DE102004013988A1

DE102004013988A1 - Der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis und recA-inaktivierte Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion

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Publication number: DE102004013988A1
Application number: DE102004013988A
Authority: DE
Inventors: Jörg Dr. Feesche; Friedhelm Prof. Meinhardt; Hannes Nahrstedt; Jens Waldeck; Mark Gröne; Renée Eichstädt
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-10-13
Also published as: US20070212693A1; WO2005095446A1; JP2007533306A; WO2005095446A8; EP1725582A1

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 2) zusammen mit dem zugehörigen Gen recA (SEQ ID NO. 1), einschließlich verwandten Proteinen und Genen hierzu. Das Gen recA wird erfindungsgemäß unter anderem zur Konstruktion von grampositven bakteriellen Sicherheitsstämmen für die biotechnolgische Produktion eingesetzt, indem es in den betreffenden Stämmen inaktiviert wird. Diese weisen, sofern sie natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, in einer speziellen Ausführungsform zusätzliche funktionelle Deletionen in Phase-IV-Sporulationsgenen auf, vorzugsweise im Gen spolV (bei Bacillus licheniformis), im Gen yqfD (bei B. subtilis) beziehungsweise in dem hierzu jeweils homologen Gen. Des weiteren steht mit diesem RecA ein Protein zur Verfügung, das in molekularbiologischen Ansätzen oder zur Modulation der molekularbiologischen Aktivitäten von Zellen gebraucht werden kann, insbesondere im Zusammenhang mit DNA-Polymerisations- oder Rekombinationsvorgängen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Faktor RecA aus Bacillus licheniformis DSM 13 sowie Mikroorganismen als Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie funktionelle Deletionen in dem zugehörigen Gen recA aufweisen. Ferner steht RecA damit für weitere molekularbiologische Ansätze zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe in der Lage sind. Hierzu zählen beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa von Nahrungsmittelergänzungsstoffen oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen, für welche aufgrund ihrer Diversität wiederum ein großes technisches Einsatzgebiet besteht. Im ersten Fall werden die Stoffwechseleigenschaften der betreffenden Mikroorganismen zur Herstellung der Wertstoffe ausgenutzt und/oder verändert; im zweiten Fall werden Zellen eingesetzt, die die Gene der interessierenden Proteine exprimieren. In beiden Fällen handelt es sich zumeist also um gentechnisch veränderte Organismen (GVO).

Zur Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger Stand der Technik, insbesondere auch im großtechnischen Maßstab; er reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate und der Nährstoffausnutzung über die technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnnung der Wertstoffe aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium. Hierfür kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische und biochemische Ansätze zu tragen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozeß hinsichtlich der sicherheitsrelevanten Aspekte der eingesetzten Mikroorganismen zu verbessern, und zwar auf der Ebene der genetischen Eigenschaften der betrachteten Stämme.

Dies steht vor dem Hintergrund, daß die Verwendung gentechnisch veränderter Organismen im allgemeinen strengen gesetzlichen Richtlinien bezüglich der biologischen Sicherheit unterliegt. In den meisten Ländern sind die Betreiber von Anlagen mit GVO gehalten, dafür zu sorgen, daß nach Möglichkeit keine GVO in die Umgebung gelangen. Zusätzlich sollen für die Produktion verwendete GVO Eigenschaften aufweisen, die es ihnen – falls sie doch in die Umgebung gelangen sollten – erschweren oder je nach Gefahrenpotential sogar unmöglich machen sollen, sich dort zu vermehren („Containment"-Konzept).

Dem Übersichtsartikel „Suicidal genetic elements and their use in bological containment of bacteria" von S.Molin et al. (Annu. Rev. Microbiol., 1993, Band 47, Seiten 139 bis 166) zufolge wird dabei zwischen den beiden grundsätzlichen Strategien differenziert, als „aktive" Komponenten, kontrollierte Suizidsysteme in die Zellen einzuführen oder über „passive" Systeme die Zelleigenschaften so zu verändern, daß ihre Überlebenschancen unter Streßbedingungen sinken. Die zweite, für die vorliegende Anmeldung relevante Strategie wird darin auch als „Disablement approach" bezeichnet.

Stämme von GVO mit einem verminderten Risiko für Mensch und Umwelt im Falle einer unbeabsichtigten Freisetzung werden als Sicherheitsstämme bezeichnet. Je nach den grundsätzlichen Eigenschaften der Mikroorganismen werden zunehmend mehrere Eigenschaften gefordert, von denen jede für sich einen Sicherheitsaspekt darstellt. Somit ist es vorteilhaft, verschiedene Instrumente zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen zur Verfügung zu haben. Hiervon sind einige „passive" Systeme bereits im Stand der Technik beschrieben.

So betrifft die Anmeldung EP 369817 A1 Bacillus-Stämme, insbesondere B. subtilis, zur Herstellung und Sekretion von Proteinen, bei denen die Gene für extra- und intrazelluläre Proteasen, nämlich epr, rp-I, rp-II, isp-1, apr und/oder npr durch Punktmutationen oder Insertionen inaktiver Genkopien funktionell inaktiviert worden sind. Der Sinn dieser gentechnischen Veränderungen besteht darin, die für die mit diesen Stämmen hergestellten, interessierenden Proteine schädlichen Protease-Aktivitäten zu minimieren. Die betreffenden Stämme können zusätzlich über Mutationen verfügen, die die Sporulation und damit eine Bildung ebenso schädlicher Sporulationsproteasen verhindern. Hierunter wird das in Phase Null der Sporulation (siehe unten) von B. subtilis aktive Gen spoOA genannt, um durch dessen Inaktivierung die mit der Sporulation verbundene Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern.

Die Anmeldung WO 92/16642 A1 verfolgt den gleichen Lösungsansatz: sie offenbart, daß durch Inaktivierung der Proteasegene apr, npr, isp-1, epr, bpr, rsp und mpr von Bacillus ein Großteil der extrazellulären Protease-Aktivität ausgeschaltet wird, und lehrt, daß dies durch die Inaktivierung des neu beschriebenen Gens vpr für die Rest-Protease III noch verbessert werden kann. Auch hier wird auf die Möglichkeit der Inaktivierung von spoOA hingewiesen, um die Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern.

Bei der Sporulation von grampositiven Bakterien handelt es sich um einen Entwicklungsprozeß zur Bildung von Dauerformen, den sogenannten Sporen, zum Überdauern widriger Umwelteinflüsse. Sie wird über eine komplexe Regulationskaskade mit vermutlich mehr als 100 Genen und unter Beteiligung von speziellen Sigma-Faktoren gesteuert. Den Zusammenhang dieses Prozesses mit dem Zellzyklus von B. subtilis beschreibt beispielsweise die Publikation „Cell cycle and sporulation in Bacillus subtilis" (1998) von P.A.Levin und A.D.Grossmann in Curr. Opin. Microbiol., Band 1, Seiten 630 bis 635. Hier wird vor allem der Transkriptionsfaktor SpoOA als Kontrollelement zum Einleiten der Sporulation dargestellt. Die sequentielle Aktivierung der phasenspezifischen Gene durch verschiedene Sigmafaktoren faßt beispielsweise der Übersichtsartikel „Control of sigma factor activity during Bacillus subtilis sporulation" (1999) von L.Kroos et al. in Mol. Microbiol., Band 31, Seiten 1285 bis 1294 zusammen. Bei diesem Vorgang werden ihrer Reihenfolge nach die aufeinanderfolgenden Stadien Null und dann I bis VII beobachtet. Diese Numerierung findet sich auch in den Bezeichnungen der beteiligten Gene und Faktoren wieder.

Die Anmeldung EP 492274 A2 offenbart, daß im Stand der Technik bereits über unspezifische Mutagenese die Inaktivierung von Sporulationsgenen gelungen sei, wodurch asporogene Mutanten (spo-Minus-Phänotyp) erhalten worden seien.

EP 492274 A2 selbst beschreibt einen durch gezielte Mutagenese in dem frühen Sporulationsgen spoII:D behandelten B. subtilis-Stamm, der mit einer Reversionsrate von weniger als 10^–8 praktisch nicht mehr in der Lage ist, Sporen zu bilden. Diese Anmeldung lehrt, diesen Stamm erst nach Inaktivierung der weiteren Gene Ieu (für die Leucin-Synthese), pyrD1 (für die Uracil-Synthese), apr und npr für die Herstellung von Wertstoffen für die biotechnologische Produktion zu verwenden, weil hiermit Vorteile in der Produktion sowie Sicherheitsaspekte verbunden seien.

Die Anmeldung WO 97/03185 A1 befaßt sich ebenfalls mit der Inaktivierung der Sporulationsfähigkeit von Bacillus-Spezies mit Ausnahme von B. subtilis und Verwendung dieser Stämme zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen. Dieser Anmeldung zufolge soll das frühe, für den Sigmafaktor F codierende Gen spoIIAC funktionell inaktiviert werden, vorteilhafterweise in Kombination mit Deletionen in Genen der ebenfalls früh aktivierten Sporulationsgengruppen spo2, spo3. Hierfür wird eine irreversible Inaktivierung der betreffenden chromosomalen Abschnitte für spoIIAC beschrieben.

Die Anmeldung WO 02/097064 A1 ( EP 1391502 A1 ) betrifft Mikroorganismen, bei denen Gene aus den Stadien II, III, IV oder V der Sporulation deletiert oder inaktiviert worden sind. Hierbei handelt es sich um die Gene sigE, sigF, spoIIE, spoIISB und sigG von B. subtilis, die innerhalb des Genorts von spoIVCB bis spoIIIC von B. subtilis liegen. Dieser kann anhand der Datenbank SubtiList (zugänglich über http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) auf den Bereich der Positionen von ca. 2.642.000 kb bis ca. 2.700.000 kb des inzwischen bekannten Gesamtgenoms von B. subtilis eingegrenzt werden. Dieser Anmeldung hatte die Aufgabe zugrunde gelegen, überflüssige oder schädliche Aktivitäten von Bacillus-Stämmen auszuschalten, um die biotechnologische Produktion zu verbessern. Durch die genannten Modifikationen der mittleren bis späten Sporulationsgene würde bei Einsatz der betreffenden Stämme für die biotechnologische Produktion die Sporenbildung unterdrückt; dies wirke sich vorteilhaft auf die Nährstoff- und Energieverwertung aus; gleichzeitig könne die Dauer der Fermentation erhöht werden, um darüber die Gesamtausbeute an interessierendem Wertstoff zu erhöhen.

Der Übergang grampositiver Bakterien in die Dauerform der Spore wird also durch ungünstige Umweltbedingungen ausgelöst. Genau dies dürfte auch dann geschehen, wenn Bakterien aus den optimalen Wachstumsbedingungen der Fermentation unbeabsichtigt aus der Anlage austreten und in die Umgebung gelangen sollten. Demgegenüber ist, wie soeben dargelegt, über die Unterbindung der Fähigkeit zur Sporulation zur Erzeugung sicherer GVO bislang erst wenig nachgedacht worden. Der einschlägige Stand der Technik scheint lediglich nahezulegen, daß die Sporulation grampositiver Bakterien (a) wegen der damit verbundenen Proteaseaktivitäten und/oder (b) zur Verlängerung der Fermentationsdauer frühzeitig und vollständig unterbunden werden sollte, um letztlich die Fermentationsausbeute der so erhaltenen asporogenen Stämme zu steigern. Zur Verfolgung von Sicherheitsaspekten werden dagegen nur mehrere, zusätzlich einzuführende Mutationen offenbart.

Das für den in Prokaryonten beschriebenen Faktor RecA codierende Gen recA ist in der Molekularbiologie sehr bekannt, bislang insbesondere jedoch aus einem anderen Zusammenhang als dem der Herstellung von Sicherheitsstämmen. Dieser Faktor bindet spezifisch und kooperativ an einzelsträngige DNA und sorgt unter ATP-Hydrolyse für eine teilweise Entwindung doppelsträngiger DNA. Dieser Vorgang ermöglicht den genetischen Vorgang der Rekombination, das heißt den Strangaustausch zwischen ähnlichen DNA-Molekülen. So ist es in der Molekularbiologie ein übliches Vorgehen, das recA-Gen, dadurch zu verwenden, daß es über ein entsprechendes genetisches Konstrukt mit einer defekten recA-Kopie inaktiviert und somit ein recA-Minus-Phänotyp erzeugt wird, welcher nicht mehr zur Rekombination in der Lage ist. Beispielsweise nach dem Patent US 4713337 werden durch Crossing-over erzeugte Deletionsmutanten durch anschließende Inaktivierung von recA genetisch stabilisiert.

Eine biochemische Beschreibung des RecA aus Escherichia coli liefert beispielsweise die Publikation „C-terminal deletions of the Escherichia coli RecA" von S.L.Lusetti et al. (2003; J. Biol. Chem., Band 278, Heft 18, Seiten 16372–16380). Daraus geht hervor, daß insbesondere der C-Terminus dieses Moleküls die Einzelstrangbindung vermittelt und entsprechende Deletionsmutanten in diesem Bereich neben anderen biochemischen Eigenschaften eine erhöhte Mitomycin-Sensitivität aufweisen. Mitomycin ist dafür bekannt, daß es die DNA-Synthese beeinträchtigt und dadurch bakterizid wirkt. Der N-terminale Bereich ist dagegen stärker an der Bindung von DNA-Doppelsträngen beteiligt.

Der bereits zitierte Übersichtsartikel von S.Molin et al. verweist ebenfalls auf Arbeiten, bei denen eine recA-Minus-Mutation als Markergen für den gramnegativen Escherichia coli verwendet wird. Es wird die Vermutung geäußert, diese Mutation allein könne schon ausreichen, um jegliches Umweltrisiko durch diesen Stamm auszuschließen. Andererseits werden zwei Nachteile dieses Ansatzes diskutiert, nämlich zum einen sei es technisch schwierig, diese Mutanten herzustellen und zum anderen würden die betreffenden Stämme auch in ihrem erwünschten Einsatz („short-term competitive properties") derart behindert sein, daß man andere die Lebensfähigkeit beschränkende und im betreffenden Artikel erwähnte Mutationen vorziehen würde. Auch in Kombination mit dem grundsätzlich anderen Ansatz zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen, nämlich dem Einführen von Suizidsystemen, habe sich die Inaktivierung von RecA als nachteilhaft herausgestellt.

Die Publikation „Freisetzung gentechnisch veränderter Bakterien" von Selbitschka et al. (2003; Biologie in unserer Zeit, Band 33, Heft 3, Seiten 162–175) beschreibt die Freisetzung von gramnegativen, mit einem Luciferase-Gen modifizierten Bakterien der Spezies Sinorhizobium meliloti in einem mehrjährigen Freilandversuch. Sie trugen zusätzlich eine Inaktivierung des recA-Gens, welche dazu geführt hat, daß Zellen dieser Klone unter natürlichen Bedingungen letztlich nicht überleben konnten.

K.-D. Wittchen hat im Zuge seiner bei der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster eingereichten Dissertation (1995) mit dem Titel „Entwicklung eines Sicherheitsstammes von Bacillus megaterium DSM 319 und molekulargenetische Charakterisierung des Gens für die extrazelluläre neutrale Metalloprotease (nprM)" einen Stamm des grampositiven B. megaterium erzeugt, der nach gezielter Gendisruption Deletionen in der im Titel genannten neutralen Metalloprotease, der der Isopropylmalat-Dehydrogenase, und eines nicht näher bezeichneten SpoIV-Proteins enthält. Anschließend wurde an diesem Stamm eine recA-Mutation vorgenommen, welche in bezug auf die UV-Sensitivität des Stammes im Vergleich zum Wildtyp allerdings keine wesentlichen Unterschiede verursachte, wohl aber bei Wachstum auf Mitomycin C-haltigen Agarplatten. Diese Vierfachmutante wurde als Sicherheitsstamm vorgeschlagen, ohne jedoch dessen Realisierbarkeit oder sogar die konkreten Auswirkungen dieser Modifikationen auf einen Produktionsprozeß mit entsprechend modifizierten Bakterienstämmen zu untersuchen.

Die in derselben Arbeitsgruppe angefertigte Diplomarbeit von N. Nahrstedt (2000) mit dem Titel „Molekulargenetische Charakterisierung des recA-Gens von Bacillus megaterium DSM 319 und Konstruktion einer Deletionsmutante" schlägt folgende, nebeneinander vorliegende vier Mutationen in zum Teil Gruppen von Genen vor: recA-Minus, Protease-Minus, Leucin-Auxotrophie und Sporulations-Defizienz. Es wird diskutiert, eine recA-Defizienz als eine Sicherheitsmarke neben anderen in Produktionsstämme einzuführen, weil sich dadurch zum einen unerwünschte Rekombinationsprozesse unterdrücken ließen und zum anderen die betreffenden Mutanten eine erhöhte Sensitivität gegenüber DNA-schädigenden Agenzien aufweisen, das heißt in der Umwelt eine geringere Überlebenschance besitzen sollten. Auch dieser Vorschlag wurde nicht weiterverfolgt.

Den Stand der Technik zu RecA kann man dahingehend zusammenfassen, daß dieses Protein bisher überwiegend aus genetischen Zusammenhängen bekannt ist. Der Einsatz dieses Faktors bzw. die Inaktivierung des betreffenden Gens zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen von GVO wird aufgrund seiner physiologischen Bedeutung bislang eher abgelehnt. Erfolgreiche beschreibene Beispiele hierfür sind lediglich recA-Minus-Mutanten der gramnegativen Spezies Sinorhizobium meliloti und des grampositiven Bacillus megaterium, letztere jeweils nur in Kombination mit drei weiteren sicherheitsrelevanten Mutationen.

Insgesamt bleibt festzuhalten, daß zur Herstellung von Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion verschiedene alternative genetische Systeme nach einem „passiven" Wirkmechanismus etabliert sind, wie die Inaktivierung von Proteasegenen, die Ausschaltung von verschiedenen Stoffwechselgenen zur Erzeugung von Aminosäure- oder Nukleobasenauxotrophien. Bei sporenbildenden grampositiven Bakterien ist die Unterbindung der Sporulation beschrieben, insbesondere zu einem frühen Zeitpunkt, vor allem aber um zusätzliche Vorteile in der Fermentation zu erzielen.

Es stellte sich somit die Aufgabe, ein weiteres geeignetes Sicherheitssystem für gentechnisch veränderte grampositive Bakterien zu entwickeln, wofür als Grundlage zunächst ein geeigneter Faktor und/oder ein geeignetes Gen zu identifizieren waren.

Einen Teilaspekt dieser Aufgabe stellte nach Feststellung der grundsätzlichen Eignung eines solchen Systems die Isolierung eines hierfür verwendbaren genetischen Elements, eventuell eines Gens, und der Aminosäuresequenz eines hiervon gegebenenfalls codierten Faktors dar, um dieses System entsprechenden molekularbiologischen Konstruktionen für den Einsatz in Produktionsstämmen zugänglich zu machen, insbesondere in Kombination mit einem oder mehreren weiteren der Sicherheit dienenden Regulationsmechanismen.

Ein weiterer Teilaspekt der Aufgabe bestand darin, daß dieses System mit anderen Sicherheitssystemen kombinierbar sein sollte.

Somit lag eine Teilaufgabe darin, ein weiteres derartiges, hiermit zu kombinierendes Sicherheitssystem zu definieren, vorzugsweise eines, das neben diesen beiden Systemen keine weiteren Mutationen erforderlich machen würde. Mit anderen Worten: maximal diese zwei Mutationen sollten ausreichen, um einen grampositiven Sicherheitsstamm zu erzeugen, der weitgehende Anforderungen an die Verminderung der Lebensfähigkeit in der Umwelt erfüllen, das heißt zu einer minimalen Reversionsrate führen sollte. Denn eine niedrigere Zahl als vier nebeneinander wirksame Systeme bedeutet einen zunehmend geringeren Arbeitsaufwand zur Herstellung dieser Stämme.

Ein Nebenaspekt dieser Aufgabe bestand darin, ein derartiges Sicherheitssystem zu finden, das nicht so speziell ist, daß es nicht auch in anderen molekularbiologischen Ansätzen Verwendung finden könnte.

Diese Aufgabe wird durch den Faktor RecA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96% identisch ist, beziehungsweise durch die für einen Faktor RecA codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist, gelöst.

Die in SEQ ID NO. 2 und 1 angegebenen Aminosäure- und Nukleotidsequenzen sind die für RecA. Dabei codieren alle Positionen von 1 bis 1047 für das Protein; die letzten drei stellen dabei das Stop-Codon dar. Sie werden als Gen und Protein recA beziehungsweise RecA bezeichnet. Sie stammen aus dem bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) unter der Nummer DSM 13 hinterlegten Stamm Bacillus licheniformis. Erfindungsgemäße Lösungen der Aufgabe stellen alle Faktoren beziehungsweise Nukleinsäuren dar, die hierzu eine hinreichend Homologie aufweisen, wie sie mit den jeweiligen Prozentangaben definiert ist.

Als nächster Stand der Technik kann der entsprechende Faktor aus B. amyloliquefaciens angesehen werden. Die zugehörigen DNA- und Aminosäuresequenzen sind in der Datenbank NCBI der National Institutes of Health der USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) unter der Zugangsnummer AJ515542 veröffentlicht. RecA aus B. licheniformis DSM 13 weist hierzu auf Aminosäureebene eine Homologie von 94,0% Identität und auf Nukleinsäureebene eine Übereinstimmung von 81,2% Identität auf. Beide Vergleiche gehen aus den Alignments der 1 und 2 hervor, wo die Sequenzen von B. amyloliquefaciens jeweils in der zweiten Zeile dargestellt sind.

Als nächstähnliche Enzyme wurden RecA aus B. subtilis und RecE aus B. subtilis mit jeweils 93,4% Identität ermittelt. Sie weisen auf DNA-Ebene Homologiewerte von 81,0% beziehungsweise 81,2% Identität auf. Sie sind ebenfalls in der NCBI-Datenbank, und zwar unter den Eintragungsnummern Z99112 (Region 161035 bis 162078) beziehungsweise X52132 veröffentlicht. Die Aminosäure- und DNA-Vergleiche mit diesen Faktoren sind ebenfalls in den 1 und 2 (jeweils Zeilen 3 beziehungsweise 4) dargestellt.

Diese hohen, beanspruchten Homologiewerte um den konkret hier beschriebenen Faktor lassen erwarten, daß derselbe Faktor RecA besonders in verwandten Stämmen oder Spezies, wahrscheinlich aber auch in weniger verwandten Spezies, wahrscheinlich sogar gramnegativen Organismen die zugehörige Funktion übernimmt. Diese liegt erfindungsgemäß in der eingangs erläuterten DNA-Einzelstrangbindung und der damit verbundenen Rolle für Rekombinationsvorgänge von Nukleinsäuren. Vergleichbare Wirkungen sollten auch mit Deletionen des recA-Gens verbunden sein, nämlich die Unterbindung von DNA-Rekombinationen und eine dadurch verminderte Lebensfähigkeit. Gleichzeitig sollte ein recA-Gen aus dem einen Stamm geeignet sein, diese Funktion in einem anderen zu übernehmen; dies wird mit zunehmender Ähnlichkeit zunehmend besser gelingen. Hierdurch wird der Einsatz des betreffenden Gens für die Herstellung von Deletionsmutanten der verschiedensten grampositiven Mikroorganismen möglich.

Dadurch wird für RecA und vor allem für das zugehörige Gen recA ein weites technologisches und kommerziell relevantes Gebiet eröffnet, nämlich die Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von genetisch veränderten grampositiven Bakterien. Sie können über Mutationen in recA nicht nur hinsichtlich ihrer genetischen Stabilität sondern auch ihrer Sicherheit verbessert werden. Dies gilt, wie unten weiter ausgeführt, insbesondere für Stämme, die in der biotechnologischen Produktion tatsächlich eingesetzt werden, wie beispielsweise Bacillus licheniformis.

Wie unten ebenfalls detaillierter ausgeführt geschieht dies vorzugsweise im Zusammenhang mit einer und besonders bevorzugt keinen weiteren sicherheitsrelevanten Deletionen. Ebenso bevorzugt geschieht dies in möglichst nahe verwandten Stämmen. Hierbei ist jedoch von B. megaterium abzusehen, zum einen weil hierfür, wie einleitend beschrieben, bereits die Spezies-eigenen recA-Gene beziehungsweise die hierin deletierten Mutanten zur Verfügung stehen und zum anderen weil diese Spezies, die sich insbesondere durch ihre großen Zellen und damit verbundene mikrobiologische Eigenheiten auszeichnet, im allgemeinen nicht für die großtechnische Fermentation genutzt wird.

Gegenstände der vorliegenden Erfindung liegen somit in dem Faktor RecA (SEQ ID NO. 2) und dem zugehörigen Gen recA (SEQ ID NO. 1) aus B. licheniformis DSM 13 beziehungsweise nahen Verwandten hierzu. Ebenso stellt die Verwendung eines recA-Gens zu dessen funktioneller Inaktivierung in einem grampositiven Bakterium einen Erfindungsgegenstand dar, vorzugsweise in Kombination mit der funktionellen Inaktivierung eines in der Phase IV der Sporulation grampositiver Mikroorganismen aktiven Gens, vorzugsweise spoIV, yqfD beziehungsweise Homologen hierzu. Dies geschieht vorteilhafterweise mithilfe der in der vorliegenden Anmeldung zusätzlich beschriebenen Gene spoIV und yqfD. Einen entsprechenden Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellen die hierdurch erhaltenen grampositiven Mikroorganismen dar; ebenso die mit diesen Organismen durchgeführten Fermentationen, insbesondere zur Herstellung von Wertstoffen. Des weiteren steht mit der vorliegenden Anmeldung ein RecA-Protein zur Verfügung, das in molekularbiologischen Ansätzen oder zur Modulation der molekularbiologischen Aktivitäten von Zellen verwendet werden kann, insbesondere im Zusammenhang mit DNA-Polymerisations- oder Rekombinationsvorgängen.

Zum ersten Erfindungsgegenstand gehört jeder oben definierte Faktor RecA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.

Denn wie erläutert ist mit zunehmender Ähnlichkeit eine zunehmende Übereinstimmung der Funktionen und damit eine Austauschbarkeit der Faktoren zu erwarten.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen Faktor RecA, der von einer Nukleinsäure codiert ist, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.

In bevorzugten Ausführungsformen sind das Faktoren, die von einer Nukleinsäure codiert sind, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.

Denn über die Nukleinsäuren stehen die betreffenden Faktoren beziehungsweise Gene für die Transformation in andere, vorzugsweise verwandte Spezies oder für Modifikationen zur Verfügung. Hierzu gehören, wie unten detaillierter erläutert, insbesondere Mutationen der betreffenden Gene. Mit einem zunehmenden Maß an Identität zur angegebenen Sequenz sollte der Erfolg bei solchen Spezies umso größer sein, die zu B. licheniformis zunehmend verwandt sind, insbesondere bei der für die biotechnologische Produktion besonders wichtigen Spezies B. licheniformis selbst.

Wie erläutert dienen der Verwirklichung der vorliegenden Erfindung vor allem die für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäuren, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.

Dies gilt um so mehr für derartige Nukleinsäuren, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Denn diese können über entsprechende Konstruktionen zur Transformation und/oder zur Mutagenese verwendet werden, wobei eine zunehmende Ähnlichkeit den erwünschten Erfolg umso wahrscheinlicher werden läßt.

Ganz besonders bevorzugt handelt es sich dabei um eine derartige Nukleinsäure, die für einen zuvor beschriebenen Faktor RecA codiert. Dies gilt beispielsweise für Strategien, bei denen ein funktioneller Faktor RecA hergestellt werden soll, etwa für die unten ausgeführten molekularbiologischen Versuchsansätze, oder für die Erzielung einer maximalen Übereinstimmung mit dem jeweils endogenen tatsächlich für RecA codierenden Gen, welches modifiziert und/oder ausgeschaltet werden soll. Denn in vielen Fällen reicht eine Mutation in einer einzigen Position, um etwa über eine nonsense-Mutation das Gen beziehungsweise den Faktor in seiner natürlichen Funktion auszuschalten.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung einer für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure zur funktionellen Inaktivierung des Gens recA in einem grampositiven Bakterium dar, welches nicht Bacillus megaterium ist.

Denn zum einen gibt es für B. megaterium bereits die einleitend erwähnten Studien, in denen vorgeschlagen wird, gleichzeitig mit mehreren anderen Mutationen auch recA zu deletieren, um zu Sicherheitsstämmen zu gelangen. Zum zweiten stellen andere grampositive Bakterien wie beispielsweise solche der Gattungen Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium und Clostridium im Stand der Technik wichtigere Wirtsorganismen für die biotechnologische Produktion von Wertstoffen (siehe unten) dar.

Unter der funktionellen Inaktivierung ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung jede Art von Modifikation oder Mutation zu verstehen, wonach die Funktion eines RecA als Einzelstrang-DNA-bindenden Faktors unterbunden wird. Dazu gehört die Ausführungsform, daß ein praktisch vollständiges, aber inaktives Protein gebildet wird, daß inaktive Teile eines RecA in der Zelle vorliegen, bis hin zu den Möglichkeiten, daß das Gen recA nicht mehr translatiert wird oder sogar vollständig deletiert ist. Somit besteht die eingangs diskutierte „Verwendung" dieses Faktors oder dieses Gens dieser Ausführungsform nach darin, daß er beziehungsweise es von der betreffenden Zelle eben nicht mehr auf seine natürliche Weise zur Wirkung kommt. Dies wird diesem Erfindungsgegenstand zufolge auf genetischer Ebene dadurch erreicht, daß das betreffende Gen ausgeschaltet wird.

Nach einer Ausführungsform dieser Verwendung wird eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt.

Derartige Nukleinsäuren können über an sich bekannte Verfahren zur Punktmutagenese erzeugt werden. Solche sind beispielsweise in einschlägigen Handbüchern wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis, „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, dargestellt. Zudem stehen hierfür inzwischen zahlreiche kommerzielle Baukästen zur Verfügung, etwa das QuickChange^®-Kit der Firma Stratagene, La Jolla, USA. Das Prinzip besteht darin, daß Oligonukleotide mit einzelnen Austauschen (Mismatch-Primer) synthetisiert und mit dem einzelsträngig vorgelegten Gen hybridisiert werden; anschließende DNA-Polymerisation ergibt dann entsprechende Punktmutanten. Hierfür können die jeweiligen Spezies-eigenen recA-Sequenzen verwendet werden. Aufgrund der hohen Homologien ist es möglich und erfindungsgemäß besonders vorteilhaft, diese Reaktion anhand der mit SEQ ID NO. 1 zur Verfügung gestellten Sequenz oder etwa den anderen aus 2 hervorgehenden Sequenzen verwandter Spezies durchzuführen. Diese Sequenzen können auch dazu dienen, entsprechende Mismatch-Primer für verwandte Spezies zu entwerten, insbesondere anhand der im Alignment der 2 identifizierbaren konservierten Bereiche.

Nach einer Ausführungsform dieser Verwendung wird eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.

Auch diese Verfahren sind dem Fachmann an sich vertraut. Somit ist es möglich, die Bildung eines Faktors RecA durch die Wirtszelle dadurch zu verhindern, daß ein Teil des Gens auf einem entsprechenden Transformationsvektor über Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten und der Vektor anschließend in den interessierenden Wirt transformiert wird, wo über die – bis dahin noch mögliche – homologe Rekombination das aktive Gen gegen die inaktive Kopie ausgetauscht wird. In der Ausführungsform der Insertionsmutation kann lediglich das intakte Gen unterbrechend oder anstelle eines recA-Genteils ein anderes Gen, beispielsweise ein Selektionsmarker eingefügt werden. Hierüber ist das Mutationsereignis in an sich bekannter Weise phänotypisch überprüfbar.

Um diese jeweils notwendigen Rekombinationsereignisse zwischen dem in die Zelle eingeführten defekten Gen und der beispielsweise auf dem Chromosom endogen vorhandenen intakten Genkopie zu ermöglichen, ist nach dem derzeitigen Wissensstand eine Übereinstimmung in jeweils mindestens 70 bis 150 zusammenhängenden Nukleinsäurepositionen, jeweils in den beiden Randsequenzen zu dem nichtübereinstimmenden Teil nötig, wobei es auf den dazwischenliegenden Teil nicht ankommt. Dementsprechend sind solche Ausführungsformen bevorzugt, die lediglich zwei flankierende Regionen mit mindestens diesen Größen umfassen.

Nach einer alternativen Ausführungsform dieser Verwendung werden Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit den für das Protein codierenden Bereich zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig flankieren.

Denn allein um den Austausch der beiden Genkopien über homologe Rekombination zu ermöglichen, braucht es sich dabei nicht zwangsläufig um proteincodierende Abschnitte zu handeln. Vielmehr eignen sich hierfür auch die Randbereiche der betreffenden Gene, welche natürlicherweise eine andere Funktion (Promotor, Terminator, Enhancer etc.) ausüben oder lediglich nichtfunktionelle intergenische Abschnitte darstellen. So kann die funktionelle Inaktivierung beispielsweise auch in der Deletion des Promotors bestehen, wofür es bei einer Deletionsmutation dieser Ausführungsform notwendig ist, auf flankierende, nichtcodierende Abschnitte zurückzugreifen. Je nach Einzelfall kann es auch sinnvoll sein, für die flankierenden Regionen solche Abschnitte auszuwählen, die zum Teil in den proteincodierenden Bereich hineinreichen und zum Teil außerhalb liegen.

Derartige, wenigstens zum Teil nichtcodierende Bereiche können für die Gene recA aus B. amyloliquefaciens und für recA und recE aus B. subtilis den oben angegebenen Datenbankeinträgen entnommen werden. Für andere Stämme, beispielsweise auch für recA aus B. licheniformis ist es möglich, die betreffenden nichtcodierenden Bereiche über PCR-basierte Verfahren aus einer Präparation der genomischen DNA zu erschließen. Diese Verfahren (beispielsweise anchored PCR) sind im Stand der Technik etabliert. Als Ausgangspunkte hierfür dienen die bekannten Genabschnitte. Der vorliegenden Erfindung zufolge können die hierfür benötigten Primer anhand der SEQ ID NO. 1 auch für andere Spezies grampositiver Bakterien und hierunter insbesondere für solche der Gattung Bacillus entworfen werden.

Bei einer entsprechenden Verwendung handelt es sich demzufolge um eine der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beziehungsweise um die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren. Die verschiedenen hierunter fallenden Ausführungsformen sind entsprechend bevorzugt.

In bevorzugten Ausführungsformen dieser Verwendungen handelt es sich bei dem grampositiven Bakterium vorzugsweise um eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus und um eines, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist, bei dem gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.

Denn viele grampositiven Bakterien sind wie einleitend beschrieben in der Lage, unter entsprechend ungünstigen Umweltbedingungen den Vorgang der Sporulation einzuleiten. Dies kann erfindungsgemäß insofern für Sicherheitsaspekte ausgenutzt werden, als in Kombination mit der oben dargestellten funktionellen Inaktivierung von recA ein Sporulationsgen aus der vergleichsweise späten Phase IV der Sporulation ebenfalls funktionell inaktiviert wird. Damit stehen der formulierten Aufgabe entsprechend zwei gleichzeitig und erfindungsgemäß miteinander kombinierbare Systeme für die Herstellung sicherer GVO zur Verfügung. Die Kombination beider Systeme war bislang noch nicht bekannt, insbesondere nicht zu diesem Zweck.

Besonders erfolgreich konnte die Inaktivierung von Sporulationsgenen an Spezies der Gattungen Clostridium und Bacillus realisiert werden, weshalb die hierdurch gekennzeichneten Ausführungsformen entsprechend bevorzugt sind.

Insbesondere ist es überraschend, daß die Verhinderung der Sporulation erst in einem so späten Stadium für diesen Zweck erfolgreich ist. Zwar werden in spoIV-Mutanten von B. licheniformis unter entsprechenden Bedingungen noch Sporen (die sogenannten „Phase-Grau-Sporen") gebildet, doch sind diese steril und nicht mehr in der Lage auszukeimen. Insofern trägt diese Mutation dem Sicherheitsaspekt Rechnung. Bisher war eine Unterbindung der Sporulation eher zu einem früheren Zeitpunkt favorisiert worden. Die Inaktivierung in Phase IV sorgt zusätzlich jedoch dafür, daß die in den früheren Sporulations-Phasen aktiven Faktoren auch weiterhin in den Mutanten gebildet werden. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, kann man vermuten, daß zumindest einige dieser Faktoren von den Zellen auch für die normalen während der Fermentation ablaufenden Stoffwechselvorgänge benötigt werden. Bei dem Ausschalten zu einem frühreren Zeitpunkt stünden sie nicht mehr zur Verfügung. Umgekehrt besteht die vorteilhafte Wirkung der Inaktivierung der Sporulation in Phase IV darin, daß der hierdurch stattfindende Eingriff in die Physiologie der Zellen nicht so gravierend ist und die Fermentation an sich weniger beeinträchtigt wird als bei einem früheren Ausschalten dieser Gene.

Bevorzugt ist eine derartige Verwendung, bei der es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spoIV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.

All diese Gene sind an sich bekannt und für diese Phase der Sporulation beschrieben. Das B. subtilis-Gen spoIVA codiert für das Phase-IV-Sporulationsprotein A, das in den Datenbanken Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) und NCBI (siehe oben) unter der Nummer P35149 hinterlegt ist. Es spielt für die Bildung einer intakten Sporenhülle und deren Zusammenbau eine Rolle. Die Aminosäuresequenz des zugehörigen Faktors SpoIVA wird in SEQ ID NO. 8 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentln erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist des Institute Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) unter der Nummer BG10275 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 7 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukleotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 7 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1876 erfindungsgemäß als Gen spoIVA bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1679; das erste Codon, das heißt die Positionen 201 bis 203 werden in vivo nicht als Leucin sondern als Methionin translatiert.

Das B. subtilis-Gen spoIVB codiert für das Phase-IV-Sporulationsprotein B, das in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P17896 hinterlegt ist. Es ist für den Sigma-Faktor-K-abhängigen Übergangspunkt während der Sporulation beziehungsweise dessen Aktivierung in der Mutterzelle von Bedeutung. Es spielt für die interkompartimentelle Signalübertragung eine Rolle, wahrscheinlich über den hydrophoben N-Terminus. Die Aminosäuresequenz des Faktors SpoIVB wird in SEQ ID NO. 10 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentln erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10311 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 9 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukleotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 9 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1675 erfindungsgemäß als Gen spoIVB bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1478.

Das B. subtilis-Gen spoIVCA codiert für eine putative ortsspezifische DNA-Rekombinase, die in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P17867 hinterlegt ist. Sie spielt wahrscheinlich eine Rolle, um die Gene spoIIIC und spoIVCB zu rekombinieren, woraus der Sigmafaktor K hervorgeht. Die Aminosäuresequenz dieser Rekombinase wird in SEQ ID NO. 12 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentln erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10458 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 11 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukleotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 11 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1900 erfindungsgemäß als Gen spoIVCA bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1703; das erste Codon, das heißt die Positionen 201 bis 203 werden in vivo nicht als Valin sondern als Methionin translatiert.

Das B. subtilis-Gen spoIVCB codiert für den RNA-Polymerase-Sigmafaktor-K-Precursor, der in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P12254 hinterlegt ist. Der Rest dieses Faktors wird von dem Gen spoIIIC codiert, welches auf dem Chromosom ca. 10 kb entfernt ist, wobei der dazwischenliegende Bereich als SKIN bezeichnet wird. Durch Excision dieses Fragments in der unmittelbar vorangehenden Sporulationsphase wird der aktive Sigma-Faktor K erhalten, welcher seinerseits als Transkriptionsfaktor wirkt. Die Aminosäuresequenz des Teilfaktors SpoIVCB wird in SEQ ID NO. 14 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentln erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10459 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 13 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukleotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 13 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 868 erfindungsgemäß als Gen spoIVCB bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 671.

Das B. subtilis-Gen spoIVFA codiert für das Phase IV-Sporulationsprotein FA. Dieser Faktor, der vermutlich in der Lage ist, mit SpoIVFB (siehe unten) ein Heterodimer zu bilden, erfüllt wahrscheinlich die Aufgabe, diesen Faktor zu stabilisieren aber dadurch gleichzeitig auch zu inhibieren. Deshalb wird SpoIVFA auch schon zu einem früheren Zeitpunkt, vermutlich in Phase II gebildet. Die Aminosäuresequenz von SpoIVFA ist in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P26936 hinterlegt. Sie wird in SEQ ID NO. 16 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentln erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10331 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 15 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukleotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 15 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1192 erfindungsgemäß als Gen spoIVFA bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 995.

Das B. subtilis-Gen spoIVFB codiert für das Phase-IV-Sporulationsprotein FB. Dabei handelt es sich um eine membranassozüerte Metalloprotease, die vermutlich für die Prozessierung von Pro-Sigma K zu Sigma K zuständig ist; sie wird ebenfalls bereits in Phase II der Sporulation gebildet. Die Aminosäuresequenz von SpoIVFB ist in den Datenbanken Swiss-Prot und NCBI unter der Nummer P26937 hinterlegt. Sie wird in SEQ ID NO. 18 der vorliegenden Anmeldung angegeben, und zwar als die vom Programm Patentln erzeugte Übersetzung der vorangegangenen DNA-Sequenz. Die zugehörige Nukleotidsequenz kann der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG10332 entnommen werden und ist im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO. 17 angegeben, und zwar zusammen mit den 200 vor dem 5'-Ende und den 197 hinter dem 3'-Ende gelegenen Nukleotiden. Hierbei wird, ungeachtet der Tatsache, daß diese Randsequenzen durchaus sinnvolle genetische Informationen, insbesondere Regulationselemente oder auch Abschnitte anderer Gene enthalten dürften, die komplette unter SEQ ID NO. 17 angegebene Nukleotidsequenz von 1 bis 1264 erfindungsgemäß als Gen spoIVFB bezeichnet. Der codierende Bereich erstreckt sich von den Positionen 201 bis 1067; das erste Codon, das heißt die Positionen 201 bis 203 werden in vivo nicht als Leucin sondern als Methionin translatiert.

Auch die beiden bevorzugten Gene gehen an sich aus dem Stand der Technik hervor. Die DNA- und Aminosäuresequenzen von spoIV aus B. licheniformis sind in der Datenbank NCBI unter der Nummer AJ616332 hinterlegt. Dieser Faktor wird in der Diplomarbeit „Arbeiten zur Herstellung einer sporulationsnegativen Mutante von Bacillus licheniformis" von M.Gröne (2002), im Fachbereich Biologie der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster, Deutschland als ein für die Sporulation von B. licheniformis essentieller Faktor beschrieben. Die zugehörigen, zum Teil auch regulatorische Bereiche umfassenden Sequenzen sind in der vorliegenden Anmeldung unter SEQ ID NO. 3 und 4 angegeben. Zu diesen Sequenzen ist zu bemerken, daß erfindungsgemäß der Bereich der Nukleotide 1 bis 1792 als Gen spoIV bezeichnet wird, wobei der eigentliche SpoIV-codierende Abschnitt die Positionen 140 bis 1336 umfaßt; die Randsequenzen mögen wiederum andere genetische Elemente wie Regulationselemente oder Teile anderer Gene enthalten. Hierunter wird das erste Codon GTG der Positionen 140 bis 142 in vivo nicht als Valin sondern als Methionin translatiert.

In dieser Arbeit wird auch auf den Faktor beziehungsweise das Gen yqfD aus B. subtilis hingewiesen, welches mit einer Homologie von 68% Identität auf Aminosäureebene als das nächstähnliche bis dato bekannte Protein angesehen wird. Dieser Faktor ist in der Datenbank Swiss-Prot unter der Nummer P54469 angegeben; sowohl die Aminosäuresequenz als auch die DNA-Sequenz mit beiden ca. 200 bp flankierenden Bereichen gehen aus der Datenbank Subtilist unter der Nummer BG11654 hervor. Der dortige Eintrag vermerkt, es sei zwar ein unbekanntes Protein, aber aufgrund der bestehenden Sequenzhomologien könne es als Ähnliches zum Phase-IV-Sporulationsprotein angesehen werden. Die zugehörigen Sequenzen können SEQ ID NO. 5 und 6 der vorliegenden Anmeldung entnommen werden. Zu diesen Sequenzen ist ergänzend zu bemerken, daß ungeachtet der ebenfalls angegebenen und möglicherweise andere genetische Elemente enthaltenden Randssequenzen erfindungsgemäß der Bereich der Nukleotide 1 bis 1594 als Gen yqfD bezeichnet wird, wobei der eigentliche proteincodierende Abschnitt die Positionen 201 bis 1397 umfaßt. Hierunter wird das erste Codon GTG der Positionen 201 bis 203 wie bei spoIV aus B. licheniformis in vivo nicht als Valin sondern als Methionin translatiert.

Es ist zu erwarten, daß alle anderen grampositiven, natürlicherweise zur Sporulation befähigten Mikroorganismen über Homologe zu den genannten sieben Genen und davon abgeleitete Faktoren vergleichbarer Funktionen verfügen. Sie dürften in an sich bekannter Weise unter Hybridisierung mit den in im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren ohne weiteres identifizierbar sein, insbesondere mithilfe der beiden homologen Sequenzen SEQ ID NO. 3 beziehungsweise 5, womit eine gewisse Varianz über Spezies-Grenzen hinweg ermöglicht wird.

Eines dieser Gene, vorzugsweise yqfD/spoIV beziehungsweise dessen Homologes wird im Produktionsstamm erfindungsgemäß gleichzeitig mit recA inaktiviert, um hieraus entsprechende Sicherheitsstämme zu erhalten. Vorteilhafterweise werden hierfür entsprechend den oben gemachten Ausführungen zur Deletionsmutagenese die in SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 oder 17 angegebenen Nukleinsäuren selbst zur Inaktivierung verwendet. Damit ist es nicht einmal nötig, die betreffenden homologen Gene aus den für die Produktion verwendeten Spezies selbst zu identifizieren. Hierbei ist zu erwarten, daß diese Deletionen umso erfolgreicher sind, je enger die betreffenden Spezies mit B. subtilis beziehungsweise B. licheniformis verwandt sind. Denn hiermit sollte eine zunehmende Homologie der betreffenden Gene verbunden sein. Aus diesem Grund sind im Sequenzprotokoll jeweils auch die ca. 200 bp umfassenden Randsequenzen angegeben, denn damit können entsprechend den für recA gemachten Ausführungen Konstrukte gebildet werden, die die für ein Crossing-over nötigen mindestens 70 bis 150 Positionen umfassenden Bereiche in vollständig flankierenden Bereichen enthalten.

Erfindungsgemäß ist es möglich, zusammen mit recA mehrere der genannten Phase IV-Gene zu inaktivieren und dadurch Sicherheitsstämme zu erhalten, die neben der Unfähigkeit zur RecA-vermittelten DNA-Rekombination nicht in der Lage sind, reife Sporen zu bilden. Erfindungsgemäß reicht es hierfür jedoch aus, neben recA lediglich eines dieser Gene zu inaktivieren, weshalb in einer bevorzugten derartigen Verwendung genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.

Hierdurch werden Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion erhalten. Diese sind außerhalb der optimalen Fermentationsbedingungen weniger gut überlebensfähig, insbesondere unter Umweltbedingungen, die schlechte Nährstoffversorgung und DNA-schädigende Einflüsse, etwa durch UV-Strahlung oder aggressive chemische Verbindungen, umfassen. Die genannte erste Gruppe von Umwelteinflüssen würde bei natürlicherweise zur Sporulation befähigten grampositiven Bakterien den Übergang in die Dauerform der Sporen induzieren; die zweite Gruppe von Einflüssen kann von Mikroorganismen natürlicherweise über RecA-vermittelte DNA-Reparatur- und Rekombinationsprozesse ausgeglichen werden. Wenn die Zellen zu beidem nicht mehr oder nur noch stark eingeschränkt in der Lage sind, sind sie erfindungsgemäß als Sicherheitsstämme geeignet.

Ferner ist es möglich, zusammen mit recA eines oder mehrere der im Stand der Technik bekannten Gene zu inaktivieren und dadurch Sicherheitsstämme zu erhalten, die neben der Unfähigkeit zur RecA-vermittelten DNA-Rekombination und zur Bildung reifer Sporen auch über diese zusätzlichen Eigenschaften gekennzeichnet sind. Dazu gehören neben „aktiven", die Lebensfähigkeit unterbindenden und entsprechend stringent zu regulierenden Systemen auch jene, die im einleitend dargestellten Stand der Technik als „passive" Systeme zur Erzeugung von GVO bezeichnet worden sind. dazu gehören insbesondere inaktivierende Mutationen in einem oder mehreren der folgenden Gene: epr, rp-I, rp-II, isp-1, apr, npr, spoOA, bpr, rsp, mpr, vpr, spoOA, spoII:D, spoIIAC, spo2, spo3, sigE, sigF, spoIIE, spoIISB, sigG, spoIVCB, spoIIIC, nprM und das Gen für die Isopropylmalat-Dehydrogenase (IeuB). Diese Genbezeichnungen sind dem in der Einleitung zur vorliegenden Anmeldung dargestellten Stand der Technik entnommen. Somit sind an dieser Stelle mit diesen Abkürzungen jeweils die in den einleitend genannten Anmeldungen und Publikationen beschriebenen Bedeutungen gemeint. Sollten für dieselben Gene beziehungsweise Gengruppen, codierend für dieselben oder homologe Proteine, im Stand der Technik weitere Namen etabliert sein, insbesondere für die Homologen in anderen Bakterienspezies als denen, die den erwähnten Arbeiten zugrundegelegen haben, so gilt das hier Gesagte entsprechend.

Erfindungsgemäß ist es jedoch nicht unbedingt notwendig, neben recA und gegebenenfalls zusätzlich einem Sporulationsphasen IV-Gen ein weiteres Gen zu inaktivieren, so daß vorzugsweise auf diese weiteren Mutationen weitgehend verzichtet wird. Hiermit ist der in der Aufgabe zur vorliegenden Anmeldung geforderte Vorteil verbunden, möglichst wenige Sicherheitssysteme parallel in derselben Zelle zu etablieren. Hiermit wird der Arbeitsaufwand geringer gehalten, als wenn man, wie in den genannten Arbeiten zu B. megaterium vorgeschlagen, vier verschiedene Deletionen vornehmen müßte. Das ist insbesondere dann relevant, wenn die betreffenden Zellen zuerst – solange sie noch zur Rekombination in der Lage sind – mit den für die Produktion relevanten Transgenen versehen werden und dann erst in Sicherheitsstämme, insbesondere in einen recA-Minus-Phänotyp überführt werden. Nur für sehr kritische Fälle, etwa hochpathogene Stämme, sind derartige weitere Mutationen angezeigt.

Aufgrund der mit der vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Sequenzen werden Sporulationsdefekte in den Genen spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD in der Nomenklatur von B. subtilis beziehungsweise im Fall von Bacillus licheniformis in dem Gen spoIV beziehungsweise den je nach Wirtszelle vorhandenen hierzu homologen Genen erzeugt.

Diese Homologie läßt sich in erster Näherung über einen Sequenzvergleich erschließen. Zur Kontrolle kann im vorliegenden, für die biotechnlogische Produktion vorgesehenen Mikroorganismus-Stamm das fragliche Gen inaktiviert und über eine Wiederherstellung des Phänotyps (Rescue) die funktionelle Übereinstimmung der betreffenden Gene überprüft werden. Überführt die parallele Bereitstellung einer erfindungsrelevanten spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD- oder spoIV-Kopie die betreffende Knock-out-Mutante wieder in einen Sporulations-positiven Phänotyp, so wäre damit der Nachweis erbracht, daß auch eine funktionelle Austauschbarkeit der betrachteten Gene besteht. Unter homologen Genen zu den genannten Phase-IV-Sporulationsgenen werden erfindungsgemäß also insbesondere solche verstanden, die einem derartigen „Rescue" zugänglich sind. Wenn das möglich ist, handelt es sich um ein bevorzugt verwendetes Sporulationsgen. Diese Kontrolle ist insbesondere deshalb mit zumutbarem Arbeitsaufwand möglich, weil zum einen erfindungsgemäß eben eine solche funktionell inaktive Mutante erzeugt werden soll und zum anderen über das Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung die betreffenden Sequenzen aus B. subtilis und die besonders bevorzugte davon zusätzlich aus B. licheniformis zur Verfügung gestellt werden, über die ein derartiger Rescue vorgenommen werden kann.

In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die erfindungsgemäße, bisher beschriebene Verwendung zur funktionellen Inaktivierung der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spoIV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, oder 17 oder Teilen davon, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.

Denn wie oben beschrieben können über diese konkreten Sequenzen, insbesondere für B. licheniformis und B. subtilis und nahe mit diesen verwandte Spezies entsprechende molekularbiologische Konstrukte hergestellt werden. Hierfür stehen alle oben zu recA ausgeführten Möglichkeiten zur Verfügung und sind entsprechend bevorzugt.

Einen eigenen Gegenstand der vorliegenden Erfindung stellen die mit den beschriebenen Verfahren erhaltenen Mikroorganismen dar. In seiner allgemeinsten Formulierung handelt es sich dabei also um ein grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem das Gen recA funktionell inaktiviert ist.

Denn wie bereits gesagt sind grampositive Bakterien, beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion von Wertstoffen und/oder ihrer vergleichsweise leichten Fermentierbarkeit die für die Biotechnologie wichtigsten Mikroorganismen. Hierunter werden für die verschiedenen Einsatzgebiete verschiedene Spezies bevorzugt, so werden niedermolekulare Verbindungen wie etwa Aminosäuren in besonders großem Ausmaß mithilfe von Corynebacterien produziert; Bacillus und hierunter insbesondere B. licheniformis wird für die Produktion von extrazellulären Proteinen besonders geschätzt. Sie alle sind erfindungsgemäß einer funktionellen Inaktivierung von RecA zugänglich.

Diese erfindungsgemäßen Bakterien zeichnen sich durch die beschriebenen Rekombinationsdefekte aus und weisen deshalb unter natürlichen Bedingungen, insbesondere in Konkurrenz mit anderen Mikroorganismen Nachteile hinsichtlich ihrer Überlebensfähigkeit auf und eignen sich somit als Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion. Hierbei handelt es sich aus den oben ausgeführten Gründen nicht um Bacillus megaterium.

Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind darunter solche grampositiven Bakterien bevorzugt, bei denen die funktionelle Inaktivierung über Punktmutagenese, teilweise Deletion oder Insertion oder vollständige Deletion des für das vollständige Protein codierenden Bereichs erfolgt ist.

Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind weiterhin darunter solche grampositiven Bakterien bevorzugt, bei denen die funktionelle Inaktivierung über eine erfindungsgemäße für RecA codierende Nukleinsäure beziehungsweise über die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren erfolgt ist. Hierbei sind die Nukleinsäuren den oben beschriebenen Homologiewerten entsprechend bevorzugt. Mikroorganismen, bei denen die funktionelle Inaktivierung mithilfe der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäure beziehungsweise Abschnitten davon erfolgt ist, stellen in dieser Hinsicht die am meisten bevorzugten Mikroorganismen dar. Entsprechend dem oben gesagten sind im Falle einer Mutagenese über Crossing over vorzugsweise Randsequenzen von jeweils mindestens 70 bis 150 bp verwendet worden, was über eine Sequenzierung der betreffenden chromosomalem Abschnitte überprüft werden kann.

Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind weiterhin darunter solche grampositiven Bakterien und hierunter vorzugsweise solche der Gattungen Clostridium oder Bacillus, bevorzugt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind und bei denen gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.

Den bisherigen Ausführungen entsprechend sind weiterhin darunter solche grampositiven Bakterien bevorzugt, bei denen es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spoIV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.

In besonderen Fällen, etwa beim Einsatz hochpathogener Stämme können auch mehrere der genannten Sporulationsgene oder eines oder mehrere der im Stand der Technik beschriebenen Gene oder Gengruppen spoIV/yqfD/Homolog, epr, rp-I, rp-II, isp-1, apr, npr, spoOA, bpr, rsp, mpr, vpr, spoOA, spoII:D, spoIIAC, spo2, spo3, sigE, sigF, spoIIE, spoIISB, sigG, spoIVCB, spoIIIC, nprM und/oder das Gen für die Isopropylmalat-Dehydrogenase (IeuB) funktionell inaktiviert werden. Unter diesen Abkürzungen sind jeweils die in den einleitend genannten Anmeldungen und Publikationen beschriebenen Bedeutungen zu verstehen, wobei eventuelle Synonyme entsprechend eingeschlossen werden.

Den bisherigen Ausführungen entsprechend handelt es sich dabei jedoch bevorzugt jeweils um ein solches grampositives Bakterium, bei dem – neben der RecA-Inaktivierung – genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.

Entsprechend dem oben Gesagten ist weiterhin jeweils ein solches derartiges grampositives Bakterium bevorzugt, bei dem die funktionelle Inaktivierung der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spoIV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe einer der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, oder 17 oder Teilen davon erfolgt ist, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.

Dies läßt sich über Präparationen der betreffenden DNA, beispielsweise der chromosomalen DNA eines erfindungsgemäßen Stamms und Restriktionsanalyse oder PCR überprüfen. Als Primer hierfür können die jeweiligen flankierenden Sequenzen verwendet werden, wobei die Größe des PCR-Produkts Aufschluß über das Vorhandensein und gegebenenfalls die Größe von Inserts gibt.

Entsprechend den bisherigen Ausführungen sind unter den erfindungsgemäßen grampositiven Bakterien besonders solche bevorzugt, bei denen es sich um Vertreter der Gattungen Clostridium oder Bacillus handelt, insbesondere um solche der Spezies Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. globigii, B. clausii oder B. lentus, und ganz besonders um Stämme von B. licheniformis.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen die Verfahren zur Fermentation eines erfindungsgemäßen grampositiven Bakteriums dar.

Denn diese Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß RecA, vorzugsweise im Zusammenspiel mit den dargestellten bevorzugten Ausführungsformen nicht aktiv ist und der betreffende Stamm im Falle einer versehentlichen Freisetzung in die Umgebung der Anlage ein deutlich minimiertes Sicherheitsrisiko darstellt. Für Verfahren zur Fermentation werden entsprechende Sicherheitsanforderungen gestellt, so daß sie gegebenenfalls nur dann durchführbar sind, wenn sie diese Anforderungen erfüllen.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.

Zwar ist es vorteilhaft, wenn entsprechende Stämme auch im Labormaßstab eingesetzt werden. Doch sind hier die übrigen Rahmenbedingungen im allgemeinen leichter zu erfüllen. Außerdem besteht das Haupeinsatzgebiet der Fermentation von Mikroorganismen in der biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen.

Der Bedeutung dieser Wertstoffe entsprechend sind hierunter solche Verfahren bevorzugt, bei denen es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.

Hierunter sind beispielsweise Aminosäuren oder Vitamine zu nennen, die besonders als Nahrungsmittelergänzungsstoffe Verwendung finden. Bei pharmazeutisch relevanten Verbindungen kann es sich um Vor- oder Zwischenstufen zu Medikamenten oder sogar um diese selbst handeln. In all diesen Fällen spricht man auch von Biotransformation, wonach die Stoffwechseleigenschaften der Mikroorganismen ausgenutzt werden, um die ansonsten aufwendige chemische Synthese ganz oder zumindest in einzelnen Schritten zu ersetzen.

In nicht minder bevorzugten Verfahren handelt es sich bei dem Protein um ein Enzym, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.

Industrielle Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung. So dienen α-Amylasen beispielsweise dazu, um das Altbackenwerden von Brot zu verhindern oder um Fruchtsäfte zu klären. Proteasen werden zum Aufschluß von Proteinen verwendet. All diese Enzyme sind für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben, wobei insbesondere die von grampositiven Bakterien bereits natürlicherweise hergestellten Subtilisin-Proteasen einen prominenten Platz einnehmen. Insbesondere in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung der natürlichen Rohstoffe. Ferner können all diese Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren für chemische Reaktionen eingesetzt werden.

Wie einleitend in der Aufgabe formuliert war es erwünscht, ein solches Sicherheitssystem zu finden, das nicht so speziell ist, daß es nicht auch in anderen molekularbiologischen Ansätzen Verwendung finden könnte. Derartige Ansätze können zu einem weiteren eigenständigen Erfindungsgegenstand zusammengefaßt werden.

Das bedeutet allgemein formuliert die Verwendung des oben beschriebenen Faktors RecA in einem molekularbiologischen Reaktionsansatz. Hierfür werden dessen natürlicherweise vorhandenen Aktivitäten ausgenutzt.

Dementsprechend bevorzugt ist die Verwendung zum Stabilisieren einzelsträngiger DNA, insbesondere bei einer DNA-Polymerisation, bei in vitro erfolgenden Rekombinationsvorgängen, oder zum Überführen doppelsträngiger DNA in einzelsträngige DNA oder umgekehrt.

Denn RecA ist ein DNA-einzelstrangbindendes Protein, welches wie erläutert auch eine gewisse Affinität zu doppelsträngiger DNA aufweist. Bei dem natürlichen Prozeß des Crossing over im Zuge der homologen Rekombination kommt diese Funktion zum Tragen. So kann RecA beispielsweise einer PCR oder einer Präparation von Phagen-DNA zugegeben werden, um die Einzelstränge zu stabilisieren. Wenn in vitro Rekombinationsvorgänge nachvollzogen werden, etwa beim Einführen von Mutationen (so auch bei den oben ausgeführten erfindungsgemäßen Mutationen), kann dies von RecA unterstützt werden. Schließlich ist unter dem Überführen doppelsträngiger DNA in einzelsträngige DNA oder umgekehrt eine Gyrase- oder Gyrase-unterstützende Funktion gemeint. Dies kann für die Beeinflussung der DNA-Topologie, etwa bei der Arbeit mit Plasmid-DNA ausgenutzt werden.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Vektoren dar, die eine zuvor beschriebene Nukleinsäure enthalten. Denn auch in dieser Form wird die vorliegende Erfindung verwirklicht. So kann diese DNA in Form von Klonierungsvektoren molekularbiologisch bearbeitet oder gelagert werden.

Vorzugsweise handelt es sich bei einem solchen Vektor um einen Expressionsvektor. Denn dieser kann dazu ausgenutzt werden, um ein erfindungsgemäßes RecA herzustellen und den genannten Anwendungen des Faktors zuzuführen.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen dementsprechend auch Verfahren zur Herstellung eines zuvor beschriebenen Faktors RecA dar.

Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer der oben beschriebenen Nukleinsäuren, insbesondere solchen mit zunehmenden Hologiewerten zur SEQ ID NO. 1 erfolgen, vorzugsweise eines entsprechenden Expressionsvektors und weiter bevorzugt durch Fermentation eines diese Nukleinsäure beziehungsweise diesen Expressionsvektor enthaltenden Wirts.

So wird die vorliegende Erfindung dadurch verwirklicht, daß eine Zelle ein solches Gen in Form einer chromosomalen Kopie erhält und translatiert. Leichter steuerbar erscheint demgegenüber die Bereitstellung dieses Gens in Form eines Plasmids, das gegebenenfalls in mehreren Kopien für die Bildung dieses Faktors sorgt.

Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure zur Expression dieses Faktors dar. Denn entspechend dem oben Gesagten wird dadurch die vorliegende Erfindung zumindest in einem Aspekt verwirklicht.

Vorzugsweise dient das dazu, um diesen Faktor selbst herzustellen, insbesondere in einem oben beschriebenen Verfahren. Alternativ hierzu kann die intrazelluläre Expression auch dazu dienen, um molekularbiologische Aktivitäten der betreffenden Zellen zu modulieren, insbesondere bei in vivo erfolgenden Rekombinationsvorgängen.

Hierbei ist beispielsweise an die Inaktivierung durch einen Antisense- oder RNA-Interferenz-Ansatz gedacht, nach welchem die für RecA codierende mRNA gezielt ausgeschaltet oder nur in einem Teil translatierbar macht. Hierdurch kann die Expression dieses Faktors ganz gezielt moduliert werden. Das gilt sowohl für biotechnologische Produktionsstämme als auch für Laboransätze zum Studium molekularbiologischer Aspekte.

Hierzu gehört schließlich auch eine derartige Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden, oben beschriebenen Nukleinsäure zur Inaktivierung dieses Faktors oder des Gens recA in einem in vitro-Ansatz, insbesondere über Wechselwirkung mit einer zugehörigen Nukleinsäure. Das kann besonders für in-vitro-Transkriptions- oder -Translationsansätze vorteilhaft sein, um Rekombinationsvorgänge zu unterbinden.

Beschreibung der Figuren

1: Aminosäuresequenz-Alignment von SEQ ID NO. 2 mit denen der im Stand der Technik beschriebenen nächstähnlichen Rec-Faktoren.

Dabei bedeuten:

1: Faktor RecA aus B. licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 2)
2: Faktor RecA aus B. amyloliquefaciens (AJ515542 in NCBI)
3: Faktor RecA aus B. subtilis (Z99112 in NCBI; Region 161035 bis 162078)
4: Faktor RecE aus B. subtilis (X52132 in NCBI)

2: Nukleinsäuresequenz-Alignment von SEQ ID NO. 1 mit denen der im Stand der Technik beschriebenen nächstähnlichen rec-Gene.

Dabei bedeuten:

1: Gen recA aus B. licheniformis DSM 13 (SEQ ID NO. 1)
2: Gen recA aus B. amyloliquefaciens (AJ515542 in NCBI)
3: Gen recA aus B. subtilis (Z99112 in NCBI; Region 161035 bis 162078)
4: Gen recE aus B. subtilis (X52132 in NCBI)

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Faktor RecA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens zu 96% identisch ist.
Faktor nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
Faktor RecA, codiert von einer Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
Faktor nach Anspruch 3, codiert von einer Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
Für einen Faktor RecA codierende Nukleinsäure, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens zu 85% identisch ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 6, deren Nukleotidsequenz zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz zunehmend bevorzugt mindestens zu 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder 6, codierend für einen Faktor RecA nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verwendung einer für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure zur funktionellen Inaktivierung des Gens recA in einem grampositiven Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt wird, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt werden, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit den für das Protein codierenden Bereich zumindest teilweise, vorzugsweise vollständig flankieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei es sich um eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7 handelt, beziehungsweise um die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei das grampositive Bakterium, vorzugsweise eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus, natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist und gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spoIV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei die funktionelle Inaktivierung der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spoIV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, oder 17 oder Teilen davon erfolgt, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.
Grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem das Gen recA funktionell inaktiviert ist.
Grampositives Bakterium nach Anspruch 17, wobei die funktionelle Inaktivierung über Punktmutagenese, teilweise Deletion oder Insertion oder vollständige Deletion des für das vollständige Protein codierenden Bereichs erfolgt ist.
Grampositives Bakterium nach Anspruch 17 oder 18, wobei die funktionelle Inaktivierung über eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7 beziehungsweise über die zumindest teilweise nichtcodierenden flankierenden Bereiche zu diesen Nukleinsäuren erfolgt ist.
Grampositives Bakterium nach einem der Ansprüche 17 bis 19, vorzugsweise eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist und bei dem gleichzeitig mit recA ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
Grampositives Bakterium nach Anspruch 20, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von
subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spoIV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
Grampositives Bakterium nach Anspruch 20 oder 21, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
Grampositives Bakterium nach Anspruch 21 oder 22, wobei die funktionelle Inaktivierung der Gene spoIVA, spoIVB, spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA, spoIVFB, yqfD oder spoIV beziehungsweise den hierzu jeweils homologen Genen mithilfe der Sequenzen SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, oder 17 oder Teilen davon erfolgt ist, vorzugsweise mithilfe von Teilen, die mindestens 70 bis 150 zusammenhängende Nukleinsäurepositionen umfassen, besonders bevorzugt mithilfe von zwei solchen Teilen, die einen dazwischenliegenden Teil des Gens umschließen.
Grampositives Bakterium nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei es sich um eines der Gattungen Clostridium oder Bacillus handelt, insbesondere um eines der Spezies Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. globigii, B. clausii oder B. lentus, und ganz besonders um einen Stamm von B. licheniformis.
Verfahren zur Fermentation eines grampositiven Bakteriums nach einem der Ansprüche 17 bis 24.
Verfahren nach Anspruch 25 zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
Verwendung des Faktors RecA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem molekularbiologischen Reaktionsansatz.
Verwendung nach Anspruch 29 zum Stabilisieren einzelsträngiger DNA, insbesondere bei einer DNA-Polymerisation, bei in vitro erfolgenden Rekombinationsvorgängen, oder zum Überführen doppelsträngiger DNA in einzelsträngige DNA oder umgekehrt.
Vektor, enthaltend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7.
Vektor nach Anspruch 31, wobei es sich um einen Expressionsvektor handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Faktors RecA nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verfahren nach Anspruch 33, unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7, vorzugsweise eines Expressionsvektors nach Anspruch 32, weiter bevorzugt durch Fermentation eines diese Nukleinsäure beziehungsweise diesen Expressionsvektor enthaltenden Wirts.
Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure zur Expression dieses Faktors.
Verwendung nach Anspruch 35, um diesen Faktor selbst herzustellen, insbesondere in einem Verfahren nach Anspruch 34, oder um molekularbiologische Aktivitäten der betreffenden Zellen zu modulieren, insbesondere bei in vivo erfolgenden Rekombinationsvorgängen.
Verwendung der für einen Faktor RecA codierenden Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Inaktivierung dieses Faktors oder des Gens recA in einem in vitro-Ansatz, insbesondere über Wechselwirkung mit einer zugehörigen Nukleinsäure.