JP6088283B2

JP6088283B2 - ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法

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Publication number: JP6088283B2
Application number: JP2013030147A
Authority: JP
Inventors: 陽祐名取; 健太増田
Original assignee: Kao Corp
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Priority date: 2013-02-19
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2017-03-01
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Also published as: JP2014158429A

Description

本発明は、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産方法に関する。

ポリ−ガンマ−グルタミン酸（以下、本明細書において「ＰＧＡ」ともいう）は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基とα位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。また、ＰＧＡはγ−ポリグルタミン酸と呼称される場合もある。ＰＧＡは、納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から近年新たな高分子素材として注目されている。

ＰＧＡを生産する微生物としては、納豆菌を含む一部のバシラス（Bacillus）属細菌とその近縁種（Bacillus subtilis var．chungkookjang、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans）や、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる。このようなＰＧＡ生産能を有する微生物種の育種によりＰＧＡを生産することは可能であるが、ＰＧＡの生産性を向上させるための最適化には、各微生物種の複雑な栄養要求性を解消したり、ＰＧＡ合成系が受ける厳密な制御を解除するなど、多大な労力を要する。このため、遺伝子組換え技術を用いたＰＧＡ高生産化法がこれまでに検討されている。例えば、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子群のなかで、枯草菌（Bacillus subtilis）におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子と、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を宿主微生物に導入した組換え微生物を用いたＰＧＡの生産方法が特許文献１に記載されている。

一方、微生物は元来、自然界における様々な環境変化に対応するための多種多様な遺伝子群を有しており、近年のゲノム解読の結果からは、細胞増殖／分裂、代謝、核酸合成、情報伝達に関わる遺伝子群、さらに多くの機能未知の遺伝子群が存在することが明らかにされている。一方で、工業的な有用物質生産に微生物を用いる場合、限定した培地成分が豊富に供給され安定に生存できる環境が与えられるため、ゲノム上にコードにされる遺伝子のなかには、有用物質の生産にとっては不要な或いは有害な働きをする遺伝子も存在する。
そこで、不要な或いは有害な働きをすると考えられる遺伝子を欠失又は不活性化することによって、有用物質（例えば異種タンパク質）の生産性を向上させるといった試みが行われている。例えば、特許文献２には、転移因子を有するＰＧＡの生産能を有する納豆菌において、recA遺伝子を欠損させることにより、ＰＧＡの生産性を安定に保持する方法が記載されている。ここで、特許文献２に記載の方法は、recA遺伝子の欠損により、納豆菌の染色体中に存在する転移因子（トランスポゾン(Tn)や挿入配列(IS)）の転移を抑制し、PGA合成遺伝子群の機能破壊を抑制する技術である。
これに対して、特許文献３には、枯草菌においてrecA遺伝子を欠損させた場合、導入するプラスミドが宿主細胞内で不安定となる場合があることが記載されている。

特開２００９−８９７０８号公報特開２０１０−５７３８８号公報特開平１−１９１６８９号公報

本発明は、ＰＧＡを効率良く且つ安定的に生産することができる、ＰＧＡの生産方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、ＰＧＡを生産する微生物のＰＧＡの生産性を安定化させる、ＰＧＡの生産性安定化方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、ＰＧＡを効率良く且つ安定的に生産することができ、前記方法に好適に用いることができる、ＰＧＡ生産用組換え微生物を提供することを課題とする。

本発明者等は上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、納豆菌を除く枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させ、当該枯草菌を培養してＰＧＡを生産させることで、従来の微生物を用いた場合と比較してＰＧＡの生産性が安定化することを見出した。これは、プラスミドの不安定の要因とされる転移因子を有しない枯草菌において、recA遺伝子を欠損させることでプラスミドを安定的に保持させることを可能とした。本発明はこの知見に基づき完成されたものである。

本発明は、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた、納豆菌を除く枯草菌を用いてＰＧＡを生産する、ＰＧＡの生産方法に関する。
また、本発明は、納豆菌を除く枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてＰＧＡの生産性を安定化させる、ＰＧＡの生産性安定化方法に関する。
さらに、本発明は、納豆菌を除く枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた、ＰＧＡ生産用組換え微生物に関する。

本発明のＰＧＡの生産方法は、ＰＧＡを効率良く、且つ安定的に生産することができる。
また、本発明のＰＧＡの生産性安定化方法は、recA遺伝子及び当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失及び不活性化させない場合と比較してＰＧＡの生産性を安定化させることができる。
さらに、本発明のＰＧＡ生産用組換え微生物は、ＰＧＡの生産効率が良く且つ安定的に生産することができ、前記方法に好適に用いることができる。

SOE-PCR断片を用いた２重交差法によるrecA遺伝子欠失手順の一例を示す説明図である。ＰＧＡ合成に関与する遺伝子群のクローニング工程の一例を示す説明図である。

本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、国際コンソーシアムの成果として報告され（Kunst F.，et al.，Nature，1997，vol．390，p．249-256）、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis（BSORF DB）（http://bacillus.genome.ad.jp/参照)、BSORF Bacillus subtilis Genome Database（http://bacillus.genome.ad.jp/参照）において公開されている。

本明細書において、アミノ酸配列の同一性及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Lipman，DJ.，Pearson．WR.，Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。

本明細書における「ストリンジェントな条件下」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION（Joseph Sambrook，David W．Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)）記載の条件が挙げられる。前記「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７１℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７４℃以上がより好ましい。これら「ストリンジェントな条件」により、塩基配列同一性では約８０％以上又は約９０％以上の塩基配列を有する遺伝子の確認が可能である。
上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の要素又は他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。

本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。

本明細書において、「ＰＧＡの生産性向上」とは、組換え微生物の１回の培養でＰＧＡの生産性が向上することを指す。また、「ＰＧＡの安定的な生産性向上」とは、組換え微生物の継代培養や培地の置換を行ってもＰＧＡの生産性が低下せずに向上することを指す。さらに、「ＰＧＡの生産性安定化」とは、組換え微生物の継代培養や培地の置換を行ってもＰＧＡの生産性が低下しないこと又は低下し難くなることを指す。

本発明で用いる組換え微生物は、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた納豆菌を除く枯草菌である。当該枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化することで、当該枯草菌のＰＧＡ生産能を安定的に向上させることができる。本発明では、このような当該枯草菌を培養し、当該枯草菌にＰＧＡを産生させる。

本明細書において、recA遺伝子は組換え酵素の１種であり相同組換え活性を有するRecAをコードする遺伝子である。ここで、枯草菌BSU16940株のRecAのアミノ酸配列を配列番号１２に、配列番号１２のアミノ酸配列からなるRecAをコードするrecA遺伝子の塩基配列を配列番号１１に、それぞれ示す。
なお、本発明においてrecA遺伝子は配列番号１１に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１２に示すアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への１〜数個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号１１に示す塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、recA遺伝子には、配列番号１１に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、相同組換え活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。本明細書において、これらの遺伝子をrecA遺伝子に相当する遺伝子とする。

本発明において、recA遺伝子は、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質

recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化は、recA遺伝子中に他のＤＮＡ断片を挿入する、又は、当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行なうことができるが、標的遺伝子を物理的に欠失させることが好ましい。
recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。

recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させる方法としては、常法を使用することができる。例えば、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を分断して不活性化することが可能である（Leenhouts，K.，et al.，Mol．Gen．Genet.，1996，vol．253，p．217-224）。
特に、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Itaya，M.，Tanaka，T.，Mol．Gen．Genet.，1990，vol．223，p．268-272）、このような方法を繰り返すことによって、目的の組換え微生物を得ることができる。また、ランダムな遺伝子の不活性化方法としては、変異誘発剤の使用や親微生物への紫外線、ガンマ線等の照射によっても実施可能である。この場合、標的とする構造遺伝子内への塩基置換、塩基挿入或いは一部欠失といった変異導入の他に、プロモーター領域等の制御領域への同様の変異導入、または標的遺伝子の発現制御に関連する遺伝子への同様の変異導入によっても同等の効果が期待できる。さらに、より効率的な手法として、標的とする遺伝子の上流、下流領域を含むが標的とする遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片をSOE（splicing by overlap extension）-PCR法（Horton，RM.，et al.，Gene，1989，vol．77，p．61-68）によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノム上の標的とする遺伝子の外側の２箇所で二回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的とする遺伝子を欠失させるといった手法も実施可能である（図１参照）。

本発明で用いる組換え微生物は、納豆菌を除く枯草菌であれば特に制限はないが、Bacillus subtilis Marburg No．168系統株が好ましい。また、本発明で用いる組換え微生物は、本来的にＰＧＡ生産能を有していない納豆菌を除く枯草菌であってもよいし、本来的にＰＧＡ生産能を有している納豆菌を除く枯草菌であってもよい。本来的にＰＧＡ生産能を有していない枯草菌の場合、ＰＧＡ生産能を付与するために、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群を発現可能に導入する必要がある。一方、本来的にＰＧＡ生産能を有している場合、生産性向上に対してより大きな効果を図るべく、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失又は不活性化を行なえばよい。さらに、本発明で用いる組換え微生物は、トランスポゾン(Tn)や挿入配列(IS)などの転移因子を有さないことが好ましい。

ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群としては特に制限はなく、通常のＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群を採用することができる。本発明においては、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種、好ましくは枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が枯草菌に導入されていることが好ましい。これら遺伝子を枯草菌に導入した場合に、ＰＧＡが生産されることは既に確認されている（特開２０１０−２１３６６４参照）。
ここで、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子群の１種として、枯草菌におけるpgsB遺伝子（BG12531:ywsC遺伝子、又はcapB遺伝子とも別称される）、pgsC遺伝子（BG12532:ywtA遺伝子、又はcapC遺伝子とも別称される）及びpgsA遺伝子（BG12533:ywtB遺伝子、又はcapA遺伝子とも別称される）から構成されているものが挙げられる。遺伝子組換えの宿主微生物として広く利用されているBacillus subtilis Marburg No．168系統株は、これらpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を染色体上に有しているが、ＰＧＡ生産能を有していない。同じく、納豆菌は、これらpgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子を染色体（ゲノム）上に有しているが、ＰＧＡ生産能を有している。なお、pgsB遺伝子、pgsC遺伝子及びpgsA遺伝子は、それぞれPgsB、PgsC及びPgsAをコードする遺伝子である。

枯草菌BSU35900株のPgsBのアミノ酸配列を配列番号１４に、配列番号１４のアミノ酸配列からなるPgsBをコードするpgsB遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、それぞれ示す。
なお、本発明においてpgsB遺伝子は配列番号１３に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、グルタミン酸を基質とするアミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、pgsB遺伝子には、配列番号１４に示すアミノ酸配列に対して５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、pgsB遺伝子には、配列番号１３に示す塩基配列に対して６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、pgsB遺伝子には、配列番号１３に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。本明細書において、これらの遺伝子を枯草菌におけるpgsB遺伝子に相当する遺伝子とする。より具体的には、枯草菌168株のpgsB遺伝子とBacillus licheniformis ATCC14580株、Bacillus amyloliquefacience FZB42株及びOceanobacillus iheyensis HTE831株由来のpgsB遺伝子との塩基配列の同一性はそれぞれ79％、82％及び62％であり、またそのアミノ酸配列の同一性はそれぞれ90％、93％及び55％であり、これらは枯草菌におけるpgsB遺伝子に相当する遺伝子に含まれる。

本明細書における「アミドリガーゼ活性」とは、pgsC遺伝子とともにpgsB遺伝子を宿主微生物に導入された際に菌体外にＰＧＡを生産する能力を意味する。ここで、アミドリガーゼ活性は、グルタミン酸及びATP又はGTPを基質とし、これに塩化マンガン加えたものを反応溶液として用いた場合に、反応溶液中にＰＧＡの生成を確認することにより測定することができる（Urushibata，Y.，et al.，J．Bacteriol.，2002，vol．184，p．337-343参照）。所定の微生物におけるPGA生産能の評価は、例えばグルタミン酸又はその塩を含有するPGA生産寒天培地に培養したときにコロニー周辺に形成される半透明の粘性物質を目視によって観察する方法、SDS-PAGEによってＰＧＡを検出する方法（Yamaguchi，F.，et al.，Biosci．Biotechnol．Biochem.，1996，vol．60，p．255-258）、酸加水分解後にアミノ酸分析装置を用いて定量する方法（Ogawa，Y.，et al.，Biosci．Biotechnol．Biochem.，1997，vol．61，p．1684-1687）、培養液から精製し乾燥重量を求める定量法（Ashiuchi，M.，et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，1999，vol．263，p．6-12）、ゲルろ過カラムを用いたHPLC（高速液体クロマトグラフィー）による定量／定性法（Kubota，H.，et al.，Biosci．Biotechnol．Biochem.，1993，vol．57，p．1212-1213）によって行うことができる。

本発明において、pgsB遺伝子は下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質

枯草菌BSU35890株のPgsCのアミノ酸配列を配列番号１６に、配列番号１６のアミノ酸配列からなるPgsCをコードするpgsC遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、それぞれ示す。
なお、本発明においてpgsC遺伝子は配列番号１５に示す塩基配列からなる遺伝子に限定されない。例えば、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、配列番号１６に示すアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、前述のPgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。ここで、アミノ酸の付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。さらに、pgsC遺伝子には、配列番号１６に示すアミノ酸配列に対して５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、PgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、pgsC遺伝子には、配列番号１５に示す塩基配列に対して５５％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、前述のPgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。さらに、pgsC遺伝子には、配列番号１５に示す塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前述のPgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む意味である。本明細書において、これらの遺伝子を枯草菌におけるpgsC遺伝子に相当する遺伝子とする。より具体的には、枯草菌168株のpgsC遺伝子とBacillus licheniformisATCC14580株、Bacillus amyloliquefacienceFZB42株及びOceanobacillus iheyensisHTE831株由来のpgsC遺伝子との塩基配列の同一性はそれぞれ78％、84％及び59％であり、またそのアミノ酸配列の同一性はそれぞれ90％、94％及び51％であり、これらは枯草菌におけるpgsC遺伝子に相当する遺伝子に含まれる。

本明細書において、前述のPgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成するといったPgsCタンパク質の機能とは、宿主微生物にてpgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた際にＰＧＡを生産する能力を意味する。このことは、pgsB遺伝子を単独で発現させた宿主微生物ではＰＧＡが生産されず、pgsB遺伝子とともにpgsC遺伝子を発現させた場合に、ＰＧＡが生産されることを意味する。

本発明において、pgsC遺伝子は下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
（ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、前記pgsB遺伝子がコードするPgsBタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記pgsB遺伝子がコードするPgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質

ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群は、枯草菌由来の遺伝子又は遺伝子群に限定されず、枯草菌以外の微生物に由来するＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群であってもよい。

枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子などの、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子は、ＰＧＡを生産することが知られている微生物から常法に従って単離することができる。ＰＧＡ生産能を有する微生物としては、枯草菌の他に、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans、Oceanobacillus iheyensis、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができ、これら微生物からＰＧＡ合成に関与する遺伝子を単離することができる。

本発明において、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子など、導入されたＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群の上流に、宿主細胞内において機能を有する、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が結合されていることが好ましい。当該制御領域は、結合した下流遺伝子を発現させ、当該遺伝子の発現を宿主細胞内において高めることができるものであることがより好ましく、下流遺伝子を構成的に発現又は／及び高発現させるものが特に好ましい。このような制御領域として、バチルス属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、rapA遺伝子の制御領域、Bacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、クロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域などが例示されるが特に限定されない。なお、本明細書において、転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Shine，J.，Dalgarno，L.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，1974，vol．71，p．1342-1346）に相当する部位である。
また、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子など、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群を宿主微生物に導入する際は、通常のプラスミド（ベクター）を使用することができる。また、プラスミドは、遺伝子導入対象の宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、pT181、pC194、pUB110、pE194、pSN2、pHY300PLK等を例示することができる。選択されるプラスミドは、宿主細胞内で自己複製可能なプラスミドであることが好ましく、そのプラスミドが多コピーであることがより好ましい。さらに、そのプラスミドのコピー数が宿主ゲノム（染色体）に対し、2以上100コピー以下であれば良く、好ましくは2以上50コピー以下、より好ましくは2以上30コピー以下であれば良い。また、発現ベクターを用いた形質転換には、通常の手法、例えばプロトプラスト法（Chamg，S.，Cohen，SH.，Mol．Gen．Genet.，1979，vol．168，p．111-115）やコンピテントセル法（Young，FE.，Spizizen，J.，J．Bacteriol.，1963，vol．86，p．392-400）を適用することができる。
枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子など、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群の導入方法については、特開２００９−８９７０８号公報、特開２０１０−２１３６２７号公報、特開２０１０−２１３６２８号公報、特開２０１０−２１３６６４号公報、特開２０１０−２１３６６５号公報などを参照することができ、本発明ではこれらの文献に記載の方法を取り込むことができる。

本発明において、recA遺伝子を欠失又は不活性化する時期、及びＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群の枯草菌への導入時期は特に限定されない。例えば、recA遺伝子を欠失又は不活性化した枯草菌にＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群を導入して組換え微生物を作製してもよい。あるいは、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群を導入した枯草菌のゲノム上のrecA遺伝子を欠失又は不活性化してもよい。

以上で説明した本発明の組換え微生物を用いることによって、ＰＧＡを優れた生産性で製造することができる。製造されたＰＧＡは、化粧品、医薬品、食品、水質浄化剤、保水材料、増粘剤等の様々な用途に使用することができる。特に、本発明の組換え微生物においては、従来の遺伝子組換え技術によるＰＧＡ生産方法と比較して優れた生産性が得られることから上記用途で利用されるＰＧＡの生産コストを大幅に低減することができる。

本発明の組換え微生物を用いてＰＧＡを生産する際には、適切な培地において当該組換え微生物を培養し、菌体外に生産されたＰＧＡを培地から回収する。培地としては、グリセロール、グルコース、フルクトース、マルトース、キシロース、アラビノース、各種有機酸等の炭素源、各種アミノ酸、ポリペプトン、トリプトン、硫酸アンモニウムや尿素等の窒素源、ナトリウム塩等の無機塩類及びその他必要な栄養源、微量金属塩等を含有する組成の培地を使用できる。また、培地としては合成培地でもよいし、天然培地でもよい。

ＰＧＡの生産性を向上させる観点から、培養対象の組換え微生物が生育に必要とするグルタミン酸量よりも過剰量のグルタミン酸が添加された培地を使用することが好ましい。具体的には培地中へはグルタミン酸塩（好ましくはグルタミン酸ナトリウム）として添加することが好ましく、その濃度（グルタミン酸換算）は好ましくは０．００５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは６００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下、特に好ましくは３００ｇ／Ｌ以下であり、好ましくは０．００５〜６００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．１〜４００ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．５〜３００ｇ／Ｌである。培地中のグルタミン酸ナトリウム濃度が低すぎる場合には、培地中のグルタミン酸が組換え微生物の生育に消費されＰＧＡの生産性が向上しないおそれがある。また、培地中のグルタミン酸濃度が高すぎる場合には、グルタミン酸ナトリウムの飽和溶解度を超えることから、グルタミン酸ナトリウムやその他の培地成分が析出してしまうといった問題が生じるおそれがある。

本発明の組換え微生物の培養条件は適宜選択することができる。具体的には、至適温度は、好ましくは１０℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、好ましく４０℃以下であり、好ましくは１０〜４０℃であり、より好ましくは３０〜４０℃である。至適pHは、好ましくはpH4以上であり、より好ましくはpH5以上であり、好ましくはpH8以下であり、好ましくはpH4〜8であり、より好ましくはpH5〜8である。また、培養日数は、種菌接種後、好ましくは１日以上であり、より好ましくは２日以上であり、好ましくは１０日以下であり、より好ましくは５日以下であり、好ましくは１〜１０日であり、より好ましくは２〜５日である。培養方法に特に制限はないが、振とう培養、攪拌培養、通気培養、静置培養などが挙げられる。

培地中に蓄積されたＰＧＡを回収する際には、ＰＧＡを生産させた枯草菌の菌体を除去する必要があるが、これには遠心分離による方法、限外濾過膜を用いる方法、電気透析法、pHをＰＧＡの等電点付近に維持することで沈殿として回収する方法等が挙げられ、さらに上記手法を組み合わせて用いることも可能である。
また、培地からのＰＧＡの回収方法についても特に制限はなく、生産された物質を単離、回収する際に通常用いられる方法で行うことができる。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により目的のＰＧＡを単離、回収することができる。

本発明の組換え微生物を用いて、培養条件を適宜設定することによって、種々の分子量のＰＧＡを製造することができる。例えば、本発明により生産されるＰＧＡの重量平均分子量は50万以上が好ましく、90万以上がより好ましく、500万以下が好ましく、200万以下がより好ましい。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、微生物及び用途を開示する。

＜１＞recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた、納豆菌を除く枯草菌を用いてＰＧＡを生産する、ＰＧＡの生産方法。
＜２＞納豆菌を除く枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させてＰＧＡの生産性を安定化させる、ＰＧＡの生産性安定化方法。

＜３＞前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１＞又は＜２＞項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
＜４＞前記枯草菌が、ＰＧＡ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜５＞前記枯草菌に、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群が発現可能に導入されており、前記枯草菌にＰＧＡを生産させる、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜６＞前記ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群として、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が前記枯草菌に発現可能に導入されている、前記＜５＞項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜７＞前記pgsB遺伝子が下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜６＞項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質。
＜８＞前記pgsC遺伝子が下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜６＞項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
（ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、前記pgsB遺伝子がコードするPgsBタンパク質の存在下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記pgsB遺伝子がコードするPgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質
＜９＞前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が、宿主細胞内で自己複製可能なプラスミド（ベクター）に組み込まれている、前記＜６＞〜＜８＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜１０＞前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が、その上流に、前記微生物において機能を有する、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域を有する、前記＜６＞〜＜９＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜１１＞前記制御領域がバチルス属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、rapA遺伝子の制御領域、Bacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域である、前記＜１０＞の項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜１２＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜１３＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No．168系統株である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜１４＞前記枯草菌の継代培養、培地の置換、又は前記枯草菌の継代培養及び培地の置換を行いながら前記枯草菌を培養してＰＧＡを生産する、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。
＜１５＞グルタミン酸又はその塩（好ましくはグルタミン酸ナトリウム）の含有量が０．００５ｇ／Ｌ以上（好ましくは０．０５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上）６００ｇ／Ｌ以下（好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは４００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは３００ｇ／Ｌ以下）の培地で前記枯草菌を培養してＰＧＡを生産する、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載のＰＧＡの生産方法又はＰＧＡの生産性安定化方法。

＜１６＞納豆菌を除く枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた、ＰＧＡ生産用組換え微生物。

＜１７＞前記recA遺伝子が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜１６＞項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜１８＞ＰＧＡ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた、前記＜１６＞又は＜１７＞項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜１９＞前記枯草菌に、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群が発現可能に導入されている、前記＜１６＞〜＜１８＞のいずれか１項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２０＞前記ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群として、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が前記枯草菌に発現可能に導入されている、前記＜１９＞項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２１＞前記pgsB遺伝子が前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜２０＞項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２２＞前記pgsC遺伝子が前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜２０＞項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２３＞前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が、宿主細胞内で自己複製可能なプラスミド（ベクター）に組み込まれている、前記＜２０＞〜＜２２＞のいずれか１項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２４＞前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が、その上流に、前記微生物において機能を有する、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域を有する、前記＜２０＞〜＜２３＞のいずれか１項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２５＞前記制御領域がバチルス属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、rapA遺伝子の制御領域、Bacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域である、前記＜２４＞項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２６＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜１６＞〜＜２５＞のいずれか１項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。
＜２７＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No．168系統株である、前記＜１６＞〜＜２６＞のいずれか１項記載のＰＧＡ生産用組換え微生物。

＜２８＞ＰＧＡ生産用組換え微生物としての、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた納豆菌を除く枯草菌の使用。
＜２９＞ＰＧＡの生産のための、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた納豆菌を除く枯草菌の使用。
＜３０＞recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた納豆菌を除く枯草菌を、ＰＧＡ生産用組換え微生物として使用する方法。

＜３１＞前記recA遺伝子が前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜２８＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３２＞前記枯草菌が、ＰＧＡ生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、前記＜２８＞〜＜３１＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３３＞前記枯草菌に、ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群が発現可能に導入されている、前記＜２８＞〜＜３２＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３４＞前記ＰＧＡ合成に関与する遺伝子又はＰＧＡ合成に関与する遺伝子群として、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が前記枯草菌に発現可能に導入されている、前記＜３３＞項記載の使用又は方法。
＜３５＞前記pgsB遺伝子が前記（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜３４＞項記載の使用又は方法。
＜３６＞前記pgsC遺伝子が前記（ｇ）〜（ｉ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、前記＜３４＞項記載の使用又は方法。
＜３７＞前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が、宿主細胞内で自己複製可能なプラスミド（ベクター）に組み込まれている、前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３８＞前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種（好ましくは前記pgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び前記pgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子）が、その上流に、前記微生物において機能を有する、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域を有する、前記＜３４＞〜＜３７＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜３９＞前記制御領域がバチルス属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、aprE遺伝子の制御領域、spoVG遺伝子の制御領域、rapA遺伝子の制御領域、Bacillus sp．KSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の制御領域、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域である、前記＜３８＞項記載の使用又は方法。
＜４０＞前記枯草菌が転移因子（好ましくはトランスポゾン及び挿入配列）を有さない、前記＜２８＞〜＜３９＞のいずれか１項記載の使用又は方法。
＜４１＞前記枯草菌がBacillus subtilis Marburg No．168系統株である、前記＜２８＞〜＜４０＞のいずれか１項記載の使用又は方法。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、表１には、本実施例で使用したプライマーの名称、その塩基配列及び配列番号をまとめて示した。ここで、表１に示す塩基配列において、下線部分は制限酵素認識配列を示している。また、本実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ社製）及びKOD-Plus-Neo DNA Polymerase（東洋紡績社製）、並びに付属の試薬類を用いた。

製造例１枯草菌改変体の作製
図１に示す手順に従い、recA遺伝子を欠失させた枯草菌改変体を作製した。

（１）遺伝子欠失用遺伝子断片の作製
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示したRECA-F1（配列番号１）及びRECA-R1（配列番号２）のプライマーセットを用いて、ゲノム上のrecA遺伝子の上流領域に隣接する約０．９ｋｂの断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、RECA-F2（配列番号３）及びRECA-R2（配列番号４）のプライマーセットを用いて、ゲノム中のrecA遺伝子の下流領域に隣接する約０．８ｋｂの断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、プラスミドpDG1727（Guerout-Fleury et al.，Gene.，1995，vol．167，p．335-336；Bacillus Genetic Stock Center［http://www.bgsc.org/］より入手可能）のＤＮＡを鋳型とし、表１に示したSPC-F（配列番号５）及びSPC-R（配列番号６）のプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Ｓｐｃ）を含む約１．０ｋｂの断片（Ｃ）を調製した。

次に、得られたＤＮＡ断片（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合して鋳型とし、RECA-F1（配列番号１）及びRECA-R2（配列番号４）のプライマーセットを用いたSOE−PCRにて3断片を（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合し、約２．７ｋｂの遺伝子欠失用ＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。

（２）コンピテントセルの作製
枯草菌１６８株をCI培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０３質量％アミケース（SIGMA社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０μｇ／ｍＬトリプトファン）において３７℃で、生育度（ＯＤ₆₀₀）の値が１程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部（０．５ｍＬ）を分取し、遠心分離にて菌体のみを回収後、１ｍＬのCII培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０１５質量％アミケース（SIGMA社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に菌体を再懸濁することで、枯草菌株のコンピテントセル懸濁液を調製した。

（３）枯草菌１６８株の形質転換
前記（２）で調製したコンピテントセル懸濁液１００μＬに、前記（１）で得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を最終濃度が１５μｇ／ｍＬ以上となるよう添加し、３７℃で９０分間振盪培養後、１００μＬのＬＢ液体培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ）を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。その後、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ、１．５質量％寒天）に培養液１０μＬ又は１００μＬを塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲ及びシークエンスによってrecA遺伝子がＳｐｃ耐性遺伝子に置換した目的とする枯草菌改変体であることを確認した。以上のようにして、recA遺伝子欠失株（kao119株）を構築した。

製造例２ＰＧＡ合成関連遺伝子導入用ベクターの構築
図２に示す手順に従い、ＰＧＡ合成関連遺伝子導入用ベクターを作製した。

バシラス・エスピー（Bacillus sp．）KSM-366株（FERM BP-6262）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、P-S237/BSpgsB_atg_FW（配列番号７）及びHindIII_BSpgsBC_RV（配列番号８）のプライマーセットを用いて、pgsBC遺伝子１．７ｋｂのＤＮＡ断片（BC）を調製した。さらに、バシラス・エスピーKSM-S237株（FERM BP-7875）から調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、Cm_S237-FW（配列番号９）とP_S237-RV（配列番号１０）のプライマーセットを用いて、KSM-S237株由来のセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）プロモーター領域０．６ｋｂのＤＮＡ断片（P_S237）を調製した。

次に、得られたＤＮＡ断片（P_S237）及び（BC）を鋳型とし、Cm_S237-FW（配列番号９）とHindIII_BSpgsBC_RV（配列番号８）のプライマーセットを用いたＰＣＲ法にて、断片（P_S237）及び断片（BC）を１断片化した２．３ｋｂのＤＮＡ断片（P_BC）を得た。続いて、このＤＮＡ断片（P_BC）を制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、同様の制限酵素処理を施したプラスミドベクターpHY300PLK（Takara社製）とDNA Ligation kit Ver．2（Takara社製）を用いてライゲーション反応（結合化）を行なった。

上記ライゲーション試料を用いて、大腸菌（HB101株）をコンピテントセル法にて形質転換し、テトラサイクリン-塩酸塩（SIGMA-ALDRICH社製）を15ppm添加したＬＢ寒天培地（LBTc寒天培地）上に出現したコロニーを形質転換体とした。得られた形質転換体を再度LBTc寒天培地にて生育させ、得られた菌体からハイピュアプラスミドアイソレーションキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い組換えプラスミドを調製した。これらを制限酵素BamHI及びHindIIIにて制限酵素処理し、電気泳動法にてプラスミドベクター上のBamHI及びHindIII制限酵素認識部位に目的とする上記ＤＮＡ断片（P_BC）が挿入していることを確認した。

このようにして、ＤＮＡ断片（P_BC）の挿入が確認できた組換えプラスミドをＰＧＡ組換え生産用ベクターpHY_PS237/pgsBCとした。本製造例において、ＰＣＲ反応はGeneAmp9700（PE Applied Biosystems社製）とTaKaRa LA Taq（Takara社製）を用い、キット添付のプロトコールに従い実施した。

製造例３ＰＧＡ合成関連遺伝子導入用ベクターの導入による枯草菌の形質転換
野生株である枯草菌１６８株、及び製造例１で作製した枯草菌変異株（kao119株）に対し、製造例２で作製したＰＧＡ組換え生産用ベクターpHY_PS237/pgsBCを用い、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet.，1979，vol．168，p．111）によって各菌株に導入した。テトラサイクリン-塩酸塩30ppmを添加したDM3プロトプラスト再生培地（DM3培地）上に生育したコロニーを、プラスミドを導入した目的とする枯草菌形質転換体として選抜した。

実施例１ＰＧＡ生産性評価（１）
製造例３にて得られた形質転換体を５ｍＬのＬＢ培地（１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、１５ｐｐｍテトラサイクリン）で一夜３０℃で振盪培養を行った（継代培養回数：１回）。さらに、この培養液を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、一夜３０℃で振盪培養を行った（継代培養回数：２回）。次に、継代培養回数：１、２回の培養液０．４ｍＬをそれぞれ２×Ｌ−マルトース＋ＭＳＧ培地（２質量％トリプトン、１質量％酵母エキス、１質量％ＮａＣｌ、７．５質量％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、８質量％グルタミン酸ナトリウム１水和物）２０ｍＬに接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った（Ｎ＝３）。培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量及び分子量を測定した。その結果を表２に示す。

表２の結果から、枯草菌１６８株では継代培養回数の増加に伴いＰＧＡ生産性が大きく低下した。
これに対し、recA遺伝子を欠失させた枯草菌にＰＧＡ合成関連遺伝子を導入したkao119株では継代培養回数の増加に伴うＰＧＡ生産性の低下は約１０％程度であった。これは、recA遺伝子を欠失させた枯草菌を宿主微生物として用いた場合、ＰＧＡの生産性が安定化したことを示す。

実施例２ＰＧＡ生産性評価（２）
製造例３にて得られた形質転換体を５ｍＬのＬＢ培地で３０℃において１５時間振盪培養を行った。培養開始から１日から後の菌体を回収、洗浄し、新たな２×Ｌ−マルトース＋ＭＳＧ培地に置換し、２日間振盪培養を行った（Ｎ＝３）。培養終了後、後述の測定例に示す分析条件にてＰＧＡ生産量及び分子量を測定した。その結果を表３に示す。

表３の結果から、１６８株では培養日数の経過に伴うＰＧＡ生産量の増加が確認できなかった。これに対して、recA遺伝子を欠失させた宿主微生物にＰＧＡ合成関連遺伝子を導入したkao119株では、ＰＧＡ生産性が大きく増加した。これは、recA遺伝子を欠失させた枯草菌を宿主微生物として用いた場合、アルカリプロテアーゼの生産性が安定化したことを示す。

以上の結果から、recA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた枯草菌を用いてＰＧＡを生産することで、ＰＧＡの生産性が安定化することがわかる。

（測定例）ＰＧＡの定量及び分子量測定法
実施例１及び２に示した評価培養終了後の培養液試料を、室温にて14,800rpmで30分間遠心分離（商品名：himacCF15RX、日立工機社製）に供し、遠心分離にて得られた培養液上清中に含まれるＰＧＡについて、HPLC法にて定量及び分子量測定を行った。使用したＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（商品名：ＬＣ−９Ａ、島津製作所社製）、オートサンプラー（商品名：ＡＳ−２０００、日立計測機器社製）、カラムオーブン（商品名：ＣＴＯ−６Ａ、島津製作所社製）、ＵＶ検出計（商品名：ＳＰＤ−１０Ａ、島津製作所社製）、脱ガス装置（商品名：ＤＧ６６０Ｂ、ＧＬサイエンス社製）及びクロマトデータ解析装置（商品名：Ｄ−２５００、日立計測機器社製）を接続して用いた。分析カラムは、排除限界の異なる２種類の東ソー社製の親水性ポリマー用ゲルろ過カラムTSKgel G6000PWXL（7.8mm Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界＞５×１０⁷）及びTSKgel G4000PWXL（7.8mm Ｉ．Ｄ．×３０ｃｍ、排除限界１×１０⁶）を用い、これら分析カラムの直前にガードカラムTSK guardcolumn PWXL（6.0mm Ｉ．Ｄ．×４．０ｃｍ）を接続した。なお、分析条件は、溶離液０．１Ｍ硫酸ナトリウム、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度５０℃、溶出ピークの検出波長２１０ｎｍとした。試料注入量はサンプルループ（レオダイン）を用い、１分析あたり２０μＬとした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くための前処理としてMULTI SCREEN MNHV45（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過処理し調製した。また、濃度検定には分子量80万のＰＧＡ（明治フードマテリアル社製）を用いて検量線を作成した。さらに、分子量検定には、プルラン（商品名：Shodex STANRD P-82、昭和電工社製）を用いて予め重量平均分子量を求めた各種分子量の異なるポリグルタミン酸（和光純薬工業社製：１６２−２１４１１及び１６２−２１４０１、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製：Ｐ−４８８６及びＰ−４７６１、明治フードマテリアル：分子量８８万）を用いた。

Claims

納豆菌（Bacillus subtilis var．natto）を除く枯草菌（Bacillus subtilis）のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて、継代培養におけるポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性を安定化させる、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性安定化方法であって、
前記recA遺伝子が下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのタンパク質をコードする遺伝子である、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性安定化方法。
（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、相同組換え活性を有するタンパク質
前記枯草菌が、ポリ−ガンマ−グルタミン酸生産能を有する枯草菌のrecA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させて得られた枯草菌である、請求項１記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性安定化方法。
前記枯草菌に、ポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子又はポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子群が発現可能に導入されており、前記枯草菌にポリ−ガンマ−グルタミン酸を生産させる、請求項１又は２記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性安定化方法。
前記ポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子又はポリ−ガンマ−グルタミン酸合成に関与する遺伝子群として、枯草菌におけるpgsB遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子、及び枯草菌におけるpgsC遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が前記枯草菌に発現可能に導入されており、
前記pgsB遺伝子が、下記タンパク質（ｄ）又は（ｆ）をコードする遺伝子であり、
前記pgsC遺伝子が、下記タンパク質（ｇ）又は（ｉ）をコードする遺伝子である、請求項３記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の生産性安定化方法。
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミドリガーゼ活性を有するタンパク質
（ｇ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、前記pgsB遺伝子がコードするPgsBタンパク質の共存下でＰＧＡを生成する機能を有するタンパク質