン遺伝子保有組換えプラスミドpAPNCK(BMB Microbiol.,2007,7:69)を鋳型として、表2記載のプライマーpycA/kan−pt4−F(配列番号35)及びkan−pt4/rplS−R(配列番号36)を用いて、カナマイシン耐性遺伝子断片(D)をPCRにより増幅した。
実施例1で構築したMGB874T_PspoVG−spoVFAB株と、MGB874T_PspoVG−spoVFAB_PrplS−pycA株を、50mLの改変S7+MSG培地(10%グルコース、1.8%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属、200mM グルタミン酸ナトリウム1水和物、4.0%炭酸カルシウム、0.6%塩化アンモニウム)で37℃において8時間振盪培養を行い、得られた培養液を、改変S7+MSG培地(10%グルコース、0.6%塩化アンモニウム、0.15%リン酸水素2カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水和物、0.005%硫酸マンガン5水和物、50mM MOPS(モノホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤(pH7.0)、その他微量金属、200mM グルタミン酸ナトリウム1水和物、4.0%炭酸カルシウム)50mLに接種し、37℃、200rpmで2日間、振盪培養を行った。
培養終了後、下記参考例に示す分析条件にてDPA生産量を測定し、MGB874T_PspoVG−spoVFAB株の生産量を100%とした場合の相対値を求めた。
培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間の遠心分離(日立工機、himacCF15RX)に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるDPAについて、HPLC法にて定量及び分子量分析を行った。HPLC装置は、送液ポンプ(島津、LC−9A)、オートサンプラー(日立計測機器、AS−2000)、カラムオーブン(島津、CTO−6A)、UV検出計(島津、SPD−10A)、脱ガス装置(GLサイエンス、DG660B)及びクロマトデータ解析装置(日立計測機器、D−2500)を接続したものを用いた。分析カラムは、High Performance Carbohydrate Column 60(Å)4μm 4.6×250mm HPLC Column(Aminopropylmethylsilyl bonded amorphous silica)(Waters)を使用した。溶離液としては、20mM EDTAを含む水を濃リン酸でpH3.4に合わせた水溶液とアセトニトリル溶液とを1:1に混合した溶液を用いた。測定条件は、検出波長を270nmとし、流速を1mL/分とした。HPLC分析に供するサンプルは、不溶物を除くため、MULTI SCREEN MNHV45(MILLIPORE製、0.45μmデュラポア膜)にてフィルターろ過により前処理した。濃度検定は、2,6−Pyridinedicarboxlic acid:DPA,99%(SIGMA−ALDRICH)を用いて作成した検量線に基づいて行った。
Claims (11)
- 枯草菌変異株であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有し、且つ
枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とが強化された、
枯草菌変異株。 - 前記枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、下記(i)及び(ii)に記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1記載の枯草菌変異株:
(i)下記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットA遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(a)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示すヌクレオチド配列と80%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号4に示すアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)下記(j)〜(o)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットB遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(j)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(k)配列番号5に示すヌクレオチド配列と80%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(m)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(n)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(o)配列番号6に示すアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、下記(p)〜(u)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1又は2記載の枯草菌変異株:
(p)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(q)配列番号1に示すヌクレオチド配列と80%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(r)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(s)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(t)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(u)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、枯草菌spoVFA遺伝子及び枯草菌spoVFB遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1〜3のいずれか1項記載の枯草菌変異株。
- 前記枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、枯草菌pycA遺伝子である、請求項1〜4のいずれか1項記載の枯草菌変異株。
- 枯草菌変異株の製造方法であって、
prophage6領域、prophage1領域、prophage4領域、PBSX領域、prophage5領域、prophage3領域、spb領域、pks領域、skin領域、pps領域、prophage2領域、ydcL−ydeK−ydhU領域、yisB−yitD領域、yunA−yurT領域、cgeE−ypmQ領域、yeeK−yesX領域、pdp−rocR領域、ycxB−sipU領域、SKIN−Pro7領域、sbo−ywhH領域、yybP−yyaJ領域及びyncM−fosB領域からなる群より選択される1以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現と、枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の発現とを強化することを含む、方法。 - 前記枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、下記(i)及び(ii)に記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項6記載の方法:
(i)下記(a)〜(f)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットA遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(a)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示すヌクレオチド配列と80%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)配列番号4に示すアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(ii)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(ii)下記(j)〜(o)からなる群より選択される少なくとも1つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットB遺伝子又はこれに相当する遺伝子:
(j)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(k)配列番号5に示すヌクレオチド配列と80%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(l)配列番号5に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(m)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(n)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(o)配列番号6に示すアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ(i)に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、下記(p)〜(u)からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項6又は7記載の方法:
(p)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(q)配列番号1に示すヌクレオチド配列と80%以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(r)配列番号1に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(s)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(t)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(u)配列番号2に示すアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、枯草菌spoVFA遺伝子及び枯草菌spoVFB遺伝子からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項6〜8のいずれか1項記載の方法。
- 前記枯草菌ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子が、枯草菌pycA遺伝子である、請求項6〜9のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の枯草菌変異株を用いるジピコリン酸又はその塩の製造方法。
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