WO2008006734A2 - Uv-sensitive sicherheitsstämme für die biotechnologische produktion - Google Patents

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WO2008006734A2
WO2008006734A2 PCT/EP2007/056684 EP2007056684W WO2008006734A2 WO 2008006734 A2 WO2008006734 A2 WO 2008006734A2 EP 2007056684 W EP2007056684 W EP 2007056684W WO 2008006734 A2 WO2008006734 A2 WO 2008006734A2
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Susanne Wieland
Friedhelm Meinhardt
Jens Waldeck
Heike Meyer-Rammes
Hannes Nahrstedt
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Henkel Ag & Co. Kgaa
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to methods for increasing the UV sensitivity of certain bacteria, which are thus suitable as safety strains for biotechnological production.
  • the present invention is in the field of biotechnology, in particular the production of recyclables by fermentation of microorganisms which are capable of forming the valuable substances of interest.
  • microorganisms which are capable of forming the valuable substances of interest.
  • These include, for example, the production of low molecular weight compounds, such as food supplements or pharmaceutically relevant compounds, or of proteins, which in turn is due to their diversity, a large technical application.
  • the metabolic properties of the microorganisms in question are utilized and / or modified for the production of valuable substances; in the second case, cells are used which express the genes of the proteins of interest. In both cases, therefore, most of them are genetically modified organisms (GMOs).
  • GMOs genetically modified organisms
  • microorganisms For fermentation of microorganisms is a rich state of the art, in particular for fermentation on an industrial scale; It ranges from the optimization of the relevant strains with regard to the rate of formation and the utilization of nutrients on the technical design of the fermenter to the extraction of recyclables from the cells themselves and / or the fermentation medium.
  • the aim of the present invention is to improve this process with regard to the safety-relevant aspects of the microorganisms used, namely at the level of the genetic properties of the strains considered.
  • the application EP 369817 A1 relates to Bacillus strains, in particular B. subtilis, for the production and secretion of proteins in which the genes for extra- and intracellular proteases, namely epr, rp-1, rp-II, isp-1, apr and / or npr have been functionally inactivated by point mutations or insertions of inactive gene copies.
  • the purpose of these genetic engineering modifications is to minimize the protease activities deleterious to the proteins of interest produced by these strains.
  • the strains concerned may have mutations which prevent sporulation and thus formation of likewise harmful sporulation proteases. Among them is called the spoOA gene active in phase zero of sporulation (see below) of B. subtilis, in order to prevent the sporulation-related formation of intracellular proteases by its inactivation.
  • the application WO 92/16642 A1 pursues the same approach: it discloses that by inactivating the protease genes apr, npr, isp-1, epr, bpr, rsp and mpr of Bacillus eliminates much of the extracellular protease activity, and teaches that this can be further improved by inactivating the newly described gene vpr for the residual protease IM. Again, the possibility of inactivation of spoOA is pointed out to prevent the formation of intracellular proteases.
  • EP 492274 A2 Another approach for the production of "passive" systems of Gram-positive bacteria is their sporulation process.
  • the application EP 492274 A2 reveals that the inactivation of sporulation genes has already been achieved by non-specific mutagenesis in the prior art, whereby asporogenic mutants (spo-minus) EP492274 A2 itself describes a B. subtilis strain treated by targeted mutagenesis in the early sporulation gene spollD which, with a reversion rate of less than 10 -8, is practically unable to form spores.
  • This application teaches to use this strain only after inactivation of the other genes leu (for leucine synthesis), pyrD1 (for uracil synthesis), apr and npr for the production of valuable materials for biotechnological production, because this advantages in the Production and safety aspects are connected.
  • the application WO 97/03185 A1 also deals with the inactivation of the sporulation ability of Bacillus species with the exception of B. subtilis and use of these strains for the biotechnological production of recyclables.
  • the early spollAC gene coding for the sigma factor F is to be functionally inactivated, advantageously in combination with deletions in genes of the also early activated sporulation gene groups spo2, spo3.
  • an irreversible inactivation of the relevant chromosomal sections for spollAC is described.
  • the application WO 02/097064 A1 (EP 1391502 A1) relates to microorganisms in which genes from stages II, III, IV or V of sporulation have been deleted or inactivated. These are the genes sigE, sigF, spollE, spollSB and sigG of B. subtilis, which are located within the locus of spolVCB to spolllC of B. subtilis. This can be estimated on the basis of the database SubtiList (accessible via http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) on the range of positions from approx. 2.642.000 kb to approx. 2.700.000 kb of the now known total genome of B subtilis.
  • SubtiList accessible via http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi
  • This application was based on the task eliminate unnecessary or harmful activities of Bacillus strains to improve biotechnological production.
  • the above-mentioned modifications of the middle to late sporulation genes would suppress spore formation when using the relevant strains for biotechnological production; this has an advantageous effect on the nutrient and energy utilization; At the same time, the duration of the fermentation can be increased in order to increase the overall yield of interesting valuable material.
  • the application WO 2005/095446 A1 relates to the factor RecA from Bacillus licheniformis DSM 13 and the use of the associated gene for the construction of Gram-positive bacterial safety strains for biotechnological production. This use is made by inactivating this gene in the respective strains.
  • These strains, if naturally capable of sporulation, in a specific embodiment of this application have additional functional deletions in phase IV sporulation genes, preferably in the gene spolV (in Bacillus licheniformis), in the gene yqfD (in B. subtilis) and in each homologous gene.
  • inactivating recA a major disadvantage of inactivating recA is that the strains concerned are impaired in their ability to recombine DNA. This impairs the possibilities of further genetically modifying these strains, that is, for example, to introduce transgenes and transcribe them correctly. In addition, they show overall a significantly deteriorated under fermentation conditions compared to the parent strain growth. They are therefore only of limited use for the biotechnological production of valuable substances.
  • a hitherto barely approached way to produce safety strains is the utilization of the UV-induced DNA repair system, which gives the bacteria protection against the DNA-damaging, for example, pyrimidine dimer-inducing UV radiation.
  • UV-induced DNA repair system which gives the bacteria protection against the DNA-damaging, for example, pyrimidine dimer-inducing UV radiation.
  • These include, among others, the gene products UvrA, UvrB, UvrC and others, which are involved in the repair of DNA damage.
  • Bacillus megaterium has an SOS system, which differs from all other systems not only in representatives of the genus Bacillus, but in all previously studied bacteria.
  • megaterium has two functional recA genes, one of which is essential and thus can not be deleted. A mutant without RecA activity is therefore not feasible for B. megaterium. (Nahrstedt H, Schröder C, Meinhardt F; Evidence for two recA genes mediating DNA repair in Bacillus megaterium; Microbiology SGM, Vol. 151, pp. 775-787 (2005)).
  • UV-sensitive mutants of Bacillus megaterium were compared with UV-sensitive mutants of Bacillus subtilis.
  • the disclosed UV-sensitive Bacillus subtilis strains uvrA19 and uvrB109 are each deficient in one of the genes uvrA or uvrB. However, they have neither a functional inactivation of both genes uvrA and uvrB nor the one functional inactivation of one of these genes in combination with another gene.
  • UV-sensitive bacteria whose UV sensitivity is caused by the functional inactivation of a DNA element or DNA segment which does not comprise the genes uvrA and uvrB is likewise not disclosed.
  • a partial aspect of this task is the isolation of a genetic element, possibly a gene, and the amino acid sequence of any encoded factor, in order to make this system suitable for use in production strains, in accordance with molecular biology constructions. especially in combination with one or more further safety regulatory mechanisms.
  • This object is achieved by methods for increasing the UV sensitivity of Gram-positive bacteria which are not Bacillus megaterium, comprising a) a part of the uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB or b) the genes uvrA and uvrB and / or functionally inactivates the gene uvrC of these bacteria or their respective homologs from the respective bacterium,
  • a first embodiment of this method involves the functional inactivation of both genes uvrA and uvrB.
  • a second embodiment involves the functional inactivation of a portion of the uvrBA operon that does not include the genes uvrA and uvrB.
  • a third embodiment involves the functional inactivation of the gene uvrC.
  • Further embodiments of the method according to the invention correspond to the abovementioned first and second embodiments, but in addition, the gene uvrC is additionally functionally inactivated. Instead of the genes mentioned, it is also possible to use the respective homologs from the relevant bacterium.
  • a further solution to the above object is to provide methods for increasing the UV sensitivity of Gram-positive bacteria other than Bacillus megaterium, comprising part of the uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB, and / or the gene uvrC of these bacteria functionally inactivated and additionally functionally inactivates at least one of the genes uvrB and uvrA or their respective homologs from the respective bacterium.
  • nucleic acid regions a) of the bacterial uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB or b) of the genes uvrA and uvrB and / or of the gene uvrC for increasing the UV sensitivity of gram-positive bacteria, which are not Bacillus megaterium.
  • nucleic acid regions of the bacterial uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB, and / or the gene uvrC and additionally provides one or more nucleic acid regions of at least one of
  • the uvrBA operon and / or the gene uvrC serve as the essential components of the UV-induced DNA repair system as starting points for the production of UV-sensitive Gram-positive bacteria.
  • examples of such combinations are shown in Table 1 below, these examples not being meant to be exhaustive.
  • Functionally inactivated genes according to the invention are marked by a cross (X).
  • At least one of the two genes uvrA and uvrB is functionally inactivated in combination with the gene uvrC and / or at least one further part of the uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB.
  • both genes uvrA and uvrB are functionally inactivated.
  • An advantage of the invention over inactivation of the recA gene is that the bacteria are still capable of homologous recombination and thus continue to be genetically modified. Furthermore, this type of sensitization is compatible with other passive systems for producing safety strains, in particular with the simultaneous inactivation of sporulation genes.
  • Gram-positive bacteria are to be understood as meaning those bacteria which, according to the general microbiological understanding, are included, in particular those listed below individually.
  • UV sensitivity is to be understood as impairment of the viability of Gram-positive bacteria under the influence of UV radiation. Basically, all living things are UV-sensitive. According to the invention, a microorganism produced according to the invention is then termed "intensified UV-sensitive" if its UV sensitivity is higher than that of the starting bacterial strain to which the method according to the invention has been applied.This can be verified by qualitative and quantitative tests as described in US Pat the examples of the present application are disclosed.
  • FIG. 4 and SEQ ID NO. Figure 7 shows the DNA segment from the genomic sequence of B. licheniformis DSM13 as described in Veith et al .; 2004; J. Mol. Biotechnol., Vol.
  • Table 2 shows the explanations given in the sequence listing for the individual regions of this DNA segment.
  • the genes csbA, uvrB and uvrA2 which are particularly relevant in connection with the present invention are additionally noted as coding sequences (CDS).
  • CDS coding sequences
  • FIG. 1 Part of this, comprising genes csbA, uvrB and uvrA, is shown in Figure 1 (wild type).
  • the gene csbA has the number RBL05040 as described in the GenBank entry AE017333 for B. licheniformis and codes for CsbA, a probable membrane protein.
  • the genetic element uvrC which can likewise be obtained from Bacillus licheniformis DSM 13, is available in the sequence listing under SEQ ID NO. 1 1 indicated. It includes 1773 positions including stop codon. It codes (box ⁇ 221>: CDS) for the C subunit of UV-labeled exinuclease (box ⁇ 223>: uvrC; exinuclease ABC subunit C).
  • the deduced amino acid sequence of this subunit follows in SEQ ID NO. 12 and includes 590 amino acids.
  • the reduction in UV-induced exinuclease activity constitutes an implementation of the present invention.
  • uvrBA operon is understood to mean all genes, gene regulatory elements and other DNA sequences which are given in SEQ ID NO: 7 for Bacillus licheniformis DSM 13 and in Table 2, even if they consist of more than one Regulation. DNA sequences of other bacteria which are homologous to SEQ ID NO: 7, for example with a functional correspondence to the genes or gene regulatory elements according to SEQ ID NO: 7 or Table 2, are expressly included in this definition. Other genes of the particular bacterium whose functional inactivation results in a functionally attenuated or completely inactivated UV-induced DNA excision repair system, for example due to a diminished or completely inactivated UvrABC excinuclease activity, are included in this definition.
  • the part of the uvrBA operon that forms a unit with regard to its regulation is preferably that contains at least one of the two genes uvrA or uvrB.
  • both genes are adjacent to each other and are regulated together under the control of the same elements. These include, in particular, those shown in SEQ ID NO. 7 elements DinR box (1 1 13 to 1126), (putative) -10 region (1150 to 1155), the ribosome binding sites (776 to 1009 for csbA and 1181 to 1185 for uvrB / uvrA2, respectively) and the terminator (6061 to 6095).
  • operon applies in particular to the range from position about 1 150 to 6095 because it comprises a regulatory unit from the site of ribosome binding to its dissociation. At this point, it is furthermore explicitly stated that there are also upstream or downstream regulatory elements of the DNA sequence coding for subunit C (SEQ ID NO: 11).
  • Inactivation can be effected, for example, by partial or complete deletion of the gene (s) mentioned or else by gene regulatory elements which bring about the expression of these genes (for example by their transcription or translation).
  • the method of deletion established in the prior art results in the fact that the gene product in question can no longer be produced by the modified bacterium. It can be carried out, for example, via homologous recombination with a correspondingly shortened fragment. To control this procedure, a fragment may also be recombined with another function, so that a substitution mutation is de facto carried out.
  • Alternatives to this are partial or complete deletions or substitutions of the associated promoter and point mutations in the gene or in regulatory areas.
  • the latter serve to completely inactivate the gene or to cause only a weakening, that is to say reduction of the gene activity or enzyme reactivity, so that a certain base rate of the relevant activity is retained in the relevant bacterium.
  • the gene in question thus remains active and the derived protein acts as an enzyme but is attenuated so that it is reduced in its effect; it is functionally inactivated according to the invention.
  • flanking genes yvjD, ywkF, gloA the gene for a putative dioxygenase (BIJ03755), yvkN and / or yvIA (see SEQ ID NO.
  • the use of further flanking regions facilitates inactivation via homologous recombination.
  • a uvrC deletion is based on the sequence information from SEQ ID NO. 1 1 possible. All these interventions are in each case according to the invention when an increased UV sensitivity and in particular a reduced uvRABC exinuclease activity compared with the starting strain is achieved in the mutants.
  • Another possibility of inactivation is to inactivate the mRNA derived from the genes concerned via interference with pure complementary RNA. As a result, the genes themselves remain intact, but at the level of gene action, depending on the reaction leads to a partial or even complete functional inactivation. In the case of B.
  • licheniformis since the genes uvrB and uvrA2 are monocistronic and are most likely regulated by the promoter upstream of the uvrB gene, only uvrA2 or both can be selectively eliminated in this way.
  • inactivation constructs based on SEQ ID NO. 7 or 11 itself or the respectively derived amino acid sequence possible.
  • SEQ ID NO. 8 DNA sequences which are useful as primers for isolating the corresponding regions from gene libraries. Their construction can be seen, for example, Example 1 of the present application. Because of the high inter-species homology, it can be assumed that in most cases the oligonucleotides SEQ ID NO. 1 to 6 and / or even the deletion constructs already prepared therewith from B. licheniformis are correspondingly suitable for the deletion of the relevant locus in most other Gram-positive bacteria. As further alternatives, it is possible to resort to the regions coding for the exinucleaseABC of E. coli and to prepare thereon hybridization probes or deletion constructs and apply them to the species in question.
  • the invention is not directed to B. megaterium but to other Bacillus genera, including in particular B. licheniformis, as well as Staphylococcus and Corynebacteria.
  • a preferred embodiment thus forms methods according to the invention, wherein the bacteria introduced into the method are a gram-positive bacterium of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus (not B. megaterium), in particular of the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., and especially B. licheniformis.
  • the invention can be applied in particular to those Bacillus species which are taxonomically known as Bacillus sp. must be designated and have a higher degree of relatedness to B. licheniformis than to B. megaterium.
  • Bacillus sp. must be designated and have a higher degree of relatedness to B. licheniformis than to B. megaterium.
  • B. lentus DSM 5483 Bacillus alcalophilus (DSM 1 1233), Bacillus gibsonii (DSM 14391), Bacillus sp. (DSM 14390), Bacillus sp. (DSM 14392) and Bacillus gibsonii (DSM 14393) deposited with the DSMZ.
  • B. licheniformis specifically B. licheniformis DSM 13.
  • a preferred embodiment form methods according to the invention, wherein one or more of the genes uvrB, uvrA and / or uvrC or the respective Functionally inactivates homologues from the respective bacterium, preferably uvrB and uvrA or the respective homologs from the respective bacterium.
  • uvrA or uvrB alone are never inactivated in this regard, but either both genes uvrA and uvrB or one of the named genes in combination with at least one further gene, for example with uvrC or csbA.
  • Table 1 shows examples of possible combinations of functionally inactivated genes.
  • the examples of this application are based on partial deletions of the genes uvrB and uvrA from B. licheniformis DSM 13. Since the gene product of uvrC forms the third subunit of the exinuclease, its inactivation leads in principle to the same phenotypic image, ie impairment of viability due to increased UV sensitivity.
  • a preferred embodiment forms methods according to the invention, wherein a deletion mutation, a substitution mutation or a point mutation is carried out on one or more of the genes mentioned.
  • the skilled person has numerous options available in the prior art for modifying one or more of the genes mentioned to the extent that the DNA excision repair and thus their overall viability are impaired in the relevant cells. They may relate to the regulatory DNA segments, for example the ribosome binding sites or -10 regions, as described for B.licheniformis DSM 13 in SEQ ID NO. 7 and in similar organization also in other microorganisms, especially others Bacillus species can be found. You can also refer to the coding areas themselves.
  • the advantage of a deletion mutation, in particular of the coding region, is that the gene in question is only read fragmentarily or not at all and the associated gene product occurs only as a corresponding fragment or not at all in the cell.
  • This procedure is illustrated in FIG. 1, according to which a short 5 'region of the gene uvrB can be fused to a short 3' region of the gene uvrA and the intermediate part can be removed. Both gene products are therefore no longer available to the cells in question.
  • the success of this procedure is demonstrated by the examples of the present application using corresponding mutants of B. licheniformis DSM 13.
  • deletion mutation can afford a substitution mutation of a DNA segment.
  • this offers the advantage that an indicator, for example a section coding for an easily detectable gene product, can be introduced. About its verifiability, the success of the procedure can be checked.
  • a point mutation can also lead to inactivation of the gene. This procedure is recommended if the gene product is not completely but only partially inactivated, so that some basic activity of the gene product concerned remains in the cells.
  • a preferred embodiment form methods according to the invention, wherein additionally inactivated recA or its homologues.
  • the factor RecA described for prokaryotes and the gene recA coding for it are well known in molecular biology.
  • This factor binds specifically and cooperatively to single-stranded DNA and provides partial unwinding of double-stranded DNA under ATP hydrolysis. This process allows the genetic process of recombination, that is, the strand exchange between similar DNA molecules. So it is a common practice in molecular biology to use the recA gene in that it is inactivated via a corresponding genetic construct with a defective recA copy and thus a recA-minus phenotype is generated, which is no longer for recombination in the Location is.
  • the factor RecA from Bacillus licheniformis DSM 13 is used together with the corresponding gene recA as SEQ ID NO.
  • WO 2005/095446 A1 2 or SEQ ID NO.1 in WO 2005/095446 A1. These sequences can be used to isolate the homologous genes from other bacteria unless they are already known from the bacterium of interest. According to WO 2005/095446 A1, recA is used inter alia for the construction of Gram-positive bacterial safety strains for biotechnological production by being inactivated in the relevant strains. This significantly reduces the survivability of the strains concerned.
  • the impairments of the UV repair systems involved in the present invention are combined in preferred embodiments with inactivations of the recA gene. These are to be understood in accordance with the above statements both partial and complete inactivations of recA. Particularly preferred are the procedures described in WO 2005/095446 A1.
  • the advantage of such a combination of different-acting safety systems is that the cells in question are sensitive to various environmental influences and their survival rate is further reduced. Furthermore, this reduces the likelihood that due to reverse mutations or horizontal gene transfer, as it might occur in the environment, the safety-relevant mutation is reversed. This is especially true for those mutants in which the recombination itself is impaired by impairment of the RecA factor.
  • a preferred embodiment is inventive method, wherein the introduced into the process bacteria are those bacteria, preferably the genus Bacillus, which are naturally capable of sporulation, and at the same time functionally inactivates a sporulation gene.
  • the impairments of the UV repair system and, where appropriate, of the recombination apparatus can be combined with those of the sporulation capability, in other respects to obtain less viable strains.
  • the additional impairment of sporulation ability the ability of the cells to be impaired or even prevented from developing permanent forms, the so-called spores, under the conditions prevailing in the environment, thereby avoiding possibly only temporary selection pressure.
  • a preferred embodiment are methods according to the invention, wherein the inactivated gene from phase IV of sporulation in the nomenclature of B. subtilis is one of the genes spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD or a gene homologous thereto
  • the inactivated gene from phase IV of sporulation in the nomenclature of B. subtilis is one of the genes spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD or a gene homologous thereto
  • the inactivated gene from phase IV of sporulation in the nomenclature of B. subtilis is one of the genes spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD or a gene homologous thereto
  • yqfD in the case of Bacillus lichen
  • a preferred embodiment is a method according to the invention, wherein one functionally inactivated exactly one gene from the phase IV of sporulation.
  • the present invention is also achieved by the use of one or more nucleic acid regions a) of the bacterial uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB or b) of the genes uvrA and uvrB and / or of the gene uvrC for increasing the UV sensitivity of gram-positive bacteria , which are not Bacillus megaterium, realized.
  • Nucleic acid regions of the bacterial uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB, and / or of the gene uvrC and additionally one or more nucleic acid regions of at least one of the
  • Bacterium for increasing the UV sensitivity of Gram-positive bacteria other than Bacillus megaterium Bacterium for increasing the UV sensitivity of Gram-positive bacteria other than Bacillus megaterium.
  • the uvrBA operon includes, in addition to other genes and the associated regulatory elements, the genes uvrB and uvrA, which may in fact be co-transcribed and translated in B. licheniformis DSM 13 and related species.
  • the associated sequences go together with the regulatory elements of SEQ ID NO. 7 and FIG. 1, respectively.
  • the amino acid sequences for CsbA, UvrB and UvrA disclose SEQ ID NO. 8, 9 and 10, respectively.
  • the sequence information on uvrC discloses SEQ ID NO. 1 1 and 12.
  • this sequence information can be used according to the invention to partially or completely inactivate these genes in Gram-positive bacteria other than Bacillus megaterium.
  • the use is based on the general knowledge such that the relevant sequence information is used directly or after determination of the homologous sequences from the respective bacterial species of interest for biotechnological constructs.
  • such a use according to the invention represents a preferred embodiment, wherein the bacteria introduced into the process are Gram-positive bacteria of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular of the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., and especially B. licheniformis.
  • the bacteria introduced into the process are Gram-positive bacteria of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular of the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B
  • such use according to the invention represents a preferred embodiment, which is one or more nucleic acid regions of one or more of the genes uvrB, uvrA and / or uvrC or the respective homologs from the relevant bacterium, preferably uvrB and uvrA, or from the respective homologs from the respective bacterium.
  • such use according to the invention represents a preferred embodiment, wherein a deletion mutation, a substitution mutation or a point mutation is carried out in one or more of said genes.
  • a preferred embodiment thereof are uses according to the invention wherein a nucleic acid encoding a non-active protein having a point mutation is used.
  • homologous recombination takes place in such M utagenesesch ritten after transformation with the relevant DNA constructs.
  • This requires flanking, matching areas of a certain length, which allows strand exchange. These are suitably at least 70 to 150 nucleic acid positions long.
  • they comprise border sequences of the protein coding region so that the intervening region is deleted or replaced by an inserted element, for example a marker gene.
  • an inserted element for example a marker gene.
  • a further preferred embodiment forms uses according to the invention wherein nucleic acids with a total of two nucleic acid sections are used, which each comprise at least 70 to 150 nucleic acid positions and thus flank a part of the gene or genes.
  • edge regions of the protein-coding regions in question are selected according to this aspect.
  • the flanking areas to uvrC can be taken from generally accessible databases or, for example, via outward, based on SEQ ID NO. 11 designed primers can be obtained from gene banks to the microorganism of interest.
  • a preferred embodiment thereof are uses according to the invention which are one or more nucleic acid regions which are selected from SEQ ID NO. 7 and / or SEQ ID NO. 1 1 or derived from it.
  • SEQ ID NO. 7 among other areas, the coding regions of the genes csbA, uvrB and uvrA, which are particularly suitable for the uses mentioned in which the coding regions are mutated.
  • uvrC which in SEQ ID NO. 11 is shown.
  • these specific sequences may also be used for other species such as Staphylococcus or Corynebacterium, more preferably for other Bacillus species, in particular Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp. and especially for other strains of B. licheniformis.
  • Staphylococcus or Corynebacterium more preferably for other Bacillus species, in particular Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus s
  • the above-mentioned uses can be realized in which the flanking regions are used, in particular in the case of homologous recombination.
  • the uvrBA operon comprises the genes csbA, uvrB and uvrA, the latter two of which are likely to be transcribed and translated together and related species. Since these two code for two subunits of the same enzyme, it makes sense to turn off both at the same time in order to spare the cell superfluous protein synthesis work.
  • other genes or sequences of the uvrBA operon in a broader sense as described above in particular with reference to SEQ ID NO: 7 or Table 2, also be functionally inactivated. Larger deletions simultaneously inactivate several of these genes. For example, it represents embodiments of the present application, large parts of the in SEQ ID NO. 7 area, this complete area or even more spacious To delete sections of the bacterial chromosome, provided that the DNA excision repair is impaired.
  • a preferred embodiment thereof are uses according to the invention wherein one of the oligonucleotides according to SEQ ID NO. 1 to 6 is used, preferably several of them, more preferably in pairwise complement.
  • these primers can be used with the same success also in other species, in particular in Bacillus. Due to the essential importance of the PCR in the described procedure, these primers are preferably used in pairs.
  • the bacteria are those bacteria, preferably of the genus Bacillus, which are naturally capable of sporulation, and at the same time functionally inactivating a sporulation gene;
  • the inactivated gene from phase IV of sporulation in the nomenclature of B. subtilis is one of the genes spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD or a gene homologous thereto , preferably in the case of B. subtilis, by the gene yqfD, in the case of Bacillus licheniformis by the gene spolV and in any other case by a gene homologous thereto, and / or
  • the present invention is also provided by an enhanced UV-sensitive Gram-positive bacterium, which is not Bacillus megaterium, in which a) a part of the uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB or b) the genes uvrA and uvrB and / or the gene uvrC is functionally inactivated realized.
  • a bacterium which is not Bacillus megaterium, in which a part of the uvrBA operon which does not comprise the genes uvrA and uvrB and / or the gene uvrC is functionally inactivated, and additionally at least one of the genes uvrB and uvrA or their respective homologs the functionally inactivated bacterium.
  • intensified UV-sensitive gram-positive bacteria are those which have a higher UV sensitivity than those without the claimed sequence deviation.
  • These may be wild-type strains that differ from other wild-type strains in this respect.
  • these are to be understood as meaning those bacteria which have been obtained by genetic modification of the uvrBA operon and / or the gene uvrC of starting bacteria and can therefore be attributed to a new bacterial strain.
  • Examples thereof are the strains B. licheniformis DSM 13 ⁇ uvrBA and ⁇ spolV / ⁇ uvrBA obtained according to Examples 1 and 2 of the present application.
  • the bacterial strains obtained thereby are when the components of the UV-induced DNA excision repair encoded by said genes are weaker, attenuated or completely inactivated with respect to their function in the cells.
  • Such strains are suitable according to the task as safety strains for biotechnological use, because they have a significantly reduced survival outside the protected laboratory and / or fermentation conditions, especially under the influence of UV radiation. It is a common environmental factor that bacteria are confronted with in the event of an exit from the production plant into the environment.
  • UV irradiation is a common method of sterilization for laboratories and biotechnology plants.
  • Example 5 That they are still suitable as biotechnologically usable production strains, for example for the production of extracellular enzymes, is illustrated by Example 5 and FIG. 3 of the present application.
  • UV-sensitive gram-positive bacteria According to the statements made above, the following UV-sensitive gram-positive bacteria according to the invention correspondingly represent preferred embodiments:
  • Bacterium of the invention which is a Gram-positive bacterium of the genera Staphylococcus, Corynebacteria or Bacillus, in particular of the species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis,
  • B. licheniformis B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., And especially B. licheniformis.
  • Inventive bacterium wherein one or more of the genes uvrB, uvrA and / or uvrC or the respective homologs are functionally inactivated from the respective bacterium, wherein uvrA or uvrB or the respective homologs from the respective bacterium are never inactivated alone.
  • uvrB and uvrA or the respective homologs from the respective bacterium are functionally inactivated.
  • Inventive bacterium wherein the functional inactivation on one or more of said genes via a deletion mutation, a substitution mutation or a point mutation has occurred.
  • Inventive bacterium wherein in addition recA or its homologue is inactivated.
  • a preferred embodiment thereof forms such a bacterium according to the invention, which is naturally capable of sporulation, preferably of the genus Bacillus, in which additionally a gene from the phase IV of sporulation is functionally inactivated.
  • UV-sensitive gram-positive bacteria According to the statements made above, the following UV-sensitive gram-positive bacteria according to the invention correspondingly represent preferred embodiments:
  • Bacterium according to the invention wherein the inactivated gene from phase IV of sporulation in the nomenclature of B. subtilis is one of the genes spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB or yqfD or a gene homologous thereto, preferably in the case of B. subtilis the gene yqfD, in the case of Bacillus licheniformis the gene spolV and in any other case a gene homologous to it.
  • bacterium wherein exactly one gene from the phase IV of sporulation is functionally inactivated.
  • the provision of safety strains was intended to improve biotechnological production. This is done by culturing, that is usually by fermentation of suitable microorganisms.
  • the present invention is thus also realized by methods for culturing, in particular for fermentation of a bacterium described above as being according to the invention.
  • Cultivating means any kind of keeping and / or living preservation of the respective bacteria. These include, for example, the plating on culture media-containing plates or the shaking culture in liquid medium. Biotechnologically relevant products can already be detected in this culture stage (see FIG. 3 B) and optionally even isolated. Biotechnologically much more important, because more productive than the plate or shake culture, is the fermentation. These are understood to mean all processes in which microorganisms are cultivated under controlled conditions, in particular with regard to nutrient and gas supply. As a rule, this happens in so-called fermenters with a capacity of a few milliliters up to many thousands of liters, in which the organisms in question can grow to defined cell densities.
  • the batch culture that is to say the growth up to a maximum value and final harvesting or the continuous culture
  • the batch culture can be distinguished as methods.
  • a constant cell density over a relatively long period of time is set and nutrients or metabolic products and valuable substances are continuously added or removed.
  • These techniques which are familiar to the person skilled in the art, can be designed with regard to the valuable substance of interest, for example, whether it is a secreted compound or a substance which must be isolated from the biomass of the cultured organisms.
  • the microorganism cultured is a Gram-positive bacterium, with the exception of Bacillus megaterium, all of these methods are a functionally attenuated or totally inactivated UV-induced DNA excision repair system based on a modification of the invention of the uvrBA operon and / or of the gene uvrC and thus is to be regarded as an inventive safety strain.
  • a preferred embodiment thereof is a method according to the invention, wherein the low molecular weight compound is a natural substance, a food supplement or a pharmaceutically relevant compound.
  • these include, for example, amino acids or vitamins which are particularly used as food supplements.
  • Pharmaceutically relevant compounds may be precursors or intermediates to or even medications themselves. In all these cases one also speaks of biotransformation, according to which the metabolic properties of the microorganisms are exploited in order to replace the otherwise complex chemical synthesis completely or at least in individual steps.
  • a no less preferred embodiment thereof is a method according to the invention, wherein the protein is an enzyme, in particular one of the group of ⁇ -amylases, proteases, cellulases, lipases, oxidoreductases, peroxidases, laccases, oxidases and hemicellulases.
  • the protein is an enzyme, in particular one of the group of ⁇ -amylases, proteases, cellulases, lipases, oxidoreductases, peroxidases, laccases, oxidases and hemicellulases.
  • Industrial enzymes produced by such processes find use, for example, in the food industry.
  • ⁇ -amylases are used to prevent the staling of bread or to clarify fruit juices.
  • Proteases are used to digest proteins. All of these enzymes are described for use in detergents and cleaning agents, in particular the subtilisin proteases already produced naturally by Gram-positive bacteria occupy a prominent place. Especially in the textile and leather industries, they serve the processing of natural resources. Furthermore, all these enzymes can be used in turn in the sense of biotransformation as catalysts for chemical reactions.
  • the present invention is thus also characterized by the use of at least one, preferably at least two, mutually opposite nucleic acids according to SEQ ID NO. 1 to 6 for amplifying an in vivo enclosed DNA region.
  • genetic inactivation constructs can be obtained with which, in particular, the genes uvrA and uvrB or their homologs can be inactivated in other species, preferably related to B. licheniformis.
  • the control by means of externally in the relevant chromosome portion of binding oligonucleotides, as far as the approaches are successful, constitutes an aspect of the invention.
  • the primer according to SEQ ID NO. 5 and / or 6 are used for functional inactivation of the intermediate region.
  • this is such a use in the context of a method described above according to the invention for producing an intensely UV-sensitive Gram-positive bacterium, which is not Bacillus megaterium.
  • this is such a use in the context of a use of one or more nucleic acid regions described above according to the invention for producing an intensely UV-sensitive Gram-positive bacterium which is not Bacillus megaterium.
  • Genomic DNA from B. licheniformis was used as described in Gärtner et al. (1988), J. Bacteriol., Vol. 170, pages 3102-3109.
  • the strain B. licheniformis DSM13 obtainable via the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig, http://www.dsmz.de) was used.
  • Table 3 Oligonucleotides that are suitable as PCR primers for the inactivation of B. licheniformis uvrBA operon.
  • PCR assays were performed with the primer pair uvrBA_527 (SEQ ID NO: 5) and uvrBA_7771c (SEQ ID NO: 6). They yielded fragments of about 7.7 kb in length for wild-type clones and those of about 3.7 kb for KO clones.
  • DNA from the parent strain and the mutants was hybridized with a DIG-labeled uvrBA PCR sample (obtained via the primers uvrB-Bali1 / uvrA-Bali2).
  • deletion mutants in the Southern analysis with about 3.4 kb showed a fragment smaller by about 3.5 kb than the starting strains with about 6.9 kb. Finally, this result was checked by sequencing. It confirmed that a ⁇ uvrBA deletion mutant had been deduced from a wild-type strain in this manner.
  • a strain of B.licheniformis inactivated with respect to sporulation was also transformed with the said deletion vector and from this a deletion mutant was isolated.
  • This parent strain is described in Nahrstedt et al. (2005), J. Biotechnol., Vol. 119, pages 245 to 254 as ⁇ spolV strain and differs from the wild-type strain of the previous experiment essentially by this deletion.
  • Licheniformis wild type, ⁇ spolV, ⁇ uvrBA and ⁇ spolV / ⁇ uvrBA were in parallel
  • the optical density (OD) at 546 nm and the glucose concentration were determined regularly.
  • OD optical density
  • the cells contained in the aliquots were pelleted at 7,000 g and the supernatants were measured.
  • the determination of the glucose concentration was carried out according to FitzGerald and Vermerris (2005), Biotechnol. Appl. Biochem., Vol. 41, pages 233 to 239, with Accu-Chek Sensor Comfort strips (from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). The protein concentration was determined using a Bradford Assay-based test kit.
  • the protease activity was determined by the hydrolysis of succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (AAPF), which is available from Bachern AG (Weil am Rhein, Germany) as a solution in DMSO and for the test in Test buffer to a final concentration of 1, 1 mM was diluted. The measurements were carried out in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.6) at 25 ° C. The amount of liberated p-nitroaniline was determined at 410 nm (molar absorption coefficient: 8,480 M "1 cm " 1 ). An activity unit is defined as the amount that releases 1 ⁇ mol of p-nitroaniline per minute. The specific activity is the activity per mg protein.
  • AAPF succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide
  • the ⁇ -amylase activity was determined by measuring the release of soluble blue fragments into the supernatant of an insoluble blue polymer over the Phadebas ® Test (Fa. Pharmacia Diagnostics, Freiburg, Germany).
  • Phadebas ® is - tablet in 10 ml distilled water, suspended, and aliquots of 500 ul used to measure 50 ul supernatant. The reaction was stopped by adding 150 ⁇ l of 0.5 M NaOH after 15 min. Controls were treated the same way, but adding the supernatant after stopping the reaction with NaOH.
  • the soluble blue hydrolysis products were separated from the insoluble blue substrate by centrifugation at 14,000g and the absorbance at 620nm was measured against the control.
  • Both the protease and the amylase activities increase with each measurement point and reach their peak towards the end of the fermentation.
  • the measurements of the extracellular enzyme activities likewise show no impairment by the deletions according to the invention.
  • the maximum levels of protease and amylase activities were even observed with one mutant, ⁇ uvrBA.
  • the protease, cellulase and ⁇ -amylase activities of the strains ⁇ polV, ⁇ uvrBA and ⁇ spolV / ⁇ uvrBA were also qualitatively examined in comparison to the wild-type strain.
  • cells were cultured overnight in LB medium and in each case equal amounts of cells were incubated on skim milk, carboxymethylcellulose (cmc) and starch-containing (medium) agar plates at 37 ° C. After 30 hours, the starch-containing plates were overlaid with Lugol's solution and the carboxymethylcellulose-containing plates covered with Congo red and the lysis of all plates determined.
  • FIG. 1 Part of the uvrBA operon comprising the genes csbA, uvrB and uvrA of FIG
  • the respective radiation intensities are given in J / m 2 .
  • the respective survival rate is plotted as a function of the radiation intensity in J / m 2 .
  • Skim milk skim milk-containing minimal medium agar plate for the detection of a protease activity cmc: carboxymethyl cellulose-containing minimal medium agar plate for the detection of a cellulase activity
  • starch starch-containing minimal medium agar plate for the detection of an ⁇ -amylase
  • FIG. 4 The complete uvrBA operon from B. licheniformis DSM13 including neighboring genetic elements; the corresponding DNA sequence is in the reverse reading direction in SEQ ID NO. 7 indicated.

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist die Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht der Spezies Bacillus megaterium angehören, wobei man: a) einen Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) die Gene uvrA und uvrB und/oder das Gen uvrC dieser Bakterien beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert. Die hierdurch erhaltenen Stämme sind besonders UV-sensitiv und damit als Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion geeignet. Diese Inaktivierung läßt sich mit anderen Inaktivierungsmöglichkeiten, insbesondere der Inaktivierung von recA und/oder der Inaktivierung von Sporulationsgenen kombinieren. Ferner werden entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für Teile des bakteriellen uvrBA-Operons und/oder des uvrC-Gens und für die Durchführung der Inaktivierung geeignete Oligonukleotide aufgezeigt, sowie entsprechende Bakterienstämme und damit durchgeführte Fermentationsverfahren.

Description

UV-sensitive Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur die Erhöhung der UV-Sensitivität bestimmter Bakterien, welche sich damit als Sicherheitsstämme für die biotechnologische Produktion eignen.
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen, die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe in der Lage sind. Hierzu zählen beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa von Nahrungsmittelergänzungsstoffen oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen, für welche aufgrund ihrer Diversität wiederum ein großes technisches Einsatzgebiet besteht. Im ersten Fall werden die Stoffwechseleigenschaften der betreffenden Mikroorganismen zur Herstellung der Wertstoffe ausgenutzt und/oder verändert; im zweiten Fall werden Zellen eingesetzt, die die Gene der interessierenden Proteine exprimieren. In beiden Fällen handelt es sich zumeist also um gentechnisch veränderte Organismen (GVO).
Zur Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger stand der Technik, insbesondere auch zur Fermentation im großtechnischen Maßstab; er reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate und der Nährstoffausnutzung über die technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnnung der Wertstoffe aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium. Hierfür kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische und biochemische Ansätze zum Tragen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozeß hinsichtlich der sicherheitsrelevanten Aspekte der eingesetzten Mikroorganismen zu verbessern, und zwar auf der Ebene der genetischen Eigenschaften der betrachteten Stämme.
Dies steht vor dem Hintergrund, dass die Verwendung gentechnisch veränderter Organismen im Allgemeinen strengen gesetzlichen Richtlinien bezüglich der biologischen Sicherheit unterliegt. In den meisten Ländern sind die Betreiber von Anlagen mit GVO gehalten, dafür zu sorgen, dass nach Möglichkeit keine GVO in die Umgebung gelangen. Zusätzlich sollen für die Produktion verwendete GVO Eigenschaften aufweisen, die es ihnen - falls sie doch in die Umgebung gelangen sollten - erschweren oder je nach Gefahrenpotential sogar unmöglich machen sollen, sich dort zu vermehren („Containmenf-Konzept).
Dem Übersichtsartikel „Suicidal genetic elements and their use in biological Containment of bacteria" von S. Molin et al. (Annu. Rev. Microbiol., 1993, Band 47, Seiten 139 bis 166) zufolge wird dabei zwischen den beiden grundsätzlichen Strategien differenziert, als „aktive" Komponenten kontrollierte Suizidsysteme in die Zellen einzuführen oder über „passive" Systeme die Zelleigenschaften so zu verändern, dass ihre Überlebenschancen unter Streßbedingungen sinken. Die zweite, auch für die vorliegende Anmeldung relevante Strategie wird darin auch als „Disablement approach" bezeichnet.
Stämme von GVO mit einem verminderten Risiko für Mensch und Umwelt im Falle einer unbeabsichtigten Freisetzung werden als Sicherheitsstämme bezeichnet. Je nach den grundsätzlichen Eigenschaften der Mikroorganismen werden zunehmend mehrere Eigenschaften gefordert, von denen jede für sich einen Sicherheitsaspekt darstellt. Somit ist es vorteilhaft, verschiedene Instrumente zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen zur Verfügung zu haben. Hiervon sind einige „passive" Systeme bereits im Stand der Technik beschrieben.
So betrifft die Anmeldung EP 369817 A1 Bacillus-Stämme, insbesondere B. subtilis, zur Herstellung und Sekretion von Proteinen, bei denen die Gene für extra- und intrazelluläre Proteasen, nämlich epr, rp-l, rp-ll, isp-1 , apr und/oder npr durch Punktmutationen oder Insertionen inaktiver Genkopien funktionell inaktiviert worden sind. Der Sinn dieser gentechnischen Veränderungen besteht darin, die für die mit diesen Stämmen hergestellten, interessierenden Proteine schädlichen Protease-Aktivitäten zu minimieren. Die betreffenden Stämme können zusätzlich über Mutationen verfügen, die die Sporulation und damit eine Bildung ebenso schädlicher Sporulationsproteasen verhindern. Hierunter wird das in Phase Null der Sporulation (siehe unten) von B. subtilis aktive Gen spoOA genannt, um durch dessen Inaktivierung die mit der Sporulation verbundene Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern.
Die Anmeldung WO 92/16642 A1 verfolgt den gleichen Lösungsansatz: sie offenbart, dass durch Inaktivierung der Proteasegene apr, npr, isp-1 , epr, bpr, rsp und mpr von Bacillus ein Großteil der extrazellulären Protease-Aktivität ausgeschaltet wird, und lehrt, dass dies durch die Inaktivierung des neu beschriebenen Gens vpr für die Rest- Protease IM noch verbessert werden kann. Auch hier wird auf die Möglichkeit der Inaktivierung von spoOA hingewiesen, um die Bildung intrazellulärer Proteasen zu verhindern.
Ein weiterer Ansatzpunkt zur Erzeugung „passiver" Systeme von grampositiven Bakterien ist deren Sporulationsprozeß. So offenbart die Anmeldung EP 492274 A2, dass im Stand der Technik bereits über unspezifische Mutagenese die Inaktivierung von Sporulations- genen gelungen sei, wodurch asporogene Mutanten (spo-Minus-Phänotyp) erhalten worden seien. EP 492274 A2 selbst beschreibt einen durch gezielte Mutagenese in dem frühen Sporulationsgen spollD behandelten B. subtilis-Stamm, der mit einer Reversionsrate von weniger als 10"8 praktisch nicht mehr in der Lage ist, Sporen zu bilden. Diese Anmeldung lehrt, diesen Stamm erst nach Inaktivierung der weiteren Gene leu (für die Leucin-Synthese), pyrD1 (für die Uracil-Synthese), apr und npr für die Herstellung von Wertstoffen für die biotechnologische Produktion zu verwenden, weil hiermit Vorteile in der Produktion sowie Sicherheitsaspekte verbunden seien.
Die Anmeldung WO 97/03185 A1 befaßt sich ebenfalls mit der Inaktivierung der Sporulationsfähigkeit von Bacillus-Spezies mit Ausnahme von B. subtilis und Verwendung dieser Stämme zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen. Dieser Anmeldung zufolge soll das frühe, für den Sigmafaktor F codierende Gen spollAC funktionell inaktiviert werden, vorteilhafterweise in Kombination mit Deletionen in Genen der ebenfalls früh aktivierten Sporulationsgengruppen spo2, spo3. Hierfür wird eine irreversible Inaktivierung der betreffenden chromosomalen Abschnitte für spollAC beschrieben.
Die Anmeldung WO 02/097064 A1 (EP 1391502 A1 ) betrifft Mikroorganismen, bei denen Gene aus den Stadien II, III, IV oder V der Sporulation deletiert oder inaktiviert worden sind. Hierbei handelt es sich um die Gene sigE, sigF, spollE, spollSB und sigG von B. subtilis, die innerhalb des Genorts von spolVCB bis spolllC von B. subtilis liegen. Dieser kann anhand der Datenbank SubtiList (zugänglich über http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi) auf den Bereich der Positionen von ca. 2.642.000 kb bis ca. 2.700.000 kb des inzwischen bekannten Gesamtgenoms von B. subtilis eingegrenzt werden. Dieser Anmeldung hatte die Aufgabe zugrundegelegen, überflüssige oder schädliche Aktivitäten von Bacillus-Stämmen auszuschalten, um die biotechnologische Produktion zu verbessern. Durch die genannten Modifikationen der mittleren bis späten Sporulationsgene würde bei Einsatz der betreffenden Stämme für die biotechnologische Produktion die Sporenbildung unterdrückt; dies wirke sich vorteilhaft auf die Nährstoff- und Energieverwertung aus; gleichzeitig könne die Dauer der Fermentation erhöht werden, um darüber die Gesamtausbeute an interessierendem Wertstoff zu erhöhen.
Die Anmeldung WO 2005/095446 A1 betrifft den Faktor RecA aus Bacillus licheniformis DSM 13 und die Verwendung des zugehörigen Gens zur Konstruktion von grampositiven bakteriellen Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion. Diese Verwendung erfolgt, indem dieses Gen in den betreffenden Stämmen inaktiviert wird. Diese Stämme weisen, sofern sie natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, in einer speziellen Ausführungsform dieser Anmeldung zusätzliche funktionelle Deletionen in Phase-IV- Sporulationsgenen auf, vorzugsweise im Gen spolV (bei Bacillus licheniformis), im Gen yqfD (bei B. subtilis) beziehungsweise in dem hierzu jeweils homologen Gen.
Ein wesentlicher Nachteil der Inaktivierung von recA besteht allerdings darin, dass die betreffenden Stämme hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur DNA-Rekombination beeinträchtigt sind. Dies beeinträchtigt die Möglichkeiten, diese Stämme weiter gentechnisch zu verändern, das heißt beispielsweise Transgene einzubringen und korrekt zur Transkription zu bringen. Darüber hinaus zeigen sie insgesamt ein unter Fermentationsbedingungen gegenüber dem Ausgangsstamm deutlich verschlechtertes Wachstum. Sie eignen sich somit nur eingeschränkt für die biotechnologische Herstellung von Wertstoffen.
Ein bislang kaum beschrittener Weg zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen ist die Ausnutzung des UV-induzierten DNA-Reparatursystems, welches den Bakterien einen Schutz gegen die DNA-schädigende, beispielsweise Pyrimidin-Dimere induzierende UV- Strahlung vermittelt. Dazu gehören bei Bakterien unter anderem die Genprodukte UvrA, UvrB, UvrC und andere, die an der Reparatur der DNA-Schäden beteiligt sind.
Die Publikation „Structural and functional characterization of the Bacillus megaterium uvrBA locus and generation of UV-sensitive mutants" von Nahrstedt und Meinhardt in Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004), Band 65, Seiten 193-199, befasst sich mit diesem System, und zwar anhand von Bacillus megaterium. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die beiden Gene für UvrA und UvrB in diesem Bakterium auf einem Operon liegen und ein Knockout jedes dieser beiden Gene wie auch des kompletten Locus zu UV-sensitiven Stämmen führt. In allen drei Fällen zeigte sich praktisch die gleiche Erhöhung der UV- Sensitivität dieses Stamms. Mit einer Inaktivierung von uvrC befaßt sich diese Arbeit nicht.
Bacillus megaterium verfügt über ein SOS-System, das sich von allen anderen Systemen nicht nur bei Vertretern der Gattung Bacillus, sondern bei allen bislang untersuchten Bakterien unterscheidet. B. megaterium besitzt nämlich zwei funktionelle recA-Gene, von denen eines essentiell ist und daher nicht deletiert werden kann. Eine Mutante ohne RecA-Aktivität ist daher für B. megaterium nicht zu realisieren. (Nahrstedt H, Schröder C, Meinhardt F; Evidence for two recA genes mediating DNA repair in Bacillus megaterium; Microbiology SGM, Band 151, Seiten 775-787 (2005)).
Wegen der besonderen Eigenschaften von Bacillus megaterium wie beispielsweise auch dessen besonderer Größe im Vergleich zu B. subtilis, B. licheniformis oder B. lentus und des geringeren Verwandtschaftsgrads zu anderen biotechnologisch wichtigen Spezies wie Staphylococcus oder Corynebakterien sind daran gewonnene Erkenntnisse bezüglich der UV-induzierten DNA-Reparatur somit nicht ohne weiteres auf andere Mikroorganismen übertragbar.
In der Veröffentlichung von Englih und Vary (Journal of Bacteriology 1986, Seite 155-160) UV-sensitive Mutanten von Bacillus megaterium mit UV-sensitiven Mutanten von Bacillus subtilis verglichen. Die offenbarten UV-sensitiven Bacillus subtilis-Stämme uvrA19 und uvrB109 sind jeweils defizient in einem der Gene uvrA oder uvrB. Sie weisen jedoch weder eine funktionelle Inaktivierung beider Gene uvrA und uvrB auf noch die eine funktionelle Inaktivierung eines dieser Gene in Kombination mit einem weiteren Gen. UV- sensitive Bakterien, deren UV-Sensitivität durch die funktionelle Inaktivierung eines DNA- Elements bzw. DNA-Abschnitts bewirkt ist, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, ist ebenfalls nicht offenbart.
Insgesamt sind inzwischen also zur Herstellung von Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion verschiedene alternative genetische Systeme nach einem „passiven" Wirkmechanismus etabliert. Dabei wird es als vorteilhaft angesehen, über mehrere, unterschiedlich wirkende Systeme zu verfügen, um sie nebeneinander auf einen bestimmten Stamm anzuwenden, damit dieser als besonders sicher eingestuft werden kann.
Es stellte sich somit die Aufgabe, ein weiteres geeignetes Sicherheitssystem für gentechnisch veränderte grampositive Bakterien, insbesondere der Gattungen Bacillus (mit Ausnahme von Bacillus megaterium), Staphylococcus und Corynebakterium zu entwickeln, wofür als Grundlage zunächst geeignete Faktoren und/oder geeignete Gene zu identifizieren waren. Vorteilhafterweise sollte dieses System eine möglichst hohe UV- Sensitivität der veränderten, grampositiven Bakterien bewirken.
Einen Teilaspekt dieser Aufgabe stellte nach Feststellung der grundsätzlichen Eignung eines solchen Systems die Isolierung eines hierfür verwendbaren genetischen Elements, eventuell eines Gens, und der Aminosäuresequenz eines hiervon gegebenenfalls codierten Faktors dar, um dieses System entsprechenden molekularbiologischen Konstruktionen für den Einsatz in Produktionsstämmen zugänglich zu machen, insbesondere in Kombination mit einem oder mehreren weiteren der Sicherheit dienenden Regulationsmechanismen.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, gelöst, wobei man a) einen Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) die Gene uvrA und uvrB und/oder das Gen uvrC dieser Bakterien beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert,
Eine erste Ausführungsform dieses Verfahrens beinhaltet die funktionelle Inaktivierung beider Gene uvrA und uvrB. Eine zweite Ausführungsform beinhaltet die funktionelle Inaktivierung eines Teils des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst. Eine dritte Ausführungsform beinhaltet die funktionelle Inaktivierung des Gens uvrC. Weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen der vorstehend genannten ersten und zweiten Ausführungsform, wobei man allerdings zusätzlich auch das Gen uvrC funktionell inaktiviert. Anstelle der genannten Gene können auch die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium verwendet werden. Eine weitere Lösung der vorstehenden Aufgabe stellen Verfahren dar zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, wobei man einen Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder das Gen uvrC dieser Bakterien funktionell inaktiviert und zusätzlich mindestens eines der Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert.
Weitere Lösungen der vorstehenden Aufgabe sind Verwendungen eines oder mehrerer Nukleinsäurebereiche a) des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) der Gene uvrA und uvrB und/oder des Gens uvrC zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind.
Ebenso stellt die Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäurebereiche des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder des Gens uvrC und zusätzlich einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche aus mindestens einem der
Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweiligen Homologen aus dem betreffenden
Bakterium zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, eine weitere Lösung der Aufgabe dar.
Alle aufgeführten, erfindungsgemäße Verfahren kennzeichnenden Merkmale gelten in gleichermaßen vorteilhafter Weise auch für diese Verwendungen und umgekehrt. Ferner wird die vorliegende Aufgabe durch die auf erfindungsgemäße Weise erzeugten Bakterienstämme gelöst, sowie durch Fermentationsverfahren, die auf diesen Stämmen aufbauen. Des Weiteren werden mit SEQ ID NO. 1 bis 6 Oligonukleotide zur Verfügung gestellt, mit denen erfindungsgemäße Lösungen verwirklicht werden können.
Erfindungsgemäß dienen das uvrBA-Operon und/oder das Gen uvrC als die wesentlichen Komponenten des UV-induzierten DNA-Reparatursystems als Ansatzpunkte zur Erzeugung von UV-sensitiven grampositiven Bakterien. Erfindungsgemäß differenziert wird zwischen denjenigen Teilen bzw. Genen oder Sequenzen des uvrBA-Operons, die nicht die Gene uvrA und uvrB umfassen, und den Genen uvrA und uvrB des uvrBA- Operons. Zusammen mit dem Gen uvrC sind erfindungsgemäße Verfahren, Verwendungen und Bakterien durch Kombinationen von funktionellen Inaktivierungen realisierbar, wie sie vorstehend beschrieben sind. Zur weiteren Erläuterung erfindungsgemäß möglicher Inaktivierungskombinationen sind Beispiele für solche Kombinationen in nachfolgender Tabelle 1 dargestellt, wobei diese Beispiele nicht als abschließende Aufstellung zu verstehen sind. Erfindungsgemäß funktionell inaktivierte Gene sind durch ein Kreuz (X) markiert.
Tabelle 1 : Beispiele für Kombinationen erfindungsgemäßer Geninaktivierungen
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In einer bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist mindestens eines der beiden Gene uvrA und uvrB in Kombination mit dem Gen uvrC und/oder mindestens einem weiteren Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, funktionell inaktiviert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind beide Gene uvrA und uvrB funktionell inaktiviert. Der Erfolg dieses Vorgehens wird mit den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung belegt, wonach UV-sensitive Stämme der Spezies B. licheniformis erhalten worden sind, die sich als Sicherheitsstämme im Sinne des Containment-Konzepts eignen und trotz der vorgenommenen erfindungsgemäßen Modifikation(en) als Produktionsstämme geeignet sind.
Ein Vorteil der Erfindung gegenüber einer Inaktivierung des recA-Gens besteht darin, dass die Bakterien weiterhin zur homologen Rekombination in der Lage und damit weiterhin gentechnisch modifizierbar sind. Des Weiteren ist diese Art der Sensibilisierung mit anderen passiven Systemen zur Erzeugung von Sicherheitsstämmen vereinbar, insbesondere mit der gleichzeitigen Inaktivierung von Sporulationsgenen.
Die einzelnen Arbeitsschritte der erfindungsgemäßen Verfahren sind an sich dem auf dem Gebiet der Biotechnologie arbeitenden Fachmann vertraut. Standardmethoden können beispielsweise dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder „Mikrobiologische Methoden: Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken" von E. Bast (1999) Spektrum, Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, oder vergleichbaren einschlägigen Werken entnommen werden.
Unter grampositiven Bakterien sind diejenigen Bakterien zu verstehen, die nach allgemeinem mikrobiologischen Verständnis dazu gerechnet werden, insbesondere die unten einzeln aufgeführten.
Unter UV-Sensitivität ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung eine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der grampositiven Bakterien unter Einfluss von UV-Strahlung zu verstehen. Grundsätzlich sind alle Lebewesen UV-empfindlich. Ein erfindungsgemäß erzeugter Mikroorganismus wird erfindungsgemäß dann als „verstärkt UV-sensitiv" bezeichnet, wenn seine UV-Sensitivität höher als die des Ausgangsbakterienstamms ist, auf den das erfindungsgemäße Verfahren angewendet worden ist. Dies kann anhand qualitativer und quantitativer Tests überprüft werden, wie sie in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung offenbart sind.
Das uvrBA-Operon ist ein aus mehreren Komponenten bestehendes genetisches Element mit mehreren Genprodukten. Figur 4 und SEQ ID NO. 7 (in umgekehrter Leserichtung zu der Darstellung in Figur 4) zeigen den DNA-Abschnitt aus der genomischen Sequenz von B. licheniformis DSM13, wie sie in Veith et al.; 2004; J. Mol. Biotechnol., Band 7, Seiten 204 bis 21 1 ) und dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) als der die Gene uvrA, insbesondere uvrA2, und uvrB enthaltende Teil offenbart ist. Dieser Stamm ist beispielsweise über die DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de) als DSM13 erhältlich.
In folgender Tabelle 2 sind die im Sequenzprotokoll angegebenen Erläuterungen zu den einzelnen Bereichen dieses DNA-Abschnitts wiedergegeben. Hierunter werden die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besonders relevanten Gene csbA, uvrB und uvrA2 zusätzlich als codierende Sequenzen (CDS) vermerkt. Die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen folgen im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 8, 9 beziehungsweise 10.
Tabelle 2: Genetische Elemente des DNA-Abschnitts gemäß SEQ ID NO. 7
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Ein Teil hieraus, der die Gene csbA, uvrB und uvrA umfasst, ist in Figur 1 (wild type) dargestellt. Das Gen csbA weist gemäß den Angaben im Sequenzprotokoll in dem genannten GenBank-Eintrag AE017333 zu B. licheniformis die Nummer RBL05040 auf und codiert für CsbA, ein vermutliches Membranprotein. Die beiden anderen, ebenfalls aus B. licheniformis erhaltenen Gene codieren für die beiden Untereinheiten A und B der UV-indizierten Exinuclease, die die Excision von Pyrimidin-Dimeren aus der DNA katalysiert.
Das genetische Element uvrC, wie es ebenfalls aus Bacillus licheniformis DSM 13 erhalten werden kann, ist im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 1 angegeben. Es umfaßt einschließlich Stop-Codon 1773 Positionen. Es codiert (Feld <221>: CDS) für die C-Untereinheit der UV-indizierten Exinuclease (Feld <223>: uvrC; exinuclease ABC subunit C). Die abgeleitete Aminosäuresequenz dieser Untereinheit folgt in SEQ ID NO. 12 und umfaßt 590 Aminosäuren.
Wie unten näher erläutert stellt insbesondere die Verringerung der UV-induzierten Exinuclease-Aktivität eine Verwirklichung der vorliegenden Erfindung dar.
Zu diesen Genen gibt es in den meisten anderen Organismen Homologe. So kennt man beispielsweise aus E. coli die gleichwirkende uvrABC-Exinuclease. Insbesondere bei grampositiven Organismen und hierunter ganz besonderes anderen Bacillus-Spezies ist die gleiche genomische Organisation wie in B. licheniformis DSM 13 zu erwarten.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff uvrBA-Operon alle Gene, genregulatorischen Elemente und sonstigen DNA-Sequenzen verstanden, die in SEQ ID NO:7 für Bacillus licheniformis DSM 13 sowie in Tabelle 2 angegeben sind, auch wenn sie aus mehr als einer Regulationseinheit bestehen. Zu SEQ ID NO:7 homologe DNA- Sequenzen anderer Bakterien, beispielsweise mit einer funktionellen Entsprechung zu den Genen oder genregulatorischen Elementen gemäß SEQ ID NO:7 oder Tabelle 2, sind ausdrücklich in diese Definition eingeschlossen. Auch weitere Gene des jeweiligen Bakteriums, deren funktionelle Inaktivierung ein funktionell abgeschwächtes oder völlig inaktiviertes UV-induziertes DNA-Excisions-Reparatursystem, beispielsweise auf Grund einer verminderten oder völlig inaktivierten UvrABC Excinuclease-Aktivität, bedingt, sind in diese Definition mit eingeschlossen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der hinsichtlich seiner Regulation eine Einheit bildende Teil des uvrBA-Operons, der zumindest eines der beiden Gene uvrA oder uvrB enthält. In der Regel und insbesondere bei Bacillus-Spezies liegen beide Gene nebeneinander und werden gemeinsam unter der Kontrolle derselben Elemente reguliert. Hierzu zählen insbesondere die in SEQ ID NO. 7 aufgeführten Elemente DinR-Box (1 1 13 bis 1126), (vermutliche) -10-Region (1150 bis 1155), die Ribosomenbindungsstellen (776 bis 1009 für csbA beziehungsweise 1181 bis 1185 für uvrB/uvrA2) sowie der Terminator (6061 bis 6095). Insbesondere auf den Bereich von Position ca. 1 150 bis 6095 trifft der Begriff Operon zu, weil er vom Ort der Ribosomenbindung bis zu deren Dissoziation eine Regulationseinheit umfasst. An dieser Stelle wird weiterhin explizit darauf hingewisen, dass sich auch stromauf- oder stromabwärts der für die Untereinheit C codierenden DNA-Sequenz (SEQ ID NO. 11 ) Regulationselemente befinden.
Eine Inaktivierung kann beispielsweise durch partielle oder vollständige Deletion des beziehungsweise der genannten Gene oder auch von genregulatorischen Elementen, die die Expression dieser Gene (beispielsweise durch deren Transkription oder Translation) bewirken, erfolgen. Die im Stand der Technik etablierte Methode der Deletion führt dazu, dass das betreffende Genprodukt von dem modifizierten Bakterium nicht mehr hergestellt werden kann. Sie ist beispielsweise über homologe Rekombination mit einem entsprechend verkürzten Fragment durchführbar. Zur Kontrolle dieses Vorgehens kann auch ein Fragement mit einer anderen Funktion hineinrekombiniert werden, so dass de facto eine Substitutionsmutation durchgeführt wird. Alternativen hierzu sind partielle oder vollständige Deletionen beziehungsweise Substitutionen des zugehörigen Promotors und Punktmutationen im Gen oder in regulatorischen Bereichen. Insbesondere letztere dienen dazu, das Gen vollständig zu inaktivieren oder nur eine Schwächung, das heißt Absenkung der Genaktivität oder Enzymreaktivität hervorzurufen, so dass in dem betreffenden Bakterium eine gewisse Grundrate der betreffenden Aktivität erhalten bleibt. Das betreffende Gen bleibt also aktiv und das abgeleitete Protein wirkt als Enzym, jedoch abgeschwächt, so dass es hinsichtlich seiner Wirkung herabgesetzt ist; es ist im Sinne der Erfindung funktionell inaktiviert.
Eine weitere Möglichkeit der Inaktivierung besteht darin, die genannten Gen-Bereiche weiträumig zu deletieren. Hierzu eignet sich insbesondere der weit über csbA, uvrB und uvrA hinausgehende in SEQ ID NO. 7 gezeigte DNA-Abschnitt oder kleinere, uvrB und/oder uvrA umfassende Abschnitte davon. Dadurch können auch weitere Gene, insbesondere die flankierenden Gene yvjD, ywkF, gloA, das Gen für eine vermutliche Dioxygenase (BIJ03755), yvkN und/oder yvIA (vergleiche SEQ ID NO. 7) inaktiviert werden. Die Ausnutzung weiter flankierender Bereiche erleichtert die Inaktivierung über homologe Rekombination. Auf analoge Weise ist eine uvrC-Deletion anhand der Sequenzinformationen aus SEQ ID NO. 1 1 möglich. All diese Eingriffe sind jeweils dann erfindungsgemäß, wenn darüber in den Mutanten eine erhöhte UV-Sensitivität und insbesondere eine gegenüber dem Ausgangsstamm verringerte uvrABC-Exinuclease- Aktivität erreicht wird. Eine weitere Möglichkeit der Inaktivierung besteht darin, über Interferenz mit reiner komplementären RNA die von den betreffenden Genen abgeleitete mRNA zu inaktivieren. Hierdurch bleiben die Gene an sich intakt, aber auf der Ebene der Genwirkung kommt es je nach Reaktionsführung zu einer teilweisen oder sogar vollständigen funktionellen Inaktivierung. Da im Falle von B. licheniformis die Gene uvrB und uvrA2 monocistronisch vorliegen und höchstwahrscheinlich über den vor dem uvrB-Gen gelegenen Promotor reguliert werden, lassen sich auf diese Weise gezielt nur uvrA2 oder beide zusammen ausschalten.
Sollte aus einem bestimmten, für ein erfindungsgemäßes Verfahren vorgesehenen grampositiven Bakterienstamm dieses Operon oder das Gen uvrC beziehungsweise einer der zu deren Inaktivierung verwendbaren DNA-Bereiche nicht bekannt sein, so kann man er mithilfe von Routinemethoden erhalten werden. Dazu gehört beispielsweise die Erstellung einer Genbank und Isolierung desjenigen Bereichs, der über Hybridisierung mit einem uvrB und/oder uvrA beziehungsweise uvrC enthaltenden Teile von SEQ ID NO. 7 beziehungsweisel 1 oder hiervon abgeleiteten Oligonukleotiden identifiziert werden kann.
Alternativ hierzu sind Inaktivierungs-Konstrukte aufgrund von SEQ ID NO. 7 oder 11 selbst oder der jeweils abgeleiteten Aminosäuresequenz möglich. So können aus den Aminosäuresequenzen SEQ ID NO. 8, 9, 10 und 12 rückwärts DNA-Sequenzen abgeleitet werden, die als Primer zur Isolierung der entsprechenden Bereiche aus Genbanken verwendbar sind. Deren Konstruktion kann zum Beispiel Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung entnommen werden. Denn aufgrund der hohen Inter-Spezies-Homologie kann davon ausgegangen werden, dass in den meisten Fällen die Oligonukleotide SEQ ID NO. 1 bis 6 und/oder sogar die damit bereits aus B. licheniformis hergestellten Deletionskonstrukte in entsprechender weise zur Deletion des betreffenden Genorts in den meisten anderen grampositiven Bakterien geeignet sind. Als weitere Alternativen ist es möglich, auf die für die ExinucleaseABC von E. coli codierenden Bereiche zurückzugreifen und hierüber Hybridisierungssonden oder Deletionskonstrukte herzustellen und auf die betreffenden Spezies anzuwenden.
Durch die aufgeführten Modifikationen zur Erhöhung der UV-Sensitivität werden Bakterienstämme erhalten, in deren betroffenen Zellen die DNA-Excisionsreparatur beeinträchtigt oder sogar gänzlich unmöglich ist. Hierdurch werden UV-induzierte DNA- Schäden in Form von Pyrimidin-Dimeren nicht mehr repariert, so dass die betreffenden Zellen innerhalb kurzer Zeit und insbesondere unter UV-Einstrahlung ihre Lebensfähigkeit verlieren. Dies entspricht insofern den einleitend dargestellten Anforderungen an Sicherheitsstämme, als solche Zellen bei Austritt in die Umgebung durch zwangläufig auf sie einwirkende UV-Strahlung abgetötet werden. Solche Bakterienstämme sind in einer natürlichen Umgebung nicht dauerhaft lebensfähig. Dies wird mit den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung belegt.
Die Erfindung ist nicht auf B. megaterium sondern auf andere Bacillus-Gattungen, darunter insbesondere auf B. licheniformis, sowie auf Staphylococcus und Corynebakterien ausgerichtet.
Eine bevorzugte Ausführungsform bilden somit erfindungsgemäße Verfahren, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um ein grampositives Bakterium der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus (nicht B. megaterium) handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.
Hierunter sind diejenigen Gattungen und Spezies zu verstehen, die nach allgemeinem mikrobiologischen Verständnis dazuzurechnen sind. In Zweifelsfällen entscheidet die von der DSMZ (siehe oben) vorgenommene Klassifikation.
Unter den genannten Spezies läßt sich die Erfindung insbesondere auf solche Bacillus- Spezies anwenden, die taxonomisch als Bacillus sp. bezeichnet werden müssen und zu B. licheniformis einen höheren Verwandtschaftsgrad aufweisen als zu B. megaterium. Unter den verwendbaren Stämmen sei auf B. lentus DSM 5483, Bacillus alcalophilus (DSM 1 1233), Bacillus gibsonii (DSM 14391 ), Bacillus sp. (DSM 14390), Bacillus sp. (DSM 14392) und Bacillus gibsonii (DSM 14393) verwiesen, die bei der DSMZ hinterlegt sind. Gemäß den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung läßt sie sich insbesondere anhand von B. licheniformis, konkret B. licheniformis DSM 13 umsetzen.
Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man eines oder mehrere der Gene uvrB, uvrA und/oder uvrC beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert, vorzugsweise uvrB und uvrA beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium.
Im Gegensatz zu mehreren in SEQ ID NO. 7 angegebenen Gensequenzen, für die nur eine hypothetische Funktion besteht (zum Beispiel ywkF) oder die im Stoffwechsel eine Rolle spielen (zum Beispiel gloA) sind die Genprodukte von uvrB, uvrA (in B. licheniformis uvrA2) und uvrC beziehungsweise deren Homologe unmittelbar an der UV-induzierten DNA-Reparatur beteiligt. Also werden erfindungsgemäß vorzugsweise eines oder mehrere dieser Gene, optinonal in Kombination mit weiteren Genen, funktionell inaktiviert. Dadurch wird eine weniger oder sogar völlig inaktive UvrABC-Exinuklease erhalten, so dass in den betreffenden Zellen die DNA-Excisionsreparatur und damit insgesamt ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigt ist. Erfindungsgemäß werden diesbezüglich nie uvrA oder uvrB alleine inaktiviert, sondern entweder beide Gene uvrA und uvrB oder eines der genannten Gene in Komination mit mindestens einem weiteren Gen, beispielsweise mit uvrC oder csbA. Diesbezüglich wird nochmals auf die vorstehende Tabelle 1 verwiesen, die Beispiele für mögliche Kombinationen funktionell inaktivierter Gene zeigt.
Den Erfolg dieses Vorgehens belegen die Beispiele der vorliegenden Anmeldung anhand von partiellen Deletionen der Gene uvrB und uvrA von B. licheniformis DSM 13. Da das Genprodukt von uvrC die dritte Untereinheit der Exinuclease bildet, führt dessen Inaktivierung zu grundsätzlich dem gleichen phänotypischen Bild, das heißt der Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit durch erhöhte UV-Sensitivität.
Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man an einem oder mehreren der genannten Gene eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation durchführt.
Wie oben erläutert stehen dem Fachmann zahlreiche im Stand der Technik etablierte Möglichkeiten zur Verfügung, um erfindungsgemäß eines oder mehrere der genannten Gene soweit zu modifizieren, daß in den betreffenden Zellen die DNA-Excisionsreparatur und damit insgesamt ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigt ist. Sie können die regulatorischen DNA-Abschnitte betreffen, beispielsweise die Ribosomenbindungsstellen oder -10-Regionen, wie sie für B. licheniformis DSM 13 in SEQ ID NO. 7 dargestellt sind und in ähnlicher Organisation auch in anderen Mikroorganismen, insbesondere anderen Bacillus-Spezies zu finden sind. Sie können auch die codierenden Bereiche selbst betreffen.
Der Vorteil einer Deletionsmutation, insbesondere des codierenden Bereichs, besteht darin, dass das betreffende Gen nur bruchstückhaft oder überhaupt nicht abgelesen wird und das zugehörige Genprodukt nur als entsprechendes Fragment oder überhaupt nicht in der Zelle auftritt. Dieses Vorgehen illustriert Figur 1 , wonach ein kurzer 5'-Bereich des Gens uvrB mit einem kurzen 3'-Bereich des Gens uvrA fusioniert und der dazwischenliegende Teil entfernt werden kann. Beide Genprodukte stehen den betreffenden Zellen damit nicht mehr zur Verfügung. Den Erfolg dieses Vorgehens demonstrieren die Beispiele zur vorliegenden Anmeldung anhand entsprechender Mutanten von B. licheniformis DSM 13.
Dasselbe wie eine Deletionsmutation kann eine Substitutionsmutation eines DNA- Abschnitts leisten. Zusätzlich bietet diese den Vorteil, dass darüber ein Indikator, etwa ein für ein leicht nachweisbares Genprodukt codierender Abschnitt, eingebracht kann. Über dessen Nachweisbarkeit kann der Erfolg des Vorgehens überprüft werden.
Auch eine Punktmutation kann zu einer Inaktivierung des Gens führen. Dieses Vorgehen ist dann empfehlenswert, wenn das Genprodukt nicht vollständig sondern nur teilweise inaktiviert werden soll, so dass eine gewisse Basisaktivität des betreffenden Genprodukts weiterhin in den Zellen vorhanden bleibt.
Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert.
Der für Prokaryonten beschriebene Faktor RecA und das hierfür codierende Gen recA sind in der Molekularbiologie sehr bekannt. Dieser Faktor bindet spezifisch und kooperativ an einzelsträngige DNA und sorgt unter ATP-Hydrolyse für eine teilweise Entwindung doppelsträngiger DNA. Dieser Vorgang ermöglicht den genetischen Vorgang der Rekombination, das heißt den Strangaustausch zwischen ähnlichen DNA-Molekülen. So ist es in der Molekularbiologie ein übliches Vorgehen, das recA-Gen dadurch zu verwenden, dass es über ein entsprechendes genetisches Konstrukt mit einer defekten recA-Kopie inaktiviert und somit ein recA-Minus-Phänotyp erzeugt wird, welcher nicht mehr zur Rekombination in der Lage ist. Der Faktor RecA aus Bacillus licheniformis DSM 13 wird zusammen mit dem zugehörigen Gen recA als SEQ ID NO. 2 beziehungsweise SEQ ID NO.1 in WO 2005/095446 A1 offenbart. Diese Sequenzen können dazu verwendet werden, um die homologen Gene aus anderen Bakterien zu isolieren, sofern sie aus dem interessierenden Bakterium nicht schon bekannt sind. Gemäß WO 2005/095446 A1 wird recA unter anderem zur Konstruktion von grampositiven bakteriellen Sicherheitsstämmen für die biotechnologische Produktion eingesetzt, indem es in den betreffenden Stämmen inaktiviert wird. Dadurch wird die Überlebensfähigkeit der betreffenden Stämme beträchtlich herabgesetzt.
Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorgenommenen Beeinträchtigungen der an der UV-Reparatur beteiligten Systeme werden in bevorzugten Ausführungsformen mit Inaktivierungen des Gens recA kombiniert. Hierunter sind entsprechend den oben gemachten Ausführungen sowohl teilweise als auch vollständige Inaktivierungen von recA zu verstehen. Besonders bevorzugt sind diejeingen Vorgehensweisen, die in WO 2005/095446 A1 beschrieben sind. Der Vorteil solch einer Kombination unterschiedlich wirkender Sicherheitssysteme besteht darin, dass die betreffenden Zellen gegenüber verschiedenen Umwelteinflüssen empfindlich werden und ihre Überlebensrate weiter verringert wird. Des Weiteren sinkt dadurch die Wahrscheinlichkeit, dass aufgrund von Rückmutationen oder horizontalem Gentransfer, wie er in der Umgebung stattfinden könnte, die sicherheitsrelevante Mutation wieder rückgängig gemacht wird. Dies trifft insbesondere auf solche Mutanten zu, in denen über Beeinträchtigung des Faktors RecA die Rekombination selbst beeinträchtigt ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um solche Bakterien, vorzugsweise der Gattung Bacillus, handelt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, und man gleichzeitig ein Sporulations-Gen funktionell inaktiviert.
Die grundsätzliche Möglichkeit, Sicherheitsstämme über die Beeinträchtigung der Sporulationsfähigkeit zu erzeugen, ist im Stand der Technik beschrieben. Hierzu sei auf die Darstellungen in WO 2005/095446 A1 verwiesen. Erfindungsgemäß lassen sich die Beeinträchtigungen des UV-Reparatursystems und gegebenenfalls des Rekombinationsapparats mit denen der Sporulationsfähigkeit kombinieren, um in weiterer Hinsicht weniger überlebensfähige Stämme zu erhalten. Im Falle der zusätzlichen Beeinträchtigung der Sporulationsfähigkeit wird die Fähigkeit der Zellen beeinträchtigt oder sogar ganz unterbunden, unter den in der Umgebung herrschenden Bedingungen Dauerformen, die sogenannten Sporen, zu entwickeln und dadurch dem möglicherweise nur vorübergehenden Selektionsdruck zu entgehen.
Der Erfolg des Vorgehens, Sporulations-Gene funktionell zu inaktivieren, geht aus der Anmeldung WO 2005/095446 A1 hervor. Dort werden auch geeignete gentechnische Konstrukte offenbart, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung mit erfindungsgemäßen Verfahren zur Beinträchtigung des UV-Reparatursystems kombiniert werden können.
Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
Hierzu sei insbesondere auf die Darstellungen in WO 2005/095446 A1 verwiesen, wonach gerade diese Beeinträchtigungen in einem vergleichweise späten Stadium der Sporulation besonders erfolgreich zur Herstellung von Sicherheitsstämmen eingesetzt werden können. Denn damit stehen die Genprodukte der früheren Sporulationsphasen den betreffenden Mikroorganimen weiterhin zur Verfügung. Das ist dann vorteilhaft, wenn sie im üblichen Stoffwechsel ebenfalls eine Rolle spielen.
Eine bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verfahren, wobei man genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert.
Wie in WO 2005/095446 A1 diskutiert ist es vorteilhaft, das Ziel der Unterbindung der Sporulation ab Phase IV mit möglichst wenig Arbeitsschritten zu erreichen, um die Konstruktion geeigneter Stämme mit möglichst geringem Arbeitsaufwand zu verbinden. Das gilt insbesondere für die hier angegebene Ausführungsform, wonach ohnehin mindestens eine Modifikation im UV-Reparatursystem erfolgen muß. Die vorliegende Erfindung wird auch durch die Verwendung eines oder mehrerer Nukleinsäurebereiche a) des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) der Gene uvrA und uvrB und/oder des Gens uvrC zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind., verwirklicht.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung eines oder mehrerer
Nukleinsäurebereiche des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder des Gens uvrC und zusätzlich einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche aus mindestens einem der
Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweiligen Homologen aus dem betreffenden
Bakterium zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, dar.
Wie oben erläutert umfaßt das uvrBA-Operon neben weiteren Genen und den zugehörigen regulatorischen Elementen die Gene uvrB und uvrA, welche bei B. licheniformis DSM 13 und verwandten Spezies tatsächlich gemeinsam transkribiert und translatiert werden dürften. Die zugehörigen Sequenzen gehen zusammen mit den regulatorischen Elementen aus SEQ ID NO. 7 beziehungsweise Figur 1 hervor. Die Aminosäuresequenzen für CsbA, UvrB und UvrA offenbaren SEQ ID NO. 8, 9 beziehungsweise 10. Die Sequenzinformationen zu uvrC offenbaren SEQ ID NO. 1 1 und 12.
Insbesondere diese Sequenzinformationen können erfindungsgemäß dazu genutzt werden, um diese Gene in grampositiven Bakterium außer Bacillus megaterium teilweise oder vollständig zu inaktivieren. Die Verwendung gestaltet sich unter Rückgriff auf das allgemeine Fachwissen so, dass die betreffenden Sequenzinformationen unmittelbar oder nach Ermittlung der homologen Sequenzen aus den jeweils interessierenden Bakterien- Spezies für biotechnologische Konstrukte genutzt werden. Wie in Beispiel 1 illustriert, können beispielsweise Deletionskonstrukte hergestellt werden, die über Rekombination in die betreffenden Zellen eingeschleust werden und über homologe Rekombination zu einer Inaktivierung der betreffenden Gene führen. Dieses Vorgehen ist an sich dem Fachmann bekannt. Die oben bereits gemachten Ausführungen gelten entsprechend. Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellt solch eine erfindungsgemäße Verwendung eine bevorzugte Ausführungsform dar, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um grampositive Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellt solch eine erfindungsgemäße Verwendung eine bevorzugte Ausführungsform dar, wobei es sich um einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche aus einem oder mehreren der Gene uvrB, uvrA und/oder uvrC beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium handelt, vorzugsweise aus uvrB und uvrA, beziehungsweise aus den jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellt solch eine erfindungsgemäße Verwendung eine bevorzugte Ausführungsform dar, wobei in einem oder mehreren der genannten Gene eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation durchgeführt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.
So ist es über die Arbeitsschritte (1.) Isolierung des Gens, (2.) ortsgerichtete Mutagenese, beisielsweise über einen Mismatch-Primer, (3.) Transformation des mutierten Gens und (4.) homologe Rekombination in das bakterielle Chromosom vergleichsweise einfach möglich, die oben als erfindungswesentlich dargestellten Gene zu mutieren. Das Vorgehen über Einführen einer Punktmutation ist sehr zielgerichtet. Auf diese Weise können auch Mutanten erhalten werden, in denen die betreffenden Genprodukte nicht vollständig inaktiv sondern in ihrer Reaktivität lediglich herabgesetzt worden sind. Das ist dann sinnvoll, wenn eine gewisse Basisaktivität erhalten bleiben soll. Das ist auch dann empfehlenswert, wenn das mutagenisierte Genprodukt in vivo beispielsweise über Wechselwirkung mit einem anderen Faktor eine weitere Funktion ausübt, die durch geschickte Auswahl der erfindungsgemäßen Punktmutation aufrechterhalten bleibt. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt wird, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.
Denn wie oben erläutert findet bei derartigen M utagenesesch ritten nach Transformation mit den betreffenden DNA-Konstrukten homologe Rekombination statt. Diese erfordert flankierende, übereinstimmende Bereiche einer gewissen Länge, die den Strangaustausch ermöglicht. Diese sind geeigneterweise jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen lang.
Zweckmäßigerweise umfassen sie Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs, so dass der dazwischenliegende Bereich deletiert beziehungsweise durch ein eingefügtes Element, beispielsweise ein Markergen ersetzt wird. Hierdurch kommt es in der Regel nur noch zur Transkription und Translation kleiner N-terminaler Proeinbereiche, die in vivo praktisch keine Funktion mehr ausüben.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt werden, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit einen Teil des Gens oder der Gene flankieren.
Als Alternative zum vorherigen Ansatz werden diesem Aspekt zufolge Randbereiche der betreffenden proteincodierenden Bereiche ausgewählt. Hierfür stehen beispielsweise über SEQ ID NO. 7 entsprechend große Abschnitte zur Verfügung. Die zu uvrC flankierenden Bereiche können allgemein zugänglichen Datenbanken entnommen werden oder beispielsweise über nach außen gerichtete, anhand von SEQ ID NO. 11 entworfene Primer aus Genbanken zum interessierenden Mikroorganimus erhalten werden.
Der Vorteil dieses Vorgehens besteht darin, dass von den jeweils umschlossenen, zu inaktivierenden Genabschnitten überhaupt kein abgeleitetes Genprodukt mehr erhalten wird. Die erfindungsgemäße Verringerung der UV-Excisisions-Reparatur kommt somit einem vollständigen Ausschalten gleich. Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei es sich um einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche handelt, die aus SEQ ID NO. 7 und/oder SEQ ID NO. 1 1 stammen oder davon abgeleitet sind.
So offenbart SEQ ID NO. 7 neben weiteren Bereichen die codierenden Bereiche der Gene csbA, uvrB und uvrA, welche sich insbesondere für die genannten Verwendungen eignen, in denen die codierenden Bereiche mutiert werden. Entsprechendes gilt für uvrC, welches in SEQ ID NO. 11 gezeigt ist. Diese Sequenzen sind insbesondere auf B. licheniformis-Spezies anwendbar, da sie aus einem solchen erhalten worden sind. Zudem ist der Erfolg dieses Vorgehens durch die Beispiele zur vorliegenden Anmeldung belegt. Aufgrund der hohen Interspezies-Homologie bei lebenswichtigen Genen, die in SEQ ID N0:7 offenbart sind, können diese konkreten Sequenzen auch für andere Spezies verwendet werden, wie etwa Staphylococcus oder Corynebakterium, zunehmend bevorzugt für weitere Bacillus-Spezies, insbesondere für Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp. und ganz besonders für andere Stämme von B. licheniformis.
Zusätzlich gehen aus SEQ ID NO. 7 die flankierenden Bereiche zu diesen Genen von B. licheniformis hervor beziehungsweise können anhand von SEQ ID NO. 11 nach Standardmethoden erhalten werden. Darüber sind die genannten Verwendungen realisierbar, bei denen auf die flankierenden Regionen zurückgegriffen wird, insbesondere bei homologer Rekombination.
Wie oben erläutert umfasst das uvrBA-Operon die Gene csbA, uvrB und uvrA wobei die beiden letzteren bei und verwandten Spezies gemeinsam transkribiert und translatiert werden dürften. Da diese beiden für zwei Untereinheiten desselben Enzyms codieren, ist es sinnvoll, beide gleichzeitig auszuschalten, um der Zelle überflüssige Protein- Synthesearbeit zu ersparen. Optional können weitere Gene oder Sequenzen des uvrBA- Operons im weiteren Sinne, wie vorstehend insbesondere anhand von SEQ ID N0:7 oder Tabelle 2 beschrieben, ebenfalls funktionell inaktiviert werden. Durch weiträumigere Deletionen werden mehrere dieser Gene gleichzeitig inaktiviert. So stellt es beispielsweise Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung dar, große Teile des in SEQ ID NO. 7 gezeigten Bereichs, diesen kompletten Bereich oder noch weiträumigere Abschnitte des Baktereinchromosoms zu deletieren, sofern dadurch die DNA- Excisionsreparatur beeinträchtigt wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bilden erfindungsgemäße Verwendungen, wobei eines der Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6 verwendet wird, vorzugsweise mehrere davon, besonders bevorzugt in paarweiser Ergänzung.
Dieses Vorgehen ist im Zuge der mit der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Beispiele angewendet worden. Das demnach erfolgreiche Vorgehen, bei dem die in SEQ ID NO. 1 bis 4 aufgeführten Oligonukleotide zum Einsatz kamen, ist zusätzlich in Figur 1 dargestellt. Mit Hilfe dieser Primer konnten PCR Konstrukte hergestellt werden, die weite Bereiche der Gene uvrA und uvrB umfassen und wie in Beispiel 1 beschrieben zu deren weitgehender Deletion verwendet wurden. Der Erfolg dieses Vorgehens wurde mit dem Primerpaar gemäß SEQ ID NO. 5 und 6 überprüft. Als Variation dieses Vorgehens ist es auch möglich, SEQ ID NO. 5 anstelle von SEQ ID NO. 1 und/oder SEQ ID NO. 6 anstelle von SEQ ID NO. 4 einzusetzen und dadurch Bereiche zu amplifizieren, die die Randsequenzen der betreffenden Gene umfassen. Als weitere Alternative kann mit Hilfe des Primerpaars gemäß SEQ ID NO. 5 und 6 ein größerer Bereich aus dem Genom amplifiziert werden, das dadurch erhaltene Produkt weiter mutiert und über homologe Rekombination wieder den betreffenden Zellen zugeführt werden.
Wegen der hohen Interspezies-Homologien (siehe oben), insbesondere innerhalb der Gattung Bacillus ist zu erwarten, dass diese Primer mit dem gleichen Erfolg auch bei anderen Spezies, insbesondere bei Bacillus eingesetzt werden können. Aufgrund der wesentlichen Bedeutung, die bei bei den geschilderten Vorgehen der PCR zukommt, werden diese Primer vorzugsweise paarweise eingesetzt.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellen folgende erfindungsgemäße Verwendungen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dar:
• Erfindungsgemäße Verwendung, wobei zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert wird;
• Erfindungsgemäße Verwendung, wobei wobei es sich bei den Bakterien um solche Bakterien, vorzugsweise der Gattung Bacillus, handelt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, und gleichzeitig ein Sporulations-Gen funktionell inaktiviert wird; • hierunter eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen, und/oder
• wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.
Die vorliegende Erfindung wird auch durch ein verstärkt UV-sensitives grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem a) ein Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) die Gene uvrA und uvrB und/oder das Gen uvrC funktionell inaktiviert ist, verwirklicht.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein verstärkt UV-sensitives grampositives
Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem ein Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder das Gen uvrC funktionell inaktiviert ist, und zusätzlich mindestens eines der Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert ist.
Unter verstärkt UV-sensitiven grampositiven Bakterien sind im Sinne der vorliegenden Erfindung solche zu verstehen, die eine höhere UV-Sensitivität als diejenigen ohne die anspruchsgemäße Sequenzabweichung besitzen. Hierbei kann es sich um Wildtyp- Stämme handeln, die sich diesbezüglich von anderen Wildtypstämmen unterschieden. Insbesondere sind darunter solche Bakterien zu verstehen, die durch gentechnische Modifizierung des uvrBA-Operons und/oder des Gens uvrC von Ausgangsbakterien erhalten worden sind und insofern einem neuen Bakterienstamm zugerechnet werden können. Beispiele hierfür sind die Gemäß Beispiel 1 und 2 der vorliegenden Anmeldung erhaltenen Stämme B. licheniformis DSM 13 ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA.
Zu den hierfür dem Fachmann zur Verfügung stehenden Möglichkeiten sei auf Routinemethoden wir die Isolierung von Mikroorganismen aus einem natürlichen Habitat, auf die bisherigen Ausführungen und auf die Beipiele der vorliegenden Anmeldung verwiesen. Erfindungsgemäß sind die dadurch erhaltenen Bakterienstämme dann, wenn die von den genannen Genen codierten Bestandteile der UV-induzierten DNA-Excisions- Reparatur hinsichtlich ihrer in den Zellen ausgeübten Funktion schwächer, abgeschwächt oder vollständig inaktiviert sind. Solche Stämme sind gemäß der gestellten Aufgabe als Sicherheitsstämme für den biotechnologischen Einsatz geeigent, weil sie außerhalb der geschützen Labor- und/oder Fermentationsbedingungen, insbesondere unter Einwirken von UV-Strahlung eine deutlich verringerte Überlebensrate besitzen. Dabei handelt es sich um einen üblichen Umweltfaktor, mit dem Bakterien bei einem eventuellen Austritt aus der Produktionsanlage in die Umgebung konfrontiert sind. Zudem stellt die UV- Bestrahlung eine übliche Sterilisierungsmethode für Labors und biotechnologische Produktionsstätten dar.
Die erhöhte UV-Sensitivität erfindungsgemäßer Stämme belegen Beispiel 3 und Figur 2 der vorliegenden Anmeldung.
Dass sie sich dennoch als biotechnologisch verwendbare Produktionsstämme, etwa zur Herstellung von extrazellulären Enzymen eignen, belegen Beispiel 5 und Figur 3 der vorliegenden Anmeldung.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellen folgende erfindungsgemäßen UV-sensitiven grampositiven Bakterien entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dar:
• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei es sich um ein grampositives Bakterium der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis,
B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.
• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei eines oder mehrere der Gene uvrB, uvrA und/oder uvrC beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert sind, wobei uvrA oder uvrB beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium nie alleinig inaktiviert sind. Vorzugsweise sind uvrB und uvrA beziehungsweise die jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert.
• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei die funktionelle Inaktivierung an einem oder mehreren der genannten Gene über eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation erfolgt ist. • Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform hiervon bildet solch ein erfindungsgemäßes Bakterium, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist, vorzugsweise eines der Gattung Bacillus, bei dem zusätzlich ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
Die Vorteile auch dieser Ausführungsform ergeben sich aus den bisherigen Ausführungen.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen stellen folgende erfindungsgemäßen UV-sensitiven grampositiven Bakterien entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dar:
• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
• Erfindungsgemäßes Bakterium, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
Gemäß der gestellten Aufgabe sollte durch Bereitstellung von Sicherheitsstämmen die biotechnologische Produktion verbessert werden. Diese erfolgt durch Kultivieren, das heißt in der Regel durch Fermentation hierfür geeigneter Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung wird somit auch durch Verfahren zur Kultivierung, insbesondere zur Fermentation eines oben als erfindungsgemäß beschriebenen Bakteriums verwirklicht.
Unter Kultivieren ist jede Art von Aufbewahren und/oder Lebenderhaltung der betreffenden Bakterien zu verstehen. Dazu gehören beispielsweise das Ausplattieren auf Nährmedien-haltigen Platten oder die Schüttelkultur in Flüssigmedium. Bereits in diesem Kulturstadium können biotechnologisch relevante Produkte detektiert (siehe Figur 3 B) und gegebenenfalls sogar isoliert werden. Biotechnologisch wesentlich bedeutsamer, weil ertragreicher als die Platten- oder Schüttelkultur, ist die Fermentation. Hierunter werden alle Verfahren verstanden, bei denen Mikroorganimen unter kontrollierten Bedingungen - insbesondere hinsichtlich der Nährstoff- und Gasversorgung -kultiviert werden. In der Regel geschieht dies in sogenannten Fermentern mit Fassungsvermögen von einigen Millilitern bis hin zu vielen tausend Litern, in denen die betreffenden Organismen zu definierten Zelldichten heranwachsen können. Hierbei können als Verfahrensweisen insbesondere die Batch- Kultur, das heißt das Anwachsen bis zu einem Maximalwert und abschließendes Abernten oder die kontinuierliche Kultur unterschieden werden. Bei letzterer wird eine über einen längeren Zeitraum konstante Zelldichte eingestellt und Nährstoffe beziehungsweise Stoffwechselprodukte sowie Wertstoffe kontinuierlich zu- beziehungsweise abgeführt. Diese dem Fachmann an sich vertrauten Techniken sind hinsichtlich des interessierenden Wertstoffs ausgestaltbar, beispielsweise ob es sich um eine sekretierte Verbindung handelt oder um einen Stoff, der aus der Biomasse der kultivierten Organismen isoliert werden muß.
Erfindungsgemäß sind all diese Verfahren dann, wenn es sich bei dem in Kultur genommenen Mikroorganimus um ein grampositives Bakterium, mit Ausnahme von Bacillus megaterium, handelt, das ein funktionell abgeschwächtes oder völlig inaktiviertes UV-induziertes DNA-Excisions-Reparatursystem auf der Grundlage einer erfindungsgemäßen Modifizierung des uvrBA-Operons und/oder des Gens uvrC besitzt und somit als erfindungsgemäßer Sicherheitsstamm anzusehen ist.
Bevorzugt ist darunter ein Verfahren zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
Denn dieses sind die wirtschaftlich bedeutendsten Anwendungsgebiete der biotechnologischen Produktion.
Eine bevorzugte Ausführungsform davon ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt. Hierunter sind beispielsweise Aminosäuren oder Vitamine zu nennen, die besonders als Nahrungsmittelergänzungsstoffe Verwendung finden. Bei pharmazeutisch relevanten Verbindungen kann es sich um Vor- oder Zwischenstufen zu Medikamenten oder sogar um diese selbst handeln. In all diesen Fällen spricht man auch von Biotransformation, wonach die Stoffwechseleigenschaften der Mikroorganismen ausgenutzt werden, um die ansonsten aufwendige chemische Synthese ganz oder zumindest in einzelnen Schritten zu ersetzen.
Eine nicht minder bevorzugte Ausführungsform davon ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
Industrielle Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung. So dienen α-Amylasen beispielsweise dazu, um das Altbackenwerden von Brot zu verhindern oder um Fruchtsäfte zu klären. Proteasen werden zum Aufschluß von Proteinen verwendet. All diese Enzyme sind für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln beschrieben, wobei insbesondere die von grampositiven Bakterien bereits natürlicherweise hergestellten Subtilisin-Proteasen einen prominenten Platz einnehmen. Insbesondere in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung der natürlichen Rohstoffe. Ferner können all diese Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren für chemische Reaktionen eingesetzt werden.
Wie oben erläutert und durch die Beispiele 1 und 2 belegt ist, konnte die gestellte Aufgabe letztlich dadurch gelöst werden, dass die in den genannten Beispielen beschriebenen und zum Teil in Figur 1 eingezeichneten Oligonukleotide zur Amplifizierung des in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs verwendet wurden. Hierauf bauen die bisher beschriebenen Erfindungsaspekte auf.
Die vorliegende Erfindung wird somit auch durch die Verwendung mindestens einer, vorzugsweise von mindestens zwei einander entgegenorientierten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6 zur Amplifizierung eines in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs verwirklicht. Wie oben erläutert lassen sich darüber genetische Inaktivierungskonstrukte erhalten, mit denen insbesondere die Gene uvrA und uvrB beziehungsweise deren Homologe in anderen, vorzugsweise zu B. licheniformis verwandten Spezies inaktiviert werden können. Auch die Kontrolle mithilfe weiter außen im betreffenden Chromosomenabschnitt bindender Oligonukleotide, inwiefern die betreffenden Ansätze erfolgreich sind, stellt einen Aspekt der Erfindung dar. Ferner können auch die Primer gemäß SEQ ID NO. 5 und/oder 6 zur funktionellen Inaktivierung des dazwischenliegenden Bereich verwendet werden.
Sofern auf diese Weise hinsichtlich der UV-induzierten DNA-Excisions-Reparatur beeinträchtigte grampositive Bakterien (mit Ausnahme von Bacillus megaterium) erhalten werden, handelt es sich um erfindungsgemäße Verwendungen einer oder mehrerer Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um eine solche Verwendung im Rahmen eines oben als erfindungsgemäß beschriebenen Verfahrens zur Erzeugung eines verstärkt UV-sensitiven grampositiven Bakteriums, welches nicht Bacillus megaterium ist.
In einer ebenso bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um eine solche Verwendung im Rahmen einer oben als erfindungsgemäß beschriebenen Verwendung einer oder mehrerer Nukleinsäurebereiche zur Erzeugung eines verstärkt UV-sensitiven grampositiven Bakteriums, welches nicht Bacillus megaterium ist.
In einer ebenso bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um eine solche Verwendung im Rahmen einer oben als erfindungsgemäß beschriebenen Verwendung zur Erzeugung eines Bakteriums wie er oben als erfindungsgemäß beschrieben worden ist. Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder „Mikrobiologische Methoden: Eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken" von E. Bast (1999) Spektrum, Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Inaktivierung der uvrBA-Region von B. licheniformis
Genomische DNA aus B. licheniformis wurde wie in Gärtner et al. (1988), J. Bacteriol., Band 170, Seiten 3102 bis 3109 beschrieben, isoliert. Hierfür wurde der über die DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig; http://www.dsmz.de) erhältliche Stamm B. licheniformis DSM13 verwendet.
Basierend auf der genomischen Sequenz von B. licheniformis DSM13 (Veith et al.; 2004; J. Mol. Biotechnol., Band 7, Seiten 204 bis 211 ) und dem Eintrag AE017333 (Basen 1 bis 4.222.645) in der Datenbank GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; Stand 2.12.2004) wurden die in folgender Tabelle 3 zusammengestellten sechs Oligonukleotide als Primer entworfen.
Tabelle 3: Oligonukleotide, die sich als PCR-Primer für die Inaktivierung des uvrBA- Operons von B. licheniformis eignen.
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Um eine uvrBA-Deletion zu erzielen, die sowohl uvrA als auch uvrB beeinträchtigt, wurden ausgehend von der chromosomalen B. licheniformis-DNA zwei PCR-Produkte hergestellt: Eine Flanke wurde mit dem Primerpaar uvrB-Bali1/uvrB-Bali2 und die andere mit dem Primerpaar uvrA-Bali1/uvrA-Bali2 amplifiziert (siehe Figur 1 ). Diese beiden Fragmente wurden unter Ausnutzung der Hincll-Schnittstellen hintereineinander in den E. coli- Klonierungsvektor pUCBM21 (Boehringer Mannheim, Deutschland) zwischenkloniert, wordurch eine uvrBA-Deletionskassette erhalten wurde. Diese wurde anschließend in die Pstl-Schnittstelle des E. coli/Bacillus-Shuttlevektors pSKE194 (Nahrstedt et al.; 2005; J. Biotechnol., Band 1 19, Seiten 245 bis 254) ligiert, wodurch der Vektor pSKE194uvrBA erhalten wurde.
Nach Restriktion dieses Vektors mit Xbal wurde das den Bacillus-Origin, das Erythromycin-Resistenzgen und die uvrBA-Deletionskassette enthaltende Fragment religiert, wodurch der Deletionsvektor pΔuvrBA erhalten wurde. Dieser wurde als Knock- Out-Vektor in einen B. licheniformis-Wildtypstamm transformiert, und zwar über PEG- vermittelte Protoplasten-Transformation, entsprechend Chang, Cohen (1979), Mol. Gen. Genet, Band 168, Seiten 11 1 bis 1 15.
Die Selektion erfolgte bei Inkubation in Kulturmedium mit 5 μg Erythromycin ml"1 bei 30°C. Anschließend wurden Klone mit integriertem Vektor dadurch indentifiziert, dass sie bei 0,3 μg Erythromycin ml"1 und der nicht-permissiven Temperatur von 42°C Wachstum zeigten, nicht aber mehr bei 5 μg/ml"1 Erythromycin und 42°C. Die selektierten, dann bei 42°C und ohne Antibiotikum angezogenen Klone wurden über PCR auf Deletionen getestet.
Diese PCR-Untersuchungen erfolgten mit dem Primer-Paar uvrBA_527 (SEQ ID NO. 5) und uvrBA_7771c (SEQ ID NO. 6). Sie lieferten für Wildtyp-Klone Fragmente mit ca. 7,7 kb Länge und für KO-Klone solche mit ca. 3,7 kb. Zur weiteren Überprüfung der chromosomalen Organisation der uvrBA-Region wurde DNA aus dem Ausgangsstämmen und den Mutanten mit einer DIG-markierten uvrBA- PCR-Probe hybridisiert (erhalten über die Primer uvrB-Bali1/uvrA-Bali2). Erwartungsgemäß zeigten die Deletionsmutanten in der Southern-Analyse mit ca. 3,4 kb ein um ca. 3,5 kb kleineres Fragment als die Ausgangsstämme mit ca. 6,9 kb. Schließlich wurde dieses Ergebnis noch anhand einer Sequenzierung überprüft. Sie bestätigte, dass auf diese Weise aus einem Wildtypstamm eine ΔuvrBA-Deletionsmutante abgeleitet worden war.
Beispiel 2
Inaktivierung der uvrBA-Region eines hinsichtlich der Sporulation defizienten B. licheniformis-Stammes
Parallel zu dem Vorgehen gemäß Beispiel 1 wurde auch ein hinsichtlich der Sporulation inaktivierter Stamm von B. licheniformis mit dem genannten Deletionsvektor transformiert und hieraus eine Deletionsmutante isoliert. Dieser Ausgangsstamm ist in Nahrstedt et al. (2005), J. Biotechnol., Band 119, Seiten 245 bis 254 als ΔspolV-Stamm beschrieben und unterschiedet sich von dem Wildtypstamm des vorangegangenen Versuchs im wesentlichen durch diese Deletion.
Wie über die Beispiel 1 entsprechenden Untersuchungen und entsprechend der genannten Publikation zu ΔspolV eine zusätzliche Kontroll-PCR hinsichtlich der Deletion des Sporulationsgens gezeigt wurde, wurde dadurch ein B. licheniformis ΔspolV/ΔuvrBA erhalten. Dieser war auch nicht mehr zur Sporulation befähigt.
Beispiel 3
Untersuchung der UV-Sensitivität der Mutanten ΔspolV, ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA in
Vergleich zum Wildtypstamm
Zellen der vier in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Stämme
B. licheniformis Wildtyp, ΔspolV, ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA wurden in parallelen
Ansätzen in Minimalmedium bis zur mittleren exponentiellen Phase kultiviert und Verdünnungen dieser Kulturen in 15 mM NaCI-Lösung auf LB-Medium-Platten aufgebracht.
Für eine qualitative Untersuchung wurden diese Platten mit O, 2, 4, 6, 8, 10 beziehungsweise 20 J/m2 UV-Licht bestrahlt und über Nacht im Dunkeln inkubiert. Eine Hälfte der Agarplatte ist dabei zur Kontrolle während der Bestrahlung mit Plexiglas abgedeckt worden. Das Ergebnis ist in Figur 2 (A) dargestellt: Während der Wildtyp und die ΔspolV-Mutante praktisch keine Beeinträchtigung ihres Zellwachstums zeigten, wurde durch die uvrBA-Deletion eine deutliche Sensitivität hervorgerufen. Diese ist überraschenderweise bei der Doppelmutante noch stärker ausgeprägt.
Zur quantitativen Auswertungs dieses Versuchs wurden die jeweils erhaltenen Koloniezahlen in Relation zu der bei 0 J/m2 (100%) gesetzt. Das Ergebnis ist in Figur 2 (B) dargestellt. Demnach sind die ΔuvrBA- und die ΔspolV/ΔuvrBA-Doppelmutante meßbar in ihrer Überlebensrate beeinträchtigt. So reichte eine Strahlungsintensität von 10 J/m2, um alle Zellen von ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA abzutöten, während 24,6% und 34,6% der Wildtyp- beziehungsweise ΔspolV-Zellen nach derselben UV-Dosis überlebten.
Zur Kontrolle war auch eine gemäß WO 2005/095446 A1 hergestellte recA- Deletionsmutante getestet worden, die eine mittlere Überlebensrate zeigte.
Beispiel 4
Wachstumskurven und extrazelluläre Enzymaktivitäten der Mutanten ΔspolV, ΔuvrBA und
ΔspolV/ΔuvrBA in Vergleich zum Wildtypstamm
Zellen der vier in den vorangegangenen Beispielen beschriebenen Stämme B. licheniformis Wildtyp, ΔspolV, ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA wurden in einem Minimai- Medium (100 ml M9-Lösung, 10 ml Glucose (20% w/v), 10 ml MgSO4 100 mM, 2 ml Casaminoacids (10% w/v), 1 ml CaCI2 100 mM, 1 ml Hefeextrakt (10% w/v), 100 μl MnSO4 (2mg/ml); destilliertem Wasser ad 1 I, pH 7,4; M9-Lösung: 60 g Na2HPO4, 30 g KH2PO4, 10 g NH4CI, 5 g NaCI, destilliertem Wasser ad 1 I, pH7,4), das als einzige C- Quelle 2 g/l Glucose enthielt, für 48 h bei 37°C in einem 100 ml-Batch-Fermenter kultiviert. Hierbei wurden regelmäßig die optische Dichte (OD) bei 546 nm und die Glucosekonzentration bestimmt. Gleichzeitig wurden nach 6, 9, 12, 24, 30, 36 und 48 h Aliquots aus den Überständen entnommen und darin die Protease- und die α- Amylaseaktivität bestimmt. Hierfür wurden in den Aliquots die enthaltenen Zellen bei 7.000 g pelletiert und die Überstände vermessen.
Die Bestimmung der Glucosekonzentration erfolgte gemäß FitzGerald und Vermerris (2005), Biotechnol. Appl. Biochem., Band 41 , Seiten 233 bis 239, mit Accu-Chek Sensor Comfort strips (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Die Proteinkonzentration wurde mithilfe eines auf der Bradford-Bestimmungsmethode beruhenden Test-Kits bestimmt.
Die Proteaseaktivität wurde über die Hydrolyse von Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid (AAPF), ermittelt, welches von der Firma Bachern AG (Weil am Rhein, Germany) als Lösung in DMSO erhältlich ist und für den Test in Testpuffer auf eine Endkonzentration von 1 ,1 mM verdünnt worden war. Die Messungen wurden in 0,1 M Tris-HCI (pH 8.6) bei 25°C durchgeführt. Die Menge an freigesetztem p-Nitroanilin wurde bei 410 nm bestimmt (molarer Absorptionskoeffizient: 8.480 M"1 cm"1). Eine Aktivitätseinheit ist als die Menge definiert, die 1 μmol p-Nitroanilin pro Minute freisetzt. Die spezifische Aktivität ist die Aktivität pro mg Protein.
Die α-Amylaseaktivität wurde über den Phadebas® Test (Fa. Pharmacia Diagnostics, Freiburg, Germany) durch Messung der Freisetzung löslicher blauer Fragmente in den Überstand aus einem unlöslichen blauen Polymer bestimmt. Dafür wird eine Phadebas®- Tablette in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert und Aliquots von jeweils 500 μl zur Messung von 50 μl Überstand verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 μl 0.5 M NaOH nach 15 min beendet. Kontrollen wurden auf die gleiche Weise behandelt, allerdings unter Zugabe des Überstands nach Abstoppen der Reaktion mit NaOH. Die löslichen blauen Hydrolyseprodukte wurden vom unlöslichen blauen Substrat durch Zentrifugation bei 14.000 g abgetrennt und die Absorption bei 620 nm gegen die Kontrolle gemessen.
Diese Untersuchungen erfolgten nacheinander an drei identisch durchgeführten Meßreihen; die jeweiligen arithmetischen Mittelwerte sind in Figur 3 (A) dargestellt.
Anhand der Messungen der optischen Dichte bei 546 nm erkennt man, dass alle Stämme über ein praktisch gleiches Wachstumsverhalten verfügen. Es zeigten sich keine Beeinträchtigungen durch den Verbrauch der Glucose als einziger C-Quelle nach jeweils ca. 8 h. Daraus kann man schließen, dass die Deletionsmutanten gegenüber dem jeweiligen Ausgangsstamm praktisch keine signifikanten Nachteile besitzen. Auch bei vorangegangenen Untersuchungen zum Wachstum auf Agarplatten mit LB-Medium und auf Minimalmedium, das mit Glucose supplementiert war, hatten sie keine Beeinträchtigungen gezeigt.
Sowohl die Protease- als auch die Amylase-Aktivitäten nehmen mit jedem Meßpunkt zu und erreichen gegen Ende der Fermentation ihren Höhepunkt. Die Messungen der extrazellulären Enzymaktivitäten zeigen ebenfalls keine Beeinträchtigung durch die erfindungsgemäßen Deletionen. Die Maximalwerte der Protease- wie der Amylase- Aktivitäten wurden sogar bei einer Mutante, nämlich ΔuvrBA beobachtet.
Beispiel 5
Extrazelluläre Enzymaktivitäten der Mutanten ΔspolV, ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA in
Vergleich zum Wildtypstamm
Die Protease-, Cellulase- und α-Amylase-Aktivitäten der Stämme ΔspolV, ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA wurden auch qualitativ in Vergleich zum Wildtypstamm untersucht. Hierfür wurden Zellen über Nacht in LB-Medium kultiviert und jeweils gleiche Zellmengen auf Magermilch- (skim milk), Carboxymethylcellulose- (cmc) und Stärke-haltigen (starch) Minimalmedium-Agarplatten bei 37°C inkubiert. Nach 30 h wurden die Stärke-haltigen Platten mit Lugolscher Lösung und die Carboxymethylcellulose-haltigen Platten mit Kongorot überschichtet und die Lysehöfe aller Platten ermittelt.
Das Ergebnis ist in Figur 3 (B) dargestellt. Alle Stämme zeigten qualitativ dieselben Ergebnisse, nämlich je Substrat ungefähr gleichgroße Lysehöfe. Somit haben die Deletionsmutanten trotz der genetischen Modifikationen alle drei gemessenen Enzymaktivitäten, einschließlich des zugehörigen Detektions- und Sekretionsapparats beibehalten und sind somit weiterhin als Produktionsstämme für extrazelluläre Enzyme geeignet. Dieses Ergebnis bestätigte sich in einer Wiederholung des Versuchs auf entsprechend supplementierten LB-Agarplatten. Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Teil des uvrBA-Operons, der die Gene csbA, uvrB und uvrA umfasst, von
B. licheniformis
Schematische Darstellung der für uvrBA codierenden Bereiche der Wildtyp- Region (wild type) und der in Beispiel 1 beschriebenen Deletionsmutante (ΔuvrBA). Offene Leseraster (open reading frames; ORF) sind als Pfeile dargestellt; die Positionen der PCR-Primer zur Erzeugung der Deletionsmutanten sind als kleine Dreiecke angezeigt. Die zugehörige DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO. 7 angegeben; die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für CsbA, UvrB und UvrA2 in SEQ ID NO. 8, 9 beziehungsweise 10.
Figur 2 (A): Qualitative Untersuchung der UV-Sensitivität der B. licheniformis-Mutanten ΔspolV (1.1 ), ΔuvrBA (1.10) und ΔspolV/ΔuvrBA (1.11 ) in Vergleich zum Wildtypstamm (1 ) gemäß Beispiel 3.
In der Kopfzeile sind die jeweiligen Strahlungsintensitäten in J/m2 angegeben.
Figur 2 (B): Quantitative Untersuchung der UV-Sensitivität der B. licheniformis- Mutanten ΔspolV, ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA in Vergleich zum Wildtypstamm gemäß Beispiel 3 und zu einer recA-Deletionsmutante. Aufgetragen ist die jeweilige Überlebensrate in Abhängigkeit von der Strahlungsintensität in J/m2.
Dabei bedeuten: schwarze Rauten (♦): B. licheniformis Wildtyp schwarze Quadrate (■) B. licheniformis ΔspolV schwarze Dreiecke (A): B. licheniformis ΔrecA (gemäß WO 2005/095446 A1 ) weiße Rauten (0): B. licheniformis ΔuvrBA weiße Quadrate (D): B. licheniformis ΔspolV/ΔuvrBA
Figur 3 (A): Wachstumskurven der Mutanten ΔspolV, ΔuvrBA und ΔspolV/ΔuvrBA in
Vergleich zum Wildtypstamm gemäß Beispiel 4. Dabei bedeuten: durchgezogene Linien: Zelldichte (Optische Dichte bei 546 nm) gepunktete Linien: Glucose-Konzentration kurz-gestrichelte Linien: Protease-Aktivität lang-gestrichelte Linien: α-Amylase-Aktivität schwarze Rauten (♦): B. licheniformis Wildtyp schwarze Punkte (•): B. licheniformis ΔspolV weiße Rauten (0): B. licheniformis ΔuvrBA weiße Kreise (o): B. licheniformis ΔspolV/ΔuvrBA
Figur 3 (B): Qualitativer Nachweis der Enzymaktivitäten der B. licheniformis-Mutanten ΔspolV (1.1 ), ΔuvrBA (1.10) und ΔspolV/ΔuvrBA (1.11 ) in Vergleich zum Wildtypstamm (1 ) gemäß Beispiel 5.
Dabei bedeuten: skim milk: Magermilch-haltige Minimalmedium-Agarplatte zum Nachweis einer Protease-Aktivität cmc: Carboxymethylcellulose-haltige Minimalmedium-Agarplatte zum Nachweis einer Cellulase-Aktivität starch: Stärke-haltige Minimalmedium-Agarplatte zum Nachweis einer α-Amylase-
Aktivität
Figur 4: Das komplette uvrBA-Operon aus B. licheniformis DSM13 einschließlich benachbarter genetischer Elemente; die zugehörige DNA-Sequenz ist in umgekehrter Leserichtung in SEQ ID NO. 7 angegeben.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, wobei man a) einen Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) die Gene uvrA und uvrB und/oder das Gen uvrC dieser Bakterien beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert.
2. Verfahren zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind, wobei man einen Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder das Gen uvrC dieser Bakterien funktionell inaktiviert und zusätzlich mindestens eines der Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um grampositive Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis,
B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei man an einem oder mehreren der genannten Gene eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation durchführt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei man zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um solche Bakterien, vorzugsweise der Gattung Bacillus, handelt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, und man gleichzeitig ein Sporulations-Gen funktionell inaktiviert.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spolVFA, spolVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei man genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert.
9. Verwendung eines oder mehrerer Nukleinsäurebereiche a) des bakteriellen uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) der Gene uvrA und uvrB und/oder des Gens uvrC zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind.
10. Verwendung eines oder mehrerer Nukleinsäurebereiche des bakteriellen uvrBA- Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder des Gens uvrC und zusätzlich einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche aus mindestens einem der Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweiligen Homologen aus dem betreffenden Bakterium zur Erhöhung der UV-Sensitivität grampositiver Bakterien, welche nicht Bacillus megaterium sind.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei es sich bei den in das Verfahren eingebrachten Bakterien um grampositive Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis,
B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , wobei in einem oder mehreren der genannten Gene eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation durchgeführt wird.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei eine für ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation eingesetzt wird.
14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei eine Nukleinsäure mit einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt wird, vorzugsweise umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassenden Randsequenzen des für das Protein codierenden Bereichs.
15. Verwendung nach Anspruch 12, wobei Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten eingesetzt werden, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen umfassen und damit einen Teil des Gens oder der Gene flankieren.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei es sich um einen oder mehrere Nukleinsäurebereiche handelt, die aus SEQ ID NO. 7 und/oder SEQ ID NO. 1 1 stammen oder davon abgeleitet sind.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei eines der Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6 verwendet wird, vorzugsweise mehrere davon, besonders bevorzugt in paarweiser Ergänzung.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 17, wobei zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert wird.
19. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei es sich bei den Bakterien um solche Bakterien, vorzugsweise der Gattung Bacillus, handelt, die natürlicherweise zur Sporulation befähigt sind, und gleichzeitig ein Sporulations-Gen funktionell inaktiviert wird.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spoIVFA, spoIVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert wird.
22. Verstärkt UV-sensitives grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem a) ein Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst oder b) die Gene uvrA und uvrB und/oder das Gen uvrC funktionell inaktiviert ist.
23. Verstärkt UV-sensitives grampositives Bakterium, welches nicht Bacillus megaterium ist, bei dem ein Teil des uvrBA-Operons, der nicht die Gene uvrA und uvrB umfasst, und/oder das Gen uvrC funktionell inaktiviert ist, und zusätzlich mindestens eines der Gene uvrB und uvrA beziehungsweise deren jeweilige Homologe aus dem betreffenden Bakterium funktionell inaktiviert ist.
24. Bakterium nach Anspruch 22 oder 23, wobei es sich um ein grampositives Bakterium der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterien oder Bacillus handelt, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum,
Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. globigii, B. lentus, B. alcalophilus, B. gibsonii, B. pumilus, Bacillus sp., und ganz besonders um B. licheniformis.
25. Bakterium nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die funktionelle Inaktivierung an einem oder mehreren der genannten Gene über eine Deletionsmutation, eine Substitutionsmutation oder eine Punktmutation erfolgt ist.
26. Bakterium nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei zusätzlich recA beziehungsweise dessen Homologes inaktiviert ist.
27. Bakterium nach einem der Ansprüche 22 bis 26, das natürlicherweise zur Sporulation befähigt ist, vorzugsweise eines der Gattung Bacillus, bei dem zusätzlich ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
28. Bakterium nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem inaktivierten Gen aus der Phase IV der Sporulation in der Nomenklatur von B. subtilis um eines der Gene spolVA, spoIVB, spolVCA, spolVCB, spolVFA, spolVFB oder yqfD beziehungsweise um ein hierzu homologes Gen handelt, vorzugsweise im Fall von B. subtilis um das Gen yqfD, im Fall von Bacillus licheniformis um das Gen spolV und in jedem anderen Fall um ein hierzu homologes Gen.
29. Bakterium nach Anspruch 27 oder 28, wobei genau ein Gen aus der Phase IV der Sporulation funktionell inaktiviert ist.
30. Verfahren zur Kultivierung, insbesondere zur Fermentation eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 22 bis 29.
31. Verfahren nach Anspruch 30 zur Herstellung eines Wertstoffs, insbesondere einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
32. Verfahren nach Anspruch 31 , wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch relevante Verbindung handelt.
33. Verfahren nach Anspruch 31 , wobei es sich bei dem Protein um ein Enzym handelt, insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
34. Verwendung mindestens einer, vorzugsweise von mindestens zwei einander entgegenorientierten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO. 1 bis 6 zur Amplifizierung eines in vivo davon umschlossenen DNA-Bereichs.
35. Verwendung nach Anspruch 34 im Rahmen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
36. Verwendung nach Anspruch 34 im Rahmen einer Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 21.
37. Verwendung nach Anspruch 34 zur Erzeugung eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 22 bis 29.
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