JP6760757B2 - 枯草菌変異株及びその利用 - Google Patents

Description

本発明は、新規な枯草菌変異株及びその利用に関する。

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」とも称する）は、グルタミン酸のγ−位のカルボキシル基とα−位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物であり、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｎａｔｔｏ）を始め、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ等の一部のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌や、Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ等が産生する粘性物質として知られている。ＰＧＡは、保水性、親水性、増粘性、生分解性等、種々の性質から有用な高分子素材として近年注目され、その生産性の向上が重要な課題の一つとなっている。

近年、枯草菌について遺伝子破壊株の網羅的な研究が行われ、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子のうち２７１個の遺伝子が生育に必須であることが明らかにされた（非特許文献１）。また、ゲノムの大領域あるいは遺伝子を欠失させた変異株の網羅的解析により、各種酵素の生産性に優れた変異株が見出されている。これらの研究で得られた枯草菌変異株の１つであるＭＧＢ８７４株は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）に由来し、そのゲノムの合計８７４ｋｂが削除された変異株であるが、野生株である１６８株に比較して、タンパク質の分泌生産性が有意に向上することが報告されている（特許文献１）。そして、最近では、当該ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株を用いて、上記のＰＧＡを効率よく製造する方法が報告されている（特許文献２）。さらに、ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌株に対してアセトイン合成に関わる酵素遺伝子群（ａｌｓＳ遺伝子、ａｌｓＤ遺伝子）を欠失させた場合にＰＧＡの生産性が向上することが報告されている（特許文献３）。

一方、クエン酸シンターゼは、クエン酸回路の最初の反応を触媒する酵素であり、アセチルＣｏＡの酢酸残基をオキサロ酢酸に付加し、クエン酸を合成する反応を触媒する。
従来、パントエア・アグロメランスに属する微生物に、コリネ型細菌のクエン酸シンターゼ遺伝子を導入した場合にＬ−グルタミン酸の生産能が向上することが報告されている（特許文献４）。しかしながら、枯草菌を用いたＰＧＡ生産性の向上において、クエン酸シンターゼ（ＣｉｔＺ）が関与するという報告はなく、ＣｉｔＺの発現制御とアセトイン合成酵素群の発現制御を組み合わせた場合に如何なる影響を及ぼすかは不明である。

特開２００７−１３００１３号公報 特開２０１３−２５２１１５号公報 特開２０１５−２１３４６７号公報 特開２００８−２０００４４号公報

K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003

本発明は、ＰＧＡを高生産することができる枯草菌変異株及びこれを用いたＰＧＡの生産技術を提供することに関する。

本発明者は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）のゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株を用いてＰＧＡをより効率良く生産することができる微生物株を構築すべく検討した結果、クエン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化した場合、それのみではＰＧＡの生産性は殆ど変わらないが、クエン酸シンターゼ遺伝子の発現強化と共にアセトイン合成遺伝子群が欠失した枯草菌変異株では、アセトイン合成遺伝子群を欠失した枯草菌変異株に比べて優れたＰＧＡ生産能を有することを見出した。

すなわち本発明は、以下の（１）〜（５）に係るものである。
（１）枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
（２）（１）の枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
（３）枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
（４）組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
（５）（２）の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。

本発明によれば、高いＰＧＡ生産能を有する枯草菌変異株が提供される。本発明の枯草菌変異株を用いることによりＰＧＡの効率的生産が実現できる。

枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。 枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。 ｍａｚＦカセットを使用したマーカーフリー欠失法の手順を示す模式図。 枯草菌へのクエン酸シンターゼ遺伝子の導入手順及び導入位置に関する一実施形態を示す模式図。

本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ Ｖｅｒ．１１（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、アミノ酸配列では１〜１８個、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個であり、ヌクレオチド配列では１〜５６個、好ましくは１〜２８個、より好ましくは１〜１４個、さらに好ましくは１〜７個であり得る。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。

本明細書において、別途定義されない限り、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上、好ましくは約９０％以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、又は、６×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、６×ＳＳＣ、６５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。

本明細書において、遺伝子又は領域の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。別途定義されない限り、遺伝子の上流及び下流とは、遺伝子の翻訳開始点又は転写開始点からの上流領域及び終始コドンからの下流領域には限定されない。

本明細書において、遺伝子の制御領域とは、下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、或いは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。

本明細書において、ＰＧＡの生産に関わる遺伝子（目的遺伝子）と制御領域とを「作動可能に連結する」とは、制御領域による遺伝子発現を制御する機能が目的遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と目的遺伝子とを配置することをいう。目的遺伝子と制御領域を作動可能に連結する方法としては、当該制御領域の下流に当該目的遺伝子を連結する方法が挙げられる。
また、本明細書において、目的遺伝子であるＰＧＡの生産に関わる遺伝子を導入した枯草菌変異株を組換え枯草菌といい、目的遺伝子は導入されていないが、目的遺伝子の発現能が優れた宿主として改良された枯草菌を枯草菌変異株という。

[１．枯草菌変異株の構築]
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築されており、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。
本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、クエン酸シンターゼ遺伝子を強発現させる遺伝子改変と、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化させる改変を加えることによって作製することができる。

[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]
本発明の枯草菌変異株の親株となる、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の１以上が欠失している。
ここで示す「領域が欠失」とは、上記記載の遺伝子を両端として挟み込まれる領域を、両端の遺伝子を含めて欠失していることである。

好ましくは、当該枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される領域の全てを欠失している枯草菌ＭＧＢ８７４株（特開２００７−１３００１３号公報）や、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域からなる群より選択される領域の全てを欠失しているＯＡ１０５株が挙げられる。

ＯＡ１０５株は、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域を欠失した株（ＭＧＢ４６９株）に対して、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域をさらに欠失することにより、調製される。
なお、本明細書記載のＭＧＢ８７４株の欠失領域であるｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域及びｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）領域は、隣接した領域であり、特開２００７−１３００１３号公報に記載されているＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域と同じ領域である。
ＭＧＢ４６９株及びＭＧＢ８７４株は国立遺伝学研究所ＮＢＲＰ（ナショナルバイオリソースプロジェクト）より分譲可能となっている（http://www.shigen.nig.ac.jp/bsub/kaoListAction.do）。

上記ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、例えば、１６８株（ＮＢＲＣ １１１４７０）等の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノム配列を、公開されている枯草菌１６８株のゲノム配列と対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（[www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）のヌクレオチドにおける天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。

あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１に記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。

ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。

まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に結合するプライマーの５'末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ'の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ'の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。

次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ'、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ'を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。

上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。

上記手順で構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。

次に、得られた形質転換体から、ゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる（特開平２００９−２５４３５０号公報）。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。

次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。

ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてｃｈｐＡ（ｍａｚＦ）遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９-２５４３５０号公報を参照）。

以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が一部又は全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。

[１−２．クエン酸シンターゼ遺伝子の発現強化]
本発明の枯草菌変異株においては、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築されている。
クエン酸シンターゼ遺伝子とは、下記式で示されるように、アセチルＣｏＡの酢酸残基をオキサロ酢酸に付加し、クエン酸を合成する反応を触媒する活性（クエン酸シンターゼ活性）を有するタンパク質（クエン酸シンターゼ）をコードする遺伝子であり、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子及びそれに相当する遺伝子が包含される。

枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子（ｃｉｔＺ遺伝子）は、遺伝子番号：ＢＧ１０８５５として特定され、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号２に示すアミノ酸配列からなる枯草菌クエン酸シンターゼ（ＣｉｔＺ）をコードする。

枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外の微生物のｃｉｔＺ遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ等のバチルス属微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとし、ストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子を同定することができる。

例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ １９４２株のクエン酸シンターゼ遺伝子（遺伝子番号：ＥＡＴＲ１９４２＿０２３２０）（配列番号７、８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＡＳ４３．３株のクエン酸シンターゼ遺伝子（遺伝子番号：Ｂ９３８＿１３５４０）（配列番号９、１０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ７株のｃｉｔＺ遺伝子（配列番号１１、１２）は、枯草菌１６８株の枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子との配列同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ８４％、８２％、８２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９３％、９４％、９４％である。これらは、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。

したがって、枯草菌クエン酸シンターゼ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

本発明において、クエン酸シンターゼ遺伝子を強発現させる遺伝子改変とは、当該遺伝子の発現が改変前と比較して増強するような遺伝子改変であればその手段は限定されない。例えば、改変前と比較して発現を増強できる制御領域（強発現制御領域）の制御下にクエン酸シンターゼ遺伝子を作動可能に連結させること、制御領域又は強発現制御領域と作動可能に連結されたクエン酸シンターゼ遺伝子を、細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に新たに導入すること等が挙げられる。好ましくは、野生型クエン酸シンターゼ遺伝子に加えて、強発現制御領域の制御下にあるクエン酸シンターゼ遺伝子をさらに導入することが挙げられる。
斯かる強発現制御領域としては、例えば、バシラス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ｒＲＮＡオペロンの制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子（ｒｐｌＳ遺伝子等）の制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が例示されるが、特に限定されない。

強発現制御領域の制御下にあるクエン酸シンターゼ遺伝子をゲノム中にさらに導入する場合の手順を以下に例示する。
先ず、当該強発現制御領域の制御下にクエン酸シンターゼ遺伝子が発現されるように配置され、さらに宿主ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片として構築され得る。このＤＮＡ断片を上述した宿主に導入すれば、宿主ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、宿主を形質転換することができる。形質転換法としては、宿主となる微生物に応じて適切な、かつ一般的な方法を採用することができる。より具体的には、例えば、上流から、上述した強発現制御領域（例えば、ｓｐｏＶＧ遺伝子やｒｐｌＳ遺伝子制御領域）、クエン酸シンターゼ遺伝子の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製し、得られたＤＮＡ断片を用いて宿主を形質転換することが挙げられる。得られた形質転換体は、形質転換前の宿主と比べてクエン酸シンターゼ遺伝子を多数保有しているため、及び／又は強発現制御領域の制御下に配置されているため、該遺伝子の発現が増強又は付加される。

[１−３．ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子の欠失又は不活性化]
本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。
ここで、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子は、アセトイン合成に関わる枯草菌遺伝子である。ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子は、アセトイン合成遺伝子群（ａｌｓＳＤ）として１つのオペロンを形成している。本発明においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのが好ましい。

ａｌｓＳ遺伝子とａｌｓＤ遺伝子のＢＳＯＲＦ ＤＢにおける登録番号及びコードするタンパク質を以下の表２に示す。

ａｌｓＳ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、ａｌｓＤ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｍ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、本発明の枯草菌変異株においては、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失又は不活性化に加え、さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化することが、ＰＧＡの生産性をさらに向上させる点で好ましい。さらに、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのに加え、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が共に欠失又は不活性化されるのがより好ましい。

ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子及びｙｄａＰ遺伝子は酢酸合成に関わる遺伝子で、ｌｄｈ遺伝子は乳酸合成に関わる遺伝子である。各遺伝子のＢＳＯＲＦ ＤＢにおける登録番号及びコードするタンパク質を以下の表３に示す。当業者は、当該ＢＳＯＲＦ ＤＢの情報に基づいて、親株における上記遺伝子を同定することができる。

本発明において、ａｃｋＡ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ａ１）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ａ２）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ３）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ４）配列番号１８０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ５）配列番号１８０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ａ６）配列番号１８０に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、ｌｄｈ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｂ１）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ３）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ４）配列番号１８２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ５）配列番号１８２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ６）配列番号１８２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、ｐｔａ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｃ１）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ３）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ４）配列番号１８４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ５）配列番号１８４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ６）配列番号１８４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

また、ｙｄａＰ遺伝子としては、以下が挙げられる。
（ｄ１）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ２）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ３）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ４）配列番号１８６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ５）配列番号１８６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ６）配列番号１８６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。上記遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記[１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株]にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。欠失又は不活性化させる遺伝子の枯草菌ゲノム上での位置やヌクレオチド配列は、上述したＢＳＯＲＦ ＤＢにて確認することができる。

以上の手順で、本発明の枯草菌変異株を作製することができるが、当該枯草菌変異株は、最終的に得られた微生物において、上述したゲノムの大領域の欠失、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するような遺伝子構築、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失又は不活性化が達成されていればよく、それぞれの遺伝子改変・導入工程の順序は特に限定されない。例えば、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で所定の遺伝子を強発現するように改変し、次いで上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化して製造されてもよく、あるいは、上述したゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、上述した手順で所定の遺伝子を欠失又は不活性化し、次いで上述した手順で所定の遺伝子を強発現するように改変して製造されてもよい。好ましくは、ゲノムの大領域が欠失したゲノム欠失株に対して、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築された枯草菌変異株を親株とし、これにａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化することにより製造できる。

[２．組換え枯草菌の構築]
本発明の組換え枯草菌は、上述したクエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化され、さらに目的とするＰＧＡ合成酵素遺伝子、又はＰＧＡ合成酵素遺伝子及びＰＧＡ分解酵素遺伝子（以下、「目的遺伝子」という）が発現可能なように強化又は導入されたものである。なお、本発明の目的遺伝子が発現可能なように導入された組換え枯草菌には、本来、目的遺伝子が発現している枯草菌において、本発明に関わる遺伝子改変がなされた枯草菌が含まれる。

[２−１．ＰＧＡ合成酵素遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、枯草菌遺伝子ｐｇｓＢ（配列番号１３）、ｐｇｓＣ（配列番号１５）、ｐｇｓＡ（配列番号１７）及びｐｇｓＥ（配列番号１９）、ならびにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が挙げられ、好ましくは、少なくとも枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とを含む組み合わせであり、より好ましくは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせ、あるいは枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子と、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせである。

枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１４に示すアミノ酸配列と少なくとも５５％、例えば、５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'）配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'）配列番号１５に示すヌクレオチド配列と少なくとも５９％、例えば、５９％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'）配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'）配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'）配列番号１６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'）配列番号１６に示すアミノ酸配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はそれに相当する遺伝子がコードするタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ''）配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ''）配列番号１７に示すヌクレオチド配列と少なくとも４８％、例えば、４８％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ''）配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ''）配列番号１８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ''）配列番号１８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ''）配列番号１８に示すアミノ酸配列と少なくとも３０％、例えば、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ａ'''）配列番号１９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ'''）配列番号１９に示すヌクレオチド配列と少なくとも５１％、例えば、５１％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ'''）配列番号１９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ'''）配列番号２０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ'''）配列番号２０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ'''）配列番号２０に示すアミノ酸配列と少なくとも３５％、例えば、３５％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつ上記枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子と、上記枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子又はその相当遺伝子の存在下で、ＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

上記において、タンパク質の「アミドリガーゼ活性」は、グルタミン酸、及びＡＴＰ又はＧＴＰを基質とし、これに塩化マンガンを加えた反応溶液中におけるＰＧＡの生成を検出することにより測定することができる（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，２００２，１８４：３３７−３４３）。また、上述の枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子がコードするタンパク質の「アミドリガーゼ活性」とは、当該ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子を、上記ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子とともに枯草菌又はその変異株に導入した際に、当該株におけるＰＧＡの生産と菌体外への分泌をもたらす能力であり得る。
所定の微生物におけるＰＧＡ生産能の評価は、例えば、グルタミン酸又はその塩を含有するＰＧＡ生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＰＧＡを検出する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，６０：２５５−２５８）；酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：１６８４−１６８７）；培養液から精製し乾燥重量を求める定量法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９，２６３：６−１２）；ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，５７：１２１２−１２１３）等によって行うことができる。

また、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ、及びｐｇｓＥの各遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ合成に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物としては、ＰＧＡ生産性微生物であってもＰＧＡ非生産性微生物であってもよく、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ等のバチルス属微生物、及びＮａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａ、Ｈｙｄｒａ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子は、上記の微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号１３、１５、１７又は１９で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドやそのフラグメントをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うことによって同定することができる。また例えば、公知のゲノム配列情報に基づいて上記微生物のゲノムのヌクレオチド配列と、配列番号１３、１５、１７又は１９で示されるヌクレオチド配列とを比較することによって、上記微生物における枯草菌ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ、ｐｇｓＡ又はｐｇｓＥに相当する遺伝子を同定することができる。

例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｓＣ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０１遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＢ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ９９．９％、７８％、８１％及び６２％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ９９．７％、８９％、９３％及び５５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。

また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＣ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｔＡ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ０２０２遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＣ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列において、それぞれ１００％、７８％、８３％及び５９％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列において、それぞれ１００％、８９％、９３％及び５１％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子に相当する遺伝子として例示され、具体的に枯草菌によるＰＧＡ生産において利用できることが示されている（特開２０１０−２１３６６４号公報）。

また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−３６６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＡ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｙｗｔＢ遺伝子、及びＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＨＴＥ８３１株のＯＢ２９１７遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＡ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ１００％、６８％、７５％及び４８％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ１００％、６７％、７８％及び３０％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＡ遺伝子に相当する遺伝子として例示される（特開２０１０−２１３６６４号公報）。

また例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｓＥ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｐｇｓＥ遺伝子、及びＢａｃｉｌｌｓｕ ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｈ９４０１株のｃａｐＥ遺伝子は、枯草菌１６８株のｐｇｓＥ遺伝子との同一性が、ヌクレオチド配列においてそれぞれ６３％、７６％及び５１％であり、またそれらのコードするアミノ酸配列においてそれぞれ４７％、７２％及び３５％である。これらは、枯草菌ｐｇｓＥ遺伝子に相当する遺伝子として例示される。

枯草菌遺伝子ｐｇｓＢＣＡＥに相当するバチルス属又は他の属に属する微生物の遺伝子の具体的な例としては、下記表４に示す遺伝子が挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子は、上記（ａ）〜（ｆ）、（ａ'）〜（ｆ'）、（ａ''）〜（ｆ''）及び（ａ'''）〜（ｆ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、少なくとも上記（ａ）〜（ｆ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ａ'）〜（ｆ'）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせを含む。また好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、少なくとも上記（ａ）で表した遺伝子と、（ａ'）で表した遺伝子との組み合わせを含む。さらに好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、上記（ａ）及び（ａ'）で表した遺伝子の組み合わせであるか、又は上記（ａ）、（ａ'）、（ａ''）及び（ａ'''）で表した遺伝子の組み合わせである。

別の好ましい実施形態において、本発明の枯草菌変異株において発現可能に強化又は導入されるＰＧＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、配列番号１３、１５、１７、１９並びに２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つが挙げられ、好ましくは、少なくとも配列番号１３、２３、２９、３７、４５及び５１のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１５、２５、３１、３９、４７及び５３のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせを含む。より好ましくは、発現可能に強化又は導入される遺伝子は、配列番号１３、２３、２９、３７、４５及び５１のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１５、２５、３１、３９、４７及び５３のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１７、２７、３３、４１、４９及び５５のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つと、配列番号１９、３５、４３及び５７のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つとの組み合わせである。

[２−２．ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子]
ＰＧＡ合成酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌においては、さらにＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子が発現可能に強化又は導入されるのが好ましい。微生物がＰＧＡを高生産すると培地の粘度が高まり、その結果、微生物の生存やＰＧＡの生産性に悪影響が及ぶ場合がある。例えば、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子が発現可能に強化又は導入されることで、低分子化されたＰＧＡが生産され、培養液の粘度を抑制することにより、ＰＧＡの高生産に伴う上記課題を解決することができる。
したがって、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子としては、枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子（配列番号２１）又はそれに相当する遺伝子が挙げられる。

枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外のバチルス属又は他の属に属する微生物のＰＧＡ分解に関与する遺伝子が挙げられる。枯草菌以外の微生物の枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当する遺伝子は、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子に関して上述したのと同様の手順で、配列番号２４で示されるヌクレオチド配列をもとに探索又は同定することができる。枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子に相当するバチルス属微生物遺伝子の具体的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ１４５８０株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号５９）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２株のｐｇｄＳ遺伝子（配列番号６１）が挙げられる。

枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子としては、以下が挙げられる：
（ｇ）配列番号２１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２１に示すヌクレオチド配列と少なくとも６２％、例えば、６２％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２２に示すアミノ酸配列と少なくとも５７％、例えば、５７％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつＰＧＡ分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

好ましい実施形態において、本発明の組換え枯草菌において発現可能なように強化又は導入されるＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子は、上記（ｇ）〜（ｌ）で表した遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つであり、好ましくは、上記（ｇ）で表した遺伝子である。

別の好ましい実施形態において、枯草菌ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子は、配列番号２１、５９及び６１のいずれかに示す配列からなる遺伝子のうちの少なくとも１つである。

[２−３．ＰＧＡの生産に関わる遺伝子の発現可能な強化又は導入]
ＰＧＡの生産に関わる遺伝子（目的遺伝子）を発現可能なように強化又は導入するとは、本発明の枯草菌変異株において、目的遺伝子が少なくとも発現可能な状態に置かれることを意味し、当該遺伝子が本発明の枯草菌変異株中に発現しているか否かは問われない。
斯かる目的遺伝子の発現可能な強化又は導入は、親株のゲノム上の目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の制御領域配列を強制御領域に置換すること、あるいは、強制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含む断片を、親株のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって成すことができる。またあるいは、親株中に複数の目的遺伝子を発現可能に存在させる改変により成すこともできる。
目的遺伝子を発現可能なように強化又は導入するための手順の一例を以下に記載する。

（１）目的遺伝子が制御領域と作動可能に連結され、さらに親株ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片を構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ｓｐｏＶＧ遺伝子制御領域、ｒｒｎＯオペロン制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子）の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に親株ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。次いで、このＤＮＡ断片を親株に導入すれば、親株ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。

（２）制御領域と作動可能に連結された目的遺伝子を含むベクターを構築する。例えば、上流から、制御領域（例えば、ＫＳＭ−Ｓ２３７のセルラーゼ遺伝子の制御領域）、目的遺伝子（例えば、ｐｇｓＢＣ遺伝子）の順で配置したＤＮＡを含むベクターを調製する。次いで、このベクターを親株に導入すれば、親株を形質転換することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の株と比べて目的遺伝子の発現量が増加する。

ここで、目的遺伝子の発現に使用され得る制御領域は、好ましくは、宿主内において下流の目的遺伝子の発現を高める機能を有し、より好ましくは、下流の目的遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域である。また好ましくは、目的遺伝子の野生型の制御領域と比較して、目的遺伝子の発現を強化することができる制御領域（強制御領域）である。

ＰＧＡ合成酵素遺伝子、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現に使用され得る制御領域の例としては、バチルス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、ｒｒｎＯオペロン制御領域、ｔｕｆＡ遺伝子制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が挙げられる。

好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域であるセルラーゼ遺伝子の翻訳開始点の上流０．４〜１．０ｋｂ領域（配列番号６３）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｓｐｏＶＧ遺伝子の翻訳開始点の上流０．２ｋｂの領域（配列番号１７８）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｒｒｎＯオペロンの１６ＳｒＲＮＡの上流０．２〜1.０ｋｂ領域（配列番号６４）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列、ｔｕｆＡ遺伝子の翻訳開始点の上流１ｋｂの領域（配列番号６５）、及び当該領域とヌクレオチド配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ当該領域と同等の遺伝子発現制御機能を有する塩基配列が挙げられる。

より好ましくは、ＰＧＡ合成酵素遺伝子（例えば、枯草菌ｐｇｓＢＣ遺伝子又はその相当遺伝子）に対しては上記ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子の制御領域が、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子群全て（例えば、枯草菌ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子又はその相当遺伝子群）に対してはｓｐｏＶＧ遺伝子制御領域、又はｒｒｎＯオペロン制御領域が、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素をコードする遺伝子に対してはｔｕｆＡ遺伝子制御領域が使用される。

目的遺伝子又は制御領域の親株への導入には、細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に新たに導入すること等が挙げられ、使用されるベクターは、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターであればよい。ベクターの種類は、適宜選択することができるが、親株内で自己複製可能なベクター（例えばプラスミド）であることが好ましく、多コピーのベクターであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が親株のゲノム（染色体）に対し、２以上１００コピー以下、好ましくは２以上５０コピー以下、より好ましくは２以上３０コピー以下である。好ましいプラスミドの例としては、例えば、ｐＴ１８１、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＳＮ２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

目的遺伝子又は制御領域のベクターへの挿入は、当該分野における通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的遺伝子及び制御領域の断片をＰＣＲ等によって増幅し、これらの断片を制限酵素法等によってプラスミド等のベクターに挿入し、連結すればよい。あるいは、目的遺伝子及び制御領域の断片を予め連結した断片を作製し、これをプラスミド等のベクターに挿入してもよい。その際、ベクター上において、上流から制御領域断片、目的遺伝子の断片の順で連結されているようにする。

ＰＧＡ合成酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子と枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子との組み合わせの場合は、親株に導入するＤＮＡ断片やベクター上において、上流から制御領域断片、枯草菌ｐｇｓＢ遺伝子又はその相当遺伝子の断片、次いで枯草菌ｐｇｓＣ遺伝子又はその相当遺伝子の断片の順で連結されているようにするとよい。

親株へのＤＮＡ断片又はベクターの導入は、例えばプロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，１６８：１１１−１１５）やコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６３，８６：３９２−４００、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）などの通常の手法に従って行うことができる。

[３．ＰＧＡの製造]
斯くして得られた本発明の組換え枯草菌は、親株となるゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子の発現を強化した組換え枯草菌と比べて、遥かに高いＰＧＡ生産能を有している。
よって、本発明の組換え枯草菌を培養することによって、当該菌外に効率よくＰＧＡを生産することが可能になる。
本発明のＰＧＡの製造方法においては、先ず、適切な培地において上記本発明の組換え枯草菌を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。当該培地は、合成培地であっても天然培地であってもよい。

ＰＧＡの製造においては、必ずしも培地にグルタミン酸を添加する必要はないが、ＰＧＡの生産性をより向上させるために、本発明の組換え枯草菌が生育に最低限必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地で、当該組換え枯草菌を培養することができる。グルタミン酸は、培地中へはグルタミン酸ナトリウムとして添加することが好ましいが、その濃度（グルタミン酸換算）は、例えば培地中、好ましくは０．００５〜６００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜４００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜３００ｇ／Ｌであり得る。培地中のグルタミン酸濃度は、ＰＧＡの生産性向上の点から、０．００５ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、他方、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることによる培地中のグルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分の析出を回避する点から、グルタミン酸濃度６００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。

培養条件として、至適温度は、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。至適ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、より好ましくは５〜８である。また、培養日数は、菌接種後、好ましくは１〜１０日間であり、より好ましくは１〜５日間である。
培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた菌体と分離する必要がある。ＰＧＡを分離する手段としては、遠心分離、限外濾過膜、電気透析法、ｐＨをＰＧＡの等電点付近に維持することでＰＧＡを沈殿として回収する方法、さらに上記手法の組み合わせ等が挙げられる。

本発明の例示的実施形態として、さらに以下を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
＜２＞ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する、＜１＞の枯草菌変異株。
＜３＞ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている＜１＞又は＜２＞の枯草菌変異株。
＜４＞さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている、＜１＞〜＜３＞のいずれかの枯草菌変異株。
＜５＞さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている、＜１＞〜＜３＞のいずれかの枯草菌変異株。
＜６＞クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するような遺伝子構築が、野生型クエン酸シンターゼ遺伝子に加えて、強発現制御領域の制御下にあるクエン酸シンターゼ遺伝子をさらに導入することによりなされる、＜１＞〜＜５＞の枯草菌変異株。
＜７＞クエン酸シンターゼ遺伝子が、下記の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜６＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜８＞ａｌｓＳ遺伝子が、下記の（ｇ）〜（ｌ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜７＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｇ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜９＞ａｌｓＤ遺伝子が、下記の（ｍ）〜（ｒ）からなる群より選択される、＜１＞〜＜８＞のいずれかの枯草菌変異株。
（ｍ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号７に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号８に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号８に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号８に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１０＞ａｃｋＡ遺伝子が以下の群より選択される、＜１＞〜＜９＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１７９に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８０に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８０に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１１＞ｐｔａ遺伝子が、以下の群より選択される、＜１＞〜＜１０＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１８３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８４に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリン酸アセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１２＞ｙｄａＰ遺伝子が、以下の群より選択される、＜１＞〜＜１１＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１８５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８６に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつピルビン酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１３＞ｌｄｈ遺伝子が、以下の群より選択される、＜１＞〜＜１２＞のいずれかの枯草菌変異株。
（１）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（２）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３）配列番号１８１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４）配列番号１８２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５）配列番号１８２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６）配列番号１８２に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつL-乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜１４＞＜１＞〜＜１３＞のいずれかの枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
＜１５＞ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子及びｐｇｓＥ遺伝子、並びにそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であり、ポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が枯草菌ｐｇｄＳ遺伝子又はそれに相当する遺伝子である＜１４＞の組換え枯草菌。
＜１６＞ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子、ｐｇｓＥ遺伝子及びｐｇｄＳ遺伝子、又はこれらに相当する遺伝子である＜１４＞の組換え枯草菌。
＜１７＞枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程を含む、方法。
＜１８＞組換え枯草菌の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ、又はｙｒｋＳ-ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法。
＜１９＞＜１４＞〜＜１６＞のいずれかの組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ 菌株の構築
（１−１）トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４株；特開２００７−１３００１３号公報）におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株の元株である枯草菌１６８株は、遺伝子型としてｔｒｐＣ２を所持している。つまり１６８株はトリプトファン合成に関与するインドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードするｔｒｐＣ遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株はトリプトファン非要求性であることが知られている（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．＆Ｇａｌｉｚｚｉ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５（Ｐｔ１２）：３３１９−３３２０）。枯草菌１６８株とＡＴＣＣ６０５１Ｔ株のｔｒｐＣ遺伝子を比較したところ、３２８番目から３３０番目のヌクレオチドＡＴＴが枯草菌１６８株では存在しないことがわかった。そこで、ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株ゲノムを鋳型とし、表５記載のｔｒｐＣ＿Ｆ１及びｔｒｐＣ＿Ｒ１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を構築した。このＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株をコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）で形質転換し、トリプトファン非添加のＳＭＡ寒天培地（０．２％硫酸アンモニウム、１．４％リン酸水素２カリウム、０．６％リン酸２水素カリウム、０．１％クエン酸３ナトリウム-２水和物、０．５％グルコース、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天）に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性の枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株を得た。

（１−２）ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築
上記（１−１）で構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株を宿主として、ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築を行った。本変異株の作製は、ＩＰＴＧ制御領域と遊離のｍＲＮＡ切断リボヌクレアーゼであるｍａｚＦ遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。

始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１及びａｌｓＳＤ−ＤＲ１を用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群の開始コドン上流に隣接する領域である断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ２及びａｌｓＳＤ−ＤＲ２を用いて、ａｌｓＤ遺伝子遺伝子の停止コドン下流の領域である断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＩＦ及びａｌｓＳＤ−ＩＲを用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群ＯＲＦ内と相同領域である断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。

次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｂ）、断片（Ｄ）及び断片（Ｃ）をこの順となる様に表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１及びａｌｓＳＤ−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株の形質転換を行い、ＩＰＴＧを含まずスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。

最後に、ｍａｚＦ遺伝子カセットを除くため、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上で培養し、生育したコロニーを選択した。得られた変異株は、断片（Ｂ）において細胞内相同組換えによりｍａｚＦカセットが除去された変異株となる（以下、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株と称する）。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株はゲノム上のａｌｓＳ遺伝子開始コドンからａｌｓＤ遺伝子停止コドン領域が欠失し、更に薬剤選択マーカーが除去された変異を有する枯草菌変異株である。本実施例でのｍａｚＦ遺伝子カセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築したａｌｓＳＤ遺伝子群欠失方法を図３に示した。

得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７４：５４６３）によるシークエンシングによって、ゲノム上のａｌｓＳＤ遺伝子群の欠失が生じていることを確認した。

（１−３）ａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築
上記（１−２）で構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤ株を宿主として、上述の手法と同様に、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失された変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築を行った。

ａｃｋＡ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーａｃｋＡ−ＤＦ１及びａｃｋＡ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーａｃｋＡ−ＤＦ２及びａｃｋＡ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーａｃｋＡ−ＩＦ及びａｃｋＡ−ＩＲを、それぞれ使用した。

ｐｔａ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーｐｔａ−ＤＦ１及びｐｔａ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーｐｔａ−ＤＦ２及びｐｔａ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーｐｔａ−ＩＦ及びｐｔａ−ＩＲを、それぞれ使用した。

ｙｄａＰ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーｙｄａＰ−ＤＦ１及びｙｄａＰ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーｙｄａＰ−ＤＦ２及びｙｄａＰ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーｙｄａＰ−ＩＦ及びｙｄａＰ−ＩＲを、それぞれ使用した。

ｌｄｈ遺伝子欠失の際、断片（Ａ）増幅には表６記載のプライマーｌｄｈ−ＤＦ１及びｌｄｈ−ＤＲ１を、断片（Ｂ）増幅には表６記載のプライマーｌｄｈ−ＤＦ２及びｌｄｈ−ＤＲ２を、断片（Ｃ）増幅には表６記載のプライマーｌｄｈ−ＩＦ及びｌｄｈ−ＩＲを、それぞれ使用した。

順次、欠失変異を集積させ、最終的に枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株を構築した。得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。

（１−４）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株）の構築
ゲノム上のアルカリセリンプロテアーゼをコードするａｐｒＥ遺伝子を分断する形で、クエン酸シンターゼ遺伝子ｃｉｔＺを導入するためのコンストラクトを構築した。ｃｉｔＺ遺伝子発現の制御領域として、恒常的発現制御である胞子形成に関与するｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域を用いた。
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＵＦ及びａｐｒＥ／ＰｓｐｏＶＧ−Ｒを用いて、ａｐｒＥ遺伝子上流領域を含む断片（Ｅ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーｅｒｍ ｐｔ２／ａｐｒＥ−Ｆ及びｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＤＲを用いて、ａｐｒＥ遺伝子下流領域を含む断片（Ｆ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーａｐｒＥ／ＰｓｐｏＶＧ−Ｆ及びＰｓｐｏＶＧ／ｃｉｔＺ−Ｒを用いて、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域の断片（Ｇ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７記載のプライマーＰｓｐｏＶＧ／ｃｉｔＺ−Ｆ及びｃｉｔＺ／ｅｒｍ ｐｔ２−Ｒを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｃｉｔＺ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｈ）をＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＭｕｔｉｎ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，３０９７−３１０４，１９９８）を鋳型とし、表７記載のプライマーｅｒｍ ｐｔ２−Ｆ及びｅｒｍ ｐｔｗ／ａｐｒＥ−Ｒを用いて、エリスロマイシン耐性遺伝子を含む領域の断片（Ｉ）をＰＣＲにより増幅した。

次に、得られた断片（Ｅ）、断片（Ｇ）、断片（Ｈ）、断片（Ｉ）及び断片（Ｆ）をこの順となる様に表７記載のプライマーｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＵＦ及びｎｅｗ−ａｐｒＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔを形質転換し、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株を得た。

得られた枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。

枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株は、ゲノム上に生来のｃｉｔＺ遺伝子と、導入したＰｓｐｏＶＧ制御下の枯草菌ｃｉｔＺ遺伝子との両方を有する枯草菌変異株である。本実施例のクエン酸シンターゼ遺伝子の導入手順及び導入位置を図４に示した。

（１−５）ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株）の構築
始めに、枯草菌が本来ゲノム上に有するＰＧＡ合成酵素遺伝子群（ｐｇｓＢＣＡＥ）及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の欠失変異導入を行った。本変異株の作製は、ＩＰＴＧ制御領域と遊離のｍＲＮＡ切断リボヌクレアーゼであるｍａｚＦ遺伝子を融合したカセットを使用するマーカーフリーの欠失法にて構築した（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。

実施例（１−１）にて構築した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、断片（Ｊ）増幅には表８記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＤＲ１を、断片（Ｋ）増幅には表８記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ２及びｐｇｓ−ＤＲ２を、断片（Ｌ）増幅には表８記載のプライマーｐｇｓ−ＩＦ及びｐｇｓ−ＩＲを、それぞれ使用した。さらに、枯草菌変異株ＴＯＭ３１０（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ３４５−３５８．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むｍａｚＦカセット断片（Ｍ）をＰＣＲにより増幅した。次に、得られた断片（Ｊ）、断片（Ｋ）、断片（Ｍ）及び断片（Ｌ）をこの順となる様に表８記載のプライマーｐｇｓ−ＤＦ１及びｐｇｓ−ＩＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＤＮＡ断片を得た。構築した最終ＰＣＲ産物で枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株を形質転換した。得られた形質転換体（枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株）のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の変異導入を行った各遺伝子について欠失が生じていることを確認した。

次いで、ＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−１ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ｎ）をＰＣＲにより増幅した。また、表８記載のプライマーｔｕｆＡ−２ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いて、ｔｕｆＡ遺伝子下流領域の断片（Ｏ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーＢＳｐｇｄＳ−Ｆ及びＢＳｐｇｄＳ−Ｒを用いて、ｐｇｄＳ遺伝子ＯＲＦの断片（Ｐ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、スペクチノマイシン耐性遺伝子保有のプラスミドｐＡＰＮＣ２１３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）を鋳型とし、表８記載のプライマーｓｐｃ−Ｆ及びｓｐｃ−Ｒを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の断片（Ｑ）をＰＣＲ増幅した。

次に、得られた断片（Ｎ）、断片（Ｐ）、断片（Ｑ）及び断片（Ｏ）をこの順となるように表８記載のプライマーｔｕｆＡ−１ｆ及びｔｕｆＡ−２ｒを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて上述した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株を形質転換し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株を得た。

得られた組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ及びそれに続くサンガー法によるシークエンシングによって、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子が導入されていることを確認した。

次いで、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群の導入を行った。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及び表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＲを用いて、ａｍｙＥ上流領域の断片（Ｒ）をＰＣＲにより増幅した。ｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８：３５３９−３５５２）で枯草菌野生株１６８を形質転換した変異株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｃａｔ−Ｆ及び表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＤＲを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むａｍｙＥ下流領域の断片（Ｓ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし表８記載のプライマーａｍｙＥ／ＰＶＧ−Ｆ及びＰＶＧ／ｂｓ−ｐｇｓＲを用いて、ｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域の断片（Ｔ）をＰＣＲにより増幅した。次いで、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８記載のプライマーｂｓ−ｐｇｓＦ及びｂｓ−ｐｇｓ／ｃａｔＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行い、ｐｇｓＢＣＡＥ遺伝子群の断片（Ｕ）をＰＣＲ増幅した。

次に、得られた断片（Ｒ）、断片（Ｔ）、断片（Ｕ）及び断片（Ｓ）をこの順となる様に表８記載のプライマーａｍｙＥ−ＵＦ及びａｍｙＥ−ＤＲを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、最終ＰＣＲ産物を得た。得られた最終ＰＣＲ産物を用いて組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ＰｔｕｆＡ−ｐｇｄＳ株を形質転換し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株を得た。

得られた組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。

（１−６）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株）の構築
始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株として構築した。

得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。

（１−７）ａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株）の構築

始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ株を宿主として、先述した（１−２）と同様の手法にて、表６記載のプライマーａｌｓＳＤ−ＤＦ１、ａｌｓＳＤ−ＤＲ１、ａｌｓＳＤ−ＤＦ２、ａｌｓＳＤ−ＤＲ２、ａｌｓＳＤ−ＩＦ、ａｌｓＳＤ−ＩＲ、ｐＡＰＮＣ−Ｆ及びｃｈｐＡ−Ｒを用いて、ａｌｓＳＤ遺伝子群の欠失を行い、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ΔａｌｓＳＤ株を構築した。

次に、（１−５）と同様の手法で、ゲノム上にＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を強化する変異を導入し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株を構築した。

得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

（１−８）ａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株）の構築

始めに、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ΔａｌｓＳＤ株を宿主として、先述した（１−３）と同様の手法にて順次、欠失変異を集積させ、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ΔｐｇｓＢＣＡＥΔｐｇｄＳ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株を構築した。

次に、（１−５）と同様の手法で、ゲノム上にＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を強化する変異を導入し、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株を構築した。

得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていること、及び欠失されていることを確認した。

（１−９）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ＿ｃｉｔＺ株）の構築
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ＿ｃｉｔＺ株として構築した。

得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。

（１−１０）クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失し、ＰＧＡ合成酵素遺伝子群及びＰＧＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現が強化された組換え枯草菌（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ｃｉｔＺ株）の構築
枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ｃｉｔＺ株のゲノムＤＮＡを用いてコンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株の形質転換を行い、エリスロマイシンを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ｃｉｔＺ株として構築した。

得られた組換え枯草菌のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ法を用いて、ゲノム上の所定の位置に目的遺伝子群が導入されていることを確認した。

実施例２ ＰＧＡ生産性評価１
実施例１にて得られた組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ及び組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株を５ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属）で３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）に１ｍＬ（約３％（ｖ／ｖ））接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで１日〜２日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株の到達ＰＧＡ生産量は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株における到達ＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。

結果を表９に示す。ｃｉｔＺ遺伝子が強発現した組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ｃｉｔＺ株は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡと比較して、到達ＰＧＡ生産量に変化は認められなかった。

実施例２ ＰＧＡ生産性評価２
実施例１にて得られた組換え枯草菌を５ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属）で３０℃にて１２〜１６時間振盪培養を行い、さらに得られた培養液を、３０ｍＬの５％グルコースＭ改変培地（５％グルコース、０．６％塩化アンモニウム、０．１５％リン酸水素２カリウム、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０％炭酸カルシウム）に１ｍＬ（約３％（ｖ／ｖ））接種し、３７℃、２１０ｒｐｍで１日〜２日間、振盪培養を行った。培養終了後、下記測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量を測定した。各株の到達ＰＧＡ生産量は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ株における到達ＰＧＡ生産量を１００％とした場合の相対値で示した。

結果を表１０に示す。ｃｉｔＺ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群が欠失した組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ＿ｃｉｔＺ株は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤ株と比較して、到達ＰＧＡ生産量が高かった。また、ｃｉｔＺ遺伝子が強発現し、更にａｌｓＳＤ遺伝子群、ａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が欠失した組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ＿ｃｉｔＺ株は、組換え枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰＧＡ＿ΔａｌｓＳＤΔａｃｋＡΔｐｔａΔｙｄａＰΔｌｄｈ株と比較して、到達ＰＧＡ生産量が高かった。以上の結果から、クエン酸シンターゼ遺伝子の発現強化は特定の遺伝子欠失変異と組み合わせることで高い効果を発揮することを見出した。

＜ＰＧＡの定量分析＞
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＰＧＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量分析を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる２種類の東ソー製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界＞５×１０^７）及びＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界１×１０^６）を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムＴＳＫ ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＰＷＸＬ（６．０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ）を接続した。溶離液には０．１Ｍ硫酸ナトリウム、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度は５０℃、溶出ピークの検出波長は２１０ｎｍを用いた。試料注入量はサンプルループ（レオダイン）を用い、１分析あたり５０μＬとした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてＭＵＬＴＩ ＳＣＲＥＥＮ ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。濃度検定には分子量８０万のＰＧＡ（明治フードマテリアル）を用いて検量線を作成した。

Claims (10)

1. 枯草菌変異株であって、
   ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有し、
   クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築され、かつａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株であって、
   クエン酸シンターゼ遺伝子が、下記の（ａ）、（ｂ），（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択される、枯草菌変異株。
   （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
2. さらにａｃｋＡ遺伝子、ｐｔａ遺伝子、ｙｄａＰ遺伝子及びｌｄｈ遺伝子が共に欠失又は不活性化されている、請求項１記載の枯草菌変異株。
3. ａｌｓＳ遺伝子が、下記の（ｇ）、（ｈ）、（ｊ）〜（ｌ）からなる群より選択される、請求項１又は２記載の枯草菌変異株。
   （ｇ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｈ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｊ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｋ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｌ）配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
4. ａｌｓＤ遺伝子が、下記の（ｍ）、（ｎ）、（ｐ）〜（ｒ）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
   （ｍ）配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｎ）配列番号５に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｐ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｑ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｒ）配列番号６に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
5. 請求項１〜４のいずれか１項記載の枯草菌変異株において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が発現可能に強化又は導入された組換え枯草菌。
6. ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素をコードする遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子及びｐｇｓＣ遺伝子又はこれらに相当する遺伝子である請求項５記載の組換え枯草菌。
7. ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子が、枯草菌のｐｇｓＢ遺伝子、ｐｇｓＣ遺伝子、ｐｇｓＡ遺伝子、ｐｇｓＥ遺伝子及びｐｇｄＳ遺伝子、又はこれらに相当する遺伝子である請求項５記載の組換え枯草菌。
8. 枯草菌変異株の製造方法であって、
   ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、及びａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子を共に欠失又は不活性化する工程を含む、方法であって、
   クエン酸シンターゼ遺伝子が、下記の（ａ）、（ｂ），（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択される、方法。
   （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
9. 組換え枯草菌の製造方法であって、ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７領域（ｙｒｋＳ−ｙｒａＫ）、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、クエン酸シンターゼ遺伝子が強発現するように遺伝子構築する工程、ａｌｓＳ遺伝子及びａｌｓＤ遺伝子を共に欠失又は不活性化する工程、及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子、又はポリ−γ−グルタミン酸合成酵素遺伝子及びポリ−γ−グルタミン酸分解酵素遺伝子を発現可能に強化又は導入する工程を含む、方法であって、
   クエン酸シンターゼ遺伝子が、下記の（ａ）、（ｂ），（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選択される、方法。
   （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつクエン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
10. 請求項５〜７のいずれか１項記載の組換え枯草菌を培養し、培養物からポリ−γ−グルタミン酸を回収する工程を含む、ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。